RU2351328C1 - Гипотензивное средство 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата длительного действия - Google Patents

Abstract

Предложено применение 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата (азасиднона-6), NO-независимого гем-зависимого активатора растворимой гуанилатциклазы в качестве гипотензивного средства длительного действия. В отличие от доноров N0 данный препарат вызывает снижение артериального давления в течение длительного времени и не вызывает увеличения частоты сердечных сокращений. Показано снижение давления под действием препарата как у нормотензивных, так и у гипертензивных крыс, а также сосудорасширяющая активность. Изобретение может быть использовано в клинике для длительного снижения артериального давления и лечения артериальной гипертензии.

Description

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к созданию гипотензивного средства длительного действия.

Данное изобретение может быть использовано в биохимии, физиологии и медицине.

Оксид азота (NO), синтезируемый эндотелиальными клетками и другими типами клеток и тканей, играет одну из ключевых ролей в поддержании нормального тонуса гладких мышц сосудов, определяющего величину периферического сопротивления сосудов и артериального давления крови. Помимо этого, оксид азота оказывает спазмолитическое действие на гладкие мышцы желудочно-кишечного тракта, желчных путей, мочеточников, матки, бронхов и других органов, а также ингибирует процессы агрегации и адгезии тромбоцитов и нейтрофилов. Механизм молекулярного действия NO, синтезируемого из аминокислоты L-аргинина ферментами NO-синтазами, включает в себя стадию диффузии через плазматические мембраны и связывание с гемовой группой фермента растворимой гуанилатциклазы (рГЦ). Гуанилатциклаза /КФ 4.6.1.2.; гуанозин-5'-трифосфатпирофосфатлиаза (циклизирующая)/ является ферментом, катализирующим биосинтез гуанозин-3',5'-циклофосфата (цГМФ) из ГТФ. Циклический ГМФ является вторичным мессенджером, выполняющим универсальную роль регулятора внутриклеточных процессов. Гуанилатциклаза существует двух формах - мембрансвязанной и растворимой. Оксид азота активирует только одну форму фермента - рГЦ. На данный момент известно, что в результате взаимодействия NO с атомом железа гемма, входящего в состав фермента, происходит образование комплека нитрозил-гем. При этом возникают конформационные изменения активного центра фермента, которые приводят к активации рГЦ и увеличению синтеза цГМФ в клетке. Согласно современным представлениям дисфункция эндотелия сосудов, сопровождающая такие заболевания, как гипертензия (Schiffrin et aL, 2000, Park et aL, 2001), диабет I и II типа (Endemann et aL, 2004), заболевание коронарных артерий (Monnink et aL, 2002), сердечная недостаточность (Landmesser et aL, 2001), хроническая почечная недостаточность, характеризуется уменьшением эндотелий-зависимого расширения сосудов (ЭЗР) и нарушением NO-рГЦ-цГМФ-зависимого пути реализации расширительной реакции сосудов. Следовательно, коррекция NO-рГЦ-цГМФ-зависимого расслабления гладкомышечных клеток имеет большое значение для нормализации механизма регуляции сосудистого тонуса при различных адаптивных и патофизиологических реакциях.

Известно несколько способов коррекции NO-рГЦ-цГМФ-зависимого расслабления сосудов. Показано, что экзогенный NO образуется в кровеносном русле в результате биотрансформации тринитроглицерина и других нитратов. Однако препараты-донаторы NO нельзя использовать для длительной коррекции расширительного потенциала гладкой мышцы сосудов, так как они действуют в течение короткого времени, и к ним быстро развивается толерантность. Кроме этого, в больших количествах оксид азота опасен для тканей организма, так как он может вступать в реакции с активными формами кислорода и переходить в пероксинитрит, вызывающий окислительный стресс и повреждение белковых молекул в клетках организма. Кроме этого, существуют аллостерические регуляторы активности рГЦ. В настоящее время известны аллостерические регуляторы, как YC-1 и BAY 41-2272, выпускаемые фирмой Bayer, на данный момент находящиеся на стадии разработки. В отличие от NO-доноров они способны вызывать небольшие уменьшение АД, но в течение более длительного времени (до нескольких часов).

