RU2260040C2 - Method for production of inosibe and inosine-5'-monophosphate, bacterium strain of genus bacillus as inosine producer (variants) - Google Patents
Method for production of inosibe and inosine-5'-monophosphate, bacterium strain of genus bacillus as inosine producer (variants) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2260040C2 RU2260040C2 RU2002103333/13A RU2002103333A RU2260040C2 RU 2260040 C2 RU2260040 C2 RU 2260040C2 RU 2002103333/13 A RU2002103333/13 A RU 2002103333/13A RU 2002103333 A RU2002103333 A RU 2002103333A RU 2260040 C2 RU2260040 C2 RU 2260040C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- inosine
- strain
- phosphate
- bacillus
- bacterium
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Область техники.The field of technology.
Настоящее изобретение относится к способу получения пуриновых нуклеозидов, таких как инозин, ксантозин, гуанозин, методом ферментации и к новому микроорганизму, используемому для их продукции. Пуриновые нуклеозиды используются в качестве исходных реагентов для синтеза соответствующих нуклеотидов, таких как инозин-5'-фосфат, ксантозин-5'-фосфат и гуанин-5'-фосфат.The present invention relates to a method for producing purine nucleosides, such as inosine, xanthosine, guanosine, by fermentation and to a new microorganism used for their production. Purine nucleosides are used as starting reagents for the synthesis of the corresponding nucleotides, such as inosine-5'-phosphate, xanthosine-5'-phosphate and guanine-5'-phosphate.
Предшествующий уровень техникиState of the art
Традиционно нуклеозиды получают в промышленном масштабе методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, ауксотрофных по аденину, или этих штаммов, которым дополнительно придана устойчивость к различным соединениям, таким как аналоги пуринов, сульфасоединения, аналоги метионина и антифолатные соединения. Примерами таких штаммов являются штаммы, принадлежащие к роду Bacillus (патентные заявки Японии №38-23039 (1963), 54-17033 (1979), 55-2956 (1980), 55-45199 (1980), 56-162998 (1981), 57-14160 (1982) и 57-41915 (1982), 59-42895 (1984), 06-113876 (1992)), к роду Brevibacterium (патентные заявки Японии №51-5075 (1976), 58-17592 (1983), 02-174689 (1988) и Agric. Biol. Chem., 42, 399 (1978)), к роду Escherichia (заявка РСТ WO9903988) и подобные им.Traditionally, nucleosides are produced on an industrial scale by fermentation using strains of microorganisms auxotrophic for adenine, or these strains, which are additionally given resistance to various compounds, such as purine analogs, sulfa compounds, methionine analogs and antifolate compounds. Examples of such strains are strains belonging to the genus Bacillus (Japanese patent applications No. 38-23039 (1963), 54-17033 (1979), 55-2956 (1980), 55-45199 (1980), 56-162998 (1981), 57-14160 (1982) and 57-41915 (1982), 59-42895 (1984), 06-113876 (1992)), to the genus Brevibacterium (Japanese patent application No. 51-5075 (1976), 58-17592 (1983) , 02-174689 (1988) and Agric. Biol. Chem., 42, 399 (1978)) to the genus Escherichia (PCT application WO9903988) and the like.
Получение указанных мутантных штаммов обычно состоит из обработки микроорганизмов с целью получения мутаций путем воздействия ионизирующего излучения (УФ-излучение, рентгеновское излучение) или обработки химическими агентами (нитрат натрия, диэтилсульфат, N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин) с последующей селекцией нужного штамма на подходящей питательной среде для селекции.Obtaining these mutant strains usually consists of processing microorganisms to obtain mutations by exposure to ionizing radiation (UV radiation, X-ray radiation) or treatment with chemical agents (sodium nitrate, diethyl sulfate, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine) followed by selection of the desired strain on a suitable breeding medium.
Хорошо известно, что разнообразные воздействия, которые вызывают стресс у микробных клеток (температура, облучение, голод, ингибиторы и антибиотики), могут приводить к разрывам РНК и ДНК с последующей экскрецией производных нуклеиновых кислот (Domain A. (1968). Production of purine nucleotides by fermentation. In: Progress in Inductrial Microbiology, vol.18. Ed. D.J.D.Hockenhell. J.&A.Churchill Ltd., London). В настоящее время общепризнанно, что проникновение метаболитов через цитоплазматическую мембрану обычно происходит с участием более или менее специфических транспортных белков, осуществляющих их выброс (Рао et al, 1998, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62, 1-34; Paulsen et al, 1998, J. Mol. Biol., 277, 573-592; Saier et al, 1999, J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 1, 257-279). Много лет назад было показано (Billen, D., 1957, Arch. Biochem. Biophys., 67, 333-340), что облученные УФ и рентгеновскими лучами клетки Escherichia coli экскретируют свободные основания, рибозиды, мононуклеотиды и АТФ. Такое высвобождение не было результатом лизиса клеток, поскольку никакие производные ДНК или пептиды при этом не обнаруживались.It is well known that the diverse effects that cause stress in microbial cells (temperature, radiation, hunger, inhibitors, and antibiotics) can lead to RNA and DNA breaks followed by excretion of nucleic acid derivatives (Domain A. (1968). Production of purine nucleotides by fermentation. In: Progress in Inductrial Microbiology, vol. 18. Ed. DJD Hockenhell. J. & A. Churchill Ltd., London). Currently, it is generally accepted that the penetration of metabolites through the cytoplasmic membrane usually occurs with the participation of more or less specific transport proteins that release them (Rao et al, 1998, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62, 1-34; Paulsen et al , 1998, J. Mol. Biol., 277, 573-592; Saier et al, 1999, J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 1, 257-279). It was shown many years ago (Billen, D., 1957, Arch. Biochem. Biophys., 67, 333-340) that Escherichia coli cells irradiated with UV and X-rays excrete free bases, ribosides, mononucleotides and ATP. This release was not the result of cell lysis, since no DNA derivatives or peptides were detected.
Описание изобретенияDescription of the invention
Целью настоящего изобретения являются увеличение продуктивности инозина штаммами-продуцентами инозина и предоставление способа получения инозина с использованием указанных штаммов, а также предоставление более эффективного способа получения инозин-5'-фосфата, в котором инозин используется в качестве промежуточного соединения для получения инозин-5'-фосфата.The aim of the present invention is to increase the productivity of inosine by producer strains of inosine and to provide a method for producing inosine using these strains, as well as to provide a more efficient method for producing inosine-5'-phosphate, in which inosine is used as an intermediate to obtain inosine-5'- phosphate.
Авторы настоящего изобретения предположили, что некоторые мутации, оказывающие влияние на структуру и/или функционирование клеточной мембраны, могут имитировать условия стресса и индуцировать усиление активности специфических транспортеров, увеличивая тем самым накопление в культуральной жидкости производных нуклеиновых кислот, таких как пуриновые нуклеозиды, предпочтительно инозин и ксантозин. С этой целью авторы настоящего изобретения установили, что микроорганизм, принадлежащий к роду Bacillus и содержащий новообнаруженные мутации, которые придают микроорганизму устойчивость к пептидным антибиотикам, таким как полимиксин В и колистин, может продуцировать и накапливать в культуральной жидкости значительно большие количества пуриновых нуклеозидов. Ранее не было общепризнанно, что продуктивность пуриновых нуклеозидов может быть улучшена путем наделения указанными чертами микроорганизмов - продуцентов пуриновых нуклеозидов. Поэтому данная работа была продолжена на основе обнаруженных фактов для завершения настоящего изобретения.The authors of the present invention suggested that some mutations that affect the structure and / or functioning of the cell membrane can mimic stress conditions and induce an increase in the activity of specific transporters, thereby increasing the accumulation in the culture fluid of nucleic acid derivatives such as purine nucleosides, preferably inosine and xanthosine. To this end, the authors of the present invention have found that a microorganism belonging to the genus Bacillus and containing newly discovered mutations that give the microorganism resistance to peptide antibiotics, such as polymyxin B and colistin, can produce and accumulate significantly larger amounts of purine nucleosides in the culture fluid. It was previously not universally recognized that the productivity of purine nucleosides can be improved by endowing these traits with microorganisms producing purine nucleosides. Therefore, this work was continued based on the facts discovered to complete the present invention.
Таким образом, настоящее изобретение предоставляет микроорганизм, принадлежащий к роду Bacillus, обладающий способностью к продукции пуриновых нуклеозидов. В частности, настоящее изобретение предоставляет микроорганизм с повышенной способностью к продукции пуриновых нуклеозидов, основанной на мутации, придающей микроорганизму устойчивость к пептидным антибиотикам, таким как полимиксин В и колистин.Thus, the present invention provides a microorganism belonging to the genus Bacillus, with the ability to produce purine nucleosides. In particular, the present invention provides a microorganism with an increased ability to produce purine nucleosides based on a mutation that confers resistance to peptide antibiotics, such as polymyxin B and colistin, to the microorganism.
Далее настоящее изобретение предоставляет способ получения пуриновых нуклеозидов методом ферментации, включающим стадии выращивания указанного выше микроорганизма в питательной среде с целью продукции и накопления пуриновых нуклеозидов в питательной среде, и выделения пуриновых нуклеозидов из культуральной жидкости.Further, the present invention provides a method for producing purine nucleosides by a fermentation method, comprising the steps of growing the above microorganism in a culture medium in order to produce and accumulate purine nucleosides in a culture medium and isolate purine nucleosides from the culture fluid.
Далее настоящее изобретение предоставляет способ получения пуриновых нуклеотидов, таких как инозин-5'-фосфат, ксантозин-5'-фосфата и гуанозин-5'-фосфата, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного пуринового нуклеозида и выделения полученного пуринового нуклеозида.Further, the present invention provides a method for producing purine nucleotides, such as inosine-5'-phosphate, xanthosine-5'-phosphate and guanosine-5'-phosphate, comprising the steps of growing the bacterium of the present invention in a nutrient medium, phosphorylation of the obtained and accumulated purine nucleoside and isolation of the resulting purine nucleoside.
