RU2303783C1 - Способ иммуноферментного определения антигенов - Google Patents
Способ иммуноферментного определения антигенов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2303783C1 RU2303783C1 RU2005135991/13A RU2005135991A RU2303783C1 RU 2303783 C1 RU2303783 C1 RU 2303783C1 RU 2005135991/13 A RU2005135991/13 A RU 2005135991/13A RU 2005135991 A RU2005135991 A RU 2005135991A RU 2303783 C1 RU2303783 C1 RU 2303783C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- enzyme
- complexes
- biotin
- enzyme label
- added
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 12
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 108010016529 Bacillus amyloliquefaciens ribonuclease Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims abstract 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims abstract 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 12
- 101710183938 Barstar Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 abstract 1
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 22
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 14
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 11
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 6
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 5
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 4
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- MXWJVTOOROXGIU-UHFFFAOYSA-N atrazine Chemical compound CCNC1=NC(Cl)=NC(NC(C)C)=N1 MXWJVTOOROXGIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 description 3
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 244000000013 helminth Species 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 2
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 2
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 108010039231 polyethyleneglycol-hirudin Proteins 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005353 urine analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 108091009357 vitamin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000028728 vitamin binding proteins Human genes 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и аналитической химии и представляет собой способ иммуноферментного определения антигенов. При проведении анализа на поверхности носителя формируются комплексы между молекулами антигена и специфическими антителами, которые выявляются посредством присоединения к комплексам ферментной метки и ее детекции по образованию продукта ферментативной реакции. Присоединение ферментной метки осуществляется посредством взаимодействия двух белков - бактериальной рибонуклеазы барназы и ее ингибитора барстара. При этом один из них присоединен к иммунореагенту, а другой - к ферментной метке. Изобретение позволяет определять антигены посредством непрямого введения ферментной метки в детектируемые иммунные комплексы с высокой аффинностью и специфичностью, с константой связывания комплекса - 1014 М-1. 5 ил.
Description
Изобретение относится к биотехнологии и аналитической химии и может использоваться при определении биологически активных веществ в медицинской диагностике, для характеристики качества сельскохозяйственной и пищевой продукции, экологического мониторинга, контроля технологических процессов.
В современной практике широко применяются иммуноферментные методы анализа различных веществ (Gabaldon J.A., Maquieira A., Puchades R. Current trends in immunoassay-based kits for pesticide analysis. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 1999; 39 (6): 519-538; Stefan R.L, van Staden J.F., Aboul-Enein H.Y. Immunosensors in clinical analysis. Fresenius J. Anal. Chem. 2000; 366 (6-7): 659-668; Lee N.A., Kennedy I.R. Environmental monitoring of pesticides by immunoanalytical techniques: validation, current status, and future perspectives. J. AOAC Int. 2001; 84 (5): 1393-1406; Luppa P.B., Sokoll L.J., Chan D.W. Immunosensors - principles and applications to clinical chemistry. Clin. Chim. Acta. 2001; 314 (1-2): 1-26), поскольку сочетание антител и ферментов для формирования детектируемых межмолекулярных комплексов приводит одновременно к специфичности анализа, обеспечиваемой высокоселективными антителами, и его чувствительности, обеспечиваемой высокоактивными ферментными метками. Методы иммуноферментного анализа (ИФА) подразделяются на прямые, в которых метка непосредственно присоединена к иммунореагенту (стандартному препарату антигена или специфическому антителу), и непрямые, в которых введение метки в иммунный комплекс является дополнительной стадией анализа (Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. // М.: Высш. шк. 1991). Несмотря на большую продолжительность непрямого иммуноанализа, в значительной части случаев его применение предпочтительно. Непрямое мечение предотвращает контакт фермента с компонентами анализируемой пробы, которые потенциально могут вызвать его инактивацию. Кроме того, в непрямом иммуноанализе ферментсодержащий конъюгат является универсальным реагентом, пригодным для определения самых разных антигенов. Непрямое мечение исключает необходимость для каждой новой задачи синтезировать специфические конъюгаты и характеризовать свойства полученных при синтезе продуктов.