Кроме этого, в 1966 году впервые появились данные о возможности регуляции АД производными оксатриазола (Kier LB et aL, 1966). Механизм действия соединений этого класса долгое время оставался неизвестным. В настоящей работе произведен анализ действия одного из производных оксатриазола - 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата (далее азасиднон-6) на величину АД у крыс.

Задачей изобретения является поиск нового NO-независимого активатора рГЦ, обладающего длительным гипотензивным эффектом.

Поставленная задача достигается применением химического соединения 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата формулы

гем-зависимо, NO-независимо активирующего рГЦ.

Описание данного изобретения проиллюстрировано экспериментальными данными.

Примеры 1-3 иллюстрируют физиологические аспекты действия 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата in vivo, заключающиеся в том, что препарат способен вызывать длительный гипотензивный эффект при внутривенном введении.

Пример 4 демонстрирует сосудорасширяющий эффект 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата.

Пример 5 иллюстрирует биохимический эффект 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата 0 активацию очищенного фермента-рГЦ свиньи.

Пример 6 показывает химические основы молекулярного действия 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата, заключающегося в отсутствии генерации NO.

Пример 1. Гипотензивная активность 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата у нормотензивных животных.

Гипотензивную активность соединения определяли в условиях in vivo у бодрствующих нормотензивных животных линии Вистар средней дней массы 300 г известным способом. Для измерения среднего артериального давления и частоты сердечных сокращений и для введения препарата в кровоток за сутки до эксперимента животным имплантировали полиэтиленовые катетеры (марки РЕ-10, РЕ-50) в бедренную артерию и бедренную вену. Свободные концы катетеров выводили и закрепляли на голове. Операция проводилась под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг). Через сутки крысу брали в эксперимент. В ходе эксперимента регистрировали артериальное давление датчиком фирмы STATHAM (США) с последующей обработкой данных с помощью компьютера (программа Bioshel, Факультет Фундаментальной Медицины, МГУ им. М.В.Ломоносова). Соединения вводили болюсно последовательно в дозах 0,011 мкг/кг, 0,11 мкг/кг, 1,1 мкг/кг, 11 мкг/кг и 110 мкг/кг в объеме 20 мкл. Во время всего эксперимента животные находились в состоянии бодрствования и могли свободно перемещаться по клетке. В течение 40 минут животные адаптировались к условиям эксперимента, а затем начинали регистрацию гемодинамических показателей, которая велась впоследствии непрерывно на протяжении всего опыта. Исходные значения среднего артериального давления и частоты сердечных сокращений составляли 114 мм рт.ст. и 322 удара/мин соответственно.

Болюсное введение 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата в дозах 0,011 мкг/кг, 0,11 мкг/кг, 1,1 мкг/кг не влияло на артериальное давление в течение 30 минут. Болюсное введение препарата в дозах 11 мкг/кг и 110 мкг/кг вызывало статистически значимое уменьшение среднего артериального давления на 4,7% и 8,4% соответственно, при этом не влияя на частоту сердечных сокращений. Гипотензивный эффект препарата сохранился на протяжении 30 минут. Таким образом, болюсное введение 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата нормотензивным бодрствующим крысам линии Wistar вызывает статистически значимое уменьшение среднего АД в дозах 11 мкг/кг и 110 мкг/кг.

Пример 2. Гипотензивная активность 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата у гипертензивных крыс линии SHR.

Гипотензивную активность соединения определяли в условиях in vivo у бодрствующих гипертензивных животных линии SHR средней массы 300 г известным способом. Для измерения среднего артериального давления и частоты сердечных сокращений и для введения препарата в кровоток за сутки до эксперимента животным имплантировали полиэтиленовые катетеры (марки РЕ-10, РЕ-50) в бедренную артерию и бедренную вену. Свободные концы катетеров выводили и закрепляли на голове. Операция проводилась под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг). Через сутки крысу брали в эксперимент. В ходе эксперимента регистрировали артериальное давление датчиком фирмы STATHAM (США) с последующей обработкой данных с помощью компьютера (программа Bioshel, Факультет Фундаментальной Медицины, МГУ им. М.В.Ломоносова). Соединения вводили болюсно последовательно в дозах 110 мкг/кг и 550 мкг/кг в объеме 20 мкл. Во время всего эксперимента животные находились в состоянии бодрствования и могли свободно перемещаться по клетке. В течение 40 минут животные адаптировались к условиям эксперимента, а затем начинали регистрацию гемодинамических показателей, которая велась впоследствии непрерывно на протяжении всего опыта. Исходные значения среднего артериального давления и частоты сердечных сокращений составляли 157 мм рт.ст и 311 удара/мин соответственно.