Также настоящее изобретение предоставляет способ получения гуанозин-5'-фосфата, включающий стадии выращивания указанной выше бактерии в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного ксантозина, аминирования полученного ксантозин-5'-фосфата и выделения полученного гуанозин-5'-фосфата.The present invention also provides a method for producing guanosine 5'-phosphate, comprising the steps of growing the above bacteria in a nutrient medium, phosphorylating the obtained and accumulated xanthosine, aminating the obtained xanthosine 5'-phosphate, and isolating the obtained guanosine 5'-phosphate.
Настоящее изобретение включает в себя следующее:The present invention includes the following:
1. Бактерия, принадлежащая к роду Bacillus, обладающая устойчивостью к ингибированию роста полимиксином В и/или колистином и способностью к продукции пуринового нуклеозида.1. A bacterium belonging to the genus Bacillus, which is resistant to growth inhibition by polymyxin B and / or colistin and the ability to produce purine nucleoside.
2. Бактерия, принадлежащая к роду Bacillus, в соответствии с п.1, которая принадлежит к виду Bacillus subtilis.2. A bacterium belonging to the genus Bacillus, in accordance with claim 1, which belongs to the species Bacillus subtilis.
3. Бактерия, принадлежащая к роду Bacillus, в соответствии с п.1, которая принадлежит к виду Bacillus amyloliquefaciens.3. A bacterium belonging to the genus Bacillus, in accordance with claim 1, which belongs to the species Bacillus amyloliquefaciens.
4. Бактерия в соответствии с пп.1-3, в которой пуриновым нуклеозидом является инозин.4. The bacterium in accordance with claims 1 to 3, in which the purine nucleoside is inosine.
5. Бактерия в соответствии с пп.1-3, в которой пуриновым нуклеозидом является ксантозин.5. The bacterium in accordance with claims 1 to 3, in which the purine nucleoside is xanthosine.
6. Бактерия в соответствии с пп.1-3, в которой пуриновым нуклеозидом является гуанозин.6. The bacterium in accordance with claims 1 to 3, in which the purine nucleoside is guanosine.
7. Способ получения пуринового нуклеозида, включающий стадии выращивания бактерии в соответствии с любым пп.1-6 в питательной среде с целью продукции и накопления в питательной среде пуринового нуклеозида и выделения пуринового нуклеозида из культуральной жидкости.7. A method for producing a purine nucleoside, comprising the steps of growing a bacterium in accordance with any of claims 1 to 6 in a nutrient medium for the purpose of producing and accumulating a purine nucleoside in a nutrient medium and isolating the purine nucleoside from the culture fluid.
8. Способ в соответствии с п.7, в котором пуриновым нуклеозидом является инозин.8. The method according to claim 7, wherein the purine nucleoside is inosine.
9. Способ в соответствии с п.7, в котором пуриновым нуклеозидом является ксантозин.9. The method according to claim 7, wherein the purine nucleoside is xanthosine.
10. Способ в соответствии с п.7, в котором пуриновым нуклеозидом является гуанозин.10. The method according to claim 7, wherein the purine nucleoside is guanosine.
11. Способ получения пуринового нуклеотида, включающий стадии выращивания бактерии в соответствии с любым из пп.1-6 в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного нуклеозида и выделения полученного и накопленного пуринового нуклеотида.11. A method for producing a purine nucleotide, comprising the steps of growing a bacterium in accordance with any one of claims 1 to 6 in a nutrient medium, phosphorylating the obtained and accumulated nucleoside and isolating the obtained and accumulated purine nucleotide.
12. Способ в соответствии с п.11, в котором пуриновым нуклеотидом является инозин-5'-фосфат.12. The method according to claim 11, wherein the purine nucleotide is inosine-5'-phosphate.
13. Способ в соответствии с п.11, в котором пуриновым нуклеотидом является ксантозин-5'-фосфат.13. The method according to claim 11, wherein the purine nucleotide is xanthosine 5'-phosphate.
14. Способ в соответствии с п.11, в котором пуриновым нуклеотидом является гуанозин-5'-фосфат.14. The method according to claim 11, wherein the purine nucleotide is guanosine 5'-phosphate.
15. Способ получения гуанозин-5'-фосфата, включающий стадии выращивания бактерии в соответствии с п.5 в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного ксантозина, аминирования полученного ксантозин-5'-фосфата и выделения полученного и накопленного гуанозин-5'-фосфата.15. A method of producing guanosine-5'-phosphate, comprising the steps of growing a bacterium in accordance with claim 5 in a nutrient medium, phosphorylation of the obtained and accumulated xanthosine, amination of the obtained xanthosine-5'-phosphate and isolation of the obtained and accumulated guanosine-5'-phosphate .
Настоящее изобретение более детально будет описано ниже.The present invention will be described in more detail below.
1. Бактерия согласно настоящему изобретению.1. The bacterium according to the present invention.
Вышеуказанная бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена, исходя из бактерии, уже обладающей способностью к продукции пуриновых нуклеозидов, путем придания ему заданной устойчивости. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению также может быть получена путем придания способности к продукции пуриновых нуклеозидов бактерии, обладающей заданной устойчивостью.The aforementioned bacterium according to the present invention can be obtained starting from a bacterium already possessing the ability to produce purine nucleosides by imparting a predetermined stability to it. On the other hand, the bacterium according to the present invention can also be obtained by imparting the ability to produce purine nucleosides of a bacterium with a given resistance.
Термин "бактерия, обладающая устойчивостью к ингибированию роста полимиксином В и/или колистином" означает бактерию, полученную из родительского штамма и обладающую генетическими свойствами, модифицированными таким образом, что она может расти в питательной среде, содержащей пептидные антибиотики, такие как полимиксин В и/или колистин.The term "bacterium that is resistant to growth inhibition by polymyxin B and / or colistin" means a bacterium derived from the parent strain and having genetic properties modified so that it can grow in a nutrient medium containing peptide antibiotics such as polymyxin B and / or colistin.
Например, бактерия, которая способна образовывать колонии в течение 3-5 дней в ходе выращивания при 34°С на чашках с агаром, содержащим 5 мг/л или более, предпочтительно 10 мг/л или более полимиксина В, или 5 мг/л или более, предпочтительно 10 мг/л или более колистина, является устойчивой к указанным пептидным антибиотикам.For example, a bacterium that is capable of forming colonies within 3-5 days during cultivation at 34 ° C on agar plates containing 5 mg / L or more, preferably 10 mg / L or more Polymyxin B, or 5 mg / L or more, preferably 10 mg / L or more, of colistin is resistant to said peptide antibiotics.
В дополнение к уже упомянутым выше свойствам указанная бактерия может обладать другими специфическими свойствами, такими как потребность в различных питательных добавках, устойчивость или чувствительность к химическим реагентам, зависимость от химических соединений, не выходя при этом за границы настоящего изобретения.In addition to the properties already mentioned above, this bacterium may have other specific properties, such as the need for various nutritional supplements, resistance or sensitivity to chemical reagents, dependence on chemical compounds, without going beyond the boundaries of the present invention.
Полимиксин В и колистин (полимиксин F) вместе с грамицидином, нигерицином и подобными соединениями принадлежит к классу химических соединений, называемых "пептидными антибиотиками". Указанные соединения оказывают влияние на структуру и функционирование клеточной мембраны и имитируют условия стресса. Пептидые антибиотики являются соединениями, эффективными против грамотрицательных бактерий (Vaara, Microbiol. Rev., 56, 395-411, 1992). Авторы настоящего изобретения обнаружили, что полимиксины также могут ингибировать рост грамположительных бактерий, принадлежащих к роду Bacillus. Мутации в бактериях, принадлежащих к роду Bacillus, придающие устойчивость полимиксинам, могут оказывать влияние на цитоплазматическую мембрану и имитировать условия стресса, индуцируя транспортеры для выброса из клетки пуриновых нуклеозидов.Polymyxin B and colistin (polymyxin F) together with gramicidin, nigericin and similar compounds belong to the class of chemical compounds called “peptide antibiotics”. These compounds affect the structure and functioning of the cell membrane and mimic stress conditions. Peptide antibiotics are compounds effective against gram-negative bacteria (Vaara, Microbiol. Rev., 56, 395-411, 1992). The inventors have found that polymyxins can also inhibit the growth of gram-positive bacteria belonging to the genus Bacillus. Mutations in bacteria belonging to the genus Bacillus, conferring resistance to polymyxins, can affect the cytoplasmic membrane and mimic stress conditions, inducing transporters to release purine nucleosides from the cell.
Бактерия согласно настоящему изобретению может обладать так называемой "перекрестной устойчивостью" к пептидным антибиотикам. Это означает, что бактерия, которой придана устойчивость к одному из пептидных антибиотиков, может проявлять устойчивость к другому пептидному антибиотику (смотри раздел "Примеры"). Предполагается, что пептидные антибиотики могут обладать сходным механизмом действия. Например, показано, что как полимиксин В, так и грамицидин S индуцируют накопление гуанозинтетрафосфата - регуляторного нуклеотида строгого ответа - в условиях ингибирования указанными антибиотиками макромолекулярного синтеза (Cortay J.C. and Cozzone A.J., Bochim. Biophys. Acta, 1983, 755(3), 467-473).The bacterium according to the present invention may have the so-called "cross-resistance" to peptide antibiotics. This means that a bacterium that is given resistance to one of the peptide antibiotics may show resistance to another peptide antibiotic (see the "Examples" section). It has been suggested that peptide antibiotics may have a similar mechanism of action. For example, it has been shown that both polymyxin B and gramicidin S induce the accumulation of guanosine tetraphosphate, the strict regulatory regulatory nucleotide, under conditions of inhibition of macromolecular synthesis by the indicated antibiotics (Cortay JC and Cozzone AJ, Bochim. Biophys. Acta, 1983, 755 (3), 467 -473).
