RU2295403C1

RU2295403C1 - Способ получения бактериального препарата родер для очистки почв, почвогрунтов, нефтешламов, пресных и минерализованных вод от нефти и нефтепродуктов

Info

Publication number: RU2295403C1
Application number: RU2005128330/13A
Authority: RU
Inventors: Валентина Павловна Мурыгина (RU); Валентина Павловна Мурыгина; Сергей Владимирович Калюжный (RU); Сергей Владимирович Калюжный; Натали Евгеньевна Войшвилло (RU); Наталия Евгеньевна Войшвилло
Original assignee: Валентина Павловна Мурыгина; Сергей Владимирович Калюжный; Наталия Евгеньевна Войшвилло
Priority date: 2005-09-13
Filing date: 2005-09-13
Publication date: 2007-03-20
Also published as: WO2007032704A1

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам получения препаратов-нефтедеструкторов, применяемых для очистки почв и воды, загрязненных нефтью. Способ получения препарата-нефтедеструктора Родер (Rhoder) на основе штаммов Rhodococcus ruber ВКМ Ас-1513D и Rhodococcus erythropolis BKM Ac-1514 D включает несколько этапов. Особенность способа заключается в том, что на начальном этапе его осуществления проводят отбор наиболее активных клонов R-форм штаммов, входящих в состав препарата-нефтедеструктора, а на последнем этапе - проводят совместное глубинное культивирование двух штаммов, предварительно индивидуально выращенных в инокуляторах на специально подобранных питательных средах в физиологически оптимальных режимах культивирования в промышленном масштабе. Выращивание на стадии получения максимальной биомассы проводят на питательной среде, содержащей глюкозу как единственный источник углерода, а в качестве источника азота и других органических веществ - дрожжевой автолизат или рыбный гидролизат. Предлагаемый способ позволяет получить препарат в жидкой или сухой форме с численностью активных углеводородокисляющих клеток 10¹¹-10¹² кл/мл и 10¹⁰-10¹¹ кл/г, соответственно, что в дальнейшем освобождает от необходимости проводить предварительную активизацию сухого препарата. Кроме того, способ позволяет получить бактериальный препарат с более высокой нефтеокисляющей активностью и сократить время его получения без снижения эффективности и качественных характеристик. 3 з.п. ф-лы, 6 табл.

Description

Изобретение относится к биотехнологии и экологии. Оно может быть использовано в микробиологической промышленности и предназначено для получения бактериального препарата-нефтедеструктора и защиты окружающей среды (почвы, грунтов, нефтешламов, пресных и минерализованных вод) от загрязнения углеводородами нефти и нефтепродуктов.

Нефть до настоящего времени остается одним из самых востребованных источников энергии как в России, так и во всем мире, в то же время она является и основным загрязнителем окружающей среды. Аварийные разливы нефти происходят при разведке, добыче, транспортировке и ее переработке. Основные нефтедобывающие регионы в России располагаются на севере Европейской части и в Западной Сибири на территориях с суровым и холодным климатом. Суровый климат и геофизические условия в этих регионах вызывают быстрое старение нефтепроводов и приводят к частым аварийным проливам на природные объекты огромных количеств нефти и пластовых вод. Эти же факторы препятствуют быстрому естественному восстановлению природы и усложняют применение рекультивационных технологий для восстановления загрязненных территорий.

Сравнительные испытания, проведенные в Республике Коми в 2001-2004 г., показали, что применение препаратов-нефтедеструкторов, состоящих из высокоактивных нефтеокисляющих микроорганизмов, существенно ускоряет процессы восстановления нарушенных экосистем. В Татарстане и южных регионах России, где также добывается нефть и эксплуатируются нефтепроводы, проблема защиты окружающей среды от загрязнения ее нефтью и нефтепродуктами не менее актуальна, несмотря на то, что процессы естественного восстановления природы от техногенных загрязнений в этих регионах проходят более активно по сравнению с северными.

Необходимость получения высокоактивных препаратов-деструкторв нефти обусловлена также скоплением нефтешламов в амбарах при бурении и добыче нефти и в шламонакопителях на нефтеперерабатывающих заводах. Как показали сравнительные испытания эффективности метода компостирования и биоаугментации с внесением препарата-нефтедеструктора в эксперименте по биорекультивации нефтешламов, биоаугментация является более эффективным методом.