Пример 3. Гипотензивная активность 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата у гипертензивных крыс линии SHR на фоне блокатора синтеза эндогенного NO L-NAME.

Гипотензивную активность соединения определяли в условиях in vivo у бодрствующих гипертензивных животных линии SHR массой 350 г известным способом. Для измерения среднего артериального давления и частоты сердечных сокращений и для введения препарата в кровоток за сутки до эксперимента животным имплантировали полиэтиленовые катетеры (РЕ-10, РЕ-50) в бедренную артерию и бедренную вену. Свободные концы катетеров выводили и закрепляли на голове. Операция проводилась под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг). Через сутки крысу брали в эксперимент. В ходе эксперимента регистрировали артериальное давление датчиком фирмы STATHAM (США) с последующей обработкой данных с помощью компьютера (программа Bioshel, Факультет Фундаментальной Медицины, МГУ им. М.В.Ломоносова). Сначала через венозный катетер вводили неселективный блокатор NO-синтаз L-NAME в дозе 5 мг/кг, а через 60 минут - 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата в дозе 110 мкг/кг. Эффекты 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата наблюдались в течение 90 минут. Во время всего эксперимента животные находились в состоянии бодрствования и могли свободно перемещаться по клетке. В течение 40 минут животные адаптировались к условиям эксперимента, а затем начинали регистрацию гемодинамических показателей, которая велась впоследствии непрерывно на протяжении всего опыта. Исходные значения среднего артериального давления и частоты сердечных сокращений составляли 153 мм рт.ст и 315 ударов/мин соответственно.

Болюсное введение 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата в дозе 110 мкг/кг на фоне блокатора синтеза NO L-NAME вызывает статистически значимое увеличение скорости снижения артериального давления по сравнению с контролем. К концу периода регистрации артериального давления в контроле относительное уменьшение составило Г мм рт.ст. на фоне действия 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата - 27 мм рт.ст. Таким образом, были выявлены длительные эффекты 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата при внутривенном введении бодрствующим гипертензивным животным линии SHR на фоне действия неселективного блокатора NO-синтаз L-NAME.

Пример 4. Сосудорасширяющая активность 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата.

Сосудорасширяющая активность 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата изучали по его способности изменять тонус перфузируемых сосудов. Активность 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата определяли в условиях in vitro на легочных сосудах крыс линии Вистар средней массы 250 г. Крыс декапитировали, вырезали левое легкое и выделяли легочную артерию второго порядка с небольшой частью предшествующего сосуда большего диаметра. Остальные ответвления и ответвления меньшего порядка перевязывали. Длина изолированных сосудов была равна 4 мм. Для проведения опыта артерию закрепляли на игле из нержавеющей стали с внутренним диаметром 0,5 мм, так, что соответствующие артерии низшего порядка были свободными и сохраняли всю рабочую поверхность эндотелия. Дистальный конец сосуда оставался незакрепленным. Внешний диаметр артерии - 300-400 мкм. Сосуды перфузировали с постоянным расходом, который составлял 2 мл/мин для внутреннего протока и 4 мл/мин для внешнего протока. Объем камеры для перфузии был равен 10 мл. Для перфузии использовали модифицированный физиологический р-р Кребса-Хенсляйта (содержание веществ в мМ: NaCl - 118, KCl - 4.7, CaCl₂ - 3.3, MgSO₄ - 2.4, KH₂PO₄ - 1.18, глюкоза - 5.05, NaHCO₃ - 24.9; pH 7.4), раствор аэрировали карбогеном (5% CO₂, 95% O₂) в течение 20 минут перед опытом; температуру раствора поддерживали на уровне 37,5°С (Nesterova M.A., Chuiko А.А., et al., 1999). О реакции сосуда судили по изменению перфузионного давления, регистрируемого с помощью тензодатчика (STATHAM, USA) и аналогово-цифрового преобразователя. Обработанный АЦП сигнал записывали на компьютере с частотой оцифровки 128 Гц. Для создания сократительного тонуса, который присутствует в организме, сосуды перфузировались 5-10^-6 М раствором серотонина. В нашем эксперименте перфузионное давление в ответ на серотонин возрастало до 20 мм рт.ст. в легочных сосудах, что соответствует нормальным значениям (Уейр Е.К. и Ривс Дж.Т., 1995; West J.B., 1990). На фоне этого сократительного тонуса сосуды последовательно перфузировали растворами 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата с возрастающими концентрациями: 1·10⁹ М, 1·10^-8 М, 1·10^-7 М, 1·10^-6 М и 1·10^-5 М.