Термин "бактерия, обладающая способностью к продукции пуринового нуклеозида" означает способность бактерии к продукции и накоплению значительного количества пуринового нуклеозида в питательной среде в ходе выращивания указанной бактерии в этой питательной среде. Обычно это означает способность к накоплению в питательной среде не менее чем 50 мг/л, предпочтительно не менее чем 0,5 мг/л пуринового нуклеозида в условиях, описанных в Примерах (смотри ниже).The term "bacterium with the ability to produce purine nucleoside" means the ability of a bacterium to produce and accumulate a significant amount of purine nucleoside in a nutrient medium during the growth of said bacterium in this nutrient medium. Usually this means the ability to accumulate in a nutrient medium not less than 50 mg / l, preferably not less than 0.5 mg / l of purine nucleoside under the conditions described in the Examples (see below).
Использованный здесь термин "пуриновый нуклеозид" включает в себя инозин, ксантозин и гуанозин.As used herein, the term “purine nucleoside” includes inosine, xanthosine, and guanosine.
Мутантный микроорганизм, полезный для осуществления настоящего изобретения, может быть получен путем генерации мутаций с использованием традиционных методов мутагенеза, таких как облучение УФ-излучением, рентгеновским излучением, радиоактивным излучением, или обработка химическими мутагенами с последующей селекцией методом реплики. Предпочтительным мутагеном является N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (здесь и далее упоминаемый как NTG).A mutant microorganism useful for carrying out the present invention can be obtained by generating mutations using conventional mutagenesis methods, such as irradiation with UV radiation, x-ray radiation, radioactive radiation, or treatment with chemical mutagens, followed by selection by replica. A preferred mutagen is N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (hereinafter referred to as NTG).
Таким образом, возможно подвергнуть любой известный штамм, принадлежащий к роду Bacillus и уже обладающий способностью к продукции пуринового нуклеозида, одной из указанных выше процедур для получения мутантного штамма, а затем проверить полученный мутантный штамм, чтобы определить, удовлетворяет ли он упомянутым выше условиям настоящего изобретения относительно устойчивости к пептидным антибиотикам и, следовательно, подходящим для использования в настоящем изобретении. Полученные штаммы проверяются путем выращивания в питательной среде, отбираются штаммы, обладающие способностью к продукции пуринового нуклеозида с выходом, большим чем у родительского штамма, и отобранные штаммы используются в настоящем изобретении.Thus, it is possible to expose any known strain belonging to the genus Bacillus and already possessing the ability to produce purine nucleoside, one of the above procedures to obtain a mutant strain, and then check the resulting mutant strain to determine whether it satisfies the above conditions of the present invention regarding resistance to peptide antibiotics and, therefore, suitable for use in the present invention. The obtained strains are checked by growing in a nutrient medium, strains with the ability to produce purine nucleoside with a yield greater than that of the parent strain are selected, and the selected strains are used in the present invention.
Штаммы, удовлетворяющие требованиям настоящего изобретения, также могут быть получены с помощью методов генной рекомбинации, хорошо известных специалисту в данной области техники.Strains that satisfy the requirements of the present invention can also be obtained using methods of gene recombination, well known to a person skilled in the art.
Вышеуказанные особенности устойчивости могут комбинироваться в одном штамме методами последовательной селекции или генной рекомбинации.The above stability features can be combined in a single strain by sequential selection or gene recombination.
В качестве примеров микроорганизма, принадлежащего к роду Bacillus, использованного в настоящем изобретении, могут быть приведены Bacillus subtilis (В. subtilis), Bacillus amyloliquefaciens (B. amyloliquefaciens) и подобные им. Репрезентативными примерами штаммов согласно настоящему изобретению, которые могут быть использованы на практике, являются Bacillus subtilis KMBS16 polR 1-1 (ВКПМ В-8245), Bacillus amyloliquefaciens ColR 7-105 (ВКПМ В-8246). Указанные бактерии, которые могут быть использованы для продукции пуриновых нуклеозидов в соответствии с настоящим изобретением, обладают такими же бактериологическими свойствами, как и родительские штаммы, за исключением устойчивости к пептидным антибиотикам и способности к продукции пуринового нуклеозида с большим выходом. Штаммы Bacillus subtilis KMBS16 polR 1-1 и Bacillus amyloliquefaciens ColR 7-105 депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 113545 Москва, 1-й Дорожный поезд, 1) 29 января 2002 под инвентарными номерами ВКПМ В-8245 и ВКПМ В-8246 соответственно.As examples of a microorganism belonging to the genus Bacillus used in the present invention, Bacillus subtilis (B. subtilis), Bacillus amyloliquefaciens (B. amyloliquefaciens) and the like can be cited. Representative examples of strains of the present invention that can be used in practice are Bacillus subtilis KMBS16 pol R 1-1 (VKPM B-8245), Bacillus amyloliquefaciens Col R 7-105 (VKPM B-8246). These bacteria, which can be used to produce purine nucleosides in accordance with the present invention, have the same bacteriological properties as parent strains, with the exception of resistance to peptide antibiotics and the ability to produce purine nucleoside in high yield. The strains of Bacillus subtilis KMBS16 pol R 1-1 and Bacillus amyloliquefaciens Col R 7-105 were deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 113545 Moscow, 1st Road Train, 1) January 29, 2002 under accession numbers VKPM V-8245 and VKPM B-8246, respectively.
В качестве родительского штамма, который может быть улучшен с целью получения бактерии согласно настоящему изобретению, могут быть использованы штаммы, принадлежащие к роду Bacillus, такие как штамм Bacillus subtilis AJ12707 (FERM Р-12951) (патентная заявка Японии JP6113876), штамм Bacillus subtilis AJ3772 (FERM-P 2555) (патентная заявка Японии JP62014794), Bacillus pumilus NA-1102 (FERM BP-289), Bacillus subtilis NA-6011 (FERM BP-291) и Bacillus subtilis NA-6012 (FERM BP-292) (патент США 4701413), В. pumilis Gottheil No. 3218 (ATCC No. 21005) (патент США 3616206), штамм В. amyloliquefaciens AS115-7 (VKPM B-6134) (патент РФ №2003678) или подобные им. Также может быть использован штамм В. subtilis KMBS16. Этот штамм является производным от известного штамма В. subtilis 168 trpC2, содержащим мутации, введенные в ген purR, кодирующий пуриновый репрессор (purR::spc), ген ригА, кодирующий сукцинил-АМФ синтазу (purA::erm), и ген deoD, кодирующий фосфорилазу пуриновых нуклеозидов (deoD::kan).As a parent strain that can be improved to produce bacteria according to the present invention, strains belonging to the genus Bacillus can be used, such as Bacillus subtilis strain AJ12707 (FERM P-12951) (Japanese patent application JP6113876), Bacillus subtilis strain AJ3772 (FERM-P 2555) (Japanese patent application JP62014794), Bacillus pumilus NA-1102 (FERM BP-289), Bacillus subtilis NA-6011 (FERM BP-291) and Bacillus subtilis NA-6012 (FERM BP-292) (patent USA 4701413), B. pumilis Gottheil No. 3218 (ATCC No. 21005) (US patent 3,616,206), B. amyloliquefaciens AS115-7 strain (VKPM B-6134) (RF patent No. 2003678) or the like. Can also be used strain B. subtilis KMBS16. This strain is derived from the known B. subtilis 168 trpC2 strain containing mutations introduced into the purR gene encoding the purine repressor (purR :: spc), the rigA gene encoding the succinyl AMP synthase (purA :: erm), and the deoD gene, encoding purine nucleoside phosphorylase (deoD :: kan).
1. Способ получения пуриновых нуклеозидов.1. The method of obtaining purine nucleosides.
К способам согласно настоящему изобретению относится способ получения пуринового нуклеозида, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления указанного пуринового нуклеозида в питательной среде, и выделения пуринового нуклеозида из культуральной жидкости.The methods of the present invention include a method for producing a purine nucleoside, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a culture medium to produce and accumulate said purine nucleoside in a culture medium and isolate the purine nucleoside from the culture fluid.
В способе согласно настоящему изобретению выращивание бактерии, принадлежащей к роду Bacillus, выделение и очистка пуринового нуклеозида из культуральной жидкости могут быть осуществлены способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых пуриновый нуклеозид продуцируется с использованием микроорганизма.In the method according to the present invention, the cultivation of bacteria belonging to the genus Bacillus, the isolation and purification of purine nucleoside from the culture fluid can be carried out in a manner similar to traditional fermentation methods in which the purine nucleoside is produced using a microorganism.
Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, неорганические ионы и другие необходимые органические компоненты. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза, лактоза, галактоза, фруктоза, арабиноза, мальтоза, ксилоза, трехалоза, рибоза и гидролизат крахмала; спирты, такие как глицерин, маннитол и сорбитол; различные органические кислоты, такие как глюконовая кислота, фумаровая кислота, лимонная кислота и янтарная кислота и подобные им. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как сульфат аммония, хлорид аммония и фосфат аммония, органические источники азота, такие как гидролизат соевых бобов; газообразный аммиак и подобные соединения. Желательно, чтобы подходящие небольшие количества витаминов, таких как витамин B1, и других необходимых веществ, например нуклеиновых кислот, таких как аденин и РНК, или дрожжевой экстракт и подобные соединения присутствовали в питательной среде в качестве органических питательных компонент. Кроме того, небольшие количества фосфата кальция, сульфата магния, ионов железа, ионов марганца и подобных соединений могут быть добавлены, если необходимо.The nutrient medium used for growing can be either synthetic or natural, provided that the medium contains sources of carbon, nitrogen, inorganic ions and other necessary organic components. Carbon sources include various carbohydrates such as glucose, lactose, galactose, fructose, arabinose, maltose, xylose, trialose, ribose and starch hydrolyzate; alcohols such as glycerin, mannitol and sorbitol; various organic acids such as gluconic acid, fumaric acid, citric acid and succinic acid and the like. As the nitrogen source, various inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate, organic nitrogen sources such as soybean hydrolyzate can be used; ammonia gas and the like. Suitable small amounts of vitamins, such as vitamin B 1 , and other essential substances, for example, nucleic acids, such as adenine and RNA, or yeast extract and the like, are preferably present in the nutrient medium as organic nutrients. In addition, small amounts of calcium phosphate, magnesium sulfate, iron ions, manganese ions and similar compounds can be added, if necessary.
Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях в течение 16-72 часов, температура при выращивании поддерживается в пределах от 30 до 45°С и рН в пределах от 5 до 8. рН среды может регулироваться неорганическими или органическими кислотными или щелочными веществами, а также газообразным аммиаком.The cultivation is preferably carried out under aerobic conditions for 16-72 hours, the temperature during cultivation is maintained in the range from 30 to 45 ° C and the pH is in the range from 5 to 8. The pH of the medium can be regulated by inorganic or organic acid or alkaline substances, as well as gaseous ammonia .
Целевой пуриновый нуклеозид может быть выделен из культуральной жидкости любым из традиционных методов или любой комбинацией этих методов, такими как ионообменная хроматография и осаждение.The target purine nucleoside can be isolated from the culture fluid by any of the conventional methods or any combination of these methods, such as ion exchange chromatography and precipitation.
3. Способ получения пуриновых нуклеотидов.3. A method for producing purine nucleotides.
К способам согласно настоящему изобретению также относится способ получения пуринового нуклеотида, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного пуринового нуклеозида и выделения полученного и накопленного пуринового нуклеотида. Более конкретно, к способам согласно настоящему изобретению также относится способ получения инозин-5'-фосфата, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного инозина и выделения полученного и накопленного инозин-5'-фосфата. Также к способам согласно настоящему изобретению относится способ получения ксантозин-5'-фосфата, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного ксантозина и выделения полученного и накопленного ксантозин-5'-фосфата. Также к способам согласно настоящему изобретению также относится способ получения гуанозин-5'-фосфата, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного гуанозина и выделения полученного и накопленного гуанозин-5'-фосфата.The methods of the present invention also include a method for producing a purine nucleotide, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a nutrient medium, phosphorylating the obtained and accumulated purine nucleoside and isolating the obtained and accumulated purine nucleotide. More specifically, the methods of the present invention also include a method for producing inosine-5'-phosphate, comprising the steps of growing the bacteria of the present invention in a nutrient medium, phosphorylating the obtained and accumulated inosine and isolating the obtained and accumulated inosine-5'-phosphate. The methods of the present invention also include a method for producing xanthosine 5'-phosphate, comprising the steps of growing the bacteria of the present invention in a nutrient medium, phosphorylating the obtained and accumulated xanthosine and isolating the obtained and accumulated xanthosine 5'-phosphate. Also related to the methods of the present invention is a method for producing guanosine 5'-phosphate, comprising the steps of growing the bacteria of the present invention in a nutrient medium, phosphorylating the obtained and accumulated guanosine and isolating the obtained and accumulated guanosine-5'-phosphate.
Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка пуринового нуклеозида из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых пуриновый нуклеозид продуцируется с использованием микроорганизма. Далее согласно настоящему изобретению фосфорилирование полученного и накопленного пуринового нуклеозида, а также выделение полученного и накопленного пуринового нуклеотида может быть осуществлено методом, подобным традиционным методам, в которых пуриновый нуклеотид получается из пуринового нуклеозида.According to the present invention, the cultivation, isolation and purification of purine nucleoside from a culture or similar liquid can be carried out in a manner similar to traditional fermentation methods in which the purine nucleoside is produced using a microorganism. Further, according to the present invention, the phosphorylation of the obtained and accumulated purine nucleoside, as well as the isolation of the obtained and accumulated purine nucleotide can be carried out by a method similar to traditional methods in which the purine nucleotide is obtained from a purine nucleoside.
Фосфорилирование пуринового нуклеозида может быть осуществлено ферментативно с использованием различных фосфатаз, нуклеозидкиназ и нуклеозидфосфотрансфераз, или химически с использованием фосфорилирующих агентов, таких как POCl3 или подобным им. Могут быть использованы фосфатаза, способная к катализу селективного переноса фосфорильной группы пирофосфата в 5'-положение нуклеозида (Mihara et. al, Phosphorylation of nucleosides by the mutated acid phosphatase from Morganella morganii. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66:2811-2816), или кислая фосфатаза, использующая полифосфорные кислоты (их соли), фенилфосфорную кислоту (ее соли) или карбамилфосфорную кислоту (ее соли) в качестве донора фосфорной кислоты (WO9637603 A1), или подобные им. Также, в качестве примера фосфатазы может быть приведена фосфатаза, способная к каталитическому переносу фосфорильной группы в 2', 3', 5'-положение нуклеозида с использованием в качестве субстрата п-нитрофенилфосфата (Mitsugi, К., et al, Agric. Biol. Chem. 1964,28, 586-600), неорганического фосфата (JP42-1186), или ацетил фосфата (JP61-41555), или подобная ей. В качестве примера нуклеозидкиназы может быть приведена гуанозин-инозинкиназа из Е. coli (Mori et. al. Cloning of a guanosine-inosine kinase gene of Escherichia coli and characterization of the purified gene product. J. Bacteriol. 1995. 177:4921-4926; WO9108286), или подобная ей. В качестве примера нуклеозидфосфотрансферазы может быть приведена нуклеозидфосфотрансфераза, описанная Hammer-Jespersen, К. (Nucleoside catabolism, p.203-258. In A Munch-Petesen (ed.). Metabolism of nucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganism. 1980, Academic Press, New York), или подобная ей. Химическое фосфорилирование нуклеозидов может быть осуществлено с использованием фосфорилирующего агента, такого как POCl3 (Yoshikawa et. al. Studies of phosphorylation. III. Selective phosphorylation of unprotected nucleosides. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1969, 42:3505-3508), или подобного ему.Phosphorylation of purine nucleoside can be carried out enzymatically using various phosphatases, nucleoside kinases and nucleoside phosphotransferases, or chemically using phosphorylating agents such as POCl 3 or the like. Phosphatase capable of catalyzing the selective transfer of the phosphoryl group of pyrophosphate to the 5'-position of a nucleoside (Mihara et. Al, Phosphorylation of nucleosides by the mutated acid phosphatase from Morganella morganii. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66: 2811-2816 can be used). ), or acid phosphatase using polyphosphoric acids (their salts), phenylphosphoric acid (its salts) or carbamylphosphoric acid (its salts) as a phosphoric acid donor (WO9637603 A1), or the like. Also, phosphatase capable of catalytically transferring a phosphoryl group to the 2 ', 3', 5'-position of a nucleoside using p-nitrophenyl phosphate as a substrate (Mitsugi, K., et al, Agric. Biol. Chem. 1964.28, 586-600), inorganic phosphate (JP42-1186), or acetyl phosphate (JP61-41555), or the like. Guanosine inosine kinase from E. coli (Mori et. Al. Cloning of a guanosine-inosine kinase gene of Escherichia coli and characterization of the purified gene product. J. Bacteriol. 1995. 177: 4921-4926 can be cited ; WO9108286), or the like. As an example of nucleoside phosphotransferase, the nucleoside phosphotransferase described by Hammer-Jespersen, K. (Nucleoside catabolism, p.203-258. In A Munch-Petesen (ed.). Metabolism of nucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganism. 1980, Academic Press, New York), or the like. Chemical nucleoside phosphorylation can be carried out using a phosphorylating agent such as POCl 3 (Yoshikawa et. Al. Studies of phosphorylation. III. Selective phosphorylation of unprotected nucleosides. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1969, 42: 3505-3508), or the like.
Также к способам согласно настоящему изобретению относится способ получения гуанозин-5'-фосфата, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного ксантозина, аминирования полученного и накопленного ксантозин-5'-фосфата и выделения полученного и накопленного гуанозин-5'-фосфата. Согласно настоящему изобретению выращивание бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, фосфорилирование полученного и накопленного ксантозина, аминирование полученного и накопленного ксантозин-5'-фосфата, а также выделение полученного и накопленного гуанозин-5'-фосфата может быть осуществлено методом, подобным традиционным методам, в которых гуанозин-5'-фосфат получается из ксантозин-5'-фосфата.The methods of the present invention also include a method for producing guanosine-5'-phosphate, comprising the steps of growing the bacteria of the present invention in a nutrient medium, phosphorylating the obtained and accumulated xanthosine, amination of the obtained and accumulated xanthosine-5'-phosphate, and isolating the obtained and accumulated guanosine- 5'-phosphate. According to the present invention, the cultivation of the bacteria according to the present invention in a nutrient medium, the phosphorylation of the obtained and accumulated xanthosine, the amination of the obtained and accumulated xanthosine 5'-phosphate, and the isolation of the obtained and accumulated guanosine-5'-phosphate can be carried out by a method similar to traditional methods in which guanosine 5'-phosphate is derived from xanthosine 5'-phosphate.
Аминирование ксантозин-5'-фосфата может быть осуществлено ферментативно с использованием, например, GMP синтетазы из Е. coli (Fujio et. al. High level of expression of XMP aminase in Escherichia coli and its application for the industrial production of 5'-guanylic acid. Biosci. Biotech. Biochem. 1997, 61:840-845; EP0251489 B1).Amination of xanthosine 5'-phosphate can be carried out enzymatically using, for example, GMP synthetase from E. coli (Fujio et. Al. High level of expression of XMP aminase in Escherichia coli and its application for the industrial production of 5'-guanylic acid. Biosci. Biotech. Biochem. 1997, 61: 840-845; EP0251489 B1).
В способе согласно настоящему изобретению бактерия согласно настоящему изобретению может быть модифицирована с целью увеличения экспрессии генов биосинтеза пуриновых нуклеозидов.In the method of the present invention, the bacterium of the present invention can be modified to increase expression of purine nucleoside biosynthesis genes.
Наилучший способ осуществления изобретенияBEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Пример - ссылка 1. Конструирование штамма В. subtilis KMBS16 - продуцента инозина.Example - link 1. Construction of a strain of B. subtilis KMBS16 - producer of inosine.
Штамм В. subtilis KMBS16 - продуцент инозина, являющийся мутантом, содержащим инсерционно-делеционные мутации в генах purR,purA и deoD, был получен из штамма Bacillus subtilis 168 Marburg.Strain B. subtilis KMBS16, the producer of inosine, which is a mutant containing insertion-deletion mutations in the genes purR, purA, and deoD, was obtained from a strain of Bacillus subtilis 168 Marburg.
1) Конструирование мутанта В. subtilis, дефицитного по purR.1) Construction of a B. subtilis mutant deficient in purR.
ПЦР осуществлялась при 94°С, 30 секунд; 55°С, 1 мин; 72°С, 1 мин; 30 циклов; (Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), с использованием хромосомной ДНК штамма В. subtilis 168 Marburg в качестве матрицы, и следующих олигонуклеотидных затравок, №1 (SEQ ID NO:1) и №2 (SEQ ID NO:2), синтезированных в соответствии с последовательностью ДНК в геномном банке данных. Затравка №1 (28 звеньев) включает в себя последовательность с 246 по 228 нуклеотид перед старт-кодоном гена purR из В. subtilis (M. Weng, P. L. Nagy, and H. Zalkin. Identification of the Bacillus subtilis pur operon repressor. Proc. Natl. Acad, Sci. USA. 1995,92:7455-7459), а также 9 дополнительных нуклеотидов, содержащих сайт Hindlll, присоединенных к 5'-концу. Затравка №2 (28 звеньев) включает в себя последовательность с 57 по 75 нуклеотид после стоп-кодоном гена purR, а также 9 дополнительных нуклеотидов, содержащих сайт PstI, присоединенных к 5'-концу. Фрагмент, полученный в ходе ПЦР, (0.9 т.п.о.) и обработанный HindIII и PstI, был вставлен по тем же сайтам рестрикции вектора pHSG398 (TaKaRa, Япония) с образованием плазмиды pHSG398BSPR. EcoRV - HincII фрагмент (0.3 т.п.о.) во внутренней части амплифицированного гена ригR был удален из плазмиды pHSG398BSPR, и замещен геном устойчивости к спектиномицину (1.2 т.п.о.) из Enterococcu faecalis, вырезанным из pDG1726 (Bacillus Genetic Stock Center, Ohio).PCR was performed at 94 ° C for 30 seconds; 55 ° C, 1 min; 72 ° C, 1 min; 30 cycles; (Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), using the chromosomal DNA of strain B. subtilis 168 Marburg as a matrix, and the following oligonucleotide seeds, No. 1 (SEQ ID NO: 1) and No. 2 (SEQ ID NO: 2) synthesized in accordance with the DNA sequence in the genomic database. Seed No. 1 (28 links) includes the sequence from 246 to 228 nucleotides before the start codon of the purR gene from B. subtilis (M. Weng, PL Nagy, and H. Zalkin. Identification of the Bacillus subtilis pur operon repressor. Proc. Natl. Acad, Sci. USA. 1995.92: 7455-7459), as well as 9 additional nucleotides containing the Hindlll site, attached to the 5'-end. Seed No. 2 (28 links) includes a sequence from 57 to 75 nucleotides after the stop codon of the purR gene, as well as 9 additional nucleotides containing the PstI site attached to the 5'-end. A fragment obtained by PCR (0.9 kb) and treated with HindIII and PstI was inserted at the same restriction sites of the pHSG398 vector (TaKaRa, Japan) to form the plasmid pHSG398BSPR. The EcoRV - HincII fragment (0.3 kb) in the interior of the amplified ribR gene was removed from the plasmid pHSG398BSPR and replaced with the spectinomycin resistance gene (1.2 kb) from Enterococcu faecalis excised from pDG1726 (Bacillus Genetic Stock Center, Ohio).
Полученная плазмида pHSG398purR::spc была использована для трансформации компетентных клеток В. subtilis 168 Marburg, полученных методом Dubunau и Davidoff-Abelson (Dubnau, D., and R. Davidoff-Abelson. Fate of transforming DNA following uptake by competent Bacillus subtilis. J. Mol. Biol. 1971, 56:209-221). Двойные перекрестные мутанты были протестированы путем приготовления хромосомной ДНК из каждой колонии, устойчивой к спектиномицину, с последующей ПЦР, как описано выше. Одна из колоний, которая, как было подтверждено, является мутантом, дефицитным по гену purR, была названа KMBS4.The resulting plasmid pHSG398purR :: spc was used to transform competent B. subtilis 168 Marburg cells obtained by the Dubunau and Davidoff-Abelson method (Dubnau, D., and R. Davidoff-Abelson. Fate of transforming DNA following uptake by competent Bacillus subtilis. J Mol. Biol. 1971, 56: 209-221). Double cross mutants were tested by preparing chromosomal DNA from each spectinomycin resistant colony, followed by PCR as described above. One of the colonies, which was confirmed to be a purR deficient mutant, was named KMBS4.
2) Конструирование мутанта В. subtilis, дефицитного по purA.2) Construction of a B. subtilis deficient mutant in purA.
ПЦР осуществлялась при 94°С, 30 секунд; 55°С, 1 мин; 72°С, 2 мин; 30 циклов (Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), с использованием хромосомной ДНК штамма В. subtilis 168 Marburg в качестве матрицы, и следующих олигонуклеотидных затравок, №3 (SEQ ID NO:3) и №4 (SEQ ID NO:4), синтезированных в соответствии с последовательностью ДНК в геномном банке данных. Затравка №3 (29 звеньев) включает в себя последовательность с 137 по 118 нуклеотид перед старт-кодоном гена purA из В. subtilis (P. Mäntsälä and H. Zalikin. Cloning and sequence of Bacillus subtilis purA and guaA, involved in the conversion of IMP to AMP and GMP. J. Bacteriol. 1992, 174:1883-1890), а также 9 дополнительных нуклеотидов, содержащих сайт SalI, присоединенных к 5'-концу. Затравка №4 (29 звеньев) включает в себя последовательность с 51 по 70 нуклеотид после стоп-кодоном гена purA, а также 9 дополнительных нуклеотидов, содержащих сайт SphI, присоединенных к 5'-концу. Фрагмент, полученный в ходе ПЦР, (1.5 т.п.о.) и обработанный SalI и SphI, был вставлен по тем же сайтам рестрикции вектора pSTV28 (TaKaRa, Япония). Полученная плазмида pSTV28BSPA была расщеплена с помощью MluI и BglII, что привело к удалению внутреннего фрагмента длиной 0.4 т.п.о. из амплифицированного гена purA, концы были затуплены с помощью фрагмента Кленова, затем в нее лигирован фрагмент гена устойчивости к эритромицину с затупленными концами (1.6 т.п.о.) из Staphylococcus aureus, вырезанным из pDG646 (Bacillus Genetic Stock Center, Ohio).PCR was performed at 94 ° C for 30 seconds; 55 ° C, 1 min; 72 ° C, 2 min; 30 cycles (Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), using the chromosomal DNA of B. subtilis 168 Marburg strain as a template, and the following oligonucleotide seeds, No. 3 (SEQ ID NO: 3) and No. 4 (SEQ ID NO: 4) synthesized in accordance with the DNA sequence in the genomic database. Seed No. 3 (29 links) includes a sequence of 137 to 118 nucleotides before the start codon of the B. subtilis purA gene (P. Mäntsälä and H. Zalikin. Cloning and sequence of Bacillus subtilis purA and guaA, involved in the conversion of IMP to AMP and GMP. J. Bacteriol. 1992, 174: 1883-1890), as well as 9 additional nucleotides containing a SalI site attached to the 5'-end. Seed No. 4 (29 links) includes the sequence from 51 to 70 nucleotides after the stop codon of the purA gene, as well as 9 additional nucleotides containing the SphI site attached to the 5'-end. A fragment obtained by PCR (1.5 kb) and processed with SalI and SphI was inserted at the same restriction sites of the pSTV28 vector (TaKaRa, Japan). The resulting plasmid pSTV28BSPA was digested with MluI and BglII, which led to the removal of the 0.4 kb internal fragment. from the amplified purA gene, the ends were blunted with a Klenov fragment, then a fragment of the erythromycin resistance gene with blunt ends (1.6 kb) from Staphylococcus aureus cut from pDG646 (Bacillus Genetic Stock Center, Ohio) was ligated into it.