В России имеются разнообразные биопрепараты, разработанные для очистки почв от нефтяных загрязнений (коммерческие названия препаратов: Авалон, Бациспецин, Валентис, Деворойл, Достроил, Нафтокс, Никаойл, Петролан, Путидойл, Родер, Универсал и др.) [1-8]. Самыми известными из них и давно применяющимися на практике являются биопрепараты Путидойл [4] и Деворойл [4, 5]. Известно, что препарат Путидойл состоит из одного штамма бактерии Pseudomonas putida 36. Препарат получают глубинным культивированием бактерии в питательной среде при 30°С, в аэробных условиях, с последующей распылительной сушкой либо лиофилизацией полученной культуральной жидкости [7]. Поскольку препарат Путидойл является монокультурой, он обладает меньшим потенциалом и более узким спектром действия на углеводороды, чем препараты, состоящие из двух и более штаммов микроорганизмов, например Деворойл [4, 5].

Известно, что в состав препарата Деворойл входят штаммы Pseudomonas stutzeri, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus maris, Rhodococcus sp., Yarrowia lipolytica (ранее Candida sp.) [4, 5]. В соответствии с патентом [5], Деворойл также получают глубинным культивированием в питательной среде входящих в его состав микроорганизмов и последующим высушиванием полученной биомассы. Однако Деворойл состоит из микроорганизмов различной таксономической и видовой принадлежности, требующих раздельного выращивания, что существенно усложняет и удорожает процесс наработки препарата. С другой стороны, при совместном культивировании микроорганизмов, относящихся к различным таксономическим группам и различающимся по скорости роста, субстратной специфичности, температурному оптимуму роста и пр., возникает конкурентная борьба за источники питания, и в результате в таком препарате выживают не все виды из заявленных, и, соответственно, уменьшается эффективность такого препарата. То же самое относится и к препарату [9], состоящему из двух мезофильных псевдомонад, микрококка и двух психрофильных псевдомонад и ксантомоноса, всего 6 штаммов, которые при получении посевного материала выращиваются раздельно, а в ферментере культивируются вместе при 20°С с внесением сырой нефти в качестве индуктора и затем доращиваются в течение 120 часов при температуре 3°С на торфе с дополнительным внесением карбамида, суперфосфата и сульфата калия. Невысокая активность препарата, состоящего из разнородных микроорганизмов - бактерий и дрожжей Acinetobacter oleovorum, Mycococcus lactis, Candida tropicalis, Candida guilliermondii, полученных путем совместного культивирования [10], была установлена экспериментально [11].

Более предпочтительными для получения биопрепаратов с высоким титром жизнеспособных клеток, в случае применения стадии совместного культивирования, представляются ассоциации микроорганизмов одной таксономической принадлежности. Известен способ получения препарата [12], состоящего из двух видов бактерий рода Pseudomonas - Ps. putida и Ps. fluorescens, в котором применяется совместное культивирование. Согласно этому способу, на первой стадии приготовления препарата осуществляют глубинное культивирование на жидкой питательной среде, на второй стадии проводят совместное выращивание бактерий на поверхности твердого носителя, в качестве которого служит стерильный торф, т.е. осуществляется поверхностное культивирование. Предварительное глубинное культивирование проводят либо в 5 л бутылях, либо в 100 л ферментере. Для осуществления дополнительного поверхностного культивирования готовят стерильные полиэтиленовые пакеты, которые наполняют стерильным торфом в количестве 0,6 кг и засевают 150 мл посевного материала, полученного на стадии глубинного культивирования. Пакеты выдерживают герметично закрытыми в течение 7 сут при 30°С и получают препарат с титром жизнеспособных клеток 10¹² на один грамм. Недостатком указанного способа является: сложность осуществления стадии поверхностного культивирования, а именно: подготовка стерильных пластиковых пакетов, расфасовка стерильного торфа в стерильные пакеты, его инокуляция бактериями и длительность их культивирования. Способ труден для масштабирования вследствие его низкой технологичности. Кроме того, указанным способом получают препарат, состоящий не из свободных, а из иммобилизованных клеток, и в описании отсутствуют примеры, подтверждающие их углеводородокисляющую активность, а также отсутствуют условия и сроки хранения получаемого препарата.