При перфузии легочных сосудов растворами 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата в концентрациях 1·10^-9 М, 1·10^-8 M, 1·10^-7 M, 1·10^-6 M и 1·10^-5 М происходило дозозависимое уменьшение перфузионного давления относительно контроля (перфузия серотонином 10^-6 М). Статистически значимое увеличение расслабления наблюдалось при концентрациях азасиднона-6 1·10^-7 М, 1·10^-6 М и 1·10^-5 и составило 10%, 13% и 25% соответственно. Таким образом, 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олат оказывает расслабляющее действие на изолированные перфузированные препараты сосудов.

Пример 5. Активация растворимой формы гуанилатциклазы 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олатом.

Активность рГЦ измеряли в препаратах из легких свиньи, полученных известным способом. 1 кг легких свиньи очищали от хрящей, крупных сосудов, жира, измельчали в мясорубке, гомогенизировали в блендоре Уоринга в одном объеме буфера А, содержащего 25 мМ ТЭА, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ ДТТ, 40 мМ NaCl, 1 мМ PMSF, 2 мМ бензамидин, рН 7,5. Гомогенат центрифугировали 30 мин при 18000g, полученный супернатант центрифугировали при 100000 g в течение 40 мин. На колонку DEE-Toyopearl объемом 300 мл, 5×15 см, нанесли 1 л раствора белка и промыли 500 мл буфера А со скоростью 320 мл/час. рГЦ элюировали 1 л буфера А с линейным градиентом концентрации NaCl (0,04-0,05 М) со скоростью 90 мл/час. По результатам измерения активности рГЦ были объединены фракции (130 мл). Концентрации NaCl в них составила примерно 150 мМ. Полученный раствор белка развели 200 мл буфера, содержащего 25 мМ ТЭА, 7,5 мМ ДТТ, рН 7,5. На колонку с голубой агарозой (Sigma, Type 300, 0,5 мкмоль красителя на 1 мл носителя) объемом 100 мл, 2,5×40 см, нанесли 330 мл белка со скоростью 20 мл/час и промыли 100 мл буфера В, содержащего 25 мМ ТЭА, 5 мМ ДТТ, 50 мМ NaCl, 0,1 мМ PMSF, 0,2 мМ бензамидин, рН 7,5. Практически вся активность рГЦ была обнаружена в проскоке, объем которого составил 350 мл. Весь проскок нанесли на ту же колонку (которую промыли до нанесения буфером В, содержащим 1 мМ NaCl для элюции сорбированных белков) и промыли 100 мл буфера В со скоростью 24 мл/час. рГЦ частично сорбировалась на колонке (около 40% общей активности) и фермент элюировали буфером В, содержащим 750 мМ NaCl, со скоростью 80 мл/час. Были объединены фракции, обладающие наибольшей активностью (20 мл). К объединенным фракциям прибавили раствор ДТТ (+5 мМ дополнительно). 200 мл проскока, содержащего остальные 60% активности, нанесли на ту же колонку со скоростью 13 мл/час и элюировали буфером В, содержащим 750 мМ NaCl, со скоростью 80 мл/час. Были объединены фракции, обладающие наибольшей активностью (13 мл), и активные фракции предыдущей хроматографии, всего 33 мл. К этому раствору добавили 1 мкМ лейпептин, 0,2 мМ бензамидин и ДТТ (+5 мМ дополнительно). Раствор диализовали против 1 л буфера, содержащего 25 мМ ТЭА, 5 мМ ДТТ, рН 7,5 2,5 ч. На колонку с ГАП объемом 10 мл, 2,5×2 см, нанесли 20 мл раствора после диализа со скоростью 30 мл/час. Колонку промыли 10 мл буфера С, содержащего 25 мМ ТЭА, 10 мМ ДТТ, рН 7,4. рГЦ элюировали 50 мл буфера С с линейным градиентом концентрации фосфата калия (0-0,35 М). Хроматографию повторили при аналогичных условиях с оставшимися после диализа 17 мл раствора. После обеих хроматографий объединили фракции с наибольшей активностью (13 мл). Полученный раствор диализовали 14 часов против 0,5 л буфера, содержащего 25 мМ ТЭА, 5 мМ ДТТ, 100 мМ NaCl, рН 