При реализации непрямого ИФА в современной практике используются два основных способа введения метки:
- взаимодействие специфических антител и меченных ферментом антивидовых антител;
- модификация специфических антител биотином и их последующее выявление с помощью конъюгата авидин-фермент или стрептавидин-фермент.
Хотя первый способ позволяет работать с нативными специфическими антителами, не прибегая к какой бы то ни было их обработке, взаимодействие с антивидовыми антителами вносит в анализ существенный элемент неопределенности, поскольку в зависимости от свойств антивидовых и специфических антител эффективность взаимодействия между ними может значительно варьировать. В этом отношении реакция биотин-(стрепт)авидин, безусловно, более перспективна, поскольку она характеризуется высокой константой связывания - около 1015 М-1 (на 6-7 порядков превосходя реакцию с антивидовыми антителами), неизменной для всех взаимодействующих молекул и не зависящей от индивидуальных свойств используемых препаратов (Hevey R.C., Malmros М.К. Methods for the detection and determination of ligands. US Patent 4228237. October 14, 1980; Wilchek М., Bayer E.A. Applications of avidin-biotin technology: literature survey. Methods Enzymol. 1990; 184: 14-45; Diamandis E.P., Christopoulos Т.К. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem. 1991; 37 (5): 625-636; Lindqvist Y., Schneider G. Protein-biotin interactions. Curr. Opin. Struct. Biol. 1996; 6 (6): 798-803). В настоящее время коммерчески доступны как производные биотина (активированные эфиры, позволяющие быстро и в щадящих условиях биотинилировать антитела или другие белки), так и конъюгаты стрептавидина с высокоактивными ферментными метками - пероксидазой, щелочной фосфатазой и др. (Swanson P.E., Wick M.R. Commercial avidin-biotin-peroxidase complex kits. Am. J. Clin. Pathol. 1989; 91 (4, Suppl. 1): S43-44; Selvanayagam Z.E., Gopalakrishnakone P. Tests for detection of snake venoms, toxins and venom antibodies: review on recent trends (1987-1997). Toxicon. 1999; 37 (4): 565-586; Wilbur D.S., Pathare P.M., Hamlin D.K., Stayton P.S., To R., Klumb L.A., Buhler K.R., Vessella R.L. Development of new biotin/streptavidin reagents for pretargeting. Biomol. Eng. 1999; 16 (1-4); 113-118; Sugiyama К., Hoshino N., Tatsumi H., Fukuda S. Complexes containing crosslinked avidin, analytical method with the use of crosslinked avidin and analytical reagents and kits. US Patent 6787325. September 7, 2004).
Непрямой иммуноферментный анализ с использованием системы биотин-(стрептавидин) в наиболее распространенных вариантах включает следующие этапы (Avidin-Biotin Technology. Methods in Enzymology: Volume 184. John N. Abelson, Melvin I. Simon, Meir Wilchek, Edward A. Bayer, eds. San Diego, CA, USA. Academic Press, 1990):
A) до проведения анализа осуществляется биотинилирование специфических антител с отделением продукта синтеза - конъюгата, содержащего одну молекулу антитела и неопределенное (варьирующее для разных молекул конъюгата в пределах одного синтеза) количество молекул биотина, - от непрореагировавшего активированного биотина и других низкомолекулярных компонентов реакционной среды;
Б) в результате специфических иммунохимических взаимодействий (перечень и порядок которых выбирается, исходя из особенностей антигена и антител) на поверхности планшета для ИФА формируется иммобилизованный комплекс, содержащий молекулы антигена (нативного или модифицированного), биотинилированные специфические антитела и, при необходимости, дополнительные реагенты (вторые специфические антитела и др.);
B) молекулы, не включенные в иммобилизованные комплексы, удаляются посредством промывки планшета;
Г) в лунки добавляется раствор конъюгата стрептавидин-фермент. После инкубации осуществляется отмывка планшета, которая отделяет непрореагировавшие молекулы конъюгата от связавшихся с носителем. (При необходимости ускорения анализа конъюгат стептавидин-фермент может вводиться на стадии формирования специфических комплексов.);
Д) в лунки добавляется субстрат, который трансформируется молекулами фермента в составе иммобилизованных комплексов с образованием продуктов, детектируемых фотометрическим, флюориметрическим, электрохимическим или иным способом;
Е) на основании генерируемого сигнала и калибровочной зависимости определяется содержание антигена в пробе.