Полученная плазмида pSTV28BSPA::erm была использована для трансформации компетентных клеток KMBS4, полученных методом Dubunau и Davidoff-Abelson, как описано выше. Двойные перекрестные мутанты были протестированы путем приготовления хромосомной ДНК из каждой колонии, устойчивой к эритромицину, с последующей ПЦР, как описано выше. Одна из колоний, которая, как было подтверждено, является мутантом, дефицитным по гену ригА, была названа KMBS13. Как и ожидалось, клетки KMBS13 были ауксотрофными по аденину.The resulting plasmid pSTV28BSPA :: erm was used to transform competent KMBS4 cells obtained by the Dubunau and Davidoff-Abelson method, as described above. Double cross mutants were tested by preparing chromosomal DNA from each erythromycin-resistant colony, followed by PCR as described above. One of the colonies, which was confirmed to be a mutant deficient in the rhA gene, was named KMBS13. As expected, KMBS13 cells were auxotrophic for adenine.
3) Конструирование мутанта В. subtilis, дефицитного по deoD.3) Construction of a mutant of B. subtilis deficient in deoD.
Для получения 5'-концевой части гена deoD и предшествующего ей участка из В. subtilis, ПЦР осуществлялась при 94°С, 30 секунд; 55°С, 1 мин; 72°С, 1 мин; 30 циклов (Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), с использованием следующих олигонуклеотидных затравок, №5 (SEQ ID NO:5) и №6 (SEQ ID NO:6), синтезированных в соответствии с последовательностью ДНК в геномном банке данных. Затравка №5 (29 звеньев) включает в себя последовательность с 310 по 291 нуклеотид перед старт-кодоном гена deoD, а также 9 дополнительных нуклеотидов, содержащих сайт EcoRI, присоединенных к 5'-концу. Затравка №6 (28 звеньев) включает в себя последовательность с 39 по 57 нуклеотид после старт-кодона гена deoD, а также 9 дополнительных нуклеотидов, содержащих сайт BamHI, присоединенных к 5'-концу. Фрагмент, полученный в ходе ПЦР, (0.4 т.п.о.) и обработанный EcoRI и BamHI, был вставлен по тем же сайтам рестрикции вектора pSTV28 (TaKaRa, Япония), что привело к получению плазмиды pSTV28DON.To obtain the 5'-terminal portion of the deoD gene and the preceding portion from B. subtilis, PCR was performed at 94 ° C for 30 seconds; 55 ° C, 1 min; 72 ° C, 1 min; 30 cycles (Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer) using the following oligonucleotide seeds, No. 5 (SEQ ID NO: 5) and No. 6 (SEQ ID NO: 6), synthesized in accordance with the DNA sequence in the genomic database . Seed No. 5 (29 links) includes a sequence of 310 to 291 nucleotides in front of the start codon of the deoD gene, as well as 9 additional nucleotides containing an EcoRI site attached to the 5'-end. Seed No. 6 (28 links) includes the sequence from 39 to 57 nucleotides after the start codon of the deoD gene, as well as 9 additional nucleotides containing the BamHI site attached to the 5'-end. A fragment obtained by PCR (0.4 kb) and processed with EcoRI and BamHI was inserted at the same restriction sites of the pSTV28 vector (TaKaRa, Japan), resulting in plasmid pSTV28DON.
Для получения 3'-концевой части гена deoD и последующего участка, ПЦР осуществлялась при 94°С, 30 секунд; 55°С, 1 мин; 72°С, 1 мин; 30 циклов (Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), с использованием следующих олигонуклеотидных затравок, №7 (SEQ ID NO:7) и №8 (SEQ ID NO:8), синтезированных в соответствии с последовательностью ДНК в геномном банке данных. Затравка №7 (29 звеньев) включает в себя последовательность с 321 по 302 нуклеотид после стоп-кодона гена deoD, а также 9 дополнительных нуклеотидов, содержащих сайт HindIII, присоединенных к 5'-концу. Затравка №8 (28 звеньев) включает в себя последовательность с 24 по 42 нуклеотид перед стоп-кодоном гена deoD, а также 9 дополнительных нуклеотидов, содержащих сайт BamHI, присоединенных к 5'-концу. Фрагмент, полученный в ходе ПЦР, (0.4 т.п.о.) и обработанный HindIII и BamHI, был вставлен по тем же сайтам рестрикции вектора pSTV28DON, что привело к получению плазмиды pSTV28DONC.To obtain the 3'-terminal portion of the deoD gene and the subsequent region, PCR was performed at 94 ° C for 30 seconds; 55 ° C, 1 min; 72 ° C, 1 min; 30 cycles (Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer) using the following oligonucleotide seeds, No. 7 (SEQ ID NO: 7) and No. 8 (SEQ ID NO: 8), synthesized in accordance with the DNA sequence in the genomic database . Seed No. 7 (29 links) includes the sequence from 321 to 302 nucleotides after the stop codon of the deoD gene, as well as 9 additional nucleotides containing the HindIII site attached to the 5'-end. Seed No. 8 (28 links) includes a sequence of 24 to 42 nucleotides in front of the stop codon of the deoD gene, as well as 9 additional nucleotides containing the BamHI site attached to the 5'-end. A fragment obtained by PCR (0.4 kb) and processed with HindIII and BamHI was inserted at the same restriction sites of the pSTV28DON vector, resulting in plasmid pSTV28DONC.
Для того, чтобы амплифицировать ген устойчивости у канамицину из Streptococcus faecalis, ПЦР осуществлялась при 94°С, 30 секунд; 55°С, 1 мин; 72°С, 2 мин; 30 циклов (Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), с использованием ДНК-плазмиды pDG783 (Bacillus Genetic Stock Center, Ohio) в качестве матрицы и следующих олигонуклеотидных затравок, №9 (SEQ ID NO:9) и №10 (SEQ ID NO:10), синтезированных в соответствии с последовательностью ДНК в геномном банке данных. Затравка №10 (33 звена) включает в себя последовательность с 513 по 490 нуклеотид перед старт-кодоном гена устойчивости к канамицину, а также 9 дополнительных нуклеотидов, содержащих сайт BamHI, присоединенных к 5'-концу. Затравка №11 (33 звеньев) включает в себя последовательность со 117 по 140 нуклеотид после стоп-кодона указанного гена, а также 9 дополнительных нуклеотидов, содержащих сайт BamHI, присоединенных к 5'-концу. Фрагмент, полученный в ходе ПЦР (1.5 т.п.о.) и обработанный BamHI, был вставлен по уникальному сайту рестрикции BamHI вектора pSTV28DONC. Полученная плазмида pSTV28deoD::kan была использована для трансформации компетентных клеток KMBS13, полученных методом Dubunau и Davidoff-Abelson, как описано выше. Двойные перекрестные мутанты были протестированы путем приготовления хромосомной ДНК из каждой колонии, устойчивой к канамицину, с последующей ПЦР с использованием затравок №5 и №7, как описано выше. Одна из колоний, которая, как было подтверждено, является мутантом, дефицитным по гену deoD, (purR::spc purA::erm deoD::kan) была названа KMBS16.In order to amplify the kanamycin resistance gene from Streptococcus faecalis, PCR was performed at 94 ° C for 30 seconds; 55 ° C, 1 min; 72 ° C, 2 min; 30 cycles (Gene Amp PCR System Model 9600, Perkin Elmer), using pDG783 DNA plasmid (Bacillus Genetic Stock Center, Ohio) as a template and the following oligonucleotide primers, No. 9 (SEQ ID NO: 9) and No. 10 (SEQ ID NO: 10) synthesized according to the DNA sequence in the genomic database. Seed No. 10 (33 links) includes a sequence from 513 to 490 nucleotides in front of the start codon of the kanamycin resistance gene, as well as 9 additional nucleotides containing the BamHI site attached to the 5'-end. Seed No. 11 (33 links) includes the sequence from 117 to 140 nucleotides after the stop codon of the specified gene, as well as 9 additional nucleotides containing the BamHI site attached to the 5'-end. A fragment obtained by PCR (1.5 kb) and processed by BamHI was inserted at the unique BamHI restriction site of the vector pSTV28DONC. The resulting plasmid pSTV28deoD :: kan was used to transform competent KMBS13 cells obtained by the Dubunau and Davidoff-Abelson method, as described above. Double cross mutants were tested by preparing chromosomal DNA from each kanamycin resistant colony, followed by PCR using primers No. 5 and No. 7, as described above. One of the colonies, which was confirmed to be a deoD-deficient mutant (purR :: spc purA :: erm deoD :: kan), was named KMBS16.
Пример 1. Селекция и проверка мутантного штамма Bacillus subtilis - продуцента инозина, устойчивого к полимиксинам.Example 1. Selection and verification of a mutant strain of Bacillus subtilis - producer of inosine resistant to polymyxins.
Клетки штамма В. subtilis KMBS16 (108 клеток) были помещены на чашки с агаризованным (20 г/л) L-бульоном (триптон - 10 г/л, дрожжевой экстракт - 5 г/л, NaCl -0.5 г/л, глюкоза 2 г/л, рН 7.0), содержащим 15, 20, 30 или 40 мг/л сульфата полимиксина В (Sigma, США). Инокулированные чашки инкубировались при 34°С в течение 5 дней. Среди появившихся колоний (порядка 100 колоний) 21 мутант обладал повышенной по сравнению с исходным штаммом способностью к продукции инозина. Среди них был выбран спонтанный мутант Bacillus subtilis KMBS16 polR 1-1 (ВКПМ В-8245), обладавший наивысшей продуктивностью инозина.Cells of strain B. subtilis KMBS16 (10 8 cells) were placed on plates with agarized (20 g / l) L-broth (tryptone - 10 g / l, yeast extract - 5 g / l, NaCl -0.5 g / l, glucose 2 g / l, pH 7.0) containing 15, 20, 30 or 40 mg / l of polymyxin B sulfate (Sigma, USA). Inoculated plates were incubated at 34 ° C for 5 days. Among the colonies that appeared (about 100 colonies), 21 mutants had an increased ability to produce inosine compared to the initial strain. Among them, the spontaneous mutant Bacillus subtilis KMBS16 pol R 1-1 (VKPM B-8245) was selected, which had the highest inosine productivity.
Устойчивость к полимиксину В и колистину (относительная степень роста) мутантного и родительского штаммов была оценена следующим способом. Пробирки, содержащие 5 мл L-бульона с различными ступенчатыми концентрациями полимиксина или колистина, были инокулированы 106 клеток/мл тестируемого штамма, предварительно выращенного в течение 18 часов в L-бульоне, и культивировались на роторной качалке при 37°С в течение 24 часов. Полученная культуральная жидкость была соответствующим образом разбавлена водой, и ее оптическая плотность при 540 нм была определена для того, чтобы измерить степень роста: POD540 в случае полимиксина В и COD540 в случае колистина. Степень роста (OD540) такого же штамма в среде, не содержащей антибиотик, принималась за 100%. Относительная степень роста на среде, содержащей полимиксин или колистин, может быть рассчитана по формулам (POD540)/(OD540)×100 или (COD540)/(OD540)×100 соответственно. Результаты приведены в Таблице 1.Resistance to polymyxin B and colistin (relative growth) of the mutant and parent strains was evaluated in the following way. Tubes containing 5 ml of L-broth with different step concentrations of polymyxin or colistin were inoculated with 10 6 cells / ml of the test strain, previously grown for 18 hours in L-broth, and cultured on a rotary shaker at 37 ° C for 24 hours . The resulting culture liquid was suitably diluted with water, and its optical density at 540 nm was determined in order to measure the degree of growth: POD 540 in the case of polymyxin B and COD 540 in the case of colistin. The degree of growth (OD 540 ) of the same strain in an antibiotic-free medium was taken as 100%. The relative growth rate on a medium containing polymyxin or colistin can be calculated using the formulas (POD 540 ) / (OD 540 ) × 100 or (COD 540 ) / (OD 540 ) × 100, respectively. The results are shown in Table 1.
Как видно из Таблицы 1, штамм В. subtilis KMBS16 polR 1-1, полученный отбором на устойчивость к полимиксину В, также обладал устойчивостью к колистину.As can be seen from Table 1, the strain B. subtilis KMBS16 pol R 1-1, obtained by selection for resistance to polymyxin B, also had resistance to colistin.
Каждый из штаммов В. subtilis KMBS16 polR 1-1 и В. subtilis KMBS16 выращивался при 34°С при аэрации в течение 18 часов в L-бульоне. Затем 0.3 мл полученной культуры было перенесено в 3 мл питательной среды для ферментации в пробирке 20×200 мм и инкубировалось при 34°С в течение 72 часов на роторной качалке.Each of the B. subtilis KMBS16 pol R 1-1 and B. subtilis KMBS16 strains was grown at 34 ° C under aeration for 18 hours in L-broth. Then, 0.3 ml of the obtained culture was transferred to 3 ml of fermentation medium in a 20 × 200 mm tube and incubated at 34 ° C for 72 hours on a rotary shaker.
Состав питательной среды для ферментации, г/л:The composition of the nutrient medium for fermentation, g / l:
Глюкоза и сульфат марганца стерилизовались раздельно. СаСО3 стерилизовали нагреванием при 180°С в течение 2 часов. рН поддерживали в районе 7.0.Glucose and manganese sulfate were sterilized separately. CaCO 3 was sterilized by heating at 180 ° C for 2 hours. pH was maintained at 7.0.
После выращивания количество инозина, накопленное в среде, определялось методом ВЭЖХ. Образец культуральной жидкости (500 мкл) был отцентрифугирован при 1500 об/мин в течение 5 мин, супернатант был разбавлен водой в 100 раз и проанализирован с помощью ВЭЖХ.After growing, the amount of inosine accumulated in the medium was determined by HPLC. A sample of the culture fluid (500 μl) was centrifuged at 1500 rpm for 5 min, the supernatant was diluted 100 times with water and analyzed by HPLC.
Условия для анализа с помощью ВЭЖХ:Conditions for analysis using HPLC:
Колонка: Luna С18(2) 250×3 мм, 5 u (Phenomenex, USA). Буфер: 2% v/v C2H5OH; 0.8% v/v триэтиламин, 0.5% v/v уксусная кислота (ледяная), рН 4.5. Температура: 30°С. Скорость потока: 0.3 мл/мин. Объем пробы: 5 мкл. УФ-детектор: 250 нм.Column: Luna C18 (2) 250 × 3 mm, 5 u (Phenomenex, USA). Buffer: 2% v / v C 2 H 5 OH; 0.8% v / v triethylamine, 0.5% v / v acetic acid (glacial), pH 4.5. Temperature: 30 ° C. Flow rate: 0.3 ml / min. Sample volume: 5 μl. UV detector: 250 nm.
Время удерживания, мин:Retention time, min:
Полученные результаты представлены в Таблице 2.The results obtained are presented in Table 2.
..
Как видно из таблицы 2, штамм В. subtilis KMBS16 polR 1-1 продуцировал больше инозина, чем родительский штамм.As can be seen from table 2, the strain B. subtilis KMBS16 pol R 1-1 produced more inosine than the parent strain.
Пример 2. Селекция и проверка мутантного штамма Bacillus amyloliquefaciens - продуцента инозина, устойчивого к колистину.Example 2. Selection and verification of a mutant strain of Bacillus amyloliquefaciens - a producer of inosine resistant to colistin.
Клетки штамма Bacillus amyloliquefaciens AS115-7 (ВКПМ В-6134) (108 клеток) были помещены на чашки с агаризованным L-бульоном, как описано в Примере 1, содержащим 10, 15, 20, 30 или 40 мг/л сульфата колистина (Sigma, США). Инокулированные чашки инкубировались при 34°С в течение 5 дней. Среди появившихся колоний (порядка 100 колоний) 18 мутантов обладали повышенной по сравнению с исходным штаммом способностью к продукции инозина. Среди них был выбран спонтанный мутант Bacillus amyloliquefaciens ColR 7-105 (ВКПМ В-8246), обладавший наивысшей продуктивностью инозина.The cells of the strain Bacillus amyloliquefaciens AS115-7 (VKPM B-6134) (10 8 cells) were placed on plates with agarized L-broth, as described in Example 1, containing 10, 15, 20, 30 or 40 mg / l colistin sulfate ( Sigma, USA). Inoculated plates were incubated at 34 ° C for 5 days. Among the colonies that appeared (about 100 colonies), 18 mutants had an increased ability to produce inosine compared to the initial strain. Among them, the spontaneous mutant Bacillus amyloliquefaciens Col R 7-105 (VKPM B-8246) was selected, which had the highest inosine productivity.
Устойчивость к полимиксину В и колистину (относительная степень роста) мутантного и родительского штаммов была оценена способом, описанным в Примере 1. Результаты приведены в Таблице 3.Resistance to polymyxin B and colistin (relative growth rate) of the mutant and parent strains was evaluated by the method described in Example 1. The results are shown in Table 3.
Как видно из Таблицы 3, штамм Bacillus amyloliquefaciens ColR 7-105, полученный отбором на устойчивость к колистину, был более устойчив к полимиксину В.As can be seen from Table 3, the strain of Bacillus amyloliquefaciens Col R 7-105, obtained by selection for resistance to colistin, was more resistant to polymyxin B.
Каждый из штаммов Bacillus amyloliquefaciens ColR 7-105 и Bacillus amyloliquefaciens AS115-7 выращивался при 34°С при аэрации в течение 18 часов в L-бульоне. Затем 0.3 мл полученной культуры было перенесено в 3 мл питательной среды для ферментации, описанной в Примере 1, содержащей 40 мкг/мл L-гистидина и 40 мкг/мл L-тирозина вместо L-триптофана, в пробирке 20×200 мм и инкубировалось при 34°С в течение 72 часов на роторной качалке. После выращивания количество инозина, накопленное в среде, определялось методом ВЭЖХ, как описано выше. Результаты приведены в Таблице 4.Each of the strains of Bacillus amyloliquefaciens Col R 7-105 and Bacillus amyloliquefaciens AS115-7 was grown at 34 ° C. under aeration for 18 hours in L-broth. Then, 0.3 ml of the obtained culture was transferred to 3 ml of fermentation medium described in Example 1, containing 40 μg / ml L-histidine and 40 μg / ml L-tyrosine instead of L-tryptophan, in a 20 × 200 mm tube and incubated at 34 ° C for 72 hours on a rotary shaker. After growing, the amount of inosine accumulated in the medium was determined by HPLC as described above. The results are shown in Table 4.
Как видно из Таблицы 4, штамм B. amyloliquefaciens strain ColR 7-105, устойчивый к колистину, накапливал больше инозина, чем родительский штамм.As can be seen from Table 4, the colistin resistant strain B. amyloliquefaciens strain Col R 7-105 accumulated more inosine than the parent strain.
Пример 3. Продукция инозин-5'-фосфата из инозина с использованием штамма, содержащего ген, кодирующий кислую фосфатазу со сниженной активностью фосфомоноэстеразы.Example 3. Production of inosine-5'-phosphate from inosine using a strain containing a gene encoding acid phosphatase with reduced phosphomonoesterase activity.
Инозин, полученный в соответствии с Примерами 1 или 2, очищенный путем ионообменной хроматографии с последующим осаждением, фосфорилируют с использованием кислой фосфатазы со сниженной активностью фосфомоноэстеразы и пирофосфата натрия в качестве донора фосфорной группы. Источником кислой фосфатазы со сниженной активностью фосфомоноэстеразы является штамм Escherichia coli JM109/pEPI330, содержащий индуцируемую плазмиду с мутантным геном, кодирующим указанную кислую фосфатазу (патент США 6010851).Inosine obtained in accordance with Examples 1 or 2, purified by ion exchange chromatography followed by precipitation, is phosphorylated using acid phosphatase with reduced activity of phosphomonoesterase and sodium pyrophosphate as a phosphorus group donor. A source of acid phosphatase with reduced phosphomonoesterase activity is an Escherichia coli strain JM109 / pEPI330 containing an inducible plasmid with a mutant gene encoding said acid phosphatase (US Pat. No. 6,010,851).
