RU2294962C2

RU2294962C2 - YdhL PROTEIN FROM Bacillus amyloliquefaciens, DNA FRAGMENT, BACTERIUM BELONGING TO GENUS Esherichia OR Bacillus AS PRODUCER OF PURINE NUCLEOSIDES, METHOD FOR PRODUCTION OF PURINE NUCLEOSIDES AND PURINE NUCLEOTIDES

Info

Publication number: RU2294962C2
Application number: RU2005104627/13A
Authority: RU
Inventors: Натали Павловна Закатаева (RU); Наталия Павловна Закатаева; Виталий Аркадьевич Лившиц (RU); Виталий Аркадьевич Лившиц; Сергей Викторович Гронский (RU); Сергей Викторович Гронский; Екатерина Александровна Кутукова (RU); Екатерина Александровна КУТУКОВА; Анна Евгеньевна Новикова (RU); Анна Евгеньевна Новикова; Юрий Иванович Козлов (RU); Юрий Иванович Козлов
Original assignee: Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ)
Priority date: 2005-02-22
Filing date: 2005-02-22
Publication date: 2007-03-10
Also published as: RU2005104627A

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: method for production of purine nucleosides and purine nucleotides, in particular 5'-inosinic acid is disclosed. Claimed method includes using of bacterium belonging to genus Esherichia or genus Bacillus. Production of purine nucleosides and purine nucleotides by said bacterium is increased due to increased activity of YdhL pritein. Also disclosed is amino acid sequence of YdhL pritein from Bacillus amyloliquefaciens and gene encoding thereof.

EFFECT: method for industry scale production of nucleosides and nucleotides.

25 cl, 2 dwg, 6 tbl, 9 ex

Description

Область техникиTechnical field

Настоящее изобретение относится к способу получения пуриновых нуклозидов, являющихся важным исходным материалом для синтеза 5'-инозиновой кислоты и 5'-гуаниловой кислоты. Настоящее изобретение также раскрывает новые микроорганизмы, используемые в указанном способе. Настоящее изобретение также раскрывает новые ДНК и виды белков, придающие бактерии, экспрессирующей новую ДНК, устойчивость к аналогам пуриновых оснований и к пуриновым нуклеозидам.The present invention relates to a method for producing purine nucleosides, which are an important starting material for the synthesis of 5'-inosinic acid and 5'-guanilic acid. The present invention also discloses new microorganisms used in the specified method. The present invention also discloses new DNA and types of proteins that confer on a bacterium expressing a new DNA resistance to purine base analogs and purine nucleosides.

Предшествующий уровень техникиState of the art

Традиционно, промышленное производство нуклеозидов, таких как инозин, осуществляется с помощью ферментации штаммов, ауксотрофных по аденину, или штаммов, которым сообщили устойчивость к ряду веществ, таких как аналоги пурина и сульфагуанидина. Примерами таких штаммов могут являться штаммы, принадлежащие к роду Bacillus (патент Японии №54-17033 (1979), 55-2956 (1980), и 55-45199 (1980) выложенная патентная заявка Японии №56-162998 (1981), патент Японии №57-14160 (1982) и 57-41915 (1982), и выложенная патентная заявка Японии №59-42895 (1984)), или роду Brevibacterium (патент Японии №51-5075 (1976) и 58-17592 (1972), и Agric. Biol. Chem, 42, 399 (1978)), или роду Escherichia (WO 9903988) и подобные им.Traditionally, the industrial production of nucleosides, such as inosine, is carried out by fermenting strains auxotrophic for adenine, or strains that have been reported to be resistant to a number of substances, such as purine and sulfaguanidine analogues. Examples of such strains can be strains belonging to the genus Bacillus (Japanese patent No. 54-17033 (1979), 55-2956 (1980), and 55-45199 (1980) Japanese patent application laid out No. 56-162998 (1981), Japan patent No. 57-14160 (1982) and 57-41915 (1982), and Japanese Patent Application Laid-Open No. 59-42895 (1984), or the Brevibacterium genus (Japanese Patent No. 51-5075 (1976) and 58-17592 (1972), and Agric. Biol. Chem, 42, 399 (1978)), or the genus Escherichia (WO 9903988) and the like.

Процесс конструирования таких мутантных штаммов обычно включает в себя мутагенез интересующих микроорганизмов посредством УФ излучения или обработкой нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин) и последующий отбор штамма с заданными характеристиками на соответствующей селективной среде. С другой стороны, для конструирования таких мутантных штаммов также применялись методы генной инженерии, при этом указанные штаммы принадлежали к роду Bacillus (выложенная патентная заявка Японии №58-158197 (1983), 58-175493 (1983), 59-28470 (1984), 60-156388 (1985), 1-27477 (1989), 1-174385 (1989), 3-58787 (1991), 3-164185 (1991), 5-84067 (1993) и 5-192164 (1993)), к роду Brevibacterium (выложенная патентная заявка Японии №63-248394 (1988)) или к роду Escherichia (WO 9903988).The process of constructing such mutant strains usually involves mutagenesis of the microorganisms of interest by UV radiation or by treatment with nitrosoguanidine (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) and subsequent selection of the strain with the desired characteristics on the appropriate selective medium. On the other hand, genetic engineering methods were also used to construct such mutant strains, while these strains belonged to the genus Bacillus (Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-158197 (1983), 58-175493 (1983), 59-28470 (1984), 60-156388 (1985), 1-27477 (1989), 1-174385 (1989), 3-58787 (1991), 3-164185 (1991), 5-84067 (1993) and 5-192164 (1993)), to the genus Brevibacterium (Japanese Patent Application Laid-Open No. 63-248394 (1988)) or to the genus Escherichia (WO 9903988).

Продуктивность таких штаммов-продуцентов инозина может быть в дальнейшем повышена за счет усиления способности штамма к экскреции инозина. На сегодняшний день общепринятым является тот факт, что прохождение метаболитов через цитоплазматическую клеточную мембрану обычно осуществляется благодаря специфичным эффлюксным белкам-транспортерам (Рао, S.S. et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62 (1), 1-34, (1998); Paulsen, I.T. et al., J. Mol. Biol, 277, 573-592 (1998); Saier, M.H. et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 257-279 (1999)). Авторы настоящего изобретения ранее показали, что штаммы-продуценты инозина или ксантозина, принадлежащие к родам Escherichia или Bacillus, а также обладающие повышенной активностью белка RhtA, кодируемого геном rhtA (ybiF), повышенной активностью белка YijE, кодируемого геном yijE, и повышенной активностью белка YdeD, кодируемого геном ydeD, продуцируют больше инозина или ксантозина, чем соответствующие родительские штаммы (патентные заявки России 2002101666, 2002104463 и 2002104464 соответственно). Недавно было обнаружено, что белок YdhL из В.subtilis снижает чувствительность бактериальных клеток к аналогу пурина - 2-флуороаденину. С другой стороны, существуют косвенные доказательства того, что белок YdhL понижает клеточный пул гипоксантина (Johansen et al., J. Bacteriol., 185, 5200-5209,2003). Однако не было показано эффекта влияния суперэкспрессии гена ydhL на экскрецию нуклеозидов и/или продукцию нуклеозидов.The productivity of such inosine producing strains can be further enhanced by enhancing the strain's ability to excrete inosine. Today, it is generally accepted that the passage of metabolites through the cytoplasmic cell membrane is usually carried out thanks to specific efflux transporter proteins (Rao, SS et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62 (1), 1-34, ( 1998); Paulsen, IT et al., J. Mol. Biol, 277, 573-592 (1998); Saier, MH et al., J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 257-279 (1999)). The authors of the present invention previously showed that the producing strains of inosine or xanthosine belonging to the genera Escherichia or Bacillus, as well as having increased activity of the RhtA protein encoded by the rhtA gene (ybiF), increased activity of the YijE protein encoded by the yijE gene, and increased activity of the YdeD protein encoded by the ydeD gene produce more inosine or xanthosine than the corresponding parent strains (Russian patent applications 2002101666, 2002104463 and 2002104464, respectively). Recently, it was found that the YdhL protein from B. subtilis reduces the sensitivity of bacterial cells to a purine analog, 2-fluoroadenine. On the other hand, there is indirect evidence that the YdhL protein lowers the hypoxanthine cell pool (Johansen et al., J. Bacteriol. 185, 5200-5209,2003). However, the effect of overexpression of the ydhL gene on the excretion of nucleosides and / or nucleoside production has not been shown.

Более того, не существует публикаций ни о белке YdhL из Bacillus amyloliquefaciens, ни о влиянии суперэкспрессии ydhL на экскрецию нуклеозидов и/или продукцию нуклеозидов.Moreover, there are no publications either on the YdhL protein from Bacillus amyloliquefaciens, nor on the effect of overexpression of ydhL on nucleoside excretion and / or nucleoside production.

Краткое описание чертежей.A brief description of the drawings.

На Фиг.1 изображено сравнение белка YdhL из В.amyloliquefaciens (ydhL_B.am), кодируемого фрагментом ДНК, входящего в состав плазмиды pYDHL4, и белка YdhL из В.subtilis (ydhL_Bac.su), кодируемого фрагментом ДНК, входящего в состав плазмиды pYDHLFigure 1 shows a comparison of YdhL protein from B. amyloliquefaciens (ydhL_B.am) encoded by a DNA fragment contained in plasmid pYDHL4 and YdhL protein from B. subtilis (ydhL_Bac.su) encoded by a DNA fragment contained in plasmid pYDHL

На Фиг.2 изображена структура плазмиды pMWMX1.Figure 2 shows the structure of plasmid pMWMX1.

Описание изобретенияDescription of the invention

Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности штаммов-продуцентов инозина, а также предоставление способа получения инозина и 5'-инозиновой кислоты с использованием указанных штаммов. Эта цель была достигнута путем идентификации того факта, что ген ydhL из В.subtilis, кодирующий гипотетический мембранный белок, сообщает устойчивость к аналогам пуриновых оснований, таким как 8-азааденин, 6-метилпурин, 2,6-диаминопурин, 6-меркаптопурин, 8-азагуанин, и пуриновым нуклеозидам, таким как инозин и гуанозин, в случае, когда природная аллель указанного гена, клонированная на низкокопийном векторе, вводится в штамм Е.coli. Также был выделен ранее неизвестный ген ydhL из Bacillus amyloliquefaciens, и определена его нуклеотидная последовательность. Далее было установлено, что ген ydhL из Bacillus subtilis или Bacillus amyloliquefaciens может повысить продукцию нуклеозидов, когда дополнительные копии указанного гена введены в клетки соответствующего штамма-продуцента инозина, принадлежащего к роду Bacillus или роду Escherichia. Таким образом было совершено настоящее изобретение.The aim of the present invention is to increase the productivity of strains producing inosine, as well as providing a method for producing inosine and 5'-inosinic acid using these strains. This goal was achieved by identifying the fact that the ydhL gene from B. subtilis encoding a hypothetical membrane protein reports resistance to purine base analogues such as 8-azaadenine, 6-methylpurine, 2,6-diaminopurine, 6-mercaptopurine, 8 α-azaguanine, and purine nucleosides, such as inosine and guanosine, when the natural allele of the indicated gene, cloned on a low copy vector, is introduced into the E. coli strain. A previously unknown ydhL gene from Bacillus amyloliquefaciens was also isolated and its nucleotide sequence determined. It was further established that the ydhL gene from Bacillus subtilis or Bacillus amyloliquefaciens can increase nucleoside production when additional copies of this gene are introduced into the cells of the corresponding inosine producer strain belonging to the genus Bacillus or the genus Escherichia. Thus, the present invention has been completed.

Следовательно, настоящее изобретение предоставляет микроорганизм, принадлежащий к роду Bacillus или роду Escherichia и обладающий способностью к продукции инозина.Therefore, the present invention provides a microorganism belonging to the genus Bacillus or the genus Escherichia and having the ability to produce inosine.

Целью настоящего изобретения является предоставление белка YdhL из Bacillus amyloliquefaciens, выбранного из группы, состоящей из следующих белков:An object of the present invention is to provide a YdhL protein from Bacillus amyloliquefaciens selected from the group consisting of the following proteins:

(А) белок, включающий последовательность аминокислот, приведенную в списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO:2); и(A) a protein comprising the amino acid sequence shown in the sequence listing under number 2 (SEQ ID NO: 2); and

(В) белок, включающий последовательность аминокислот, содержащую делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательности аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO:2), и который обладает активностью придавать бактерии, принадлежащей к роду Bacillus или к роду Escherichia, устойчивость к пурину, выбранному из группы, состоящей из аналогов основания, инозина и гуанозина, когда указанная активность указанного белка в указанной бактерии повышена.(B) a protein comprising an amino acid sequence containing deletions, substitutions, insertions or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence listed in the sequence number 2 (SEQ ID NO: 2), and which has the activity of imparting bacteria belonging to the genus Bacillus or to the genus Escherichia, resistance to purine selected from the group consisting of analogues of the base, inosine and guanosine, when the specified activity of the specified protein in the specified bacteria is increased.

Также целью настоящего изобретения является предоставление ДНК, кодирующей описанный выше белок.It is also an object of the present invention to provide DNA encoding a protein as described above.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии, принадлежащей к роду Bacillus или к роду Escherichia, при этом указанная бактерия обладает способностью к продукции пуринового нуклеозида, и указанная бактерия обладает повышенной активностью белка, выбранного из группы, состоящей из (А) белка, кодируемого геном ydhL из Bacillus amyloliquefaciens, (В) белка, кодируемого геном ydhL из Bacillus subtilis, и (С) белка, кодируемого ортологом любого из указанных генов ydhL, описанных в пункте (А) или (В).It is also an object of the present invention to provide a bacterium belonging to the genus Bacillus or to the genus Escherichia, wherein said bacterium is capable of producing a purine nucleoside, and said bacterium has increased activity of a protein selected from the group consisting of (A) a protein encoded by the ydhL gene from Bacillus amyloliquefaciens, (B) a protein encoded by the ydhL gene from Bacillus subtilis, and (C) a protein encoded by the ortholog of any of these ydhL genes described in (A) or (B).