Известен способ получения препарата Авалон [1], в котором совместное выращивание микроорганизмов проводят на вспененном стеклообразном метафосфатном носителе. С этой целью проводят поверхностное культивирование на носителе при 20°С в течение 72-96 ч клеток Ps. fluorescens и Serratia marcescens, либо Serratia marcescens и Acidovorax delafieldii, полученных предварительным раздельным глубинным культивированием индивидуальных штаммов в течение 24-36 ч. Получают препарат с титром жизнеспособных клеток 10¹¹-10¹² кл/г препарата. Недостатком указанного способа является необходимость применения стерильного искусственного носителя и длительного поверхностного культивирования клеток на носителе, что характеризует способ как недостаточно технологичный.

Указанными выше способами получают нефтедеградирующие препараты, состоящие из иммобилизованных клеток, преимущество которых состоит в том, что они менее чувствительны к воздействию неблагоприятных условий. Недостаток иммобилизованных клеток заключается в том, что к таким клеткам затруднен доступ гидрофобных субстратов, в частности нефти и продуктов ее переработки.

Углеводородокисляющая активность биопрепаратов, предназначенных для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, определяется не только их составом, но во многом зависит также от товарной формы, в которой они предлагаются потребителю. Известные биопрепараты получают в виде суспензий, эмульсий, паст, порошков [2-11, 13, 14]. При этом каждая форма имеет свои достоинства и недостатки. В сухих биопрепаратах численность живых микроорганизмов обычно ниже, чем в суспензии или пасте [15], поскольку на отечественных заводах для получения сухих форм, в первую очередь немедицинских препаратов, как правило, практикуется распылительная сушка, которая считается менее энергоемкой и дешевой по сравнению с лиофилизацией, однако при этом существенно ухудшается качество биопрепаратов. Тем не менее, у сухих препаратов есть неоспоримое преимущество: они удобнее для транспортировки к местам их применения и имеют более длительный срок хранения. Учитывая низкую численность выживающих после распылительной сушки микроорганизмов, авторы сухих форм биопрепаратов рекомендуют перед применением проводить активацию микроорганизмов, входящих в их состав [4, 16]. Активация микроорганизмов в сухом препарате предполагает приготовление жидкой ростовой среды с биогенными элементами, внесение углеводорода как источника углерода, перемешивание и аэрацию в течение 12-24 часов, что не всегда возможно выполнить в полевых условиях [4, 16]. Жидкие и пастообразные препараты, в отличие от сухих форм, не требуют активации, и их используют в загрязненных местах, располагающихся недалеко от производства, поскольку срок хранения таких биопрепаратов при пониженной температуре [14], как правило, не превышает 2 месяцев, и их транспортирование на большие расстояния не целесообразно.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения биопрепарата Родер, основанный на культивировании R-форм штаммов Rhodococcus erythropolis BKM Ac-1514 D и Rhodococcus ruber BKM Ac-1513 D [8]. Однако этот способ получения препарата разработан, фактически, для лабораторных условий, т.к. биомассу R-форм родококков в возрасте 7-10 суток, выращенных на матрацах на агаризованной среде, предлагается использовать для приготовления биопрепарата. Причем используются для культивирования обедненные среды, содержащие нефть в качестве единственного источника углерода, что делает способ нетехнологичным. Для работы в условиях низкой минерализации загрязненных нефтью объектов входящие в состав препарата родококки предлагается выращивать в жидкой среде, в состав которой входит кукурузный экстракт и ферментолизат микробной биомассы (БВК) и предусматривается раздельное ведение культуры каждого штамма. Биопрепарат получают объединением раздельно полученной биомассы каждого из штаммов. Поэтому, несмотря на удовлетворительную биодеградирующую способность, сам процесс получения биопрепарата Родер согласно патенту [8] мало пригоден для наработки его в больших объемах и, соответственно, не позволяет применять его в природе в широких масштабах. Следует отметить также, что БВК в настоящее время нашей промышленностью практически не выпускается.