Штамм Escherichia coli JM109/pEPI330, содержащий плазмиду с мутантным геном, кодирующим кислую фосфатазу, инокулируют в 50 мл L-среды, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 1 мМ ИПТГ, и выращивают при 37°С в течение 16 часов. Затем готовят раствор пирофосфата натрия (120 г/л) и инозина (60 г/л) в 100 мМ натрий-ацетатном буфере (рН 4.0), в который добавляют бактериальные клетки, полученные, как описано выше, до достижения концентрации 2 г/л в пересчете на сухой клеточный вес. Полученную смесь инкубируют при 35°С в течение 32 часов с поддержанием рН в районе 4.0. В результате получают до 74 г/л инозин-5'-фосфата. Побочная продукция инозин-2'-фосфата и инозин-3'-фосфата не наблюдается.The Escherichia coli strain JM109 / pEPI330 containing the plasmid with the mutant gene encoding acid phosphatase was inoculated in 50 ml of L medium containing 100 μg / ml ampicillin and 1 mM IPTG and grown at 37 ° C for 16 hours. Then, a solution of sodium pyrophosphate (120 g / l) and inosine (60 g / l) in 100 mM sodium acetate buffer (pH 4.0) is prepared, into which the bacterial cells obtained as described above are added to reach a concentration of 2 g / l in terms of dry cell weight. The resulting mixture was incubated at 35 ° C for 32 hours while maintaining a pH in the region of 4.0. The result is up to 74 g / l of inosine-5'-phosphate. By-products of inosine-2'-phosphate and inosine-3'-phosphate are not observed.
Использование штаммов бактерий, принадлежащих к роду Bacillus и обладающих устойчивостью к ингибированию роста полимиксином В и/или колистином, - продуцентов инозина позволяет повысить эффективность получения конечного инозин-5'-фосфата на 8-15% в пересчете на исходную глюкозу, использовавшуюся для получения инозина в качестве промежуточного соединения.The use of bacterial strains belonging to the genus Bacillus and resistant to growth inhibition by polymyxin B and / or colistin, producers of inosine, can increase the efficiency of obtaining the final inosine 5'-phosphate by 8-15% in terms of the initial glucose used to obtain inosine as an intermediate compound.
Список последовательностей приведен в конце описания.A list of sequences is provided at the end of the description.
Claims (8)
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002103333/13A RU2260040C2 (en) | 2002-02-11 | 2002-02-11 | Method for production of inosibe and inosine-5'-monophosphate, bacterium strain of genus bacillus as inosine producer (variants) |
| JP2003029752A JP4385611B2 (en) | 2002-02-11 | 2003-02-06 | Method for producing purine nucleosides and nucleotides |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2002103333/13A RU2260040C2 (en) | 2002-02-11 | 2002-02-11 | Method for production of inosibe and inosine-5'-monophosphate, bacterium strain of genus bacillus as inosine producer (variants) |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2002103333A RU2002103333A (en) | 2003-08-27 |
| RU2260040C2 true RU2260040C2 (en) | 2005-09-10 |
Family
ID=28673168
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2002103333/13A RU2260040C2 (en) | 2002-02-11 | 2002-02-11 | Method for production of inosibe and inosine-5'-monophosphate, bacterium strain of genus bacillus as inosine producer (variants) |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4385611B2 (en) |
| RU (1) | RU2260040C2 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2725193C1 (en) * | 2017-12-15 | 2020-06-30 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Novel polypeptide and method for producing imp using said polypeptide |
| CN111665307A (en) * | 2020-07-14 | 2020-09-15 | 南京品生医疗科技有限公司 | Kit for detecting concentrations of polymyxin B1and polymyxin B2 in serum |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4760711B2 (en) * | 2004-03-31 | 2011-08-31 | 味の素株式会社 | Method for producing purine nucleosides and nucleotides by fermentation using bacteria belonging to the genus Bacillus or Escherichia |
| RU2333949C2 (en) * | 2005-09-14 | 2008-09-20 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | STRAINS OF BACTERIA Bacillus subtilis AND Bacillus amyloliquefaciens - PRODUCENTS OF INOSINE AND METHOD FOR PRODUCING INOSINE USING THEM |
| RU2320717C2 (en) * | 2005-09-14 | 2008-03-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Method for producing purine nucleosides by fermentation method using microorganisms belonging to bacillus genus |
| SK287315B6 (en) | 2006-06-02 | 2010-06-07 | Biotika, A. S. | A method for polymyxin B isolation from fermented soil |
| SK287293B6 (en) | 2006-06-15 | 2010-05-07 | Biotika, A. S. | A method for fermentation of polymyxin B by means of productive microorganism Bacillus polymyxa |
| EP2241186B1 (en) | 2008-01-11 | 2014-05-07 | Ajinomoto Co., Inc. | Use of disease resistance enhancer for plants and method of controlling plant disease by using the same |
| EP3861109A1 (en) | 2018-10-05 | 2021-08-11 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing target substance by bacterial fermentation |
| CN111830153A (en) * | 2020-07-14 | 2020-10-27 | 南京品生医学检验实验室有限公司 | Method for detecting concentrations of polymyxin B1and polymyxin B2 in serum |
-
2002
- 2002-02-11 RU RU2002103333/13A patent/RU2260040C2/en active
-
2003
- 2003-02-06 JP JP2003029752A patent/JP4385611B2/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2725193C1 (en) * | 2017-12-15 | 2020-06-30 | СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн | Novel polypeptide and method for producing imp using said polypeptide |
| CN111665307A (en) * | 2020-07-14 | 2020-09-15 | 南京品生医疗科技有限公司 | Kit for detecting concentrations of polymyxin B1and polymyxin B2 in serum |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2003259861A (en) | 2003-09-16 |
| JP4385611B2 (en) | 2009-12-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2365622C2 (en) | METHOD OF PURINE NUCLEOZIDES AND NUCLEOTIDES PRODUCTION BY FERMENTATION WITH APPLICATION OF BACTERIA BELONGING TO GENUS Escherichia OR Bacillus | |
| US8298791B2 (en) | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance | |
| KR100511151B1 (en) | Process for producing purine nucleosides via fermentation | |
| CN101432417B (en) | Bacterium capable of producing purine substance, and process for production of purine substance | |
| RU2422510C2 (en) | Method of producing purine ribonucleoside and ribonucleotides | |
| CN101432418B (en) | Bacterium capable of producing purine substance, and process for production of purine substance | |
| KR100882418B1 (en) | Inosine producing microorganism and a method of producing inosine using the same | |
| RU2260040C2 (en) | Method for production of inosibe and inosine-5'-monophosphate, bacterium strain of genus bacillus as inosine producer (variants) | |
| RU2239656C2 (en) | Method for preparing purine nucleoside and nucleotide, strain as producer of purine nucleoside (variants) | |
| KR100779865B1 (en) | Method for producing nucleotide by fermentation | |
| RU2209249C2 (en) | Method for preparing xanthosine 5'-monophosphate, strain corynebacterium ammoniagenes as producer of xanthosine 5'-monophosphate (variants) | |
| RU2333949C2 (en) | STRAINS OF BACTERIA Bacillus subtilis AND Bacillus amyloliquefaciens - PRODUCENTS OF INOSINE AND METHOD FOR PRODUCING INOSINE USING THEM | |
| JP2007075108A6 (en) | Purine nucleoside producing bacteria and method for producing purine nucleoside | |
| KR100542568B1 (en) | A Microorganism producing 5'-Xanthylic acid | |
| RU2271391C2 (en) | METHOD FOR PREPARING INOSINE AND 5'-INOSINIC ACID BY FERMENTATION METHOD BY USING MICROORGANISMS BELONGING TO GENUS Escherichia | |
| RU2405833C2 (en) | Method for microbiologial synthesis of purine nucleoside of 5'-aminoimidazole-4-carboxamide riboside (aicar) and bacillus subtilis strain - producer of aicar | |
| RU2244004C2 (en) | Method for preparing inosine and 5'-inosinic acid, strain escherichia coli as producer of inosine | |
| RU2244003C2 (en) | Method for preparing inosine and 5'-inosinic acid, strain escherichia coli as producer of inosine | |
| RU2542387C1 (en) | BACTERIA Bacillus subtilis PRODUCING 5`-AMINOIMIDAZOLE-4-CARBOXAMIDERIBOSIDE (AICAR), AND METHOD OF MICROBIOLOGICAL SYNTHESIS OF AICAR BY CULTURING THIS BACTERIUM | |
| JP4696404B2 (en) | Method for producing nucleotides by fermentation | |
| KR100785248B1 (en) | 5'- microorganism overexpressed purc gene and the process for production method of 5'-inosinic acid using the same | |
| KR100542563B1 (en) | Microorganism producing riboflavin and method for producing riboflavin using thereof | |
| RU2403286C2 (en) | Mutant phosphoribosyl pyrophosphate synthetase, dna coding said synthetase, bacterium coding said dna, method of producing purine nucleosides and method of producing purine nucelotides | |
| RU2294962C2 (en) | YdhL PROTEIN FROM Bacillus amyloliquefaciens, DNA FRAGMENT, BACTERIUM BELONGING TO GENUS Esherichia OR Bacillus AS PRODUCER OF PURINE NUCLEOSIDES, METHOD FOR PRODUCTION OF PURINE NUCLEOSIDES AND PURINE NUCLEOTIDES | |
| KR100964078B1 (en) | Corynebacterium ammoniagenes having enhanced 5'-inosinic acid productivity and method of producing 5'-inosinic acid using the same |