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, где пуриновым нуклеозидом является инозин или гуанозин.It is also an object of the present invention to provide the bacteria described above, wherein the purine nucleoside is inosine or guanosine.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой активность указанного белка повышена путем трансформации указанной бактерии с помощью ДНК, кодирующей данный белок, или путем изменения нуклеотидной последовательности, контролирующей экспрессию вышеупомянутой ДНК в хромосоме указанной бактерии.It is also an object of the present invention to provide a bacterium as described above in which the activity of said protein is enhanced by transforming said bacterium using DNA encoding the given protein, or by changing the nucleotide sequence controlling the expression of said DNA on the chromosome of said bacterium.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанной выше бактерии, в которой трансформация осуществлена в составе низкокопийного вектора.Another objective of the present invention is the provision of the bacteria described above, in which the transformation is carried out as part of a low copy vector.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа продукции пуриновых нуклеозидов, включающего в себя выращивание описанной выше бактерии в питательной среде, позволяющее накапливать в указанной питательной среде указанные пуриновые нуклеозиды, и выделение из культуральной жидкости указанных пуриновых нуклеозидов.It is also an object of the present invention to provide a method for producing purine nucleosides, comprising growing the above-described bacteria in a culture medium, allowing to accumulate said purine nucleosides in said culture medium, and isolating said purine nucleosides from the culture fluid.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором пуриновым нуклеозидом является инозин, ксантозин или гуанозин.It is also an object of the present invention to provide a process as described above, wherein the purine nucleoside is inosine, xanthosine or guanosine.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором указанная бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия генов пути биосинтеза пуриновых нуклеозидов усилена.It is also an object of the present invention to provide a method as described above, wherein said bacterium is modified in such a way that expression of genes of the purine nucleoside biosynthesis pathway is enhanced.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа продукции пуриновых нуклеотидов, включающего в себя стадии выращивания описанной выше бактерии в питательной среде, позволяющего накапливать в питательной среде указанные пуриновые нуклеотиды, фосфорилирования пуриновых нуклеозидов и выделения пуриновых нуклеотидов.Another objective of the present invention is the provision of a method for the production of purine nucleotides, which includes the steps of growing the above bacteria in a nutrient medium, which allows the accumulation of these purine nucleotides in the nutrient medium, phosphorylation of purine nucleosides, and isolation of purine nucleotides.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором пуриновым нуклеотидом является 5'-инозиновая кислота, 5'-ксантозиновая кислота или 5'-гуаниловая кислота.It is also an object of the present invention to provide a process as described above, wherein the purine nucleotide is 5'-inosinic acid, 5'-xanthosinic acid or 5'-guanilic acid.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором пуриновым нуклеотидом является инозиновая кислота.It is also an object of the present invention to provide the method described above, in which the purine nucleotide is inosinic acid.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором указанная бактерия модифицирована таким образом, что экспрессия генов пути биосинтеза пуриновых нуклеотидов усилена.It is also an object of the present invention to provide the method described above, wherein said bacterium is modified in such a way that expression of genes of the purine nucleotide biosynthesis pathway is enhanced.

Настоящее изобретение более детально будет описано ниже.The present invention will be described in more detail below.

Наилучший способ осуществления изобретения.The best way of carrying out the invention.

I. Белки согласно настоящему изобретению.I. Proteins according to the present invention.

Белки согласно настоящему изобретению включают в себя белок, аминокислотная последовательность которого приведена в списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO:2), и белок, аминокислотная последовательность которого содержит делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательности аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO:2), и который обладает активностью, придающей бактерии, принадлежащей к роду Bacillus или к роду Escherichia, устойчивость к аналогам пуринового основания или к пуриновым нуклеозидам, таким как инозин и гуанозин.Proteins according to the present invention include a protein whose amino acid sequence is listed in the sequence number 2 (SEQ ID NO: 2), and a protein whose amino acid sequence contains deletions, substitutions, insertions or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence shown in the sequence list under number 2 (SEQ ID NO: 2), and which has activity that confers bacteria belonging to the genus Bacillus or to the genus Escherichia, resistance to analogues of the purine base or purine nucleosides, such as inosine and guanosine.

Белком, аминокислотная последовательность которого приведена в списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO:2), является белок YdhL из Bacillus amyloliquefaciens. Аминокислотная последовательность указанного белка и нуклеотидная последовательность гена ydhL были неизвестны до настоящей публикации.The protein whose amino acid sequence is listed in sequence number 2 (SEQ ID NO: 2) is YdhL protein from Bacillus amyloliquefaciens. The amino acid sequence of this protein and the nucleotide sequence of the ydhL gene were unknown before this publication.

Белок YdhL из Bacillus subtilis не участвует в пути биосинтезапуриновых нуклеотидов и принадлежит к суперсемейству транспортных белков Major Facilitator Superfamily (Pao, S.S., et al, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (I): 1-32, (1998)) и к группе ортологов кластера пермеазы эффлюкса арабинозы (COG) 2814 (Tatusov, R.L. et al, Nucleic Acids Res., 29: 22-28 (2001)). Другие белки Е.coli, принадлежащие к этому семейству - AraJ и YdeA, также участвуют в экспорте арабинозы (Bost, S. et al, J. Bacteriol, 181: 2185-2191 (1999)). Геном Bacillus subtilis содержит еще 5 генов, кодирующих гомологи гена: ydhL: ybcL, yceJ, yfhI, ytbD, ywfA. Белок YdhL из В.subtilis - это высокогидрофобный белок с неизвестной функцией, состоящий из 388 аминокислот и содержащий 12 гипотетических трансмембранных сегментов. Белок YdhL кодируется геном ydhL. Ген ydhL из Bacillus subtilis subsp. subtilis str.168 (номера нуклеотидов с 624675 по 625838 в последовательности с инвентарным номером NC_000913.1 в GenBank; GL32468705) расположен на хромосоме между генами ydhK и ydhM в положении 53.50°.The YdhL protein from Bacillus subtilis is not involved in the biosynthesis of purine nucleotides and belongs to the superfamily of transport proteins Major Facilitator Superfamily (Pao, SS, et al, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (I): 1-32, (1998)) and to the group of orthologs of the arabinose efflux permease cluster (COG) 2814 (Tatusov, RL et al, Nucleic Acids Res., 29: 22-28 (2001)). Other E. coli proteins belonging to this family, AraJ and YdeA, are also involved in the export of arabinose (Bost, S. et al, J. Bacteriol, 181: 2185-2191 (1999)). The Bacillus subtilis genome contains 5 more genes encoding the gene homologs: ydhL: ybcL, yceJ, yfhI, ytbD, ywfA. Protein YdhL from B. subtilis is a highly hydrophobic protein with unknown function, consisting of 388 amino acids and containing 12 hypothetical transmembrane segments. The YdhL protein is encoded by the ydhL gene. The ydhL gene from Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 (nucleotide numbers 624675 to 625838 in sequence with accession number NC_000913.1 in GenBank; GL32468705) is located on the chromosome between the ydhK and ydhM genes at position 53.50 °.

Количество «нескольких» аминокислот, которое может быть увеличено в белках согласно настоящему изобретению, различается в зависимости от положения и/или типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Это количество может составлять от 2 до 40, предпочтительно от 2 до 20 и более предпочтительно от 2 до 5 для белка, приведенного под номером 2 (SEQ ID No. 2). Этот факт объясняется тем, что некоторые аминокислоты обладают высокой гомологией друг к другу и различия между такими аминокислотами не оказывает существенного влияния на трехмерную структуру белка и его активность. Таким образом, белком, аминокислотная последовательность которого содержит делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательности аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO:2), может являться белок, имеющий гомологию не меньшую, чем от 30% до 50%, предпочтительно от 50% до 70% и наиболее предпочтительно от 70% до 90% по отношению к общему количеству аминокислотных остатков, входящих в состав белка YdhL, и сохраняющий активность указанного белка.The amount of “several” amino acids that can be increased in the proteins of the present invention varies depending on the position and / or type of amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein. This amount can be from 2 to 40, preferably from 2 to 20, and more preferably from 2 to 5 for the protein shown under number 2 (SEQ ID No. 2). This fact is explained by the fact that some amino acids have high homology to each other and the differences between such amino acids do not significantly affect the three-dimensional structure of the protein and its activity. Thus, a protein whose amino acid sequence contains deletions, substitutions, insertions or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence shown in the list of sequences under number 2 (SEQ ID NO: 2), can be a protein having a homology of not less than 30% to 50%, preferably from 50% to 70%, and most preferably from 70% to 90% with respect to the total number of amino acid residues that make up the YdhL protein, and which retains the activity of the specified protein.

Белок, обладающий гомологией как минимум 90%, более предпочтительно гомологией как минимум в 95%, еще более предпочтительно гомологией как минимум в 98% к белку, представленному в списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO:2), и сохраняющий активность белка YdhL, является белком согласно настоящему изобретению и наиболее предпочтителен.A protein having a homology of at least 90%, more preferably a homology of at least 95%, even more preferably a homology of at least 98% of the protein shown in sequence listing number 2 (SEQ ID NO: 2), and retaining the activity of the YdhL protein is a protein according to the present invention and is most preferred.

Для оценки степени гомологии между ДНК возможно использование нескольких способов расчета, таких как BLAST search, FASTA search и CrustalW.Several methods of calculation, such as BLAST search, FASTA search, and CrustalW, can be used to assess the degree of homology between DNA.

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) это самообучающийся алгоритм поиска, используемый программами BLASTP, BLASTN, BLASTX, MEGABLAST, TBLASTN и TBLASTX; эти программы оценивают значимость найденных результатов с использованием статистических методов Karlin, Samuel и Stephen F. Altschul ("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-7). Способ поиска FASTA описан W. R. Pearson ("Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 1990 183:63-98). Способ ClustalW описан у Thompson J.D., Higgins D.G. и Gibson T.J. ("CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res. 1994, 22:4673-4680).BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) is a self-learning search algorithm used by BLASTP, BLASTN, BLASTX, MEGABLAST, TBLASTN and TBLASTX; these programs evaluate the significance of the results using statistical methods Karlin, Samuel and Stephen F. Altschul ("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87 : 2264-68; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 5873-7). The FASTA search method is described by W. R. Pearson ("Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 1990 183: 63-98). The ClustalW method is described by Thompson J.D., Higgins D.G. and Gibson T.J. ("CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res. 1994, 22: 4673-4680).

Термин "активность" по отношению к белкам согласно настоящему изобретению обозначает, что указанный белок, находясь в бактерии, придает этой бактерии устойчивость к аналогам пуринового основания, таким как 8-азааденин, 2,6-диаминопурин, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, и устойчивость к нуклеозидам, таким как инозин и гуанозин.The term "activity" in relation to the proteins according to the present invention means that the protein, when in a bacterium, confers resistance to purine base analogues such as 8-azaadenine, 2,6-diaminopurin, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, and resistance to nucleosides such as inosine and guanosine.

Фраза "повышает устойчивость к аналогам пуринового основания и к пуриновым нуклеозидам" означает способность бактерии расти на минимальной среде, содержащей аналоги пуринового основания, такие как 8-азааденин, 6-метилпурин, 2,6-диаминопурин, 6-меркаптопурин, 8-азагуанин, или пуриновые нуклеозиды, такие как инозин и гуанозин, в концентрациях, при которых природный или родительский штамм не смог бы расти в тех же условиях, или способность бактерии быстрее расти на среде, содержащей аналоги пуринового основания или пуриновые нуклеозиды, по сравнению с природным или родительским штаммом указанной бактерии. Вышеупомянутые концентрации аналогов пуринового основания составляют 300 μг/мл для 8-азааденина; 400 μг/мл в случае 2,6-диаминопурина; 400 μг/мл для 6-меркаптопурина; и для пуриновых нуклеозидов эти концентрации составляют 300 μг/мл, предпочтительно 1000 μг/мл для инозина и 10 μг/мл для гуанозина.The phrase "increases resistance to purine base analogs and to purine nucleosides" means the ability of a bacterium to grow on a minimal medium containing purine base analogues such as 8-azaadenine, 6-methylpurine, 2,6-diaminopurine, 6-mercaptopurine, 8-azaguanine, or purine nucleosides, such as inosine and guanosine, in concentrations at which the natural or parental strain could not grow under the same conditions, or the ability of a bacterium to grow faster on a medium containing purine base analogues or purine nucleosides, as eniyu with natural or parental strain of the bacterium. The above concentrations of purine base analogs are 300 μg / ml for 8-azaadenine; 400 μg / ml in case of 2,6-diaminopurine; 400 μg / ml for 6-mercaptopurine; and for purine nucleosides, these concentrations are 300 μg / ml, preferably 1000 μg / ml for inosine and 10 μg / ml for guanosine.

II. Бактерия согласно настоящему изобретению.II. The bacterium according to the present invention.

Бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, в которой продукция пуриновых нуклеозидов указанной бактерией повышена за счет повышения активности указанного белка. Более конкретно, бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, где продукция пуриновых нуклеозидов указанной бактерией повышена за счет повышения активности белка согласно настоящему изобретению в этой бактерии. Еще более конкретно, бактерия согласно настоящему изобретению содержит ДНК гена ydhL или его ортолог в хромосоме или на плазмиде. ДНК гена ydhL или его ортолог суперэкспрессируются, и в результате указанная бактерия способна продуцировать большие количества пуриновых нуклеозидов.A bacterium according to the present invention is a bacterium in which the production of purine nucleosides by said bacterium is increased by increasing the activity of said protein. More specifically, the bacterium of the present invention is a bacterium, where the production of purine nucleosides by said bacterium is increased by increasing the activity of the protein of the present invention in this bacterium. Even more specifically, the bacterium of the present invention contains the ydhL gene DNA or its ortholog on the chromosome or plasmid. The DNA of the ydhL gene or its ortholog is overexpressed, and as a result, this bacterium is capable of producing large quantities of purine nucleosides.

Бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, принадлежащая к любому из родов Bacillus или Escherichia. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, который может быть использован в настоящем изобретении, можно привести Escherichia coli (Е.coli). Примеры микроорганизмов, принадлежащих к роду Bacillus, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают в себя Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168 (В.subtilis 168) или Bacillus amyloliquefaciens (В.amyloliquefaciens).A bacterium according to the present invention is a bacterium belonging to any of the genera Bacillus or Escherichia. As an example of a microorganism belonging to the genus Escherichia, which can be used in the present invention, Escherichia coli (E. coli) can be cited. Examples of microorganisms belonging to the genus Bacillus that can be used in the present invention include Bacillus subtilis subsp.subtilis str. 168 (B. subtilis 168) or Bacillus amyloliquefaciens (B. amyloliquefaciens).