По этой причине появилась необходимость усовершенствования способа получения препарата Родер (Rhoder) с высокой нефтеокисляющей активностью в промышленных условиях для его широкого практического использования, что и является целью предлагаемого изобретения.

Штаммы родококков биопрепарата «Родер» обладают синергизмом в деградации углеводородов нефти. Так, Rhodococcus ruber BKM Ac-1513 D преимущественно активно расщепляет циклические и полициклические углеводороды, a Rhodococcus erythropolis BKM Ac-1514 D - расщепляет в первую очередь алифатические углеводороды. Однако не было априори известно, что совместное культивирование указанных штаммов приведет к высоким положительным результатам.

Существенными признаками изобретения являются:

1. подготовка лиофилизированных культур к рассеву,

2. проведение культивирования путем наращивания биомассы штаммов в начале раздельно, затем на последней стадии совместно в общем ферментере,

3. проведение концентрирования и стабилизации биомассы,

4. проведение необязательного высушивания.

Такой подход позволяет получить высокоактивный препарат в жидкой форме, или в виде концентрированной суспензии (пасты), или в сухой форме.

Технический результат изобретения заключается в разработке технологии, которая позволяет организовать процесс масштабированного получения бактериального препарата Родер с более высокой нефтеокисляющей активностью по сравнению с прототипом [8], сокращает время его получения без снижения эффективности и качественных характеристик. Это достигается тем, что на последней стадии получения препарата Родер, при наращивании биомассы штаммов R-форм Rhodococcus erythropolis BKM Ac-1514 D и Rhodococcus ruber BKM Ac-1513 D, осуществляется их совместное культивирование в общем ферментере на подобранной питательной среде, которая в качестве единственного источника углерода содержит глюкозу. При этом процесс ведут на питательной среде, содержащей в качестве источника азота и других органических веществ дрожжевой автолизат или рыбный гидролизат. Полученную в ферментере биомассу концентрируют, стабилизируют и необязательно высушивают. Разработанная технология обеспечивает ряд экономических и технических преимуществ при получении препарата, в том числе обеспечивает длительность сохранения высокой активности препарата при его хранении, без чего ни один препарат не может предназначаться для широкого использования.

Для получения активного препарата Родер отбирают на высокоминерализованной среде, содержащей нефть в качестве единственного источника углерода, отбирают наиболее активные R-формы штаммов-нефтедеструкторов Rhodococcus ruber BKM Ac-1513 D и Rhodococcus erythropolis BKM Ac-1514 D, обладающие синергизмом в деградации углеводородов нефти и способные прикрепляться к пленке нефти на разделе фаз нефть-вода благодаря липофильной клеточной стенке. Биомассу каждого штамма, полученную на твердой среде, индивидуально переносят в жидкие среды, указанные в табл.1.

Таблица 1 Состав питательных сред
Компоненты	Шифр среды, содержание компонентов г/л
Компоненты	I-БВК	II-РГ	III-ДАГ
Белково-витаминный концентрат	20,0	-	-
Рыбный гидролизат	-	20,0	-
Дрожжевой автолизат	-	-	75 мл
Кукурузный экстракт	10,0	-	-
Глюкоза	-	10,0	5,0
Na₂HPO₄×12H₂O	-	4,0	4,0
KH₂PO₄	-	1,0	1,0
NH₄Cl	-	2,0	2,0
MgSO₄	-	0,1	0,1
pH	6,8	6,8	7,1

Состав компонентов сред и их концентрации были специально подобраны. Питательные среды содержат органические источники углерода, азота, фосфора, а среды II РГ и III ДАГ содержат еще и минеральные элементы. Каждый штамм Rhodococcus ruber BKM Ac-1513 D и Rhodococcus erythropolis BKM Ac-1514 D культивируют индивидуально в колбах при перемешивании и аэрации на качалке при температуре не выше 29°С, т.к. при выращивании биомассы штаммов при температуре ниже 20°С или выше 29°С вырастают менее активные углеводород окисляющие клетки. Полученный посевной материал, каждый штамм индивидуально, вносят в ферментер-инокулятор со средой по составу иной или такой же, как применяемая в колбах, и культивируют при перемешивании и аэрации при температуре не ниже 20°С и не выше 29°С. Выращивают каждый штамм индивидуально в ферментерах-инокуляторах в соответствии с их физиологическими особенностями. Штамм Rhodococcus ruber BKM Ac-1513 D выращивают 30-36 часов, a Rhodococcus erythropolis BKM Ac-1514 D - 20-24 часа. Затем, на стадии получения препарата Родер, инокулят из двух ферментеров подают в один ферментер со средой того же состава, внося в качестве посевного материала штаммы в определенном соотношении (1,5:1), которое позволяет сократить срок совместного культивирования до 26-28 часов и получить клетки обоих штаммов с высокой углеводородокисляющей активностью и культуральную жидкость с конечным нейтральным значением pH, при этом процесс ведется в специально отработанном режиме подачи кислорода воздуха и перемешивания.