Один из вариантов реализации данного подхода описан в статье Song X.H., Huhle G., Wang L.C., Harenberg J. "Quantitative Determination of PEG-Hirudin in Human Plasma Using a Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay." Thrombosis Research 2000; 99 (2): 195-202. Ниже представлено изложение предлагаемой авторами этой статьи методики проведения анализа, рассматриваемой в настоящей заявке в качестве прототипной.
Раствор антигена вносили в лунки микротитрационных планшетов для ИФА и инкубировали в течение ночи при 4°С. После блокировки незанятых участков сорбции планшеты отмывали от непрореагировавших молекул. Тестируемые образцы, потенциально содержащие определяемый антиген, или их разведения вносили в лунки одновременно со специфическими антителами против определяемого антигена и инкубировали. Используемые количества иммобилизованного антигена и разведения специфических антител оптимизировали, исходя из сравнения результатов анализа для последовательных разведений обоих реагентов (так называемое «шахматное титрование»). После инкубации лунки отмывали, вносили биотинилированные антивидовые антитела, повторно инкубировали и отмывали планшет. Далее сформировавшиеся комплексы инкубировали с раствором конъюгата стрептавидин-пероксидаза и опять отмывали планшет. Инкубировали лунки с раствором субстрата пероксидазы, останавливали реакцию его трансформации серной кислотой и регистрировали поглощение продукта с помощью фотометра для микротитрационных планшетов. Концентрацию антигена вычисляли, используя стандартную калибровочную кривую, полученную для образцов с внесенными известными количествами антигена.
Отметим, что введение ферментной метки посредством взаимодействия биотин-(степт)авидин имеет существенные недостатки, не преодоленные в известных на сегодня работах.
1. При химическом конъюгировании антител с биотином образуется смесь продуктов разной стехиометрии и, соответственно, разных свойств. Соотношение продуктов зависит как от контролируемых (исходные концентрации реагентов, продолжительность взаимодействия, температурный режим, состав реакционной среды), так и от неконтролируемых факторов (наличие примесей, степень сохранения модифицированным биотином реакционной способности, конформационное состояние антител, число и степень доступности реакционно-способных групп на их поверхности).
2. При необходимости контакта конъюгата (стрепт)авидин-фермент с пробой результаты анализа искажаются в тех случаях, когда матрикс пробы содержит биотин, что свойственно, в частности, пробам мяса (Kopinski J.S., Leibholz J., Bryden W.L. Biotin studies in pigs. 4. Biotin availability in feedstuffs for pigs and chickens. Br. J. Nutr. 1989; 62 (3): 773-780). Аналогичные проблемы описаны также для анализа мочи, что, по всей видимости, связано с присутствующими в ней метаболитами биотина (Raguseo R.M. А direct streptavidin-binding assay does not accurately quantitate biotin in human urine. J. Nutrition, 2001; 131 (8): 2208-2214), а также при иммунохимической характеристике гельминтов (Romaris F., Iglesias R., Garcia L.O., Leiro J., Santamarina M.T., Paniagua E., Ubeira F.M. Free and bound biotin molecules in helminths: a source of artifacts for avidin biotin-based immunoassays. Parasitol. Res. 1996; 82 (7): 617-622). При анализе яиц имеющийся в пробе авидин (White Н.В. 3rd. Vitamin-binding proteins in the nutrition of the avian embryo. J. Exp.Zool. Suppl. 1987; 1: 53-63) блокирует биотин на поверхности модифицированных антител, препятствуя связыванию ферментной метки, даже если стадии анализа осуществляются последовательно и ферментный конъюгат не контактирует с пробой.