7,4. После диализа раствор центрифугировали при 18000g 25 мин. Супернатант фракционировали при помощи FPLS с использованием хромотографической установки АКТА, Amersham Bioscience, Швеция, и колонки QHyTrap объемом 5 мл. Хроматографию провели дважды, каждый раз нанося 6,5 мл раствора белка со скоростью 5 мл/мин. Колонку промывали 10 мл буфера D, содержащего 25 мМ ТЭА, 5 мМ ДТТ, 100 мМ NaCl, рН 7,4. рГц элюировали 90 мл буфера D с линейным градиентом концентрации NaCl (0,1-1,0 М). После обеих хромотографий фракции с наибольшей активностью объединили, всего 15 мл. Полученный раствор сконцентрировали до 1,8 мл с использованием мембраны РМ 30 (Amicon, Нидерланды) под давлением азота. Впоследствии эта стадия выделения фермента была исключена. Была проведена FPLC-гельфильтрация с использованием хроматографической установки АКТА, Amersham Bioscience, Швеция, и колонки Sephacryl-300 объемом 120 мл. На колонку нанесли 1,8 мл раствора белка и элюировали буфером D со скоростью 0,5 мл/мин. Фракции с наибольшей активностью объединили (5,2 мл) и сконцентрировали до 1,1 мл с использованием мембраны РМ 30 под давлением азота. 1 мл раствора белка развели в 2 мл буфера так, что конечные концентрации составили: 30% глицерин, 1М NaCl, 10 мМ ДТТ, 25 мМ ТЭА, рН 7,4. Раствор разделили на аликвоты и хранили в жидком азоте.

Метод определения активности рГЦ основан на каталитическом превращении ГТФ в цГМФ, последующем выделении цГМФ из реакционной смеси и определении его концентрации методом иммуноферментного анализа. Объем пробы составлял 100 мкл. Реакционная смесь состояла из 50 мМ Трис-HCl (рН 7,4), 5 мМ MgCl₂, 4 мМ креатинфосфата, 0,4 мг/мл креатинфосфокиназы, 0,2 мМ ГТФ, 5 мМ дитиотреитола и деионизированную воду (представлены конечные концентрации в пробе). Для получения препарата рГЦ размораживали аликвоту фермента и перед внесением в пробу разбавляли до необходимой концентрации буфером, содержащим 50 мМ Трис-HCl (рН 7,4) и 5 мМ дитриотреитол. Реакцию начинали добавлением к реакционной смеси водного раствора азасиднона-6 (100 мкМ), NO-донора - нитропруссида натрия (10 мкМ). Для исследования влияния азасиднона-6 на YC-1-индуцированную активность рГЦ в часть проб добавлялся 50 мкМ YC-1. Пробы инкубировали при 37°С 15 минут. Реакцию останавливали кипячением на водяной бане в течение 2 минут. К полученным пробам добавляли 148 мкл 101,4 мМ Zn(СН₃СОО)₂, 192 мкл 101,4 мМ Na₂CO₃, 10 мкл 100 мМ калийфосфатного буфера (рН 7,4) и 50 мкл 100 мМ NH₄HCO₃, перемешивали и в течение 10 минут выдерживали на льду. Далее пробы центрифугировались 5 минут при 8,8 тыс. оборотов/мин. Таким образом, удаляли избыток ГТФ, осаждающийся с карбонатом цинка, и денатурированный кипячением белок. Супернатант брали для исследования на содержание цГМФ методом иммуноферментного анализа с использованием антител к цГМФ. При необходимости супернатант разводили в отдельных эппендорфах 50 мкМ калийацетатным буфером (рН 6,8) для дальнейшего исследования. Калибровочную кривую строили на основе известных концентраций цГМФ, приготовленных 50 мМ калийацетатном буфере, рН 6,8. В данной работе использовались 3,2 нМ, 6,4 нМ, 12,8 нМ, 25,6 нМ, 0,05 мкМ, 0,1 мкМ, 0,2 мкМ растворы цГМФ. Калибровочные пробы осаждали так же, как и опытные пробы. Хранили осажденные калибровочные и опытные пробы при температуре - 20°С. Определение концентрации цГМФ в супернатанте проводилось по методу конкурентного имунноферментного анализа с использованием специфических антител к цГМФ на планшетном спектрофотометре при длине волны 492 нм.