Биомассу, полученную совместным культивированием двух штаммов указанных родококков, концентрируют со стабилизаторами и используют как таковую или получают сухую форму препарата в щадящих условиях. Условия получения сухой формы препарата также были отработаны в соответствии с физиологическими особенностями штаммов. Возможность использования препарата Родер как в сухой, так и суспендированной форме является его достоинством, т.к. наиболее полно отвечает требованиям потребителей.

Преимущество совместного выращивания штаммов было показано экспериментально сначала в лабораторных, затем в заводских условиях. Как видно из результатов, представленных в табл.2, более высокая углеводородокисляющая активность наблюдалась у препарата, полученного при совместном культивировании родококков на всех исследуемых средах. На средах II-РГ и III-ДАГ при совместном культивировании штаммов получается pH культуральной жидкости более высокий - 7,3-7,5, чего не наблюдается при их раздельном выращивании и что является несомненным достоинством процесса. Совместное культивирование штаммов на последнем этапе позволяет упростить и удешевить процесс масштабированной (промышленной) наработки препарата, получить конечный продукт с более высоким титром углеводородокисляющих клеток и с нейтральным значением pH культуральной жидкости, полнее утилизировать (на 95-98%) основные компоненты питательной среды. Это свидетельствует о достижении технического результата при реализации данного способа промышленного получения препарата Родер.

Таблица 2. Характеристика концентрированной суспензии препарата Родер (Rhoder), полученной раздельным и совместным культивированием R. ruber Ac-1513 D и R. erythropolis Ac-1514 D

Среда	Культивирование	10⁸ КОЕ/мл		Сухая биомасса, г/л	Конечное значение РН
Среда	Культивирование	ГТ	УВО	Сухая биомасса, г/л	Конечное значение РН
I-БВК	Раздельное, вар.1	3,2-8,2	0,03-0,05	2,3	5,5
I-БВК	Совместное, вар.2	11	10	3,8	4,9
II-РГ	Раздельное, вар.1	1,9-2,8	1,8-2,5	3,7	6,4
II-РГ	Совместное, вар.2	65	10	5,3	7,3
III-ДАГ	Раздельное, вар.1	3,1-3,3	3,9-5,5	4,1	6,7
III-ДАГ	Совместное, вар.2	54	10	5,4	7,5

При концентрировании биомассы препарата Родер (Rhoder) сепарацией и стабилизации, а также в зависимости от состава питательной среды получают препарат с титром 10⁹-10¹² кл/мл. После высушивания биомассы при подобранных режимах, оптимальных для клеток родококков, получают препарат с титром углеводородокисляющих клеток 3,0-5,0×10¹¹ на 1 г сухого препарата. Добавка стабилизаторов позволяет до 18 месяцев сохранять высокую углеводородокисляющую активность бактериальных клеток сухой формы препарата, полученного предложенным способом, а препарат в виде концентрированной суспензии, полученной предложенным способом и замороженной при (-)20°С, не теряет углеводородокисляющую активность в течение двух лет хранения без промежуточного размораживания (1,5×10⁹ KOE/мл и 1,1×10⁹ KOE/мл, соответственно).

Без замораживания препарат в виде концентрированной суспензии, полученный предложенным способом, при комнатной температуре сохраняет углеводородокисляющую активность в течение 30 дней, а при температуре хранения от +4 до +8°С - до 2-х месяцев. На каждом этапе приготовления препарата Родер (Rhoder) контролируют жизнеспособность и углеводород окисляющую активность штаммов и препарата.

Готовый препарат Родер (Rhoder) представляет собой либо розовато-коричневатого цвета концентрат живых клеток штаммов, названных выше, и остатков питательной среды с защитным составом, расфасованный в пластиковые канистры от 1,0 л до 20 л, либо сухой порошок от светло-кремового до розовато-коричневатого цвета со специфическим запахом с массовой долей влаги от 3% до 10%, расфасованный в пакеты от 0,5 кг до 25 кг, которые позволяют сохранять его активность до 18 месяцев при температуре от +4°С до +8°С. При доступе кислорода и более высокой влажности сухой формы препарата срок его хранения уменьшается. Перед применением препарат в сухой форме или в виде концентрированной суспензии достаточно разбавить водой.

Бактериальный препарат, полученный указанным способом, в виде концентрированной суспензии и в виде порошка прошел испытания в пилотных и полевых условиях.

Следующие примеры иллюстрируют предлагаемый способ получения препарата Родер (Rhoder) и его качество.

Пример 1. Клетки каждого из штаммов со скошенного агара переносят в колбы со средой следующего состава: (г/л) Na₂CO₃ (безводный) 0,1, CaCl₂×6H₂O - 0,01, MnSO₄×5Н₂O - 0,02, MgSO₄×7H₂O - 0,2, Na₂HPO₄×12H₂O - 4.0, KH₂PO₄ - 1,0, NH₄Cl - 2,0, NaCl - 5,0, гексадекан - 20,0, вода дистиллированная до 1000 мл, рН 6,9-7,1 и культивируют на качалке при аэрации и температуре 27°С в течение 5-7 суток. Затем посевной материал, каждого штамма индивидуально, переносят в колбы Эрленмейера объемом 0,5 л с тремя средами (I-БВК, II-РГ, III-ДАГ), состав которых указан в табл.1. Следует отметить, что в таблице указаны оптимальные концентрации компонентов среды. При более низких концентрациях компонентов уменьшается выход препарата, а более высокие концентрации компонентов ведут к удорожанию процесса. Клетки штамма R. erythropolis Ac-1514 D культивируют в течение 24 ч, a R. ruber Ac-1513 D в течение 36 ч, оба при температуре 28°С, при аэрации и перемешивании. Затем посевной материал переносят в колбы объемом 1,0 л со средами того же состава и культивируют каждый штамм отдельно (вариант 1) или вместе (вариант 2) так, как описано выше. При совместном культивировании штаммов время ферментации сокращается до 28 ч. Культуральную жидкость, полученную при раздельном выращивании штаммов, объединяют (вариант 1) и концентрируют центрифугированием так же, как и культуральную жидкость после совместного выращивания (вариант 2). В концентратах (вариант 1 и 2) определяют количество KOE/мл (колонии образующих единиц) гетеротрофов (ГТ) и углеводородокисляющих бактерий (УВО), вес сухой биомассы и pH (табл.2). Как видно из представленных в табл.2 данных, при совместном культивировании штаммов титр углеводородокисляющих клеток выше на 1-2 порядка, чем при раздельном. При совместном культивировании штаммов выше значение pH культуральной жидкости, и выше на 32-65% плотность полученной биомассы.

Пример 2.

Посевной материал в колбах готовили так, как описано в примере 1, и переносили в ферментер объемом 16 л со средой I-БВК (табл.1) каждый штамм индивидуально. Культивирование проводили при температуре 28°С при аэрации и перемешивании. R. erythropolis Ac-1514 D культивировали в течение 28 ч, а R. ruber Ac-1513 D в течение 40 ч. Посевной материал из ферментеров объединяли в ферментер объемом 100 л со средой I-БВК и культивировали в течение 28 ч. Культуральную жидкость концентрировали методом ультрафильтрации, стабилизировали полиглюкином и лактозой, фасовали в канистры. Титр УВО клеток составлял 2,3×10⁹ в 1 мл. Препарат применяли для очистки водоема и болотистой почвы, аварийно загрязненной нефтью в Западной Сибири (табл.3).

Как видно из представленных данных, препарат Родер (Rhoder) в виде концентрированной суспензии за 3 обработки снизил концентрацию УВ в воде (водоем) на 96%, а на болотистой почве - на 94% в полевых испытаниях в Западной Сибири.

Таблица 3.
Применение препарата Родер (Rhoder), полученного по примеру 2 в виде концентрированной суспензии, для рекультивации водной поверхности и болотистой почвы, загрязненных аварийно разлитой нефтью
Объект	Площадь, м₂	Концентрация Углеводородов начальн. конечн.		Обработка Препаратом Родер (Rhoder)	Деградация, %
Урай: водоем болото	1900 2000	11,0 г/л 10,5 г/л	0,44 г/л 0,63 г/л	ПМС, дважды ПМС, дважды	96 94
Модель морского песчаного берега	Лабораторный эксперимент в кюветах	5,5 г/л	0,98 г/л	трижды	82%
Примечание: *ПМС - предварительный механический сбор свободной нефти

В лабораторном эксперименте, имитирующем морской песчаный берег, загрязненный сырой нефтью (кюветы с кварцевым песком, насыщенным водой с растворенной морской солью в концентрации 3%), трехкратное применение препарата Родер снизило концентрацию углеводородов нефти на 82%.

Пример 3. Посевной материал обоих штаммов выращивали в колбах на среде I-БВК. На среде такого же состава последующее культивирование осуществляли согласно примеру 2. Титр готового препарата составлял 1,8×10⁹ KOE/мл. Препарат применяли в пилотном эксперименте на почве (застарелое нефтяное загрязнение) в Урае (Западная Сибирь). Проводили очистку почвы, загрязненной нефтью с концентрацией углеводородов (УВ) 178,2 г/кг почвы с использованием препаратов Путидойл - сухой порошок, Деворойл - сухой порошок, который был получен при совместном культивировании микроорганизмов, его составляющих и принадлежащих к различным родам, препарат Никаойл - концентрированная суспензия и Родер (Rhoder) - концентрированная суспензия. Препараты готовили к работе так, как написано в инструкциях к каждому препарату. Наилучшие результаты были получены с препаратом Родер (Rhoder) (табл.4).

Таблица 4
Пилотные испытания углеводороддеградирующей способности препарата Родер (Rhoder) (концентрированная суспензия) в сравнении с другими препаратами
Место проведения эксперимента, загрязнитель	Варианты	Концентрация УВ, г/кг.		Степень очистки,	Численность УВО бактерий в почве, кл/г
		Начальн.	Конечн.	%	Начальн.	Конечн.
г.Урай Западная Сибирь, разлив нефти 20-летней давности	Родер (Rhoder)	178,2	59,5	67	9×10³	1,0×10⁸
	Путидойл	178,2	78,9	56	9×10³	1,0×10⁴
	Деворойл	178,2	127,2	29	9×10³	1,0×10⁵
	Никаойл-1	178,2	104,2	42	9×10³	1,0×10⁵
	Негативный контроль	153,0	130,0	15	5×10²	1,0×10³

Пример 4. Препарат готовили согласно примеру 3, но использовали среду II-РГ. Титр УВО клеток составлял 3,3×10¹² в 1 мл. Полученный препарат применяли для биорекультивации песчаной и торфянистой почвы, загрязненной аварийно разлитой нефтью, Республика Коми, Тимано-Печорская газонефтеносная провинция (табл.5). Погодные условия не всегда благоприятствовали процессу биоремедиации, тем не менее, в результате 2-3 обработок почв препаратом Родер (Rhoder) получили снижение углеводородного загрязнения на 21-75%.

Таблица 5.
Испытания углеводороддеградирующей способности препарата Родер (Rhoder) (концентрированная суспензия) на загрязненных нефтью почвах
№	Место проведения эксперимента, загрязнитель, количество обработок	Концентрация УВ, г/кг		Степень очистки,	УВО бактерии в почве, кл/г
		Начальн.	Конечн.	%	Начальн.	Конечн.
1	г.Усинск, Республика Коми, 2001-2003 г, разлив нефти 1996 г, песчаная почва, делянки 1×3 м²,обработка 2 раза	50,0-87,0	44,4-53,6	38,0-51,6	1,0×10⁷	9,7×10⁷
2	г.Усинск, Республика Коми, 2001-2003 г, разлив нефти 1994 г, торфяная почва, делянки 1×3 м², обработка 2 раза	786,0-911,0	224,6-612,9	75,4-32,8	6,0×10⁷	9,2×10⁸
3	Заполярный Круг, Республика Коми, 2002 г, разлив нефти 1994 г, снятие верхнего слоя загрязненного торфа, двукратное фрезерование, обработка 3 раза	458,0-738,0	253,0-451,0	21-51	3,8×10⁴	1,7×10⁸
	Состояние в 2004 г		77,6-398,2	30-66		7,9×10⁷

Пример 5. Препарат готовили в виде сухого порошка. Культивирование проводили аналогично примеру 3, но использовали среду III-ДАГ. Титр УВО клеток составлял 3,0×10¹¹ в 1 г сухого препарата. Полученный препарат применяли для очистки ливневых стоков от нефтепродуктов в г.Ступино Московской области, а также для биорекультивации нефтешлама, Китай, провинция Шаньдун (табл.6). Нефтешлам предварительно модифицировали для создания условий благоприятных для работы бактерий-деструкторов препарата Родер (Rhoder). Результаты, приведенные в табл.6, показывают, что препарат Родер (Rhoder) в сухой форме за один теплый сезон в ливневых стоках практически при постоянном подтоке нефтепродуктов снизил общую концентрацию УВ в воде на 50-60%. За три обработки нефтешлама препарат Родер снизил концентрацию УВ на 53-58%, тогда как альтернативный способ биорекультивации нефтешлама - компостирование - привел к снижению УВ в нефтешламе всего лишь на 31%.

Таблица 6.
Испытания углеводороддеградирующей способности препарата Родер (Rhoder) (сухая форма) на водной поверхности, загрязненной нефтью, и нефтешламе
№	Место проведения эксперимента, загрязнитель, количество обработок	Концентрация УВ		Степень очистки,	Численность УВО бактерий, кл/г.
		Начальн.	Конечн.	%	Начальн	Конечн.
1	г.Ступино, Московская обл., 1998 г, нефтепродукты, Ливневые стоки, 10 раз	0,02 г/л	0,01 г/л	50	не определяли	не определяли
2	г.Ступино, Московская обл., 2004 г, нефтепродукты, Ливневые стоки, 8 раз	0,05 г/л	0,02 г/л	60	не определяли	не определяли
3	г.Донгин, провинция Шаньдун, Китай, 2004 г, нефтешламы, 3 раза	101,4-126,8 г/кг	69,9-52,8 г/кг	53-58	1,0×10³	1,1×10⁸

Одно из достоинств сухой формы препарата-нефтедеструктора Родер (Rhoder), полученного описанным способом, это применение его вообще без предварительной активации, ввиду очень высокой численности жизнеспособных клеток - активных деструкторов углеводородов.

Источники информации

1. WO 01/98435 А2.

2. Патент РФ 2077397.

3. Патент РФ 20532054.

4. Патент РФ 2023686.

5. РСТ 93/00045.

6. Патент РФ 2053205.

7. А.с. СССР 1428809.

8. Патент РФ 2174496.

9. Патент РФ 2138451.

10. Патент РФ 2014286.

11. Патент РФ 2067993.

12. Патент РФ 2116145.

13. Патент РФ 2090697.

14. Патент РФ 2180276.

15. Патент РФ 2114071.

16. Патент РФ 2131851.

Claims

1. Способ получения бактериального препарата Родер для очистки почв, почвогрунтов, нефтешламов, пресных и минерализованных вод от нефти и нефтепродуктов, включающий культивирование штаммов Rhodococcus erythropolis BKM Ac-1514 D и Rhodococcus ruber BKM Ac-1513 D, отличающийся тем, что для наращивания биомассы осуществляют совместное культивирование указанных штаммов в общем ферментере на питательной среде, содержащей глюкозу в качестве источника углерода, затем проводят концентрирование и стабилизацию биомассы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют питательную среду, которая в качестве источника азота и других органических веществ содержит дрожжевой автолизат, или рыбный гидролизат, или кукурузный экстракт.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что совместное культивирование проводят предпочтительно при температуре 20-29°С.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют высушивание сконцентрированной биомассы.