Возможность работы с межмолекулярными конъюгатами стандартного состава (и тем самым, унифицированных свойств) возникает при переходе от химического конъюгирования к генно-инженерному (Witkowski A., Daunert S., Kindy M.S., Bachas L.G. Enzyme-linked immunosorbent assay for an octapeptide based on a genetically engineered fusion protein. Anal. Chem. 1993; 65 (9): 1147-1151; Grigorenko V., Andreeva I., Borchers Т., Spener F., Egorov A. A genetically engineered fusion protein with horseradish peroxidase as a marker enzyme for use in competitive immunoassays. Anal. Chem. 2001; 73 (6): 1134-1139; Rau D., Kramer К., Hock В. Single-chain Fv antibody-alkaline phosphatase fusion proteins produced by one-step cloning as rapid detection tools for ELISA. J. Immunoassay Immunochem. 2002; 23 (2): 129-143). Однако для биотина из-за его небелковой природы данный подход неприменим.
Задачей изобретения является разработка способа иммуноферментного определения антигенов, в котором непрямое введение ферментной метки в детектируемые иммунные комплексы осуществляется посредством белок-белкового взаимодействия с высокой аффинностью реакции, существенно превосходящей по константе связывания иммунохимические взаимодействия, и возможностью генно-инженерного получения межмолекулярных конъюгатов стандартного состава.
Заявителями предлагается для введения ферментной метки использовать реакцию между бактериальным ферментом рибонуклеазой (барназой) и ее ингибитором барстаром. Данное взаимодействие характеризуется высокой аффинностью (константа связывания комплекса - 1014 М-1) и специфичностью, идет в широком диапазоне параметров реакционной среды и не зависит от наличия в ней каких-либо конкурирующих или ингибирующих факторов (Hartley R.W. Barnase-barstar interaction. Methods Enzymol. 2001; 341: 599-611). И барназа, и барстар представляют собой небольшие белки (массой 12 и 10 кДа соответственно) без кофакторов, углеводов и иных структурных элементов небелковой природы, что делает методически простым их генно-инженерное конъюгирование. Концевые участки аминокислотных цепей барназы и барстара не участвуют в формировании межмолекулярного комплекса, что позволяет использовать их для конъюгирования с маркерами и иммунореагентами без потери активности (Deyev S.M., Yazynin S.A., Kuznetsov D.A., Jukovich M., Hartley R.W. Ribonuclease-charged vector for facile direct cloning with positive selection. Mol. Gen. Genet. 1998; 259 (4): 379-382). Более того, показано, что генно-инженерное присоединение барназы к антителам повышает их стабильность, а благодаря этому - и воспроизводимость результатов анализа при хранении реагентов (Martsev S.P., Tsybovsky Y.I., Stremovskiy O.A., Odintsov S.G., Balandin Т.О., Arosio P., Kravchuk Z.I., Deyev S.M. Fusion of the antiferritin antibody VL domain to barnase results in enhanced solubility and altered pH stability. Protein Eng. Des. Sel. 2004; 17 (1): 85-93). Константа связывания 1014 M-1 обеспечивает количественное формирование комплексов и отсутствие их сколько-либо существенной диссоциации за время анализа. Преимуществом системы является также возможность получения конъюгатов стандартной стехиометрии и при химическом синтезе, поскольку молекула барназы не содержит цистеиновых групп, а введенный путем сайт-специфического мутагенеза в концевой участок молекулы цистеин позволяет синтезировать конъюгаты состава 1:1.
Таким образом, отличие предлагаемого подхода от прототипного состоит в том, что присоединение ферментной метки к детектируемому иммунному комплексу осуществляют не посредством взаимодействия биотин-(стрепт)авидин, а посредством взаимодействия барназа-барстар, что позволяет получать межмолекулярные конъюгаты для анализа генно-инженерными методами и унифицировать состав конъюгатов, тем самым обеспечивая высокую воспроизводимость результатов анализа.
Возможность реализации и эффективность предлагаемого подхода подтверждают представленные ниже примеры иммуноферментного анализа с использованием системы барназа-барстар, вводимой в состав детектируемых иммунных комплексов посредством химического (Пример 1) или генно-инженерного (Пример 2) конъюгирования.