Примеры бактерий, принадлежащих к роду Bacillus, также включают в себя следующие микроорганизмы:Examples of bacteria belonging to the genus Bacillus also include the following microorganisms:

Bacillus licheniformis;Bacillus licheniformis;

Bacillus pumilis;Bacillus pumilis;

Bacillus megaterium;Bacillus megaterium;

Bacillus brevis;Bacillus brevis;

Bacillus polymixa;Bacillus polymixa;

Bacillus stearothermophilus.Bacillus stearothermophilus.

В дополнение к уже упомянутым характеристикам бактерия согласно настоящему изобретению может обладать другими специфическими особенностями, такими как потребность в различных питательных веществах, устойчивость к антибиотикам, чувствительность к антибиотикам и зависимость от антибиотиков, не выходя при этом за рамки настоящего изобретения.In addition to the characteristics already mentioned, the bacterium according to the present invention may have other specific features, such as the need for various nutrients, antibiotic resistance, antibiotic sensitivity and antibiotic dependence, without departing from the scope of the present invention.

Используемый здесь термин "пуриновый нуклеозид" включает в себя инозин, ксантозин, гуанозин и аденозин, предпочтительно инозин.As used herein, the term “purine nucleoside” includes inosine, xanthosine, guanosine and adenosine, preferably inosine.

Используемый здесь термин "способность к продукции пуринового нуклеозида", обозначает способность к продукции и к накоплению пуринового нуклеозида в культуральной жидкости. Термин "обладающий способностью к продукции пурина" обозначает, что микроорганизм, принадлежащий к роду Escherichia или Bacillus, способен продуцировать и вызывать накопление пуринов, таких как пуриновые нуклеозиды, в культуральной жидкости в количествах бóльших, чем природные штаммы Е.coli, такие как штаммы Е.coli W3110 и MG1655, или природные штаммы В.subtilis, такие как В.subtilis 168. Предпочтительно этот термин обозначает, что указанный микроорганизм способен продуцировать и вызывать накопление в культуральной жидкости инозина, ксантозина, гуанозина и/или аденозина в концентрациях не менее чем 10 мг/л; более предпочтительно в концентрациях не менее чем 50 мг/л.As used herein, the term “ability to produce a purine nucleoside” refers to the ability to produce and accumulate a purine nucleoside in a culture fluid. The term "capable of producing purine" means that a microorganism belonging to the genus Escherichia or Bacillus is able to produce and cause the accumulation of purines, such as purine nucleosides, in the culture fluid in quantities greater than natural E. coli strains, such as strains E .coli W3110 and MG1655, or natural B. subtilis strains, such as B. subtilis 168. Preferably, this term means that the microorganism is capable of producing and causing the accumulation of inosine, xanthosine, guanosine and / or adenosis in the culture fluid ina in concentrations of not less than 10 mg / l; more preferably in concentrations of not less than 50 mg / L.

Используемый здесь термин также означает, что если в бактерии активность белка согласно настоящему изобретению повышена, то повышено количество молекул белка в пересчете на клетку или повышена активность самой молекулы белка.The term used here also means that if in a bacterium the activity of a protein according to the present invention is increased, then the number of protein molecules in terms of a cell is increased or the activity of the protein molecule itself is increased.

Термин "ген-ортолог" или "ортолог" обозначает ген из одного вида микроорганизма, соответствующий гену из другого вида, при этом оба эти гена являются родственными, поскольку имеют общего предка (ген-гомолог), но в процессе эволюции стали отличаться между собой в разных видах организмов. Гены-ортологи могут кодировать белки, обладающие одной или разными функциями. Если известны полные нуклеотидные последовательности хромосом организмов, для поиска ортологов может быть использован следующий алгоритм. Поиск с использованием BLAST проводится таким образом, что для гена из одного организма ищется лучший гомолог в другом организме. Затем проводится второй, обратный поиск BLAST, в котором для лучшего гомолога из другого организма, найденного на первом этапе поиска BLAST, находится лучший гомолог в первом организме. Если ген, для которого ищется гомолог на первом этапе поиска, совпадает с геном, найденным на втором этапе поиска, то ген из первого организма и его лучший гомолог в другом организме являются ортологами. Также в процессе поиска BLAST определяется степень гомологии белков, кодируемых найденными генами.The term “ortholog gene” or “ortholog” means a gene from one species of a microorganism corresponding to a gene from another species, both genes being related because they have a common ancestor (homolog gene), but in the process of evolution they began to differ from each other in different types of organisms. Ortholog genes can encode proteins that have one or different functions. If the complete nucleotide sequences of the chromosomes of organisms are known, the following algorithm can be used to search for orthologs. A search using BLAST is conducted in such a way that for a gene from one organism, the best homologue in another organism is searched. Then a second, reverse BLAST search is performed, in which, for the best homolog from another organism found in the first stage of the BLAST search, the best homolog in the first organism is found. If the gene for which the homologue is searched in the first stage of the search matches the gene found in the second stage of the search, then the gene from the first organism and its best homolog in another organism are orthologs. Also, in the BLAST search process, the degree of homology of the proteins encoded by the found genes is determined.

Для целей настоящего изобретения белки, кодируемые генами-ортологами, являются гомологичными белками и обладают одинаковой функцией. Поиск таких генов ортологов производится путем определения сиквенса этих генов и белков, кодируемых этими генами, а также функциями этих белков (смотри, например. Фиг.1 и Пример 2).For the purposes of the present invention, proteins encoded by ortholog genes are homologous proteins and have the same function. The search for such ortholog genes is carried out by determining the sequence of these genes and proteins encoded by these genes, as well as the functions of these proteins (see, for example. Figure 1 and Example 2).

Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего белок YdhL из Bacillus amyloliquefaciens, была определена авторами настоящего изобретения (SEQ ID NO:1). Нуклеотидная последовательность гена, кодирующего белок YdhL из Bacillus subtilis, ген ydhL из Bacillus subtilis subsp. subtilis str.168 (номера нуклеотидов с 13042 по 14208 в базе данных EMBL, инвентарный номер последовательности - Z99107) (SEQ ID NO:3) известен. Ген ydhL из Bacillus subtilis расположен на хромосоме между генами ydhK a ydhM в положении 53.50°. Следовательно, вышеупомянутые гены ydhL могут быть синтезированы с помощью ПЦР (полимеразная цепная реакция; по White, T.J. et al., Trends Genet., 5,185 (1989)) с использованием праймеров, полученных на основе нуклеотидной последовательности целевого гена. Гены, кодирующие белок YdhL в других микроорганизмах, могут быть получены аналогичным способом (смотри Пример 2).The nucleotide sequence of the gene encoding the YdhL protein from Bacillus amyloliquefaciens was determined by the authors of the present invention (SEQ ID NO: 1). The nucleotide sequence of the gene encoding the YdhL protein from Bacillus subtilis, the ydhL gene from Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 (nucleotide numbers 13042 to 14208 in the EMBL database, sequence accession number is Z99107) (SEQ ID NO: 3) is known. The ydhL gene from Bacillus subtilis is located on the chromosome between the ydhK and ydhM genes at position 53.50 °. Therefore, the aforementioned ydhL genes can be synthesized by PCR (polymerase chain reaction; according to White, T.J. et al., Trends Genet., 5.185 (1989)) using primers derived from the nucleotide sequence of the target gene. Genes encoding YdhL protein in other microorganisms can be obtained in a similar way (see Example 2).

Примером гена ydhL, полученного из Bacillus amyloliquefaciens, также может служить фрагмент ДНК, который кодирует белки согласно настоящему изобретению, такие как белок с аминокислотной последовательностью, приведенной под номером 2 (SEQ ID NO:2) и/или белок с аминокислотной последовательностью, включающей в себя делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательности аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 2 (SEQ ID NO:2), и который обладает активностью, придающей бактерии, принадлежащей к роду Bacillus или к роду Escherichia, устойчивость к аналогам пуриновых оснований, инозину и гуанозину, при этом активность указанного белка в указанной бактерии повышена.An example of a ydhL gene derived from Bacillus amyloliquefaciens can also be a DNA fragment that encodes the proteins of the present invention, such as a protein with the amino acid sequence shown under number 2 (SEQ ID NO: 2) and / or a protein with an amino acid sequence including deletion, substitution, insertion, or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence shown in the sequence list under number 2 (SEQ ID NO: 2), and which has activity that imparts a bacterium belonging to the genus Bacill us or to the genus Escherichia, resistance to analogues of purine bases, inosine and guanosine, while the activity of the specified protein in the specified bacteria is increased.

Ген ydhL, полученный из Bacillus subtilis, также может быть представлен ДНК, которая кодирует белки согласно настоящему изобретению, такие как белок с аминокислотной последовательностью, приведенной под номером 4 (SEQ ID NO:4) и/или белок с аминокислотной последовательностью, включающей в себя делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в последовательности аминокислот, приведенной в списке последовательностей под номером 4 (SEQ ID NO:4), и который обладает активностью придавать бактерии, принадлежащей к роду Bacillus или к роду Escherichia, устойчивость к аналогам пуриновых оснований, инозину и гуанозину.The ydhL gene obtained from Bacillus subtilis can also be represented by DNA that encodes the proteins of the present invention, such as a protein with the amino acid sequence shown at number 4 (SEQ ID NO: 4) and / or a protein with an amino acid sequence including deletions, substitutions, insertions or addition of one or more amino acids in the amino acid sequence shown in the sequence list under number 4 (SEQ ID NO: 4), and which has the activity of imparting bacteria belonging to the genus Bacillus or to the genus Escherich ia, resistance to analogues of purine bases, inosine and guanosine.

ДНК, кодирующие практически такие же белки, как описанные выше белки YdhL, могут быть получены, например, путем модификации соответствующей нуклеотидной последовательности с использованием сайт-направленного мутагенеза таким образом, что один или несколько аминокислотных остатков будут удалены, заменены, введены или добавлены. Модифицированная подобным образом ДНК может быть получена традиционными методами, вызывающими мутации. К подобного рода обработкам относятся обработка in vitro ДНК, кодирующей белки согласно настоящему изобретению, с помощью гидроксиламина, или обработка бактерии, содержащей указанную ДНК, с помощью УФ излучения или химического реагента, такого как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин или азотистая кислота.DNAs encoding substantially the same proteins as the YdhL proteins described above can be obtained, for example, by modifying the corresponding nucleotide sequence using site-directed mutagenesis so that one or more amino acid residues are deleted, replaced, introduced or added. DNA modified in this way can be obtained by traditional methods that cause mutations. Such treatments include in vitro treatment of the DNA encoding the proteins of the present invention with hydroxylamine, or treatment of a bacterium containing said DNA with UV radiation or a chemical reagent such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine or nitrous acid.

ДНК, кодирующая практически такой же белок, как белок YdhL, выделенный из Bacillus amyloliquefaciens, может быть обнаружена путем экспрессии указанной ДНК, содержащей описанные выше мутации, в подходящей для этой цели клетке и изучения активности всех экспрессируемых продуктов. ДНК, кодирующая практически такой же белок, как белок YdhL, может быть получена путем выделения ДНК из мутантной ДНК, кодирующей белок YdhL, или из клетки, которая содержит мутантную ДНК, при этом указанная ДНК гибридизуется с используемой в качестве зонда ДНК, содержащей нуклеотидную последовательность, приведенную под номером 1 (SEQ ID NO:1), в жестких условиях и кодирует белок, обладающий активностью белка YdhL. Термин «жесткие условия», упомянутый здесь, означает условия, при которых образуются так называемые специфические гибриды, а неспецифические - не образуются. Трудно четко описать такие условия в каких-либо численных выражениях. Тем не менее, например, к жестким условиям относятся условия, при которых гибридизуются ДНК, обладающие высокой степенью гомологии, к примеру ДНК, обладающие гомологией не менее 50% относительно друг друга, но ДНК, обладающие гомологией менее 50% относительно друг друга, не гибридизуются. С другой стороны, примером жестких условий являются условия, при которых ДНК гибридизуются друг с другом, при концентрации солей, соответствующей стандартным условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS при 60°С. Продолжительность отмывки зависит от вида фильтра, используемого для блоттинга, и, как правило, рекомендована изготовителем. Например, рекомендованная продолжительность отмывки нейлонового фильтра Hybond™ N+(Amersham) в жестких условиях составляет 15 минут.DNA encoding substantially the same protein as the YdhL protein isolated from Bacillus amyloliquefaciens can be detected by expressing said DNA containing the mutations described above in a cell suitable for this purpose and studying the activity of all expressed products. DNA encoding almost the same protein as YdhL protein can be obtained by isolating DNA from a mutant DNA encoding a YdhL protein or from a cell that contains mutant DNA, while the DNA hybridizes with the DNA containing the nucleotide sequence used as a probe shown under number 1 (SEQ ID NO: 1), in stringent conditions, and encodes a protein having the activity of the protein YdhL. The term "stringent conditions", mentioned here, means the conditions under which the so-called specific hybrids are formed, and non-specific ones are not formed. It is difficult to clearly describe such conditions in any numerical terms. Nevertheless, for example, stringent conditions include conditions under which DNAs with a high degree of homology hybridize, for example, DNAs that have a homology of at least 50% relative to each other, but DNAs that have a homology of less than 50% relative to each other do not hybridize . On the other hand, an example of stringent conditions is the conditions under which DNA hybridizes with each other, at a salt concentration that meets standard washing conditions for Southern hybridization, for example 1 × SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 × SSC, 0.1% SDS at 60 ° C. The duration of washing depends on the type of filter used for blotting, and is usually recommended by the manufacturer. For example, the recommended washing time for a Hybond ™ N + nylon filter (Amersham) under harsh conditions is 15 minutes.

Часть нуклеотидной последовательности, приведенной под номером 1 (SEQ ID NO:1), также может быть использована в качестве зонда. Зонды могут быть получены с помощью ПЦР, с использованием праймеров, синтезированных на основе нуклеотидной последовательности, приведенной под номером 1 (SEQ ID NO:1), и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность, приведенную под номером 1 (SEQ ID NO:1), в качестве матрицы. Когда фрагмент ДНК, длина которого составляет примерно 300 п.о., используется в качестве зонда, то условия отмывки при гибридизации могут быть следующими, например: 50°С, 2×SSC и 0.1% SDS.Part of the nucleotide sequence shown under number 1 (SEQ ID NO: 1) can also be used as a probe. Probes can be obtained by PCR using primers synthesized based on the nucleotide sequence shown under number 1 (SEQ ID NO: 1) and a DNA fragment containing the nucleotide sequence shown under number 1 (SEQ ID NO: 1), as a matrix. When a DNA fragment with a length of about 300 bp is used as a probe, the washing conditions during hybridization can be as follows, for example: 50 ° C, 2 × SSC and 0.1% SDS.

Все, описанное выше, применимо к белку YdhL, полученному из Bacillus subtilis.Everything described above applies to the YdhL protein derived from Bacillus subtilis.

Способы повышения активности белка согласно настоящему изобретению и, прежде всего, способы повышения количества молекул указанного белка в бактериальной клетке, включают в себя: изменение последовательности, регулирующей экспрессию ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, и увеличение количества копий гена, но не ограничиваются ими.Methods for increasing the activity of a protein according to the present invention, and especially methods for increasing the number of molecules of a specified protein in a bacterial cell, include, but are not limited to changing the sequence that regulates the expression of the DNA encoding the protein of the present invention and increasing the number of copies of the gene.

Изменение последовательности, регулирующей экспрессию ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, может быть достигнуто помещением ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, под контроль сильного промотора. В качестве сильных промоторов известны lac промотор, trp промотор, trc промотор, P_L промотор фага лямбда. Кроме того, промотор может быть усилен, например, введением мутации в последовательность промотора для повышения уровня транскрипции гена, расположенного за промотором. Более того, уровень трансляции мРНК может быть повышен за счет введения мутации в спейсерный участок между сайтом связывания рибосомы (RBS) и старт-кодоном. Например, была обнаружена 20-кратная разница в уровне экспрессии гена, в зависимости от состава последовательности из трех нуклеотидов, находящихся перед старт-кодоном (Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629, 1984).A change in the sequence that regulates the expression of the DNA encoding the protein of the present invention can be achieved by placing the DNA encoding the protein of the present invention under the control of a strong promoter. Lac promoter, trp promoter, trc promoter, P _L lambda phage promoter are known as strong promoters. In addition, the promoter can be enhanced, for example, by introducing a mutation in the sequence of the promoter to increase the level of transcription of the gene located behind the promoter. Moreover, the level of translation of mRNA can be increased by introducing a mutation into the spacer region between the ribosome binding site (RBS) and the start codon. For example, a 20-fold difference in the level of gene expression was found, depending on the composition of the sequence of the three nucleotides in front of the start codon (Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629, 1984).

Кроме того, для повышения уровня транскрипции указанного гена, в хромосому может быть введен энхансер. Введение в хромосому ДНК, содержащей либо ген, либо промотор, описано, например, в выложенной патентной заявке Японии №1-215280 (1989).In addition, to increase the level of transcription of the specified gene, an enhancer can be introduced into the chromosome. Introduction to the chromosome of DNA containing either a gene or a promoter is described, for example, in Japanese Patent Laid-open No. 1-215280 (1989).

Также количество копий указанного гена может быть увеличено благодаря клонированию указанного гена на векторах разной копийности с образованием рекомбинантной ДНК, которой затем трансформируют целевой микроорганизм. Более предпочтительно использование низкокопийных векторов. Примерами низкокопийных векторов являются, но не ограничиватся ими, векторы pSC101, pMW118, pMW119 и подобные им. Термин "низкокопийный вектор" используется для обозначения векторов, количество копий которых на клетку не превышает 5. Способы трансформации включают в себя все возможные способы, известные специалисту в данной области. Например, опубликован способ обработки клеток-реципиентов Escherichia coli К-12 хлоридом кальция для повышения проницаемости клеточных стенок для ДНК (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. BioL, 53, 159 (1970)).Also, the number of copies of the specified gene can be increased due to the cloning of the specified gene on vectors of different copy numbers with the formation of recombinant DNA, which then transform the target microorganism. More preferably, low copy vectors are used. Examples of low copy vectors are, but are not limited to, the vectors pSC101, pMW118, pMW119 and the like. The term "low copy vector" is used to denote vectors whose number of copies per cell does not exceed 5. Transformation methods include all possible methods known to one skilled in the art. For example, a method has been published for treating recipient cells of Escherichia coli K-12 with calcium chloride to increase the permeability of cell walls for DNA (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. BioL, 53, 159 (1970)).

Усиление экспрессии гена может также быть достигнуто путем введения нескольких копий гена в бактериальную хромосому, например, методом гомологичной рекомбинации, Mu интеграцией или подобными им. К примеру, один цикл Mu интеграции позволяет ввести в бактериальную хромосому до 3-х копий указанного гена.Enhanced gene expression can also be achieved by introducing several copies of the gene into the bacterial chromosome, for example, by homologous recombination, Mu integration, or the like. For example, one Mu integration cycle allows up to 3 copies of the indicated gene to be introduced into the bacterial chromosome.

Описанные выше способы, основанные на использовании сильного промотора или энхансера, могут быть совмещены со способами, основанными на увеличении числа копий гена или усилении экспрессии указанного гена.The methods described above based on the use of a strong promoter or enhancer can be combined with methods based on increasing the number of copies of a gene or enhancing the expression of a specified gene.

В настоящем изобретении могут быть использованы традиционные методы получения хромосомной ДНК, гибридизации, ПЦР, получения плазмидной ДНК, разрезания и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве праймеров и подобные им. Эти методы описаны, например, в книге Sambrook, J., and Russell D., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) и подобным ей.Conventional chromosomal DNA production methods, hybridization, PCR, plasmid DNA production, DNA cutting and ligation, transformation, selection of oligonucleotides as primers and the like can be used in the present invention. These methods are described, for example, in Sambrook, J., and Russell D., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) and the like.

Для конструирования микроорганизма, принадлежащего к роду Bacillus, обладающего повышенной экспрессией указанного гена или генов, кодирующего(их) белок или белки согласно настоящему изобртению, необходимые области указанного гена или генов могут быть получены с помощью ПЦР, синтезированные, в первую очередь, на основе доступной информации о генах В.subtilis. Например, ген ydhL, возможно являющийся геном, кодирующим транспортный белок, может быть клонирован из хромосомной ДНК штаммов В.subtilis с помощью ПЦР. Хромосомная ДНК, используемая для этой цели, может быть получена из любого другого штамма В.subtilis.To construct a microorganism belonging to the genus Bacillus, with increased expression of the specified gene or genes encoding the protein or proteins according to the present invention, the necessary regions of the specified gene or genes can be obtained by PCR, synthesized primarily on the basis of available information about the genes of B. subtilis. For example, the ydhL gene, possibly a gene encoding a transport protein, can be cloned from the chromosomal DNA of B. subtilis strains using PCR. The chromosomal DNA used for this purpose can be obtained from any other strain of B. subtilis.

Белок согласно настоящему изобретению включает в себя также мутанты и варианты белка YdhL, которые существуют ввиду природного разнообразия, а также гомологичные белку YdhL белки, которые могут быть получены из различных штаммов бактерий, при условии, что эти белки-мутанты, варианты и гомологи обладают функциональными характеристиками белка YdhL, а именно придают клетке устойчивость к аналогам пуриновых оснований, инозину или гуанозину.The protein according to the present invention also includes mutants and variants of the YdhL protein, which exist due to natural diversity, as well as proteins homologous to the YdhL protein, which can be obtained from various strains of bacteria, provided that these mutant proteins, variants and homologs have functional characteristics of the YdhL protein, namely, give the cell resistance to purine base analogs, inosine or guanosine.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения описанной выше ДНК, кодирующей белки согласно настоящему изобретению, в бактерию, обладающей наследуемой способностью к продукции пуриновых нуклеозидов, таких как инозин. Кроме того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей указанные ДНК, способности к продукции пуриновых нуклеозидов, таких как инозин.The bacterium of the present invention can be obtained by introducing the above-described DNA encoding the proteins of the present invention into a bacterium having an inherited ability to produce purine nucleosides, such as inosine. In addition, the bacterium of the present invention can be obtained by imparting to a bacterium already containing said DNA the ability to produce purine nucleosides, such as inosine.

Примером родительского штамма, принадлежащего к роду Bacillus, который мог быть использован в настоящем изобретении, может являться штамм В.subtilis KMBS16-1. Этот штамм является производным штамма-продуцента инозина В.subtilis KMBS16, в котором мутация purA::erm была заменена на мутацию purA::cat. В свою очередь, штамм В.subtilis KMBS 16 является производным от известного штамма В.subtilis trpC2, несущего мутации в гене purA, кодирующем сукцинил-АМФ синтазу (purA::erm), в гене purR, кодирующем пуриновый репрессор (purR::spc), и в гене deoD, кодирующем фосфорилазу пуриновых нуклеозидов (deoD::kan) (патентная заявка России 2002101666). Также примеры родительских штаммов, принадлежащих к роду Bacillus, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают в себя штамм В.subtilis АЛ 2707 (FERM Р-12951) (патентная заявка Японии JP6113876А2), штамм В.subtilis AJ3772 (FERM P-2555) (патентная заявка Японии JP62014794A2) и подобные им.An example of a parent strain belonging to the genus Bacillus, which could be used in the present invention, can be a strain of B. subtilis KMBS16-1. This strain is a derivative of the inosine producer strain B. subtilis KMBS16, in which the purA :: erm mutation has been replaced by the purA :: cat mutation. In turn, the strain B. subtilis KMBS 16 is derived from the known strain B. subtilis trpC2 carrying mutations in the purA gene encoding the succinyl AMP synthase (purA :: erm) in the purR gene encoding the purine repressor (purR :: spc ), and in the deoD gene encoding purine nucleoside phosphorylase (deoD :: kan) (Russian patent application 2002101666). Also examples of parental strains belonging to the genus Bacillus that can be used in the present invention include B. subtilis strain AL 2707 (FERM P-12951) (Japanese Patent Application JP6113876A2), B. subtilis strain AJ3772 (FERM P-2555 ) (Japanese Patent Application JP62014794A2) and the like.

Примером штамма-продуцента инозина, принадлежего к виду Е.coli, является FADRaddedd (pMWKQ). Этот штамм является производным от известного штамма W3110, несущего мутации в гене purF, кодирующем PRPP амидотрансферазу, в гене purr, кодирующем пуриновый репрессор, в гене deoD, кодирующем фосфорилазу пуриновых нуклеозидов, в гене purA, кодирующем кодирующем сукцинил-АМФ синтазу, в гене add, кодирующем аденозиндеаминазу, в гене edd, кодирующем 6-фосфоглюконатдегидразу (WO 9903988), и содержит плазмиду pMWKQ, несущую ген purFKQ, кодирующий PRPP амидотрансферазу, и является нечувствительным к ГМФ (WO 9903988).An example of an inosine producer strain belonging to the E. coli species is FADRaddedd (pMWKQ). This strain is derived from the known strain W3110 carrying mutations in the purF gene encoding the PRPP amidotransferase, in the purr gene encoding the purine repressor, in the deoD gene encoding the purine nucleoside phosphorylase, in the purA gene encoding the add succinyl syn AMP encoding gene encoding adenosine deaminase in the edd gene encoding 6-phosphogluconate dehydrase (WO 9903988) and contains the plasmid pMWKQ carrying the purFKQ gene encoding PRPP amidotransferase and is insensitive to GMF (WO 9903988).

Для увеличения удельной активности молекулы белка у белка согласно настоящему изобретению также возможно введение мутации в структурный ген, кодирующий указанный белок, для повышения активности данного белка. Для введения мутации в ген могут быть использованы: сайт-специфический мутагенез (Kramer, W. and Frits, H.J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)), рекомбинантная ПЦР (PCR Technology, Stockton Press (1989)), химический синтез определенной части ДНК, обработка целевого гена гидроксиламином, обработка штаммов микроорганизмов, содержащих целевой ген, УФ излучением или химическим реагентом, таким как нитрозогуанидин или азотистая кислота и подобные им. Микроорганизмы, в которых активность указанного белка повышена, могут быть отобраны по росту на минимальной среде, содержащей 8-азааденин, или 6-метилпурин, или 2,6-диаминопурин, или 6-меркаптопурин, или 8-азагуанин, или инозин в концентрациях, указанных в Таблице 1 (смотри ниже).To increase the specific activity of a protein molecule in a protein according to the present invention, it is also possible to introduce a mutation into the structural gene encoding the specified protein to increase the activity of this protein. The following can be used to introduce mutations into the gene: site-specific mutagenesis (Kramer, W. and Frits, HJ, Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)), recombinant PCR (PCR Technology, Stockton Press (1989)), chemical synthesis a certain part of the DNA, treating the target gene with hydroxylamine, treating the microorganism strains containing the target gene with UV radiation or a chemical reagent such as nitrosoguanidine or nitrous acid and the like. Microorganisms in which the activity of this protein is increased can be selected by growth on minimal medium containing 8-azaadenine, or 6-methylpurine, or 2,6-diaminopurin, or 6-mercaptopurine, or 8-azaguanine, or inosine in concentrations, listed in Table 1 (see below).

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть в дальнейшем модифицирована таким образом, что экспрессия одного или нескольких генов, участвующих в биосинтезе пуринов, будет усилена. Такие гены могут быть представлены pur регулоном из Е.coli (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996). Был описан штамм-продуцент инозина Е.coli, содержащий мутантный ген purF, кодирующий PRPP амидотрансферазу, не подверженную ингибированию АДФ и ГМФ по принципу обратной связи, и инактивированный ген purR, кодирующий репрессор системы биосинтеза пуриновых нуклеотидов (WO 9903988).The bacterium according to the present invention can be further modified so that the expression of one or more genes involved in the purine biosynthesis is enhanced. Such genes may be represented by a pur regulon from E. coli (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996). An E. coli inosine producer strain containing a mutant purF gene encoding a PRPP amidotransferase not susceptible to feedback inhibition of ADP and GMF and an inactivated purR gene encoding a repressor of the purine nucleotide biosynthesis system (WO 9903988) have been described.

III. Способ получения пуриновых нуклеозидов.III. A method of obtaining purine nucleosides.

К способу согласно настоящему изобретению относится способ продукции пуриновых нуклеозидов, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, позволяющего указанной бактерии продуцировать и накапливать пуриновые нуклеозиды, и сбора пуриновых нуклеозидов из культуральной жидкости. Далее, к способу согласно настоящему изобретению относится способ продукции инозина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, позволяющего указанной бактерии продуцировать и накапливать инозин, и сбора инозина из культуральной жидкости. Далее, к способу согласно настоящему изобретению относится способ продукции ксантозина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, позволяющего указанной бактерии продуцировать и накапливать ксантозин, и сбора ксантозина из культуральной жидкости. Далее, к способу согласно настоящему изобретению относится способ продукции гуанозина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, позволяющего указанной бактерии продуцировать и накапливать гуанозин, и сбора гуанозина из культуральной жидкости.A method according to the present invention relates to a method for producing purine nucleosides, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a nutrient medium allowing said bacteria to produce and accumulate purine nucleosides, and collecting purine nucleosides from the culture fluid. Further, a method according to the present invention relates to a method for producing inosine, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a nutrient medium allowing said bacteria to produce and accumulate inosine, and collecting inosine from the culture fluid. Further, a method according to the present invention relates to a method for producing xanthosine, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a nutrient medium allowing said bacterium to produce and accumulate xanthosine, and collecting xanthosine from the culture fluid. Further, a method according to the present invention relates to a method for producing guanosine, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a nutrient medium allowing said bacteria to produce and accumulate guanosine and collecting guanosine from the culture fluid.

Согласно настоящему изобретению выращивание, сбор и очистка пуриновых нуклеозидов из культуральной или подобной ей жидкости могут быть осуществлены способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых пуриновые нуклеозиды продуцируются с использованием микроорганизма. Питательная среда, используемая для получения пуриновых нуклеозидов, может быть традиционной питательной средой, содержащей источники углерода, азота, неорганические ионы и другие необходимые органические вещества. В качестве источников углерода могут быть использованы различные сахара, такие как глюкоза, лактоза, сахароза, галактоза, фруктоза, арабиноза, мальтоза, ксилоза, трегалоза, рибоза и гидролизаты крахмала;According to the present invention, the cultivation, collection and purification of purine nucleosides from a culture or similar liquid can be carried out in a manner similar to traditional fermentation methods in which purine nucleosides are produced using a microorganism. The nutrient medium used to obtain purine nucleosides may be a traditional nutrient medium containing sources of carbon, nitrogen, inorganic ions and other necessary organic substances. Various sugars can be used as carbon sources, such as glucose, lactose, sucrose, galactose, fructose, arabinose, maltose, xylose, trehalose, ribose and starch hydrolysates;

спирты, такие как глицерин, маннитол и сорбитол; органические кислоты, такие как глюконовая кислота, фумаровая кислота, лимонная кислота и янтарная кислота, и подобные им.alcohols such as glycerin, mannitol and sorbitol; organic acids such as gluconic acid, fumaric acid, citric acid and succinic acid, and the like.

В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как сульфат аммония, хлорид аммония и фосфат аммония, и органические соединения азота, такие как гидролизат соевых бобов, газобразный аммиак и раствор аммиака в воде, и подобные им. Желательно, чтобы в питательную среду входили в необходимых количествах в качестве следовых питательных веществ витамины, такие как витамин В1, необходимые вещества, например нуклеиновые кислоты, такие как аденин и РНК, или дрожжевой экстракт или подобные им. Кроме указанных компонентов, при необходимости, в питательную среду могут быть добавлены небольшие количества фосфата калия, сульфата магния, ионы железа и ионы марганца.As the nitrogen source, various inorganic ammonium salts, such as ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate, and organic nitrogen compounds, such as soybean hydrolyzate, gaseous ammonia, and a solution of ammonia in water, and the like, can be used. Preferably, vitamins such as vitamin B1, essential substances, such as nucleic acids, such as adenine and RNA, or yeast extract or the like, are included in the nutrient medium in the required amounts as trace nutrients. In addition to these components, if necessary, small amounts of potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ions and manganese ions can be added to the nutrient medium.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, от 16 до 72 часов, при поддерживаемой температуре культивирования от 30 до 45°С и рН питательной среды находится в пределах от 5 до 8. рН среды может регулироваться различными органическими и неорганическими кислотами, основаниями и в том числе газообразным аммиаком.The cultivation is preferably carried out under aerobic conditions, from 16 to 72 hours, at a maintained cultivation temperature of 30 to 45 ° C and the pH of the nutrient medium is in the range from 5 to 8. The pH of the medium can be regulated by various organic and inorganic acids, bases, including gaseous ammonia.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем целевой пуриновый нуклеозид может быть получен из культуральной жидкости любым из традиционных методов или любой их комбинацией, таких как метод ионообменной хроматографии и высушивания.After growth, solid residues, such as cells, can be removed from the culture fluid by centrifugation or filtration through a membrane, and then the target purine nucleoside can be obtained from the culture fluid by any of the traditional methods or any combination thereof, such as ion exchange chromatography and drying.

IV. Способ получения пуриновых нуклеотидов.IV. A method of obtaining purine nucleotides.

К способу согласно настоящему изобретению относится способ продукции пуриновых нуклеотидов, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, позволяющего указанной бактерии продуцировать и накапливать пуриновые нуклеозиды в культуральной жидкости, фосфорилирования полученного пуринового нуклеозида, и сбора пуринового нуклеотида. Далее, к способу согласно настоящему изобретению относится способ продукции 5'-инозиновой кислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, позволяющего указанной бактерии продуцировать и накапливать 5'-инозиновую кислоту в культуральной жидкости, фосфорилирования полученной 5'-инозиновой кислоты, и сбора 5'-инозиновой кислоты. Далее, к способу согласно настоящему изобретению относится способ продукции 5'-ксантиловой кислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, позволяющего указанной бактерии продуцировать и накапливать ксантозин в культуральной жидкости, фосфорилирования ксантозина, и сбора 5'-ксантиловой кислоты. Далее, к способу согласно настоящему изобретению относится способ продукции 5'-гуаниловой кислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, позволяющего указанной бактерии продуцировать и накапливать гуанозин в культуральной жидкости, фосфорилирования гуанозина, и сбора 5'-гуаниловой кислоты. Также к способу согласно настоящему изобретению относится способ продукции 5'-гуаниловой кислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, позволяющего указанной бактерии продуцировать и накапливать ксантозин в культуральной жидкости, фосфорилирования ксантозина, аминирования 5'-ксантиловой кислоты и сбора 5'-гуаниловой кислоты.A method according to the present invention relates to a method for producing purine nucleotides, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a nutrient medium allowing said bacterium to produce and accumulate purine nucleosides in a culture fluid, phosphorylation of the resulting purine nucleoside, and collecting the purine nucleotide. Further, a method according to the present invention relates to a method for producing 5'-inosinic acid, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a nutrient medium, allowing said bacteria to produce and accumulate 5'-inosinic acid in a culture fluid, phosphorylation of the obtained 5'-inosinic acid, and collecting 5'-inosinic acid. Further, a method according to the present invention relates to a method for producing 5'-xanthyl acid, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a nutrient medium allowing said bacterium to produce and accumulate xanthosine in a culture fluid, xanthosine phosphorylation, and collecting 5'-xanthyl acid. Further, a method according to the present invention relates to a method for producing 5'-guanilic acid, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a nutrient medium allowing said bacterium to produce and accumulate guanosine in a culture fluid, guanosine phosphorylation, and collecting 5'-guanilic acid. The method according to the present invention also relates to a method for producing 5'-guanilic acid, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a nutrient medium, allowing said bacterium to produce and accumulate xanthosine in the culture fluid, xanthosine phosphorylation, amination of 5'-xanthyl acid and 5 ' -guanilic acid.

Согласно настоящему изобретению выращивание, сбор и очистка инозина из культуральной или подобной ей жидкости могут быть осуществлены способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых инозин продуцируется с использованием микроорганизма. Далее, согласно настоящему изобретению стадии фосфорилирования инозина, позволяющие указанной бактерии выделять 5'-инозиновую кислоту в культуральную жидкость, и сбора 5'-инозиновой кислоты могут быть осуществлены способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых пуриновые нуклеотиды, такие как 5'-инозиновую кислоту получают из пуриновых нуклеозидов, таких как инозин.According to the present invention, the cultivation, collection and purification of inosine from a culture or similar liquid can be carried out in a manner similar to traditional fermentation methods in which inosine is produced using a microorganism. Further, according to the present invention, inosine phosphorylation steps allowing said bacteria to secrete 5'-inosinic acid into the culture fluid and collecting 5'-inosinic acid can be carried out in a manner similar to traditional fermentation methods in which purine nucleotides such as 5'-inosine acid is derived from purine nucleosides, such as inosine.

Фосфорилирование пуриновых нуклеозидов может быть осуществлено ферментативно, с использованием различных фосфатаз, нуклеозидных киназ или нуклеозидных фосфотрансфераз; или химически, с использованием фосфорилирующих агентов, таких как РОС1з или подобные ему. Может быть использована фосфатаза, способная катализировать селективный перенос фосфорной группы пирофосфата на С-5'-позицию нуклеозидов (Mihara et. al., Phosphorylation of nucleosides by the mutated acid phosphatase from Morganella morganii. Appl. Environ. Microbiol., 66:2811-2816 (2000)) или кислотная фосфатаза, использующая в качестве донора фосфорной кислоты полифосфорную кислоту (соли), фенилфосфорную кислоту (соли) или карбамил фосфорную кислоту (соли) (WO 9637603A1) или подобные им. Также примером фосфатазы является фосфатаза, которая способна к катализу реакции переноса фосфорной группы на С-2', 3', или 5'-позиции нуклеозида с р-нитрофенилфосфата (Mitsugi, К., et al, Agric. Biol. Chem., 28, 586-600 (1964)), с неорганического фосфата (выложенная патентная заявка Японии JP42-1186) или ацетилфосфата (выложенная патентная заявка Японии JP61-41555) в качестве донора, или подобные ей. Также примером нуклеотидной киназы является гуанозин/инозин киназа из Е.coli (Mori, H. et. al. Cloning of a guanosine-inosine kinase gene of Escherichia coli and characterization of the purified gene product. J. Bacteriol. 177:4921-4926 (1995); WO 9108286) или подобные ей. Также примером нуклеозидной фосфотрансферазы являются нуклеозидные фосфотрансферазы, описанные у Hammer-Jespersen, К. (Nucleoside catabolism, p.203-258. In A Munch-Petesen (ed.), Metabolism ofnucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganism. 1980, Academic Press, New York) или подобные им. Химическое фосфорилирование нуклеозидов может осуществляться при помощи фосфорилирующего агента, такого как POCl₃ (Yoshikawa, К. et. al. Studies of phosphorylation. III. Selective phosphorylation of unprotected nucleosides. Bull. Chem. Soc. Jpn. 42:3505-3508 (1969)) или подобного ему.Phosphorylation of purine nucleosides can be carried out enzymatically using various phosphatases, nucleoside kinases or nucleoside phosphotransferases; or chemically, using phosphorylating agents such as POCl3 or the like. A phosphatase capable of catalyzing the selective transfer of the phosphorus group of the pyrophosphate to the C-5 ′ position of nucleosides can be used (Mihara et. Al., Phosphorylation of nucleosides by the mutated acid phosphatase from Morganella morganii. Appl. Environ. Microbiol., 66: 2811- 2816 (2000)) or acid phosphatase using as phosphoric acid donor polyphosphoric acid (salts), phenylphosphoric acid (salts) or carbamyl phosphoric acid (salts) (WO 9637603A1) or the like. Another example of a phosphatase is phosphatase, which is capable of catalysing the phosphorus group transfer reaction to the C-2 ′, 3 ′, or 5 ′ position of a nucleoside from p-nitrophenyl phosphate (Mitsugi, K., et al, Agric. Biol. Chem., 28 , 586-600 (1964)), with an inorganic phosphate (Japanese Patent Laid-Open Patent Application JP42-1186) or acetyl phosphate (Japanese Patent Laid-open Patent Application JP61-41555) as a donor, or the like. An example of a nucleotide kinase is guanosine / inosine kinase from E. coli (Mori, H. et. Al. Cloning of a guanosine-inosine kinase gene of Escherichia coli and characterization of the purified gene product. J. Bacteriol. 177: 4921-4926 (1995); WO 9108286) or the like. Also an example of nucleoside phosphotransferase are nucleoside phosphotransferases described by Hammer-Jespersen, K. (Nucleoside catabolism, p.203-258. In A Munch-Petesen (ed.), Metabolism ofnucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganism. 1980, Academic Press , New York) or the like. Chemical phosphorylation of nucleosides can be carried out using a phosphorylating agent such as POCl ₃ (Yoshikawa, K. et. Al. Studies of phosphorylation. III. Selective phosphorylation of unprotected nucleosides. Bull. Chem. Soc. Jpn. 42: 3505-3508 (1969 )) or the like.

Аминирование 5'-ксантиловой кислоты может осуществляться ферментативно, с использованием, например, ГМФ синтетазы из Е.coli (Fujio et. al. High level of expression of XMP aminase in Escherichia coli and its application for the industrial production of 5'-guanylic acid. Biosci. Biotech. Biochem. 1997,61:840-845; EP 0251489 B1).Amination of 5'-xanthyl acid can be carried out enzymatically using, for example, GMF synthetase from E. coli (Fujio et. Al. High level of expression of XMP aminase in Escherichia coli and its application for the industrial production of 5'-guanylic acid Biosci. Biotech. Biochem. 1997.61: 840-845; EP 0251489 B1).

ПримерыExamples

Более детально настоящее изобретение будет разъяснено ниже со ссылкой на следующие Примеры, не ограничивающие область применения настоящего изобретения.In more detail, the present invention will be explained below with reference to the following Examples, not limiting the scope of the present invention.

Пример 1. Клонирование гена ydhL из В.subtilis.Example 1. Cloning of the ydhL gene from B. subtilis.

Полная нуклеотидная последовательность генома штамма В.subtilis subsp.subtilis 168 определена (Kunst et al., Nature 390, 249-256 (1997)). На основе заявленной нуклеотидной последовательности были синтезированы праймеры ydhL_N (SEQ ID No. 5) и ydhL_C (SEQ ID NO:6), которые в дальнейшем использовались для амплификации гена ydhL из В.subtilis с помощью ПЦР. Праймер ydhL_N комплементарен нуклеотидной последовательности с 489 до 467 п.о. перед старт кодоном гена ydhL и содержит введенный в 5'-конец сайт узнавания рестриктазы Sail. Праймер ydhL_C комплементарен нуклеотидной последовательности с 58 по 80 п.о. после стоп кодона гена ydhL и содержит введенный в 5'-конец сайт узнавания рестриктазы BglII.The complete nucleotide sequence of the genome of the strain B. subtilis subsp.subtilis 168 has been determined (Kunst et al., Nature 390, 249-256 (1997)). Based on the declared nucleotide sequence, ydhL_N primers (SEQ ID No. 5) and ydhL_C (SEQ ID NO: 6) were synthesized, which were further used to amplify the ydhL gene from B. subtilis by PCR. Primer ydhL_N is complementary to the nucleotide sequence from 489 to 467 bp before starting the codon of the ydhL gene and contains the restriction enzyme recognition site Sail inserted at the 5'-end. Primer ydhL_C is complementary to the nucleotide sequence from 58 to 80 bp after the stop codon of the ydhL gene and contains the BglII restriction enzyme recognition site introduced at the 5'-end.

Хромосомная ДНК штамма В.subtilis 168 была получена традиционными методами. ПЦР осуществлялся на амплификаторе "Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400" при следующих условиях: 30 сек при 94°С, 45 сек при 61°С, 3 мин при 72°С, 25 циклов с использованием PfuI полимеразы (Fermentas). Полученный ПЦР фрагмент, содержащий ген ydhL под собственным промотором, был обработан смесью рестриктаз BglI и SalI и клонирован в низкокопийный вектор pMW118, также предварительно обработанный смесью рестриктаз BamHI и SalI. Таким образом была получена плазмида pYDHL1.The chromosomal DNA of strain B. subtilis 168 was obtained by traditional methods. PCR was performed on a Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400 thermocycler under the following conditions: 30 sec at 94 ° C, 45 sec at 61 ° C, 3 min at 72 ° C, 25 cycles using PfuI polymerase (Fermentas). The obtained PCR fragment containing the ydhL gene under its own promoter was processed with a mixture of BglI and SalI restrictase and cloned into a low copy vector pMW118, also pre-treated with a mixture of BamHI and SalI restrictase. Thus, the plasmid pYDHL1 was obtained.

Для трансформации штамма Е.coli TG1 с помощью стандартных методов были использованы плазмида pYDHLl и соответствующий вектор. Трансформанты отбирали на чашках с L-агаром с добавлением 100 мкг/мл ампициллина. Таким образом были получены штаммы Е.coli TG1 (pYDHL1) и TG1 (pMW118). Затем оценивалась способность этих штаммов к росту в присутствии аналогов пуриновых оснований на чашках с минимальной глюкозосодержащей средой М9 с добавлением различных концентраций ингибитора роста. На чашки высевали от 10⁵ до 10⁶ клеток из ночной культуры, выращенной на минимальной среде (с добавлением 100 мг/мл ампициллина). Рост оценивался через 44 часа инкубирования при температуре 37°С.To transform the E. coli strain TG1 using standard methods, the plasmid pYDHLl and the corresponding vector were used. Transformants were selected on L-agar plates supplemented with 100 μg / ml ampicillin. Thus, strains of E. coli TG1 (pYDHL1) and TG1 (pMW118) were obtained. Then, the ability of these strains to grow in the presence of purine base analogues on plates with minimal glucose-containing M9 medium supplemented with various concentrations of growth inhibitor was evaluated. From 10 ⁵ to 10 ⁶ cells from an overnight culture grown on minimal medium (supplemented with 100 mg / ml ampicillin) were plated on plates. Growth was evaluated after 44 hours of incubation at a temperature of 37 ° C.

Результаты представлены в Таблице 1.The results are presented in Table 1.

Таблица 1Table 1 ШтаммStrain Рост на минимальной среде, содержащейGrowth on minimal medium containing -- DAP, 400 μг/млDAP, 400 μg / ml МР,400 μг/млMR 400 μg / ml AzaA, 300 μг/млAzaA, 300 μg / ml DAP, 400 μг/мл + МР, 400 μг/млDAP, 400 μg / ml + MR, 400 μg / ml TG1 (pMW118)TG1 (pMW118) ++ -- -- -- -- TG1 (pYDHL1)TG1 (pYDHL1) ++ ++ ++ ++ ++ Примечание. DAP: 2,6-диаминопурин; МР: 6-меркаптопурин; AzaA: 8-азааденин; +: хороший рост; -: нет роста. «Хороший рост» означает, что размер колоний, выросших на среде с аналогами пурина, не отличался или отличался незначительно от размера колоний контрольного штамма, растущего на среде без аналогов пурина.Note. DAP: 2,6-diaminopurine; MR: 6-mercaptopurine; AzaA: 8-azaadenine; +: good growth; -: no growth. “Good growth” means that the size of the colonies grown on a medium with purine analogues did not differ or did not differ significantly from the size of the colonies of the control strain growing on a medium without purine analogues.

Как видно из Таблицы 1, амплификация гена ydhL повышает устойчивость бактерий к 2,6-диаминопурину, 6-меркаптопурину и 8-азааденину.As can be seen from Table 1, amplification of the ydhL gene increases the resistance of bacteria to 2,6-diaminopurine, 6-mercaptopurine and 8-azaadenine.

Плазмида pYDHL1 и вектор pMW118 также были введены в штамм Е.coli TG1 deoD gsk3 путем трансформации. Штамм Е.coli TG1 deoD gsk3 является специально сконструированным родительским штаммом, используемым для оценки устойчивости к инозину и гуанозину. Этот штамм был получен путем последовательного введения мутации deoD, как описано в патентной заявке РСТ WO 9903988, и мутации gsk3, описанной у Petersen С. (J. Biol. Chem., 274, 5348-5356, 1999) с использованием трансдукции фагом PI в известный штамм TG1 (ВКПМ В-5837), важной характеристикой которого является его устойчивость к инозину и гуанозину, благодаря способности штамма деградировать пурин. Штамм TG1 deoD gsk3 не способен к деградации гуанозина и инозина за счет введенной мутации deoD (WO 9903988) и чувствителен к нуклеозидам за счет мутации gsk3 (Petersen С.J. Biol. Chem., 274, 5348-5356, 1999). Таким образом были получены штаммы TG1 deoD gsk3 (pYDHL1) и TG1 deoD gsk3 (pMW118). Способность указанных штаммов расти в присутствии инозина и гуанозина определялась, как описано выше. Результаты представлены в Таблице 2.Plasmid pYDHL1 and the vector pMW118 were also introduced into the E. coli strain TG1 deoD gsk3 by transformation. The strain E. coli TG1 deoD gsk3 is a specially designed parental strain used to assess resistance to inosine and guanosine. This strain was obtained by sequentially introducing the deoD mutation as described in PCT patent application WO 9903988 and the gsk3 mutation described by Petersen C. (J. Biol. Chem., 274, 5348-5356, 1999) using transduction with phage PI in known strain TG1 (VKPM B-5837), an important characteristic of which is its resistance to inosine and guanosine, due to the ability of the strain to degrade purine. The strain TG1 deoD gsk3 is not capable of degradation of guanosine and inosine due to the introduced deoD mutation (WO 9903988) and is sensitive to nucleosides due to the gsk3 mutation (Petersen C. J. Biol. Chem., 274, 5348-5356, 1999). Thus, strains of TG1 deoD gsk3 (pYDHL1) and TG1 deoD gsk3 (pMW118) were obtained. The ability of these strains to grow in the presence of inosine and guanosine was determined as described above. The results are presented in Table 2.

Таблица 2table 2 Рост на минимальной среде, содержащейGrowth on minimal medium containing ШтаммStrain ИнозинInosine ГуанозинGuanosine 300 мг/л300 mg / l 1000 мг/л1000 mg / l 10 мг/л10 mg / l 15 мг/л15 mg / l Е.coil deoD gsk3 (pMW118)E.coil deoD gsk3 (pMW118) -- -- -- -- E.coli deoD gsk3 (pYDHL1)E.coli deoD gsk3 (pYDHL1) ++ ++ ++ -- Примечание. +: хороший рост; -: нет роста.Note. +: good growth; -: no growth.

Из Таблицы 2 видно, что повышенная экспрессия гена ydhL придает штаммам повышенную устойчивость к инозину и некоторую устойчивость к гуанозину. Таким образом, можно предположить, что ген ydhL участвует в экскреции нуклеозидов и, более конкретно, в экскреции инозина.From Table 2 it is seen that increased expression of the ydhL gene gives strains increased resistance to inosine and some resistance to guanosine. Thus, it can be assumed that the ydhL gene is involved in the excretion of nucleosides and, more specifically, in the excretion of inosine.

Пример 2. Клонирование гена ydhL из Bacillus amyloliquefaciens.Example 2. Cloning of the ydhL gene from Bacillus amyloliquefaciens.

Данные, приведенные в Примере 1, показывают, что повышенная экспрессия гена ydhL из В.subtilis (далее: ydhL_Bs) придает клеткам устойчивость к 2,6-диаминопурину и 6-меркаптопурину, одновременно добавленным в агаризованную М9 минимальную глюкозосодержащую среду (Таблица 1). На основе этого факта было осуществлено клонирование ортолога гена ydhL_Bs из В.amyloliquefaciens (далее: ydhL_Ba). Хромосомная ДНК из штамма В.amyloliquefaciens BA1 была получена традиционными методами. Хромосомную ДНК обработали рестриктазой EcoRI и лигировали с вектором pMW118, также предварительно обработанным той же рестриктазой. Полученной ДНК трансформировали штамм Е.coli TG1. Трансформанты были отобраны на минимальной среде с добавлением 400 мкг/мл 2,6-диаминопурина, 400 мкг/мл 6-меркаптопурина и 100 мкг/мл ампициллина. Плазмидную ДНК выделили из трансформантов и проанализировали. В этом эксперименте была получена гибридная плазмида pYDHL2, содержащая минимальный размер вставки ДНК - примерно 1.6 т.п.о. В отличие от гена ydhL_Bs, этот фрагмент не содержит сайта узнавания рестриктазы EcoRI. Полученная вставка была секвенирована с использованием универсальных праймеров, что показало, что фрагмент обладает высокой степенью гомологии (более 90%) с геном ydhL_Bs (Фиг.1). Новый ген из В.amyloliquefaciens был назван геном ydhL (здесь и далее обозначающийся как ген ydhL_Ba). Будучи введенной в штаммы TG1 и TG1 deoD gsk3, плазмида pYDHL2 придает клеткам устойчивость к аналогам пуриновых оснований и к нуклеозидам, соответственно, точно так же как и плазмида pYDHLI. Таким образом был сделан вывод, что плазмида pYDHL2 действительно содержит ген ydhL_Ba.The data shown in Example 1 show that increased expression of the ydhL gene from B. subtilis (hereinafter: ydhL _Bs ) gives the cells resistance to 2,6-diaminopurine and 6-mercaptopurine, simultaneously added to the minimum glucose-containing medium agarized M9 (Table 1) . Based on this fact, the ortholog of the ydhL _Bs gene from B. amyloliquefaciens (hereinafter: ydhL _Ba ) was cloned. Chromosomal DNA from B. amyloliquefaciens BA1 strain was obtained by conventional methods. Chromosomal DNA was digested with restriction enzyme EcoRI and ligated with the vector pMW118, also pretreated with the same restriction enzyme. The resulting DNA was transformed with E. coli TG1 strain. Transformants were selected on minimal medium supplemented with 400 μg / ml 2,6-diaminopurine, 400 μg / ml 6-mercaptopurine and 100 μg / ml ampicillin. Plasmid DNA was isolated from transformants and analyzed. In this experiment, a hybrid plasmid pYDHL2 was obtained containing a minimum DNA insert size of about 1.6 kb. Unlike the ydhL _Bs gene, this fragment does not contain the EcoRI restriction enzyme recognition site. The resulting insert was sequenced using universal primers, which showed that the fragment has a high degree of homology (more than 90%) with the ydhL _Bs gene (Figure 1). The new gene from B. amyloliquefaciens was named the ydhL gene (hereinafter referred to as the ydhL _Ba gene). When introduced into the TG1 and TG1 strains of deoD gsk3, the plasmid pYDHL2 confers cell resistance to purine base analogs and nucleosides, respectively, just like the plasmid pYDHLI. Thus, it was concluded that the plasmid pYDHL2 does indeed contain the ydhL _Ba gene.

Пример 3. Эффект амплификации генов ydhL_Bs и ydhL_Ba на продукцию инозина штаммом-продуцентом инозина Е.coli.Example 3. The effect of amplification of the ydhL _Bs and ydhL _Ba genes on the production of inosine by the E. coli inosine producer strain.

Штамм-продуцент инозина Е.coli FADRaddedd (pMWKQ) трансформировали отдельно вектором pMW18, и каждой из плазмид YDHL1 и pYDHL2. Трансформанты отбирали на среде L-агар, содержащей 100 мг/л ампициллина и 75 мг/л канамицина. Таким образом были получены штаммы FADRaddedd (pMWKQ, pMW18), FADRaddedd (pMWKQ, pYDHL1) и FADRaddedd (pMWKQ, pYDHL2). Все эти штаммы выращивались при 37°С в течение 18 часов в L-бульоне со 100 мг/л ампициллина и 75 мг/л канамицина, после чего 0.3 мл полученной культуры вносили в 20×200 мм пробирки с 3 мл ферментационной среды, содержащей 100 мг/л ампициллина и 75 мг/л канамицина, и выращивали при 37°С в течение 72 часов на роторной качалке.The E. coli FADRaddedd inosine producing strain (pMWKQ) was transformed separately by the pMW18 vector, and each of the plasmids YDHL1 and pYDHL2. Transformants were selected on L-agar medium containing 100 mg / L ampicillin and 75 mg / L Kanamycin. Thus, the strains FADRaddedd (pMWKQ, pMW18), FADRaddedd (pMWKQ, pYDHL1) and FADRaddedd (pMWKQ, pYDHL2) were obtained. All these strains were grown at 37 ° C for 18 hours in L-broth with 100 mg / l ampicillin and 75 mg / l kanamycin, after which 0.3 ml of the obtained culture was introduced into 20 × 200 mm tubes with 3 ml of fermentation medium containing 100 mg / l ampicillin and 75 mg / l kanamycin, and grown at 37 ° C for 72 hours on a rotary shaker.

Состав ферментационной среды (г/л):The composition of the fermentation medium (g / l):

ГлюкозаGlucose 40.040.0 (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 16.016.0 К₂HPO₄ K ₂ HPO ₄ 0.10.1 MgSO₄×7H₂OMgSO ₄ × 7H ₂ O 1.01.0 FeSO₄×7H₂OFeSO ₄ × 7H ₂ O 0.010.01 MnSO₄×5H₂OMnSO ₄ × 5H ₂ O 0.010.01 Дрожжевой экстрактYeast extract 8.08.0 CaCO₃ CaCO ₃ 30.030.0

Глюкозу и сульфат магния стерилизовали отдельно. CaCO₃ стерилизовали сухим жаром при температуре 180°С в течение 2 часов. рН доводили до 7.0. Антибиотики добавляли в среду после стерилизации.Glucose and magnesium sulfate were sterilized separately. CaCO _{3 was} sterilized by dry heat at a temperature of 180 ° C for 2 hours. The pH was adjusted to 7.0. Antibiotics were added to the medium after sterilization.

После выращивания количество накопленного в среде инозина определяли с помощью ВЭЖХ. Пробу культуральной жидкости (500 мкл) центрифугировали при 15,000 об/мин в течение 5 минут, после чего супер разводили в 4 раза водой (Н₂О) и анализировали с помощью ВЭЖХ.After growing, the amount of inosine accumulated in the medium was determined by HPLC. A sample of the culture fluid (500 μl) was centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes, after which it was super-diluted 4 times with water (H ₂ O) and analyzed by HPLC.

Условия ВЭЖХ анализа:HPLC analysis conditions:

Колонка: Luna C18(2) 250×3 мм, 5 мкм (Phenomenex, США). Буфер: 2% v/v C₂H₅OH; 0.8% v/v триэтиламин; 0.5% v/v уксусная кислота (ледяная); рН 4.5. Температура: 30°С. Скорость потока: 0.3 мл/мин. Объем пробы: 5-10 мкл. Длина волны: UV 250 нм. Время удерживания (мин):Column: Luna C18 (2) 250 × 3 mm, 5 μm (Phenomenex, USA). Buffer: 2% v / v C ₂ H ₅ OH; 0.8% v / v triethylamine; 0.5% v / v acetic acid (glacial); pH 4.5. Temperature: 30 ° C. Flow rate: 0.3 ml / min. Sample volume: 5-10 μl. Wavelength: UV 250 nm. Retention Time (min):

КсантозинXanthosine 13.713.7 ИнозинInosine 9.69.6 ГипоксантинHypoxanthine 5.25.2 ГуанозинGuanosine 11.411.4 АденозинAdenosine 28.228.2

Результаты представлены в Таблице 3.The results are presented in Table 3.

Таблица 3Table 3 ШтаммStrain OD₅₄₀ OD ₅₄₀ Инозин, г/лInosine, g / l Е.coli FADRaddedd (pMWKQ, pMW118)E. coli FADRaddedd (pMWKQ, pMW118) 9.09.0 1.5±0.21.5 ± 0.2 E.coli FADRaddedd (pMWKQ, pYDHL1)E.coli FADRaddedd (pMWKQ, pYDHL1) 8.68.6 2.3±0.22.3 ± 0.2 Е.coli FADRaddedd (pMWKQ, pYDHL2)E. coli FADRaddedd (pMWKQ, pYDHL2) 8.48.4 2.2±0.22.2 ± 0.2

Как видно из Таблицы 3, повышенная экспрессия генов ydhL_Bs и ydhL_Ba повышает продукцию инозина у штамма FADRaddedd (pMWKQAp).As can be seen from Table 3, increased expression of the ydhL _Bs and ydhL _Ba genes increases the production of inosine in the FADRaddedd strain (pMWKQAp).

Пример 4. Клонирование гена ydhL_Bs в низкокопийный челночный вектор pMWMX1.Example 4. Cloning of the ydhL _Bs gene into the low copy shuttle vector pMWMX1.

ПЦР фрагмент, содержащий ген ydhL_Bs под собственным промотором (полученный, как описано в Примере 1), был обработан рестриктазами BglI и SalI и клонирован в низкокопийный челночный вектор pMWMX1, также предварительно обработанный рестриктазами BamHI и SalI. Таким образом была получена плазмида pYDHL3. Вектор pMWMX1 (Фиг.2) является производным от двух низкокопийных плазмид: pMW118 и рМХ30. Плазмида рМХ30 (Rabinovich et al., Mol. Biol (Moscow), 18, 189-196,1984), в свою очередь, является делеционным вариантом плазмиды pSM19035, вектора с широким спектром хозяев семейства inc18 (Brantl et al., Nucleic Acids Res., 18, 4783-4790). Обе плазмиды pMW118 и рМХ30 были обработаны рестриктазой EcoRI и затем дотированы. Таким образом был получен вектор pMWMX1.The PCR fragment containing the ydhL _Bs gene under its own promoter (obtained as described in Example 1) was digested with restriction enzymes BglI and SalI and cloned into the low copy shuttle vector pMWMX1, also pretreated with restriction enzymes BamHI and SalI. Thus, the plasmid pYDHL3 was obtained. Vector pMWMX1 (Figure 2) is derived from two low-copy plasmids: pMW118 and pMX30. Plasmid pMX30 (Rabinovich et al., Mol. Biol (Moscow), 18, 189-196.1984), in turn, is a deletion variant of plasmid pSM19035, a vector with a wide range of hosts for the inc18 family (Brantl et al., Nucleic Acids Res ., 18, 4783-4790). Both plasmids pMW118 and pMX30 were digested with EcoRI and then subsidized. Thus, the vector pMWMX1 was obtained.

Пример 5. Конструирование низкокопийной челночной плазмиды pYDHL3, содержащей ген vdhL_Ba.Example 5. Construction of a low-copy shuttle plasmid pYDHL3 containing the vdhL _Ba gene.

Плазмида pYDHL2 была обработана рестриктазой EcoRI с недорестрикцией, для получения одного фрагмента, и дотирована в плазмиду рМХ30, обработанную той же рестриктазой. Таким образом была получена челночная плазмида pYDHL4, содержащая ген ydhL_Ba. Таким образом, плазмида pYDHL4 эквивалентна плазмиде pYDHL3, за исключением замены вектора pMWMX1, содержащего гены ydhL_Bs и ydhL_Ba.Plasmid pYDHL2 was digested with EcoRI restriction enzyme with under-restriction to produce one fragment, and was donated to plasmid pMX30 treated with the same restriction enzyme. Thus, the shuttle plasmid pYDHL4 containing the ydhL _Ba gene was obtained. Thus, the plasmid pYDHL4 is equivalent to the plasmid pYDHL3, with the exception of replacing the vector pMWMX1 containing the ydhL _Bs and ydhL _Ba genes.

Пример 6. Эффект амплификации гена ydhL_Bs или гена ydhL_Ba на устойчивость штамма В.subtilis 168 к аналогам пуриновых оснований.Example 6. The effect of amplification of the ydhL _Bs gene or ydhL _Ba gene on the resistance of B. subtilis 168 strain to purine base analogs.

Плазмиды pYDHL3, pYDHL4 и вектор pMWMX1 были использованы для трансформации природного штамма В.subtilis 168 с помощью стандартных методов. Трансформанты были отобраны на чашках с L-агаром, с добавлением 10 мкг/мл эритромицина. Таким образом были получены штаммы В.subtilis 168(pMWMX1), В.subtilis 168(pYDHL3) и В.subtilis 168(pYDHL4). Затем способность этих штаммов к росту в присутствии аналогов пуриновых оснований оценивали на чашках с минимальной агаризованной средой с добавлением глюкозы М9 (минимальная среда М9, глюкоза - 2%, витаминная смесь казаминовых кислот (Difco) - 0,1%, триптофан - 100 мкг/мл), содержащей различные концентрации пуриновых аналогов. На чашки наносили от 10⁵ до 10⁶ клеток из ночной культуры, выращенной на чашках с описанной выше минимальной агаризованной средой без аналогов. Рост оценивался через 48 часов инкубации при 34°С.Plasmids pYDHL3, pYDHL4 and the vector pMWMX1 were used to transform the native strain of B. subtilis 168 using standard methods. Transformants were selected on L-agar plates supplemented with 10 μg / ml erythromycin. Thus, strains of B. subtilis 168 (pMWMX1), B. subtilis 168 (pYDHL3) and B. subtilis 168 (pYDHL4) were obtained. Then, the growth ability of these strains in the presence of purine base analogues was evaluated on plates with minimal agar medium supplemented with M9 glucose (M9 minimal medium, glucose 2%, vitamin mixture of casamic acids (Difco) 0.1%, tryptophan 100 μg / ml) containing various concentrations of purine analogues. From 10 ⁵ to 10 ⁶ cells from an overnight culture grown on plates with the minimum minimal agar medium described above without analogues were applied to the plates. Growth was evaluated after 48 hours of incubation at 34 ° C.

Результаты представлены в Таблице 4.The results are presented in Table 4.

Таблица 4Table 4 ШтаммStrain Рост на минимальной среде, содержащейGrowth on minimal medium containing -- AzaG, 2 мкг/млAzaG, 2 mcg / ml AzaG, 10 мкг/млAzaG, 10 mcg / ml MePur, 20 мкг/млMePur, 20 mcg / ml AzaA, 2 мг/млAzaA, 2 mg / ml В.subtilis 168B.subtilis 168 ++ -- -- -- -- В.subtilis 168(pYDHL3)B.subtilis 168 (pYDHL3) ++ ++ n.d.n.d. ++ n.d.n.d. В.subtilis 168(pYDHL4)B.subtilis 168 (pYDHL4) ++ ++ ++ ++ ++ Примечание: AzaG - 8-азагуанин; MePur - 6-метилпурин; AzaA - 8-азааденин; n.d. нет данных; +: хороший рост; -: нет роста. «Хороший рост» означает, что размер колоний, выросших на среде с аналогами пурина, не отличался или отличался незначительно от размера колоний контрольного штамма, растущего на среде без аналогов пурина.Note: AzaG - 8-azaguanine; MePur - 6-methylpurine; AzaA - 8-azaadenine; n.d. there is no data; +: good growth; -: no growth. “Good growth” means that the size of the colonies grown on a medium with purine analogues did not differ or did not differ significantly from the size of the colonies of the control strain growing on a medium without purine analogues.

Как видно из Таблицы 4, амплификация гена ydhL_Bs или гена ydhL_Ba повышает устойчивость бактерий к 8-азагуанину, 6-метилпурину и 8-азааденину.As can be seen from Table 4, amplification of the ydhL _Bs gene or the ydhL _Ba gene increases the resistance of bacteria to 8-azaguanine, 6-methylpurine, and 8-azaadenine.

Пример 7: Эффект амплификации гена ydhL_Bs или гена ydhL_Ba на продукцию инозина штаммом-продуцентом инозина В.subtilis.Example 7: Effect of amplification of the ydhL _Bs gene or the ydhL _Ba gene on the production of inosine by the inosine producer strain B. subtilis.

Штамм-продуцент инозина В.subtilis KMBS16-1 трансформировали вектором pMWMX1, плазмидой pYDHL3 или плазмидой pYDHL4. Таким образом были получены штаммы В.subtilis KMBS16-1 (pMWMX1), В.subtilis KMBS16-1 (pYDHL3) и В.subtilis KMBS16-1 (pYDHL4). Каждый из этих штаммов выращивали в L-бульоне с добавлением эритромицина (10 мг/л) при 37°С в течение 18 часов. Затем по 0.3 мл полученной культуры инокулировали в пробирку 20×200 мм с 3 мл ферментационной среды Bacillus, содержащей эритромицин (10 мг/л), и выращивали при 37°С в течение 72 часов на роторной качалке.The inosine producing strain of B. subtilis KMBS16-1 was transformed with the vector pMWMX1, plasmid pYDHL3 or plasmid pYDHL4. Thus, strains of B. subtilis KMBS16-1 (pMWMX1), B. subtilis KMBS16-1 (pYDHL3), and B. subtilis KMBS16-1 (pYDHL4) were obtained. Each of these strains was grown in L-broth with the addition of erythromycin (10 mg / L) at 37 ° C for 18 hours. Then, 0.3 ml of the obtained culture was inoculated into a 20 × 200 mm test tube with 3 ml of Bacillus fermentation medium containing erythromycin (10 mg / L) and grown at 37 ° C for 72 hours on a rotary shaker.

Состав ферментационной среды Bacillus: (г/л)The composition of the fermentation medium Bacillus: (g / l)

ГлюкозаGlucose 80.080.0 КН₂PO₄ KN ₂ PO ₄ 1.01.0 MgSO₄ MgSO ₄ 0.40.4 FeSO₄×7H₂OFeSO ₄ × 7H ₂ O 0.010.01 MnSO₄×5Н₂OMnSO ₄ × 5H ₂ O 0.010.01 Мамено-TNMameno-TN 1.351.35 DL-МетионинDL-methionine 0.30.3 NH₄ClNH ₄ Cl 32.032.0 АденинAdenine 0.10.1 ТриптофанTryptophan 0.020.02 CaCO₃ CaCO ₃ 50.050.0

После выращивания количество накопленного в среде инозина определяли с помощью ВЭЖХ, как описано выше. Результаты представлены в Таблице 5.After growing, the amount of inosine accumulated in the medium was determined by HPLC as described above. The results are presented in Table 5.

Таблица 5Table 5 ШтаммStrain OD₅₄₀ OD ₅₄₀ Инозин, г/лInosine, g / l В.subtilis KMBS16-1 (pMWMX1)B. subtilis KMBS16-1 (pMWMX1) 8.48.4 1.4±0.11.4 ± 0.1 В.subtilis KMBS16-1 (pYDHL3)B. subtilis KMBS16-1 (pYDHL3) 8.28.2 1.6±0.2.1.6 ± 0.2. В.subtilis KMBS16-1 (pYDHL4)B. subtilis KMBS16-1 (pYDHL4) 8.08.0 1.7±0.21.7 ± 0.2

Как видно из Таблицы 5, амплификация любого из генов ydhL_Bs или ydhL_Ba повышает продукцию инозина штаммом В.subtilis KMBS16-1.As can be seen from Table 5, the amplification of any of the ydhL _Bs or ydhL _Ba genes increases the production of inosine by B. subtilis strain KMBS16-1.

Пример 8. Модификация регуляторной области гена ydhL из В.amyloliquefaciens.Example 8. Modification of the regulatory region of the ydhL gene from B. amyloliquefaciens.

Известно, что модификация регуляторной области гена ydhL из В.subtilis, a именно модификация в G-боксе 5'-нетранслируемой области РНК, может повысить экспрессию указанного гена (Mandal, M. and Breaker, R.R., Nat. Struct. Mol. BioL, 11 (1), 29-35 (2004)). В связи с этим, с целью усиления уровня экспрессии гена ydhL такая же мутация (замена Т на С) была введена в регуляторную область гена ydhL из В.amyloliquefaciens (положение "-77" от старт-кодона указанного гена) с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuickChange™ (Stratagene). Для этой цели на основе последовательности ДНК регуляторной области гена ydhL из В.amyloliquefaciens были синтезированы два праймера 1 и 2 (SEQ ID NO:7 и 8, соответственно). В качестве матрицы использовали ДНК плазмиду pYDHL2 (pMW118-ydhL_BA). Указанная плазмида была амплифицирована целиком с использованием вышеописанных праймеров и получено несколько плазмид, содержащих ген ydhL. Нуклеотидные последовательности указанных плазмид были определены с использованием праймера 3 (SEQ ID NO:9) и наличие желаемой замены Т на С было подтверждено. Новая плазмида, содержащая ген ydhL из В.amyloliquefaciens с мутацией в регуляторной области, была названа pYDHL5. Плазмида pYDHL5 была линеаризована рестриктазой EcoRI и затем дотирована с плазмидой рМХ30, предварительно линеаризованной той же рестриктазой. Таким образом была получена челночная плазмида pYDHL6, содержащая ген ydhL_Ba с мутацией, усиливающей уровень экспрессии этого гена.It is known that the modification of the regulatory region of the ydhL gene from B. subtilis, namely, the modification in the G-box of the 5'-untranslated RNA region, can increase the expression of this gene (Mandal, M. and Breaker, RR, Nat. Struct. Mol. BioL, 11 (1), 29-35 (2004)). In this regard, in order to enhance the expression level of the ydhL gene, the same mutation (substitution of T for C) was introduced into the regulatory region of the ydhL gene from B. amyloliquefaciens (position “-77” from the start codon of the indicated gene) using the site kit Directed mutagenesis of QuickChange ™ (Stratagene). For this purpose, two primers 1 and 2 were synthesized based on the DNA sequence of the regulatory region of the ydhL gene from B. amyloliquefaciens (SEQ ID NO: 7 and 8, respectively). The DNA plasmid pYDHL2 (pMW118-ydhL _BA ) was used as a template. The indicated plasmid was amplified entirely using the above primers and several plasmids containing the ydhL gene were obtained. The nucleotide sequences of these plasmids were determined using primer 3 (SEQ ID NO: 9) and the presence of the desired replacement of T by C was confirmed. A new plasmid containing the ydhL gene from B. amyloliquefaciens with a mutation in the regulatory region was named pYDHL5. Plasmid pYDHL5 was linearized with the restriction enzyme EcoRI and then subsidized with the plasmid pMX30 previously linearized with the same restriction enzyme. Thus, the shuttle plasmid pYDHL6 containing the ydhL _Ba gene with a mutation enhancing the expression level of this gene was obtained.

Пример 9. Эффект усиления экспрессии гена ydhL_Ba на продукцию инозина штаммом-продуцентом инозина В.amyloliquefaciens.Example 9. The effect of enhancing the expression of the ydhL _Ba gene on the production of inosine by the inosine producer strain B. amyloliquefaciens.

Штамм В.subtilis 168 был трансформирован плазмидой pYDHL6 или челночным вектором pMWMX1 с использованием хорошо известного метода (Spizizen, J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 44, 1072-1078 (1958)). Полученные штаммы В.subtilis (pYDHL6) и В.subtilis (pMWMX1) были использованы в качестве доноров для трансдукции с использованием фага Е40 с целью введения плазмид pYDHL6 и pMWMX1 в штамм В. subtilis G1136A (AJ1991) - продуцент инозина (патент США 3,575,809). Указанный штамм В.subtilis G1136A был переклассифицирован Всероссийской коллекцией промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 117545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) в штамм Bacillus amyloliquefaciens и депонирован под инвентарным номером (VKPM В-8994). Поэтому в дальнейшем указанный штамм называется Bacillus amyloliquefaciens G1136A. Фаг Е40 является PBS1-подобным фагом (Takanishi, R., J. Gen. Microbiol., 31,211-217, (1963)), способным к пропагации на клетках В.subtilis и В.amyloliquefaciens. После трансдукции были получены штаммы В.amyloliquefaciens G1136A (pMWMX1) и В.amyloliquefaciens G1136A(pYDHL6).The strain B. subtilis 168 was transformed with the plasmid pYDHL6 or the shuttle vector pMWMX1 using the well-known method (Spizizen, J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 44, 1072-1078 (1958)). The resulting B. subtilis (pYDHL6) and B. subtilis (pMWMX1) strains were used as transduction donors using phage E40 to introduce plasmids pYDHL6 and pMWMX1 into B. subtilis strain G1136A (AJ1991), producer of inosine (US Pat. No. 3,575,809) . The specified strain of B. subtilis G1136A was reclassified by the All-Russian collection of industrial microorganisms (VKPM) (RF, 117545 Moscow, 1st Road passage, 1) to the strain Bacillus amyloliquefaciens and deposited under inventory number (VKPM B-8994). Therefore, in the future, this strain is called Bacillus amyloliquefaciens G1136A. Phage E40 is a PBS1-like phage (Takanishi, R., J. Gen. Microbiol., 31,211-217, (1963)), capable of propagation on B. subtilis and B. amyloliquefaciens cells. After transduction, B. amyloliquefaciens G1136A (pMWMX1) and B. amyloliquefaciens G1136A (pYDHL6) strains were obtained.

Каждый из указанных штаммов выращивали при 37°С в течение 18 часов в L-бульоне, содержащем 10 мг/л эритромицина. Затем 0.3 мл полученной культуры переносили в 3 мл ферментационной среды, содержащей 10 мг/л эритромицина, в 20×200 мм пробирках, и выращивали при 37°С в течение 72 часов на роторной качалке.Each of these strains was grown at 37 ° C for 18 hours in L-broth containing 10 mg / l of erythromycin. Then, 0.3 ml of the obtained culture was transferred into 3 ml of fermentation medium containing 10 mg / L of erythromycin in 20 × 200 mm tubes, and grown at 37 ° C for 72 hours on a rotary shaker.

Состав ферментационной среды, (г/л):The composition of the fermentation medium, (g / l):

ГлюкозаGlucose 80.080.0 КН₂PO₄ KN ₂ PO ₄ 1.01.0 MgSO₄ MgSO ₄ 0.40.4 FeSO₄*7H₂OFeSO ₄ * 7H ₂ O 0.010.01 MnSO₄*5H₂OMnSO ₄ * 5H ₂ O 0.010.01 NH₄ClNH ₄ Cl 15.015.0 АденинAdenine 0.30.3 Общий азот (в форме Mameno)Total nitrogen (in the form of Mameno) 0.80.8 CaCO₃ CaCO ₃ 25.025.0

После выращивания количество накопленного в среде инозина определяли с помощью ВЭЖХ, как описано выше. Результаты представлены в Таблице 6.After growing, the amount of inosine accumulated in the medium was determined by HPLC as described above. The results are presented in Table 6.

Таблица 6Table 6 ШтаммStrain OD₅₄₀ OD ₅₄₀ Инозин, г/лInosine, g / l В.amyloliquefaciens G1136A (pMWMX1)B. amyloliquefaciens G1136A (pMWMX1) 16.716.7 1.8±0.11.8 ± 0.1 В.amyloliquefaciens G1136A (pYDHL6)B. amyloliquefaciens G1136A (pYDHL6) 16.116.1 3.2±0.13.2 ± 0.1

Как видно из Таблицы 6, усиление экспрессии гена ydhL_Ba, вызванное наличием мутации, повышает продукцию инозина штаммом В.amyloliquefaciens G1136A.As can be seen from Table 6, increased expression of the ydhL _Ba gene caused by the presence of a mutation increases the production of inosine by B. amyloliquefaciens G1136A strain.

Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на конкретные Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.Although the invention has been described in detail with reference to specific Examples, it will be apparent to those skilled in the art that various changes may be made and equivalent replacements may be made, and such changes and replacements are not outside the scope of the present invention.

Каждый из упомянутых выше документов включен в описание в качестве ссылки во всей полноте.Each of the above documents is incorporated into the description by reference in its entirety.

Claims

1. YdhL protein from Bacillus amyloliquefaciens, having activity giving bacteria belonging to the genus Bacillus or the genus Escherichia, resistance to purine bases selected from the group consisting of analogs of purine base, inosine and guanosine, selected from the group consisting of

(A) a protein characterized by the amino acid sequence shown in the sequence list under number 2 (SEQ ID NO: 2); and

(B) a protein characterized by the amino acid sequence listed in sequence number 2 (SEQ ID NO: 2), containing deletions, substitutions, insertions, or addition of one or more amino acids in the indicated amino acid sequence that do not result in loss of activity of the specified protein.

2. The protein according to claim 1, characterized in that said purine is inosine.

3. A DNA fragment encoding a protein having the activity of the YdhL protein according to claim 1, selected from the group consisting of

(a) a DNA fragment characterized by the nucleotide sequence shown in the list of sequences under the number 1 (SEQ ID NO: 1); and

(b) a DNA fragment hybridizing under stringent conditions with the nucleotide sequence listed in the sequence number 1 (SEQ ID NO: 1), or with a probe prepared on the basis of the specified nucleotide sequence, where the conditions under which washing is carried out under stringent conditions are stringent 60 ° C, the salt concentration corresponds to 1 × SSC and 0.1% SDS, and the washing time is 15 minutes

4. A bacterium belonging to the genus Bacillus, with the ability to produce purine nucleoside, characterized in that the bacterium is modified so that it increases the expression of a DNA fragment selected from the group consisting of

(c) a DNA fragment according to claim 3,

(g) a DNA fragment characterized by the nucleotide sequence shown in the list of sequences under the number 3 (SEQ ID NO: 3); and

(e) a DNA fragment that is an ortholog of any of the DNA fragments indicated in (c) or (d).

5. The bacterium according to claim 4, characterized in that the purine nucleoside is selected from the group consisting of inosine, xanthosine and guanosine.

6. The bacterium according to claim 4, characterized in that the expression of the indicated DNA fragment is increased by transforming the bacterium with the specified DNA fragment.

7. The bacterium according to claim 6, characterized in that said transformation is carried out using a low copy vector.

8. The bacterium according to claim 4, characterized in that the expression of the indicated DNA fragment is increased by changing the sequence that regulates the expression of the DNA fragment in the bacterial chromosome.

9. A bacterium belonging to the genus Escherichia, with the ability to produce purine nucleoside, characterized in that the bacterium is modified so that it increases the expression of a DNA fragment selected from the group consisting of

(c) a DNA fragment according to claim 3,

10. The bacterium according to claim 9, characterized in that the purine nucleoside is selected from the group consisting of inosine, xanthosine and guanosine.

11. The bacterium according to claim 9, characterized in that the expression of said DNA fragment is increased by transforming the bacterium with said DNA fragment.

12. The bacterium according to claim 11, characterized in that said transformation is carried out using a low copy vector.

13. The bacterium according to claim 9, characterized in that the expression of the indicated DNA fragment is increased by changing the sequence that regulates the expression of the DNA fragment in the bacterial chromosome.

14. A method of obtaining a purine nucleoside, comprising the following stages:

(a) growing bacteria according to claim 4 or 9 in a nutrient medium and

(b) collecting purine nucleoside from the culture fluid.

15. The method according to 14, characterized in that said purine nucleoside is inosine.

16. The method according to 14, characterized in that said purine nucleoside is xanthosine.

17. The method according to 14, characterized in that said purine nucleoside is guanosine.

18. The method according to 14, characterized in that the bacterium is modified in such a way that the expression of purine nucleoside biosynthesis genes in said bacterium is enhanced.

19. A method of obtaining a purine nucleotide, comprising the following stages:

(a) growing the bacteria according to claim 4 or 9 in a nutrient medium and isolating the resulting purine nucleoside,

(b) phosphorylation of the resulting purine nucleoside; and

(c) collection of purine nucleotide.

20. The method according to claim 19, wherein the purine nucleotide is 5'-inosinic acid.

21. The method according to claim 19, characterized in that the purine nucleotide is 5'-xanthyl acid.

22. The method according to claim 19, wherein the purine nucleotide is 5'-guanilic acid.

23. The method according to claim 19, wherein the bacterium is modified in such a way that the expression of purine nucleoside biosynthesis genes in said bacterium is enhanced.

24. A method of obtaining 5'-guanilic acid, comprising the following stages:

(a) growing the bacteria according to claim 4 or 9 in a nutrient medium and isolating the resulting xanthosine,

(b) xanthosine phosphorylation,

(c) amination of 5'-xanthyl acid; and

(g) collection of 5'-guanilic acid.

25. The method according to paragraph 24, wherein the bacterium is modified so that the expression of genes for the biosynthesis of purine nucleosides in the specified bacteria is enhanced.