В вышеуказанных условиях эксперимента было показано, что 100 мкМ 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олат активирует рГЦ в 30 раз по сравнению с базальной активностью фермента (598,52±65,11 нмоль/(мин*мг ГЦ) - 100 мкМ 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олатом и 20,52±3,44 нмоль/(мин*мг ГЦ) - базальная активность фермента). Было установлено, что 100 мкМ азасиднон-6 активирует рГЦ так же, как и 10 мкМ донор NO SNP (598,52±105,11 нмоль/(мин*мг ГЦ) и 686,46±106,56 нмоль/(мин*мг ГЦ) соответственно). Активация рГЦ 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олатом, так же как и SNP, увеличивалась в присутствии 50 мкМ YC-1 в одинаковой степени (1211,39±132,30 нмоль/(мин*мг ГЦ) и 1166,22±47,88 нмоль/(мин*мг ГЦ) соответственно).

Пример 6. Образование NO из 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата.

Для определения NO-донорной активности 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата использовали спектрофотометрический метод определения NO с оксигемоглобином. Как известно, NO способен вступать в реакцию с оксигемоглобином с образованием метгемоглобина и нитрата (Lancaster et al., 1994), при этом происходит появление пиков при длинах волн 577 и 401 нм спектра поглощения. Зная коэффициент экстинкции при данных длинах волн, можно рассчитать молярную концентрацию получившегося метгемоглобина по формуле:

c=(l*d)/E,

где l - длина оптического пути, d - поглощение при данной волне волны, Е - молярный коэффициент экстинкции при данной длине волны. При расчетах учитывалось то, что оксигемоглобин взаимодействует с NO в эквимолярном соотношении, соответственно концентрация получающегося метгемоглобина равна концентрации NO.

Объем пробы для спектрофотометрирования составил 1 мл. Конечные концентрации веществ в пробе составили 25 мкМ калий-фосфатного буфера (рН 7,4), 5 мкМ оксигемоглобина. Реакцию начинали добавлением азасиднона-6 (100 мкмоль/л) в опыте дистиллированной воды в случае контроля и NO-донора в случае положительного контроля. В опытах с положительным контролем использовался NO-донор Спермин NONOaT в концентрации 5 мкмоль/л. Измерение кинетики реакции осуществлялось с помощью спектрофотометра Ultrospec 2000 (Pharmacia Biotech, США). Данные представлены в виде нмоль NO/мин на 1 моль вещества.

Указанное средство вызывает достоверное длительное снижение артериального давления при внутривенном введении.

Изобретение может быть использовано в клинике для длительного снижения артериального давления и лечения артериальной гипертензии. В отличие от доноров NO данный препарат вызывает снижение артериального давления в течение длительного времени и не вызывает увеличения частоты сердечных сокращений.

Claims (1)

1. Применение 3-(3-[1,2,4]-триазоло)-оксатриазолий-5-олата (азасиднона 6), NO-независимого гем-зависимого активатора растворимой гуанилатциклазы, в качестве гипотензивного средства длительного действия.