Пример 1. Иммуноферментный анализ гербицида атразина.
Схема проведения анализа представлена на фиг.1. 100 мкл раствора конъюгата атразина с бычьим сывороточным альбумином (0,5 мкг/мл, в ФБ - 50 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,4, с 0,1 М NaCl) добавляли в лунки полистиролового микропланшета для ИФА и инкубировали в течение ночи при 4°С. После этого лунки четырехкратно отмывали ФБТ - ФБ с 0,05% детергента Тритон Х-100. 50 мкл атразинсодержащих проб и 50 мкл химического конъюгата барназы с моноклональным антителом 1Е4/А12 против атразина (0,2 мкг/мл, в ФБТ) добавляли в лунки одновременно и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. Затем планшет повторно четырехкратно отмывали, добавляли в каждую лунку 100 мкл химического конъюгата барстар-пероксидаза (1 мкг/мл, в ФБТ) и инкубировали 1 час при 37°С. После этого планшет трехкратно отмывали ФБТ и один раз дистиллированной водой. Чтобы зарегистрировать каталитическую активность связавшейся с поверхностью планшета ферментной метки, в лунки добавляли на 100 мкл 100 мМ Na-цитратного буфера, рН 6,0, содержащего 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (0,1 мг/мл) и пероксид водорода (3,3 мМ). После 15-минутной инкубации при комнатной температуре реакцию останавливали добавлением 100 мкл 0,1 М серной кислоты. Оптическую плотность образовавшихся окрашенных продуктов регистрировали при 450 нм. Полученная калибровочная кривая конкурентной иммунодетекции представлена на фиг.2.
Пример 2. Иммуноферментный анализ белкового онкомаркера p185HER2.
Схема проведения анализа представлена на фиг.3. 100 мкл раствора р185HER2 (0,1 мкг/мл, в ФБ) добавляли в лунки микропланшета, инкубировали 2 часа при 37°С и четырехкратно отмывали ФБТ. 50 мкл проб, содержащих р185HER2, и 50 мкл рекомбинатного конъюгата барназы или барстара с мини-антителом 4D5 против р185HER2 (в обоих случаях - в концентрации 8 нг/мл, в ФБТ) инкубировали совместно в течение 20 мин при комнатной температуре и затем добавляли в лунки планшета. После 1 часа инкубации при 37°С и последующей отмывки добавляли 100 мкл конъюгата барстар-пероксидаза для выявления барназы или барназа-пероксидаза для выявления барстара (1 мкг/мл, в ФБТ) и инкубировали 1 час при 37°С. Заключительную отмывку и регистрацию пероксидазной активности осуществляли, как описано в Примере 1. Полученные калибровочные кривые конкурентной иммунодетекции представлены на фиг.4, 5.
Claims (1)
- Способ иммуноферментного определения антигенов, включающий формирование на поверхности носителя комплексов между молекулами антигена и специфическими антителами, присоединение к комплексам ферментной метки и ее детекцию по образованию продукта ферментативной реакции, отличающийся тем, что присоединение ферментной метки осуществляется посредством взаимодействия двух белков - бактериальной рибонуклеазы барназы и ее ингибитора барстара, при этом один из взаимодействующих белков ковалентно или генно-инженерно присоединен к иммунореагенту, а другой - к ферментной метке.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005135991/13A RU2303783C1 (ru) | 2005-11-21 | 2005-11-21 | Способ иммуноферментного определения антигенов |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2005135991/13A RU2303783C1 (ru) | 2005-11-21 | 2005-11-21 | Способ иммуноферментного определения антигенов |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2303783C1 true RU2303783C1 (ru) | 2007-07-27 |
Family
ID=38431774
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005135991/13A RU2303783C1 (ru) | 2005-11-21 | 2005-11-21 | Способ иммуноферментного определения антигенов |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2303783C1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113721023A (zh) * | 2021-08-31 | 2021-11-30 | 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 | 一种基于Barnase/barstar的生物免疫传感系统及应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1337775A1 (ru) * | 1984-12-26 | 1987-09-15 | Пермский Научно-Исследовательский Институт Вакцин И Сывороток | Способ иммуноферментного определени антигенов |
| RU2152036C1 (ru) * | 1998-05-12 | 2000-06-27 | Научно-производственное объединение "Биомед" | Способ определения и дифференциации ботулинических токсинов типов а и в |
| US7011955B1 (en) * | 1999-01-29 | 2006-03-14 | Universitaet Tuebingen | Quantitative determination of analytes in a heterogeneous system |
-
2005
- 2005-11-21 RU RU2005135991/13A patent/RU2303783C1/ru active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1337775A1 (ru) * | 1984-12-26 | 1987-09-15 | Пермский Научно-Исследовательский Институт Вакцин И Сывороток | Способ иммуноферментного определени антигенов |
| RU2152036C1 (ru) * | 1998-05-12 | 2000-06-27 | Научно-производственное объединение "Биомед" | Способ определения и дифференциации ботулинических токсинов типов а и в |
| US7011955B1 (en) * | 1999-01-29 | 2006-03-14 | Universitaet Tuebingen | Quantitative determination of analytes in a heterogeneous system |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113721023A (zh) * | 2021-08-31 | 2021-11-30 | 深圳市国创纳米抗体技术有限公司 | 一种基于Barnase/barstar的生物免疫传感系统及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Nishikori et al. | Broad ranges of affinity and specificity of anti-histone antibodies revealed by a quantitative peptide immunoprecipitation assay | |
| KR101132293B1 (ko) | 삼차원적 상호작용을 이용하여 멀티머-형성 폴리펩타이드의모노머로부터 멀티머를 분별 검출하는 방법 | |
| US9778252B2 (en) | Analyte detection | |
| US20100009394A1 (en) | Universal tandem solid-phases based immunoassay | |
| RU2006145450A (ru) | Анализ на антитела | |
| EP3011347B1 (en) | Method for detecting small molecules in a sample | |
| JP5166240B2 (ja) | 種々の系列の抗生物質の検出および特定を同時に行なうインビトロ方法およびこの方法による分析キット | |
| US20170138937A1 (en) | Detection of analytes | |
| US4727037A (en) | Assay kit and method for the determination of antibody class and subclass | |
| US8334103B2 (en) | Composition related to rapid ELISA process | |
| EP1554576A2 (en) | Identification of high affinity molecules by limited dilution screening | |
| Kumada et al. | Development of a one-step ELISA method using an affinity peptide tag specific to a hydrophilic polystyrene surface | |
| Zhang et al. | A Biotin–Streptavidin Amplified Enzyme-Linked Immunosorbent Assay with Improved Sensitivity for Rapid Detection of Ractopamine in muscular tissue: Development and Nonspecific Adsorption Reduction | |
| Schneider | Environmental immunoassays. | |
| Biesiadecki et al. | A High‐Throughput Solid‐Phase Microplate Protein‐Binding Assay to Investigate Interactions between Myofilament Proteins | |
| Hsieh et al. | Immunoassays | |
| RU2303783C1 (ru) | Способ иммуноферментного определения антигенов | |
| RU1838787C (ru) | Способ определени триазиновых гербицидов | |
| US20190018005A1 (en) | Tandemly repeated antibody-binding protein and its applications | |
| US20040115752A1 (en) | Method for testing samples containing prion protein for the possible presence of the prpsc form | |
| Sardinha et al. | Enzyme-linked immunofiltration assay used in the screening of solid supports and immunoreagents for the development of an azinphos-methyl flow immunosensor | |
| MXPA04008430A (es) | Ensayo para anticuerpos anti-ingap. | |
| EP0362284A1 (en) | Multiple antigen immunoassay | |
| US12455283B2 (en) | Methods for screening polypeptides capable of binding specific target molecules and tools related thereto | |
| Gorris et al. | Pushing antibody-based labeling systems to higher sensitivity by linker-assisted affinity enhancement |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner |