RU2271391C2

RU2271391C2 - METHOD FOR PREPARING INOSINE AND 5'-INOSINIC ACID BY FERMENTATION METHOD BY USING MICROORGANISMS BELONGING TO GENUS Escherichia

Info

Publication number: RU2271391C2
Application number: RU2003126890/13A
Authority: RU
Inventors: Натали Павловна Закатаева (RU); Наталия Павловна Закатаева; Сергей Викторович Гронский (RU); Сергей Викторович Гронский; Мари В чеславовна Витушкина (RU); Мария Вячеславовна Витушкина; Виталий Аркадьевич Лившиц (RU); Виталий Аркадьевич Лившиц
Original assignee: Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика"
Priority date: 2003-09-03
Filing date: 2003-09-03
Publication date: 2006-03-10
Also published as: WO2005023850A3; RU2003126890A; WO2005023850A2

Abstract

FIELD: biotechnology, microbiology.

SUBSTANCE: inosine and 5'-inosinic acid are prepared by using microorganism of genus Escherichia wherein production of inosine by indicated microorganisms is enhanced by elevating activity of protein encoding by gene yicM. Proposed invention provides elevating yield of inosine and 5'-inosinic acid.

EFFECT: improved preparing method.

8 cl, 3 dwg, 3 tbl, 4 ex

Description

Область техникиTechnical field

Настоящее изобретение относится к способу получения инозина, являющегося важным исходньм реагентом для синтеза 5'-инозиновой кислоты (инозин-5'-фосфата), и к новому микроорганизму, используемому для его продукции.The present invention relates to a method for producing inosine, which is an important starting reagent for the synthesis of 5'-inosinic acid (inosine-5'-phosphate), and to a new microorganism used for its production.

Предшествующий уровень техникиState of the art

Традиционно нуклеозиды получают в промышленном масштабе методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, ауксотрофных по аденину, или этих штаммов, которым дополнительно придана устойчивость к различньм соединениям, таким как аналоги пуринов и сульфагуанидин, при этом указанные штаммы принадлежат к роду Bacillus (патентные заявки Японии №54-17033 (1979), 55-2956 (1980) и 55-45199 (1980), выложенная патентная заявка Японии 56-162998 (1981), патентные заявки Японии №57-14160 (1982) и 57-41915 (1982), выложенная патентная заявка Японии №59-42895 (1984), к роду Brevibacterium (патентные заявки Японии №51-5075 (1976) и 58-17592 (1983), и Agric. Biol. Chem., 42, 399 (1978)), к роду Escherichia (заявка РСТ W09903988) и подобные им.Traditionally, nucleosides are obtained on an industrial scale by fermentation using strains of microorganisms auxotrophic for adenine, or these strains that are additionally resistant to various compounds, such as purine analogues and sulfaguanidine, while these strains belong to the genus Bacillus (Japanese patent application No. 54 -17033 (1979), 55-2956 (1980) and 55-45199 (1980), Japanese Patent Application Laid-open 56-162998 (1981), Japanese Patent Applications No. 57-14160 (1982) and 57-41915 (1982), laid out Japan patent application No. 59-42895 (1984), to the genus Brevibacterium (patent ie the application of Japan №51-5075 (1976) and 58-17592 (1983), and Agric. Biol. Chem., 42, 399 (1978)), to the genus Escherichia (PCT application W09903988), and the like.

Получение указанных мутантных штаммов обычно состоит из обработки микроорганизмов с целью получения мутаций, такой как облучение УФ-излучением или обработка нитрозогуанидином (N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин), с последующей селекцией нужного штамма на подходящей селективной питательной среде. С другой стороны, также практикуется выращивание мутантных штаммов, принадлежащих к роду Bacillus (выложенные патентные заявки Японии №58-158197 (1983), 58-175493 (1983), 59-28470 (1984), 60-156388 (1985), 1-27477 (1989), 1-174385 (1989), 3-58787 (1991), 3-164185 (1991), 5-84067 (1993), и 5-192164(1993)) к роду Brevibacterium (выложенная патентная заявка Японии 63-248394 (1988)), и к роду Escherichia (заявка РСТ W09903988), полученных с использованием методов генной инженерии.Obtaining these mutant strains usually consists of processing microorganisms to obtain mutations, such as irradiation with UV radiation or treatment with nitrosoguanidine (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine), followed by selection of the desired strain on a suitable selective nutrient medium. On the other hand, the cultivation of mutant strains belonging to the genus Bacillus is also practiced (Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-158197 (1983), 58-175493 (1983), 59-28470 (1984), 60-156388 (1985), 1- 27477 (1989), 1-174385 (1989), 3-58787 (1991), 3-164185 (1991), 5-84067 (1993), and 5-192164 (1993)) to the genus Brevibacterium (Japanese Patent Laid-Open 63 -248394 (1988)), and to the genus Escherichia (PCT application W09903988) obtained using genetic engineering methods.

Продуктивность штаммов - продуцентов инозина далее может быть улучшена путем увеличения способности к экскреции инозина. В настоящее время общепризнано, что проникновение метаболитов через цитоплазматическую мембрану обычно происходит с участием более или менее специфических транспортных белков, осуществляющих их выброс (Рао, S.S. et al, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62 (1), 1-34, (1998); Paulsen I.T. et al, J. Mol. Biol., 277, 573-592, (1998); Saier M.H. et al, J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 1,257-279, (1999)). Ранее авторы настоящего изобретения показали, что штаммы - продуценты инозина или ксантозина, принадлежащие к роду Escherichia и к роду Bacillus и обладающие повышенной активностью белка RhtA, кодируемого геном rhtA (ybiF), повышеной активностью белка YijE, кодируемого геном yijE или повышенной активностью белка YdeD, кодируемого геном ydeD, продуцировали больше инозина или ксантозина, чем родительские штаммы (патентные заявки РФ №2002101666, 2002104463 и 2002104464 соответственно).The productivity of the inosine producing strains can then be improved by increasing the ability to excrete inosine. Currently, it is generally accepted that the penetration of metabolites through the cytoplasmic membrane usually occurs with the participation of more or less specific transport proteins that release them (Rao, SS et al, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62 (1), 1-34, (1998); Paulsen IT et al, J. Mol. Biol., 277, 573-592, (1998); Saier MH et al, J. Mol. Microbiol. Biotechnol., 1,257-279, (1999)). Previously, the authors of the present invention showed that strains producing inosine or xanthosine belonging to the genus Escherichia and to the genus Bacillus and having increased activity of the RhtA protein encoded by the rhtA gene (ybiF), increased activity of the YijE protein encoded by the yijE gene or increased activity of the YdeD protein, encoded by the ydeD gene, more inosine or xanthosine was produced than the parental strains (RF patent applications No. 2002101666, 2002104463 and 2002104464, respectively).

Описание изобретенияDescription of the invention

Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности инозина штаммами - продуцентами инозина, и предоставление способа получения инозина и 5'-инозиновой кислоты с использованием указанных штаммов.The aim of the present invention is to increase the productivity of inosine by strains producing inosine, and to provide a method for producing inosine and 5'-inosinic acid using these strains.

Данная цель была достигнута путем установления того факта, что ген yicM, предположительно кодирующий мембранный белок, придает устойчивость к аналогу пуриновых оснований, 6-меркаптопурину и к пуриновым нуклеозидам, таким как инозин и гуанозин, в случае, когда природный аллель указанного гена введен в клетки штамма на многокопийной плазмиде. Белок YicM, кодируемый геном yicM, не вовлечен в путь биосинтеза пуриновых нуклеотидов и принадлежит к надсемейству транспортных белков (Рао, S.S. et al, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62 (1), 1-34, (1998)). Более того, ген yicM может увеличивать продукцию нуклеозидов в случае, когда его дополнительные копии введены в клетки соответствующих продуцентов инозина, принадлежащих к роду Escherichia. Таким образом было совершено настоящее изобретение.This goal was achieved by establishing the fact that the yicM gene, which supposedly encodes a membrane protein, confers resistance to the purine base analog, 6-mercaptopurine, and purine nucleosides, such as inosine and guanosine, when the natural allele of this gene is introduced into cells strain on a multi-copy plasmid. The YicM protein encoded by the yicM gene is not involved in the purine nucleotide biosynthesis pathway and belongs to the superfamily of transport proteins (Rao, S.S. et al, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 62 (1), 1-34, (1998)). Moreover, the yicM gene can increase nucleoside production when additional copies of it are introduced into the cells of the corresponding inosine producers belonging to the genus Escherichia. Thus, the present invention has been completed.

Таким образом, настоящее изобретение предоставляет микроорганизм, принадлежащий к роду Escherichia, обладающий способностью к продукции инозина.Thus, the present invention provides a microorganism belonging to the genus Escherichia, with the ability to produce inosine.

В частности, настоящее изобретение предоставляет микроорганизм с повышенной способностью к продукции инозина, основанной на повышении активности белка, вовлеченного, как предполагается, в транспорт пуриновых нуклеозидов из клетки указанного микроорганизма. Более конкретно, настоящее изобретение предоставляет микроорганизм с повышенной способностью к продукции инозина, основанной на повышении экспрессии гена, кодирующего белок, вовлеченный в процесс экскреции пуриновых нуклеозидов.In particular, the present invention provides a microorganism with an increased ability to produce inosine based on an increase in the activity of a protein involved, as expected, in the transport of purine nucleosides from a cell of said microorganism. More specifically, the present invention provides a microorganism with increased ability to produce inosine based on increased expression of a gene encoding a protein involved in the process of excretion of purine nucleosides.

Далее настоящее изобретение предоставляет способ получения пуринового нуклеозида методом ферментации, включающим стадии выращивания указанного выше микроорганизма в питательной среде с целью продукции и накопления пуринового нуклеозида в питательной среде, и выделения пуринового нуклеозида из культуральной жидкости.The present invention further provides a method for producing a purine nucleoside by a fermentation method, comprising the steps of growing the above microorganism in a culture medium to produce and accumulate a purine nucleoside in a culture medium and isolate the purine nucleoside from the culture fluid.

Далее настоящее изобретение предоставляет способ получения 5'-инозиновой кислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного инозина, и выделения полученной и накопленной 5'-инозиновой кислоты.Further, the present invention provides a method for producing 5'-inosinic acid, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a nutrient medium, phosphorylating the obtained and accumulated inosine, and isolating the obtained and accumulated 5'-inosinic acid.

Настоящее изобретение включает в себя следующее:The present invention includes the following:

1. Бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, обладающая способностью к продукции инозина, в которой активность белка YicM повышена.1. A bacterium belonging to the genus Escherichia, with the ability to produce inosine, in which the activity of the YicM protein is increased.

2. Бактерия, в соответствии с п.1, в которой активность белка, описанного в пунктах (А) или (В), в клетке упомянутой бактерии повышена:2. The bacterium, in accordance with claim 1, in which the activity of the protein described in paragraphs (A) or (B) in the cell of said bacterium is increased:

(A) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 2;(A) a protein that is represented by the amino acid sequence shown in sequence listing number 2;

(B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и который обладает активностью, придающей бактерии повышенную устойчивость к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину.(здесь и далее белки, описанные в пунктах (А) и (В), упоминаются как «белки согласно настоящему изобретению»).(B) a protein that is represented by an amino acid sequence including deletions, substitutions, insertions, or the addition of one or more amino acids to the amino acid sequence listed in sequence number 2, and which has an activity that confers enhanced resistance to bacteria on 6-mercaptopurine, inosine, and guanosine. (hereinafter, the proteins described in points (A) and (B) are referred to as “proteins of the present invention”).

3. Бактерия в соответствии с п.2, в которой активности белков, описанных в пунктах (А) или (В), повышены путем трансформации бактерии с помощью ДНК, кодирующей белки, описанные в пунктах (А) или (В), или путем изменения регуляции экспрессии указанной ДНК в хромосоме упомянутой бактерии.3. The bacterium in accordance with claim 2, in which the activity of the proteins described in points (A) or (B) is increased by transforming the bacterium using DNA encoding the proteins described in points (A) or (B), or by changes in the regulation of expression of said DNA in the chromosome of said bacterium.

4. Бактерия в соответствии с п.3, в которой трансформация осуществляется с использованием многокопийного вектора.4. The bacterium in accordance with claim 3, in which the transformation is carried out using a multi-copy vector.

5. Способ получения инозина, включающий стадии выращивания бактерии в соответствии с любым из пунктов 1-4 в питательной среде и выделения из культуральной жидкости полученного и накопленного в ней инозина.5. A method of producing inosine, comprising the steps of growing the bacterium in accordance with any one of paragraphs 1-4 in a nutrient medium and isolating the obtained and accumulated inosine from the culture fluid.

6. Способ в соответствии с п.5, в котором бактерия обладает повышенной экспрессией генов биосинтеза пуриновых нуклеозидов.6. The method according to claim 5, wherein the bacterium has increased expression of purine nucleoside biosynthesis genes.

7. Способ получения 5'-инозиновой кислоты, включающий стадии выращивания бактерии в соответствии с любым из п.п. с 1 по 4 в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного инозина.7. A method for producing 5'-inosinic acid, comprising the steps of growing a bacterium in accordance with any one of paragraphs. 1 to 4 in a nutrient medium, phosphorylation of the obtained and accumulated inosine.

8. Способ в соответствии с п.7, в котором бактерия модифицирована с целью повышения экспрессии генов биосинтеза пуриновых нуклеозидов.8. The method according to claim 7, wherein the bacterium is modified to increase expression of purine nucleoside biosynthesis genes.

Настоящее изобретение более детально будет описано ниже.The present invention will be described in more detail below.

1. Бактерия согласно настоящему изобретению.1. The bacterium according to the present invention.

Бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия, принадлежащая к роду Escherichia, обладающая способностью к продукции инозина, в которой активность белка, описанного в пунктах (А) или (В), в клетке упомянутой бактерии повышена: (А) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 2;The bacterium according to the present invention is a bacterium belonging to the genus Escherichia, having the ability to produce inosine, in which the activity of the protein described in points (A) or (B) in the cell of said bacterium is increased: (A) a protein that is represented by an amino acid sequence, given in the list of sequences at number 2;

(В) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и который обладает активностью, придающей бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, устойчивость к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину.(B) a protein that is represented by an amino acid sequence including deletions, substitutions, insertions, or the addition of one or more amino acids to the amino acid sequence listed in sequence number 2, and which has an activity that confers resistance to bacteria belonging to the genus Escherichia to 6 - mercaptopurine, inosine and guanosine.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (E.coli).The term "bacterium belonging to the genus Escherichia" means that the bacterium belongs to the genus Escherichia in accordance with the classification known to the person skilled in the field of microbiology. As an example of a microorganism belonging to the genus Escherichia used in the present invention, the bacterium Escherichia coli (E. coli) may be mentioned.

Использованный здесь термин «способность к продукции инозина» означает способность к продукции и накоплению инозина в питательной среде. Термин «бактерия, принадлежащая к роду к роду Escherichia и обладающая способностью к продукции инозина» означает то, что бактерия, принадлежащая к роду к роду Escherichia, обладает способностью к продукции и накоплению в питательной среде инозина в количестве большем, чем природный штамм E.coli, такие как штаммы E.coli W3110 и MG1655, и предпочтительно означает, что микроорганизм способен к продукции и накоплению в питательной среде количество не менее чем 10 мг/л, более предпочтительно, не менее чем 50 мг/л инозина.The term “inosine production ability” as used herein means the ability to produce and accumulate inosine in a culture medium. The term "bacterium belonging to the genus Escherichia genus and having the ability to produce inosine" means that a bacterium belonging to the genus Escherichia genus has the ability to produce and accumulate in the nutrient medium inosine in an amount greater than the natural E. coli strain such as E. coli strains W3110 and MG1655, and preferably means that the microorganism is capable of producing and accumulating in the nutrient medium an amount of not less than 10 mg / l, more preferably not less than 50 mg / l of inosine.

Термин «активность белка, описанного в пунктах (А) или (В), в клетке упомянутой бактерии повышена» означает, что количество молекул указанного белка в клетке повышено, или сама активность в пересчете на белок повышена. Термин «активность» означает активность, придающую бактерии устойчивость к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину.The term "activity of the protein described in points (A) or (B) in the cell of said bacterium is increased" means that the number of molecules of the specified protein in the cell is increased, or the activity in terms of protein is increased. The term “activity” means activity that confers resistance to 6-mercaptopurine, inosine and guanosine on bacteria.

К белкам согласно настоящему изобретению относятся белки, описанные в следующих пунктах (А) или (В):Proteins according to the present invention include proteins described in the following paragraphs (A) or (B):

(B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 2, и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину.(B) a protein that is represented by an amino acid sequence including deletions, substitutions, insertions, or the addition of one or more amino acids to the amino acid sequence listed in sequence number 2, and which has an activity that confers resistance to 6-mercaptopurine, inosine and guanosine on bacteria .

Белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 2, является белком YicM. Белок YicM не вовлечен в путь биосинтеза пуриновых нуклеотидов и принадлежит к большому надсемейству транспортных белков MFS (MFS - major facilitator superfamily) (Pao, S.S., et al, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (I): 1-32, (1998)) и к кластеру ортологов пермеаз экспорта арабинозы (COG - cluster of orthologous group) 2814 (Tatusov, R.L. et al, Nucleic Acids Res., 29: 22-28 (2001)). Другими белками, принадлежащими к этому семейству в Е. coli, являются белки AraJ and YdeA, осуществляющие транспорт арабинозы из клетки (Bost, S. et al, J. Bacteriol., 181:2185-2191 (1999)), и белок YdhP. Геном Bacillus subtilis содержит 6 генов, кодирующих гомологи гена yicM: ybcL, yceJ, ydhL, yftil, ytbD, ywfA. Белок YicM из штамма Е. coli К-12 является высокогидрофобным белком, состоящим из 396 аминокислот, содержащим 12 предполагаемых трансмембранных сегментов и обладающим неизвестной функцией. Белок YicM кодируется геном yicM. Ген yicM из штамма Е. coli К-12 (нуклеотиды с 3838176 по 3839366 в последовательности с инвентарным номером NC_000913; gi: 16127994 в базе данных GenBank) расположен в хромосоме Е. coli между генами nlpA и yicN на 82.73'.The protein that is represented by the amino acid sequence listed in sequence number 2 is YicM protein. The YicM protein is not involved in the pathogen biosynthesis of purine nucleotides and belongs to a large superfamily of transport proteins MFS (MFS - major facilitator superfamily) (Pao, SS, et al, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (I): 1-32, ( 1998)) and to the cluster of orthologs of permeases of export of arabinose (COG - cluster of orthologous group) 2814 (Tatusov, RL et al, Nucleic Acids Res., 29: 22-28 (2001)). Other proteins belonging to this family in E. coli are AraJ and YdeA proteins that transport arabinose from a cell (Bost, S. et al, J. Bacteriol., 181: 2185-2191 (1999)), and the YdhP protein. The Bacillus subtilis genome contains 6 genes encoding the homologs of the yicM gene: ybcL, yceJ, ydhL, yftil, ytbD, ywfA. The YicM protein from strain E. coli K-12 is a highly hydrophobic protein consisting of 396 amino acids, containing 12 putative transmembrane segments and having unknown function. The YicM protein is encoded by the yicM gene. The yicM gene from strain E. coli K-12 (nucleotides 3838176 to 3839366 in sequence with accession number NC_000913; gi: 16127994 in the GenBank database) is located on the E. coli chromosome between the nlpA and yicN genes at 82.73 '.

Количество «нескольких» аминокислот различается в зависимости от положения и типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Оно может быть от 2 до 35, предпочтительно от 2 до 15, и более предпочтительно от 2 до 5 для белка (А).The number of “several” amino acids varies depending on the position and type of amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein. It can be from 2 to 35, preferably from 2 to 15, and more preferably from 2 to 5 for protein (A).

Может быть использован белок, имеющий гомологию не менее чем 90%, предпочтительно не менее, чем 95%, более предпочтительно, не менее чем 98%, с аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 2, и обладающий активностью белка YicM.A protein having a homology of not less than 90%, preferably not less than 95%, more preferably not less than 98%, with the amino acid sequence listed in sequence number 2 and having YicM protein activity can be used.

Для оценки степени гомологии между ДНК возможно использование нескольких способов расчета, таких как BLAST search, FASTA search и CrustalW.Several methods of calculation, such as BLAST search, FASTA search, and CrustalW, can be used to assess the degree of homology between DNA.

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) это самообучающийся алгоритм поиска, используемый программами BLASTP, BLASTN, BLASTX, MEGABLAST, TBLASTN, и TBLASTX; эти программы оценивают значимость найденных результатов с использованием статистических методов Karlin, Samuel и Stephen F. Altschul ("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-68; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-7). Способ поиска FASTA описан W.R. Pearson ("Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 1990 183:63-98). Способ ClustalW описан Thompson J.D., Higgins D.G. и Gibson T.J. ("CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res. 1994, 22:4673-4680).BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) is a self-learning search algorithm used by BLASTP, BLASTN, BLASTX, MEGABLAST, TBLASTN, and TBLASTX; these programs evaluate the significance of the results using statistical methods Karlin, Samuel and Stephen F. Altschul ("Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87 : 2264-68; "Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences". Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90: 5873-7). The FASTA search method is described by W.R. Pearson (Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA, Methods in Enzymology, 1990 183: 63-98). The ClustalW method is described by Thompson J.D., Higgins D.G. and Gibson T.J. ("CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice", Nucleic Acids Res. 1994, 22: 4673-4680).

Термин «повышенная устойчивость к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину» означает способность бактерии к росту на минимальной питательной среде, содержащей 6-меркаптопурин, инозин и гуанозин в концентрации, при которой природный или родительский штамм не может расти, или способность бактерии расти на питательной среде, содержащей 6-меркаптопурин, инозин и гуанозин, с большей скоростью, чем природный или родительский штамм. Упомянутая выше концентрация 6-меркаптопурина, инозина и гуанозина составляет обычно от 50 до 10000 мкг/мл, предпочтительно от 100 до 1000 мкг/мл.The term "increased resistance to 6-mercaptopurine, inosine and guanosine" means the ability of the bacteria to grow on a minimum nutrient medium containing 6-mercaptopurine, inosine and guanosine in a concentration at which the natural or parent strain cannot grow, or the ability of the bacterium to grow on nutrient medium containing 6-mercaptopurine, inosine and guanosine, at a faster rate than the natural or parent strain. The above-mentioned concentration of 6-mercaptopurine, inosine and guanosine is usually from 50 to 10,000 μg / ml, preferably from 100 to 1000 μg / ml.

Методы увеличения активности белка согласно настоящему изобретению, в особенности методы увеличения количества молекул указанного белка в клетке, включают методы изменения последовательности, регулирующей экспрессию ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, и методы увеличения числа копий гена, но не ограничиваются ими.Methods for increasing the activity of a protein of the present invention, in particular methods for increasing the number of molecules of a given protein in a cell, include, but are not limited to methods for changing the expression sequence of the DNA encoding the protein of the present invention and methods for increasing the number of copies of a gene.

Изменение последовательности, регулирующей экспрессию ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, может быть достигнуто путем помещения ДНК, кодирующей белок согласно настоящему изобретению, под контроль сильного промотора. В качестве сильных промоторов известны, например lac промотор, trp промотор, trc промотор, P_L промотор фага лямбда. С другой стороны, промотор может быть усилен, например, путем введения мутации в указанный промотор с целью увеличения уровня транскрипции гена, расположенного после промотора. Далее, известно, что замена нескольких нуклеотидов в участке между местом связывания рибосомы (RBS) и старт кодоном, а в особенности, в последовательности непосредственно перед старт кодоном, в значительной степени влияет на уровень трансляции мРНК. Например, было обнаружено 20-кратное изменение уровня экспрессии в зависимости от природы трех нуклеотидов, предшествующих старт кодону (Gold et al., Annu. Rev. MicrobioL, 35, 365-403,1981; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629,1984).Changing the sequence that regulates the expression of the DNA encoding the protein of the present invention can be achieved by placing the DNA encoding the protein of the present invention under the control of a strong promoter. As strong promoters, for example, the lac promoter, trp promoter, trc promoter, P _L lambda phage promoter are known. On the other hand, the promoter can be enhanced, for example, by introducing a mutation into said promoter in order to increase the level of transcription of the gene located after the promoter. Further, it is known that the replacement of several nucleotides in the region between the ribosome binding site (RBS) and the start codon, and especially in the sequence immediately before the start codon, significantly affects the level of translation of mRNA. For example, a 20-fold change in expression level was detected depending on the nature of the three nucleotides prior to the start of the codon (Gold et al., Annu. Rev. MicrobioL, 35, 365-403.1981; Hui et al., EMBO J., 3 623-629.1984).

Более того, некий «энхансер» может быть дополнительно введен с целью увеличения уровня транскрипции указанного гена. Введение ДНК, содержащей либо ген, либо промотор в хромосомную ДНК описано, например, в выложенной патентной заявке Японии №1-215280 (1989).Moreover, a certain “enhancer" can be additionally introduced in order to increase the level of transcription of the specified gene. The introduction of DNA containing either a gene or a promoter into the chromosomal DNA is described, for example, in Japanese Patent Laid-open No. 1-215280 (1989).

В качестве альтернативы, число копий гена может быть увеличено путем введения гена в многокопийный вектор с образованием рекомбинантной ДНК, с последующим введением такой рекомбинантной ДНК в микроорганизм. Примерами векторов, использующихся для введения рекомбинантной ДНК, являются плазмидные векторы, такие как pMW118, pBR322, pUC19, pBluescript KS⁺pACYC177, pACYC184, pOK12, pAYC32, pMW119, pET22b и подобные им, фаговые векторы, такие как 11059, 1BF101, M13mp9, фаг Mu (выложенная патентная заявка Японии №2-109985) и подобные им, и транспозоны (Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/TechnoL, 1,417 (1983)), такие как Mu, Tn10, Tn5 и подобные им. Кроме того, усиление экспрессии гена может быть достигнуто путем интеграции гена в бактериальную хромосому методом гомологичной рекомбинации или подобным.Alternatively, the number of copies of a gene can be increased by introducing the gene into a multi-copy vector to form recombinant DNA, followed by introducing such recombinant DNA into the microorganism. Examples of vectors used for introducing recombinant DNA are plasmid vectors such as pMW118, pBR322, pUC19, pBluescript KS ⁺ pACYC177, pACYC184, pOK12, pAYC32, pMW119, pET22b and the like, phage vectors such as 1, F, 11059, 110, 0159, 11059 Mu phage (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-109985) and the like, and transposons (Berg, DE and Berg, CM, Bio / TechnoL, 1.417 (1983)), such as Mu, Tn10, Tn5 and the like. In addition, enhancing gene expression can be achieved by integrating the gene into the bacterial chromosome by homologous recombination or the like.

Методы использования сильного промотора или «энхансера» могут быть скомбинированы с методами увеличения числа копий гена.Methods for using a strong promoter or “enhancer” can be combined with methods for increasing the number of copies of a gene.

Методами получения хромосомной ДНК, гибридизации, полимеразной цепной реакции (ПЦР), получения плазмидной ДНК, расщепления и лигирования ДНК, трансформации, выбора олигонуклеотидов в качестве затравок и подобными методами могут являться традиционные методы, хорошо известные специалисту в данной области. Эти методы описаны в книге Sambrook, J., and Russell D., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) и других подобных изданиях.Methods for obtaining chromosomal DNA, hybridization, polymerase chain reaction (PCR), obtaining plasmid DNA, DNA cleavage and ligation, transformation, selection of oligonucleotides as seeds and similar methods can be traditional methods well known to those skilled in the art. These methods are described in Sambrook, J., and Russell D., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) and other similar publications.

Для выведения микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, и обладающего повышенной экспрессией гена, кодирующего белок согласно настоящему изобретению, необходимые участки генов могут быть получены с помощью ПЦР на основе уже доступной информации о генах Е. coli. Например, ген yicM, который, как предполагается, кодирует транспортер, может быть клонирован из хромосомной ДНК штаммов Е. coli К 12 W3110 и Е. coli MG1655 с использованием метода ПЦР. Хромосомная ДНК, используемая для этого, также может быть получена из любого другого штамма Е. coli.In order to eliminate a microorganism belonging to the genus Escherichia and having increased expression of the gene encoding the protein of the present invention, the necessary regions of the genes can be obtained by PCR based on the already available information about the E. coli genes. For example, the yicM gene, which is believed to encode a transporter, can be cloned from the chromosomal DNA of E. coli K 12 W3110 and E. coli MG1655 strains using the PCR method. The chromosomal DNA used for this can also be obtained from any other E. coli strain.

К белкам согласно настоящему изобретению относятся мутанты и варианты белка YicM, которые могут существовать вследствие природного разнообразия, при условии, что указанные мутанты и варианты демонстрируют функциональные свойства белка YicM, по крайней мере устойчивость к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину. ДНК, кодирующая указанные мутанты и варианты, может быть получена путем выделения ДНК, которая гибридизуется с геном yicM(SEQ ID NO: 1) или частью указанного гена в жестких условиях, и которая кодирует белок, увеличивающий продукцию пуриновых нуклеотидов. Термин «жесткие условия», упомянутый здесь, означает условия, при которых образуются так называемые специфические гибриды, а неспецифические не образуются. Например, к жестким условиям относятся условия, при которых гибридизуются ДНК, обладающие высокой степенью гомологии, к примеру, ДНК, обладающие гомологией не менее 70% друг относительно друга. В качестве варианта примером жестких условий являются условия соответствующие условиям, отмывки при гибридизации по Саузерну, например, 60°С, 1×SSC, 0.1% SDS, предпочтительно 0.1×SSC, 0.1% SDS. В качестве зонда для ДНК, кодирующей варианты и гибридизующейся с геном YicM, также может быть использована часть нуклеотидной последовательности под номером 1. Зонд подобного рода может быть получен в результате ПЦР с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, полученных на основе нуклеотидной последовательности под номером 1, и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность под номером 1, в качестве матрицы. В случае, когда в качестве зонда используется фрагмент ДНК длиной около 300 пар оснований, условия отмывки при гибридизации соответствуют, например, 50°С, 2×SSC и 0.1% SDS.The proteins of the present invention include mutants and variants of the YicM protein that may exist due to natural diversity, provided that these mutants and variants demonstrate the functional properties of the YicM protein, at least resistance to 6-mercaptopurine, inosine and guanosine. DNA encoding these mutants and variants can be obtained by isolating DNA that hybridizes with the yicM gene (SEQ ID NO: 1) or a portion of the specified gene under stringent conditions, and which encodes a protein that increases the production of purine nucleotides. The term "stringent conditions", referred to here, means the conditions under which the so-called specific hybrids are formed, but non-specific ones are not formed. For example, stringent conditions include conditions under which DNA with a high degree of homology hybridizes, for example, DNA with a homology of at least 70% relative to each other. Alternatively, stringent conditions are exemplified by conditions appropriate to the conditions, washing during Southern hybridization, for example, 60 ° C, 1 × SSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 × SSC, 0.1% SDS. Part of the nucleotide sequence number 1 can also be used as a probe for DNA encoding variants and hybridizing with the YicM gene. A probe of this kind can be obtained by PCR using oligonucleotides obtained on the basis of nucleotide sequence number 1 as seeds. and a DNA fragment containing the nucleotide sequence at number 1, as a matrix. When a DNA fragment with a length of about 300 base pairs is used as a probe, the washing conditions during hybridization correspond, for example, to 50 ° С, 2 × SSC, and 0.1% SDS.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения вышеуказанных ДНК в бактерию, уже обладающую способностью к продукции инозина. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей указанные ДНК, способности к продукции инозина.The bacterium according to the present invention can be obtained by introducing the above DNA into a bacterium already possessing the ability to produce inosine. On the other hand, a bacterium according to the present invention can be obtained by giving the bacterium already containing said DNA the ability to produce inosine.

В качестве родительского штамма - продуцентов инозина, в которым активности белков согласно настоящему изобретению будут повышены, может быть использован штамм Е.coli FADRaddedd (pMWKQAp). Указанный штамм является производным от известного штамма W3110, содержащего мутации, введенные в ген purF, кодирующий PRPP амидотрансферазу, ген purR, кодирующий репрессор биосинтеза пуринов, ген deoD, кодирующий фосфорилазу пуриновых нуклеозидов, ген ригА, кодирующий сукцинил-АМР-синтазу, ген add, кодирующий аденозиндеаминазу, ген edd, кодирующий 6-фосфоглюконатдегидразу (WO 9903988), а также содержащего плазмиду pMWKQAp - производную от вектора pMWKQ, в которой находятся гены pur FKQ, кодирующие PRPP амидотрансферазу, нечувствительную к гуанозин монофосфату (GMP) (WO 9903988). Для получения плазмиды pMWKQAp, ген bla был вырезан из плазмиды pUC21 по сайту рестрикции PagI и клонирован в сайт NcoI плазмиды pUK21. Из полученной плазмиды ген bla был вырезан с помощью рестриктаз Bsu151 и SmaI и клонирован в плазмиду pMWKQ по сайтам рестрикции Bsu151-SmaI. Полученная плазмида pMWKQAp сообщала клеткам устойчивость к ампициллину.As the parent strain - producers of inosine, in which the activity of the proteins according to the present invention will be increased, the E. coli FADRaddedd strain (pMWKQAp) can be used. The specified strain is derived from the known strain W3110 containing mutations introduced into the purF gene encoding PRPP amidotransferase, purR gene encoding a purine biosynthesis repressor, deoD gene encoding purine nucleoside phosphorylase, rigA gene encoding succinyl AMP synthase, add encoding adenosine deaminase, the edd gene encoding 6-phosphogluconate dehydrase (WO 9903988), as well as containing the plasmid pMWKQAp, a derivative of the pMWKQ vector, which contains the pur FKQ genes encoding PRPP amidotransferase that is not sensitive to guanosine monophosphate 9 988). To obtain plasmid pMWKQAp, the bla gene was excised from plasmid pUC21 at the PagI restriction site and cloned into the NcoI site of plasmid pUK21. The bla gene was excised from the obtained plasmid using Bsu151 and SmaI restriction enzymes and cloned into the pMWKQ plasmid at the Bsu151-SmaI restriction sites. The resulting plasmid pMWKQAp imparts ampicillin resistance to cells.

Чтобы увеличить саму активность в пересчете на белок согласно настоящему изобретению, также возможно ввести мутацию в структурную часть гена, кодирующего белок, чтобы увеличить активность белка. Для того, чтобы ввести мутацию в ген, могут быть использованы сайт-специфический мутагенез (Kramer, W. and Frits, H.J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)), методы рекомбинантной ПЦР (PCR Technology, Stockton Press (1989)), химический синтез специфических участков ДНК, обработка нужного гена с помощью гидроксиламина, обработка микробных штаммов, содержащей нужный ген, с помощью УФ-излучения или химического реагента, такого как нитрозогуанидин или азотистая кислота, или подобным методом. Микроорганизм, в котором активность указанного белка повышена, может быть отобран как штамм, растущий на минимальной среде, содержащей 6-меркаптопурин, инозин и гуанозин в концентрациях, указанных в Таблице 1 (смотри ниже).In order to increase the activity itself in terms of the protein according to the present invention, it is also possible to introduce a mutation into the structural part of the gene encoding the protein in order to increase the activity of the protein. In order to introduce a mutation into a gene, site-specific mutagenesis can be used (Kramer, W. and Frits, HJ, Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)), recombinant PCR methods (PCR Technology, Stockton Press (1989) ), chemical synthesis of specific sections of DNA, treatment of the desired gene with hydroxylamine, treatment of microbial strains containing the desired gene using UV radiation or a chemical reagent such as nitrosoguanidine or nitrous acid, or a similar method. A microorganism in which the activity of the indicated protein is increased can be selected as a strain growing on minimal medium containing 6-mercaptopurine, inosine and guanosine at the concentrations indicated in Table 1 (see below).

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть в дальнейшем улучшена за счет увеличения экспрессии одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез пуринов. Примерами таких генов являются гены риr регулона из Е. coli (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C.Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996). Описан штаммом Е. coli продуцент инозина, содержащий мутантный ген purF, кодирующий PRPP амидотрансферазу, нечувствительную к ингибированию GMP и АМР по типу обратной связи, инактивированный ген purR, кодирующий репрессор биосинтеза пуринов (WO 9903988).The bacterium of the present invention can be further improved by increasing the expression of one or more genes involved in purine biosynthesis. Examples of such genes are regregulon genes from E. coli (Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief: F.C. Neidhardt, ASM Press, Washington D.C., 1996). An inosine producer has been described by an E. coli strain containing a mutant purF gene encoding a PRPP amidotransferase that is insensitive to feedback inhibition of GMP and AMP, an inactivated purR gene encoding a purine biosynthesis repressor (WO 9903988).

Механизмом, увеличивающим продукцию пуриновых нуклеозидов бактерией путем увеличения активности белков согласно настоящему изобретению, является, как можно предположить, повышенная экскреция целевого пуринового нуклеозида из клетки бактерии.The mechanism that increases the production of purine nucleosides by the bacterium by increasing the activity of the proteins of the present invention is, as can be expected, increased excretion of the target purine nucleoside from the bacterial cell.

2. Способ получения инозина.2. A method of producing inosine.

К способам согласно настоящему изобретению относится способ получения инозина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления инозина в питательной среде, и выделения инозина из культуральной жидкости.The methods of the present invention include a method for producing inosine, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a culture medium in order to produce and accumulate inosine in a culture medium and isolate inosine from the culture fluid.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка пуринового нуклеозида из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых пуриновый нуклеозид продуцируется с использованием микроорганизма. Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, неорганические ионы и другие необходимые органические компоненты. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза, лактоза, сахароза, галактоза, фруктоза, арабиноза, мальтоза, ксилоза, трегалоза, рибоза и гидролизат крахмала; спирты, такие как глицерин, маннитол и сорбитол; различные органические кислоты, такие как глюконовая кислота, фумаровая кислота, лимонная кислота и янтарная кислота и подобные им.According to the present invention, the cultivation, isolation and purification of purine nucleoside from a culture or similar liquid can be carried out in a manner similar to traditional fermentation methods in which the purine nucleoside is produced using a microorganism. The nutrient medium used for growing can be either synthetic or natural, provided that the medium contains sources of carbon, nitrogen, inorganic ions and other necessary organic components. Carbon sources include various carbohydrates such as glucose, lactose, sucrose, galactose, fructose, arabinose, maltose, xylose, trehalose, ribose and starch hydrolyzate; alcohols such as glycerin, mannitol and sorbitol; various organic acids such as gluconic acid, fumaric acid, citric acid and succinic acid and the like.

В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как сульфат аммония, хлорид аммония и фосфат аммония, органические источники азота, такие как гидролизат соевых бобов; газообразный аммиак, раствор аммония и подобные соединения. Желательно, чтобы подходящие небольшие количества витаминов, таких как витамин B₁, и других необходимых веществ, например нуклеиновых кислот, таких как аденин и РНК, или дрожжевой экстракт и подобные соединения присутствовали в питательной среде в качестве органических питательных компонент. Кроме того, небольшие количества фосфата кальция, сульфата магния, ионов железа, ионов марганца и подобных соединений могут быть добавлены, если необходимо.As the nitrogen source, various inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride and ammonium phosphate, organic nitrogen sources such as soybean hydrolyzate can be used; ammonia gas, ammonium solution and the like. Suitable small amounts of vitamins, such as vitamin B ₁ , and other essential substances, for example, nucleic acids, such as adenine and RNA, or yeast extract and the like, are preferably present in the nutrient medium as organic nutrients. In addition, small amounts of calcium phosphate, magnesium sulfate, iron ions, manganese ions and similar compounds can be added, if necessary.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях в течение 16-72 часов, температуре при выращивании поддерживается в пределах от 30 до 45°С и рН в пределах от 5 до 8. рН среды может регулироваться неорганическими или органическими кислотными или щелочными веществами, а также газообразным аммиаком.The cultivation is preferably carried out under aerobic conditions for 16-72 hours, the temperature during cultivation is maintained in the range from 30 to 45 ° C and the pH is in the range from 5 to 8. The pH of the medium can be regulated by inorganic or organic acid or alkaline substances, as well as gaseous ammonia .

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем целевой пуриновый нуклеозид может быть выделен из культуральной жидкости любым из традиционных методов или любой комбинацией этих методов, таким как ионообменная хроматография и осаждение.After growth, solid residues, such as cells, can be removed from the culture fluid by centrifugation or filtration through a membrane, and then the target purine nucleoside can be isolated from the culture fluid by any of the traditional methods or any combination of these methods, such as ion exchange chromatography and precipitation.

3. Способ получения 5'-инозиновой кислоты.3. A method of obtaining 5'-inosinic acid.

К способам согласно настоящему изобретению также относится способ получения 5'-инозиновой кислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде, фосфорилирования полученного и накопленного инозина, и выделения полученной и накопленной 5'-инозиновой кислоты.The methods of the present invention also include a method for producing 5'-inosinic acid, comprising the steps of growing the bacteria of the present invention in a nutrient medium, phosphorylating the obtained and accumulated inosine, and isolating the obtained and accumulated 5'-inosinic acid.

Согласно настоящему изобретению выращивание, выделение и очистка инозина из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых инозин продуцируется с использованием микроорганизма. Далее, согласно настоящему изобретению фосфорилирование полученного и накопленного инозина, а также выделение полученной и накопленной 5'-инозиновой кислоты может быть осуществлено методом, подобным традиционным методам, в которых пуриновые нуклеотиды, такие как 5'-инозиновая кислота, получается из пуринового нуклеозида, такого как инозин.According to the present invention, the cultivation, isolation and purification of inosine from a culture or similar liquid can be carried out in a manner similar to traditional fermentation methods in which inosine is produced using a microorganism. Further, according to the present invention, the phosphorylation of the obtained and accumulated inosine, as well as the isolation of the obtained and accumulated 5'-inosinic acid, can be carried out by a method similar to traditional methods in which purine nucleotides, such as 5'-inosinic acid, are obtained from a purine nucleoside, such like inosine.

Фосфорилирование пуринового нуклеозида может быть осуществлено ферментативно с использованием различных фосфатаз, нуклеозидкиназ и нуклеозидфосфотрансфераз, или химически с использованием фосфорилирующих агентов, таких как POCl₃ или подобным им. Могут быть использованы фосфатаза, способная к катализу селективного переноса фосфорильной группы пирофосфата в 5'-положение нуклеозида (Mihara et. al, Phosphorylation of nucleosides by the mutated acid phosphatase from Morganella morganii. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66:2811-2816), или кислая фосфатаза, использующая полифосфорные кислоты (их соли), фенилфосфорную кислоту (ее соли) или карбамилфосфорную кислоту (ее соли) в качестве донора фосфорной кислоты (W09637603 A1), или подобные им. Также, в качестве примера фосфатазы может быть приведена фосфатаза, способная к каталитическому переносу фосфорильной группы в 2', 3', 5'-положение нуклеозида с использованием в качестве субстрата п-нитрофенилфосфата (Mitsugi, К., et al, Agric. Biol. Chem. 1964, 28, 586-600), неорганического фосфата (JP42-1186), или ацетил фосфата (JP61-41555), или подобная ей. В качестве примера нуклеозидкиназы может быть приведена гуанозин-инозинкиназа из Е. coli (Mori et. al. Cloning of a guanosineinosine kinase gene of Escherichia coli and characterization of the purified gene product. J. Bacteriol. 1995. 177:4921-4926; W09108286), или подобная ей. В качестве примера нуклеозидфосфотрансферазы может быть приведена нуклеозидфосфотрансфераза, описанная Hammer-Jespersen, К. (Nucleoside catabolism, p.203-258. In A Munch-Petesen (ed.), Metabolism ofnucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganism. 1980, Academic Press, New York), или подобная ей. Химическое фосфорилирование нуклеозидов может быть осуществлено с использованием фосфорилирующего агента, такого как РОС1з (Yoshikawa et. al. Studies ofphosphorylation. III. Selective phosphorylation of unprotected nucleosides. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1969,42:3505-3508), или подобного ему.Phosphorylation of purine nucleoside can be carried out enzymatically using various phosphatases, nucleoside kinases and nucleoside phosphotransferases, or chemically using phosphorylating agents such as POCl ₃ or the like. Phosphatase capable of catalyzing the selective transfer of the phosphoryl group of pyrophosphate to the 5'-position of a nucleoside (Mihara et. Al, Phosphorylation of nucleosides by the mutated acid phosphatase from Morganella morganii. Appl. Environ. Microbiol. 2000, 66: 2811-2816 can be used). ), or acid phosphatase using polyphosphoric acids (their salts), phenylphosphoric acid (its salts) or carbamylphosphoric acid (its salts) as a phosphoric acid donor (W09637603 A1), or the like. Also, phosphatase capable of catalytically transferring a phosphoryl group to the 2 ', 3', 5'-position of a nucleoside using p-nitrophenylphosphate as a substrate (Mitsugi, K., et al, Agric. Biol. Chem. 1964, 28, 586-600), inorganic phosphate (JP42-1186), or acetyl phosphate (JP61-41555), or the like. Guanosine inosine kinase from E. coli (Mori et. Al. Cloning of a guanosineinosine kinase gene of Escherichia coli and characterization of the kind gene product. J. Bacteriol. 1995. 177: 4921-4926; W09108286 can be cited as an example of nucleoside kinase. ), or similar to it. As an example of a nucleoside phosphotransferase, the nucleoside phosphotransferase described by Hammer-Jespersen, K. (Nucleoside catabolism, p.203-258. In A Munch-Petesen (ed.), Metabolism ofnucleotides, nucleosides, and nucleobases in microorganism. 1980, Academic Press can be cited. , New York), or the like. Chemical nucleoside phosphorylation can be carried out using a phosphorylating agent such as POCl (Yoshikawa et. Al. Studies of phosphorylation. III. Selective phosphorylation of unprotected nucleosides. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1969,42: 3505-3508), or the like. him.

Подписи к чертежамDrawing captions

Фиг.1. Схема хромосомного фрагмента ДНК, содержащегося в фазмиде рМР1, который придавал клеткам устойчивость к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину.Figure 1. Scheme of the chromosomal DNA fragment contained in the pMP1 phasmide, which conferred resistance to 6-mercaptopurine, inosine and guanosine on cells.

На Фиг.2 показана структура плазмиды pYlCM1.Figure 2 shows the structure of plasmid pYlCM1.

На Фиг.3 показана последовательность хромосомной ДНК из штамма Е.coli К-12, располагающаяся на хромосоме указанного штамма перед геном yicM (также представлена в списке последовательностей как последовательность под номером 5). Альтернативный старт-кодон обозначен жирным шрифтом. Предполагаемый сайт связывания рибосомы подчеркнут.Figure 3 shows the sequence of the chromosomal DNA from the E. coli K-12 strain located on the chromosome of the indicated strain in front of the yicM gene (also shown in the list of sequences as sequence number 5). An alternative start codon is indicated in bold. The putative ribosome binding site is underlined.

Наилучший способ осуществления изобретенияBEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

Пример 1. Клонирование генов, которые придают устойчивость к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину из Е.coli в фазмиду mini-Mu.Example 1. Cloning of genes that confer resistance to 6-mercaptopurine, inosine and guanosine from E. coli into mini-Mu phasmid.

Гены из E.coli, которые обуславливают устойчивость к аналогам пуриновых оснований, были изначально клонированы in vivo с использованием фазмиды mini-Mu d5005 (Groisman, E.A., et al., J. Bacteriol., 168, 357-364 (1986)). Штамм MG1655, лизогенный по фагу MuCts62, был использован в качестве донора. Свежеприготовленные лизаты были использованы для инфицирования лизогенного по фагу MuCts производного этого штамма. Полученные клетки высевались на минимальную среду М9 с глюкозой, содержащую канамицин (40 мкг/мл) и 6-меркаптопурин (200 мг/мл). Были отобраны колонии, появившиеся после 48-72 часов культивирования, из колоний была выделена плазмидная ДНК и использована для трансформации штамма MG1655 и TG1 deoD gsk3 стандартными методами. Трансформанты были отобраны на чашках с агаризованным L-бульоном, содержащим канамицин, как указано выше. Штамм TG1 deoD gsk3 - это родительский штамм, специально сконструированный для проверки степени устойчивости к инозину и гуанозину. Указанный штамм был получен путем последовательного переноса мутаций в генах deoD и gsk3 трансдукцией фагом Р1 в известный штамм TG1, обладающий устойчивостью к инозину и гуанозину, благодаря способности к деградации пуринов. Штамм TG1 deoD gsk3 не способен деградировать инозин и гуанозин, благодаря мутации deoD (W09903988) и чувствителен к нуклеозидам благодаря мутации gsk3 (Petersen С. J. Biol. Chem., 274, 5348-5356, 1999.).Из трансформантов, устойчивых к 200 мкг/мл 6-меркаптопурина, 1 мг/мл инозина и 30 мкг/мл гуанозина, была выделена плазмидная ДНК. Нуклеотидная последовательность концов хромосомных ДНК вставок определялась с использованием затравок, приведенных в Списке последовательностей под номерами 3 и 4 (SEQ ID NO:3 и 4), соответственно для левого и правого участков присоединения фага Mu. Полная нуклеотидная последовательность генома штамма Е. coli K-12 определена (Science, 277,1453-1474, 1997). Поэтому полученные данные о нуклеотидной последовательности были сравнены с информацией из GenBank, и таким образом были идентифицированы клонированные фрагменты.Genes from E. coli, which cause resistance to purine base analogs, were initially cloned in vivo using the mini-Mu d5005 phasmid (Groisman, E. A., et al., J. Bacteriol., 168, 357-364 (1986)). Strain MG1655, lysogenic for phage MuCts62, was used as a donor. Freshly prepared lysates were used to infect a lysogenic MuCts phage derivative of this strain. The resulting cells were plated on minimal M9 medium with glucose containing kanamycin (40 μg / ml) and 6-mercaptopurine (200 mg / ml). Colonies that appeared after 48-72 hours of cultivation were selected, plasmid DNA was isolated from the colonies and used to transform strain MG1655 and TG1 deoD gsk3 by standard methods. Transformants were selected on plates with agarized L-broth containing kanamycin, as described above. The strain TG1 deoD gsk3 is a parent strain specifically designed to test the degree of resistance to inosine and guanosine. The indicated strain was obtained by sequential transfer of mutations in the deoD and gsk3 genes by transduction with phage P1 to the known strain TG1, which is resistant to inosine and guanosine, due to the ability to degrade purines. The strain TG1 deoD gsk3 is not able to degrade inosine and guanosine due to the deoD mutation (W09903988) and is sensitive to nucleosides due to the gsk3 mutation (Petersen C. J. Biol. Chem., 274, 5348-5356, 1999.). Of transformants resistant to 200 μg / ml 6-mercaptopurine, 1 mg / ml inosine and 30 μg / ml guanosine, plasmid DNA was isolated. The nucleotide sequence of the ends of the chromosomal DNA inserts was determined using the seeds shown in the List of sequences numbered 3 and 4 (SEQ ID NO: 3 and 4), respectively, for the left and right parts of the attachment of the phage Mu. The complete nucleotide sequence of the genome of E. coli K-12 strain has been determined (Science, 277.1453-1474, 1997). Therefore, the obtained nucleotide sequence data was compared with information from GenBank, and thus cloned fragments were identified.

Оказалось, что были клонированы несколько типов вставок, принадлежащих к различным участкам хромосомы. Одна из них, 6-МР1, являющаяся хромосомной вставкой (11970 т.п.о.) в фазмиду рМР1, показана на Фиг.1.It turned out that several types of inserts belonging to different parts of the chromosome were cloned. One of them, 6-MP1, which is a chromosomal insertion (11970 kb) into the pMP1 phasmid, is shown in FIG.

Пример 2. Идентификация гена vicM, придающего устойчивость к 6-меркаптопурину. инозину и гуанозинуExample 2. Identification of the vicM gene conferring resistance to 6-mercaptopurine. inosine and guanosine

Фрагмент 6-МР1 содержал по крайней мере 8 генов. Для того, чтобы идентифицировать ген, придающий устойчивость к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину, каждый из генов был субклонирован в многокопийный вектор рОК12 (Vieira, Messing, Gene, 100,189-194,1991) и проверен на способность придавать устойчивость к указанным реагентам. Среди них ген yicM, содержащий примерно 342 п.о. перед предполагаемым старт-кодоном (последовательность Genbank, инвентарный номер NP_418118), был вырезан из фрагмента 6-МР1 с использованием ферментов рестрикции PstI и PvuII и вставлен в вектор рОК12 (Vieira, Messing, Gene, 100, 189-194, 1991), предварительно обработанный ферментами рестрикции PstI и Есо32I. Так была получена плазмида pYICM1, содержащая ген YicM (Фиг.2).Fragment 6-MP1 contained at least 8 genes. In order to identify the gene conferring resistance to 6-mercaptopurine, inosine and guanosine, each of the genes was subcloned into the pOK12 multi-copy vector (Vieira, Messing, Gene, 100,189-194,1991) and tested for its ability to confer resistance to these reagents. Among them, the yicM gene containing approximately 342 bp before the proposed start codon (Genbank sequence, accession number NP_418118), was cut from the 6-MP1 fragment using the restriction enzymes PstI and PvuII and inserted into the pOK12 vector (Vieira, Messing, Gene, 100, 189-194, 1991), previously treated with restriction enzymes PstI and Eco32I. Thus, the plasmid pYICM1 containing the YicM gene was obtained (Figure 2).

Плазмида pYICMI, а также вектор рОК12 были введены в штаммы Е. coli TG1 и TG1 deoD gsk3. Так были получены штаммы TG1(pYICM1), TG1(pOK12), TG1 deoD gsk3(pYICM1) и TG1 deoD gsk3(pOK12). Затем была определена способность этих штаммов расти в присутствии 6-меркаптопурина, инозина и гуанозина на чашках с минимальной агаризованной средой М9 с глюкозой, содержащей ступенчатые концентрации ингибитора. Чашки были засеяны клетками (от 10⁵ до 10⁶) ночной культуры, выращенной на минимальной среде, содержащей 50 мг/мл канамицина в случае штаммов с плазмидами. Степень роста была оценена после инкубации в течение 44 часов при 37°С.Plasmid pYICMI, as well as the vector pOK12, were introduced into E. coli strains TG1 and TG1 deoD gsk3. Thus, strains TG1 (pYICM1), TG1 (pOK12), TG1 deoD gsk3 (pYICM1) and TG1 deoD gsk3 (pOK12) were obtained. Then, the ability of these strains to grow in the presence of 6-mercaptopurine, inosine and guanosine on plates with minimal agarized M9 medium with glucose containing stepwise concentrations of the inhibitor was determined. The dishes were seeded with cells (from 10 ⁵ to 10 ⁶ ) of an overnight culture grown on minimal medium containing 50 mg / ml kanamycin in the case of plasmid strains. The degree of growth was evaluated after incubation for 44 hours at 37 ° C.

Результаты представлены в Таблице 1.The results are presented in Table 1.

Таблица 1.Table 1. ШтаммStrain Рост на минимальной среде, содержащей:Growth on a minimal environment containing: 6-МР, мкг/мл6-MP, mcg / ml Инозин, мкг/млInosine, mcg / ml Гуанозин, мкг/млGuanosine, mcg / ml 200200 500500 300300 10001000 1010 30thirty 50fifty E.coli TG1 (pYiCM1)E.coli TG1 (pYiCM1) -- -- n.d.n.d. n.d.n.d. n.d.n.d. n.d.n.d. n.d.n.d. E.coli TG1 (pOK12)E.coli TG1 (pOK12) ++ ++ n.d.n.d. n.d.n.d. n.d.n.d. n.d.n.d. n.d.n.d. E.coli TG1 deoD gsk3 (pYICM1)E.coli TG1 deoD gsk3 (pYICM1) n.d.n.d. n.d.n.d. -- -- -- -- -- E.coli TGl deoD gsk3 (pOK12)E.coli TGl deoD gsk3 (pOK12) n.d.n.d. n.d.n.d. ++ ++ ++ ++ -- Примечание. Рост оценивался через 48 часов, n.d.: не определяли; +: хороший рост; -: отсутствие роста.Note. Growth was evaluated after 48 hours, n.d .: not determined; +: good growth; -: lack of growth.

Штамм E.coli TG1 deoD gsk3 (pYICM1) демонстрирует устойчивость к инозину и гуанозину. Этот штамм может считаться устойчивым ко всем трем аналогам (6-меркаптопурину, инозину и гуанозину), поскольку родительский штамм E.coli TG1 (pYICM1) устойчив к 6-меркаптопурину. Штамм E.coli TG1 deoD gsk3 (pYICM1) получен из E.coli TG1 (pYICM1) без изменения фенотипа 6-МР^R.The strain E. coli TG1 deoD gsk3 (pYICM1) shows resistance to inosine and guanosine. This strain can be considered resistant to all three analogues (6-mercaptopurine, inosine and guanosine), since the parent E. coli strain TG1 (pYICM1) is resistant to 6-mercaptopurine. The strain E.coli TG1 deoD gsk3 (pYICM1) was obtained from E.coli TG1 (pYICM1) without changing the phenotype 6-MP ^R.

Как видно из Таблицы 1, амплификация гена yicM в значительной степени увеличила устойчивость клеток к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину.As can be seen from Table 1, amplification of the yicM gene significantly increased cell resistance to 6-mercaptopurine, inosine and guanosine.

Пример 3: Идентификация точки начала трансляции гена vicM.Example 3: Identification of the translation initiation point of the vicM gene.

Точка начала трансляции гена yic М не была известна, а предполагаемый аминокислотный состав соответствующего белка изменялся в разных базах данных. В соответствии с базой данных Genbank, белок (NP_418118) состоял из 451 аминокислоты. В соответствии с базой SWISS-PROT белок (Р31438) состоял из 412 аминокислот. В соответсвии с базой EcoGene белок (EG 11689) состоял из 396 аминокислот. Соответствующие старт кодоны отмечены жирным шрифтом на Фиг.3.The start point of the translation of the yic M gene was not known, and the estimated amino acid composition of the corresponding protein was changed in different databases. According to the Genbank database, the protein (NP_418118) consisted of 451 amino acids. According to the SWISS-PROT base, the protein (P31438) consisted of 412 amino acids. According to the EcoGene base, the protein (EG 11689) consisted of 396 amino acids. The corresponding start codons are marked in bold in FIG. 3.

Нуклеотидная последовательность хромосомной области, находящейся перед геном yicM, представлена в Списке последовательностей под номером 5. Для определения истинной точки начала трансляции гена yicM были синтезированы три пары затравок, а именно SEQ ID NO:6 и SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8 и SEQ ID NO:9; SEQ ID NO:10 и SEQ ID NO:11. Затем, используя сайт-направленный мутагенез, мы разрушили потенциальные старт кодоны указанного гена, содержащегося на плазмиде pYICM1, поочередным введением мутаций. Так, кодон GTG был заменен на CTG, и оба кодона ATG (ATG1 и ATG2) были заменены на АТС. Приведенные выше замены подтвердили с помощью секвенирования. Затем в штамме TG1 deoD gsk3 был изучен эффект влияния мутаций на фенотип клеток. Каждая из плазмид, содержащих мутантный ген yicM, была введена в клетки указанного штамма, после чего был проверен рост этого штамма в присутствии ингибирующих концентраций инозина. Результаты представлены в Таблице 2.The nucleotide sequence of the chromosome region in front of the yicM gene is presented in Sequence List No. 5. To determine the true start point of the translation of the yicM gene, three seed pairs were synthesized, namely SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11. Then, using site-directed mutagenesis, we destroyed the potential start codons of the indicated gene contained in the plasmid pYICM1 by the introduction of mutations in turn. So, the GTG codon was replaced by CTG, and both ATG codons (ATG1 and ATG2) were replaced by ATS. The above substitutions were confirmed by sequencing. Then, the effect of mutations on the phenotype of cells was studied in the strain TG1 deoD gsk3. Each of the plasmids containing the mutant yicM gene was introduced into the cells of the indicated strain, after which the growth of this strain was checked in the presence of inhibitory concentrations of inosine. The results are presented in Table 2.

Таблица 2table 2 ШтаммStrain Рост на среде М9 с инозиномGrowth on M9 medium with inosine -- 500 мкг/мл500 mcg / ml Е. coli TG1 deoD gsk3 (рОК12)E. coli TG1 deoD gsk3 (pOK12) ++ -- Е. coli TG1 deoD gsk3 (pOK12-yicM)E. coli TG1 deoD gsk3 (pOK12-yicM) ++ ++ Е. coli TG1 deoD gsk3 (pOK12-yicM gtg→ctg)E. coli TG1 deoD gsk3 (pOK12-yicM gtg → ctg) ++ ++ Е. coli TG1 deoD gsk3 (pOK12-yicM atgl→atc)E. coli TG1 deoD gsk3 (pOK12-yicM atgl → atc) ++ ++ Е. coli TG1 deoD gsk3 (pOK12-yicM atg2→atc)E. coli TG1 deoD gsk3 (pOK12-yicM atg2 → atc) ++ -- Примечание. Рост оценивался через 48 часов. +: хороший рост; -: отсутствие роста.Note. Growth was evaluated after 48 hours. +: good growth; -: lack of growth.

Как видно из Таблицы 2, амплификация природного гена yicM сообщила клеткам устойчивость к инозину. Мутации в кодонах GTG и ATG1 никак не повлияли на устойчивость к инозину. Тем не менее, когда кодон ATG2 был мутирован, клетки стали чувствительны к инозину. Таким образом, было высказано предположение, что кодон ATG2 является истинным старт кодовом гена yicM. Тот факт, что только перед самой короткой ORF находится последовательность, напоминающая сайт связывания рибосомы (подчеркнуто на Фиг.3), подтвердило это предположение.As can be seen from Table 2, the amplification of the natural yicM gene gave the cells resistance to inosine. Mutations in GTG and ATG1 codons did not affect inosine resistance. However, when the ATG2 codon was mutated, the cells became sensitive to inosine. Thus, it has been suggested that the ATG2 codon is the true start of the yicM code gene. The fact that only in front of the shortest ORF is a sequence resembling a ribosome binding site (emphasized in FIG. 3) confirmed this assumption.

Таким образом, ген yicM кодирует белок, состоящий из 396 аминокислотных остатков (последовательность 2) и предсказанную молекулярную массу 41.85 кДа. Анализ сиквенса белка YicM стандартными методами (Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol, 157,105-132, (1982), Tusnady and Simon, J. Mol. BioL, 283,489-506 (1998)) показал, что это высокогидрофобный белок, состоящий из 12 предсказанных трансмембранных сегментов. Белок YicM принадлежит к семейству транспортеров, осуществляющих перенос субстратов через мембрану посредством протон-движущей силы (Drug:H⁺ Antiporter-1 (12 Spanner) (DHA1)), входящему, в свою очередь, в надсемейство MFS (MFS - major facilitator superfamily) (Pao, S.S. et al, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (I): 1-32 (1998)) и к кластеру ортологов пермеаз эффлюкса арабинозы (COG) 2814 (Tatusov, R.L. et al, Nucleic Acids Res., 29: 22-28 (2001)). Другими белками из Е. coli, принадлежащим к этому семейству, являются AraJ, YdeA and YdhP. Геном Bacillus subtilis содержит 6 генов, кодирующих гомологи гена yicM gene: ybcL, yceJ, ydhL, yfliI, ytbD, ywfA. Таким образом, может быть предсказано, что ген yicM кодирует белок, участвующий в эффлюксе некоторых метаболитов. Тот факт, что суперэкспрессия этого гена сообщает клетке устойчивость к 6-меркаптопурину, инозину и гуанозину, позволяет считать производные инозина возможными субстратами для кодируемого им белка.Thus, the yicM gene encodes a protein consisting of 396 amino acid residues (sequence 2) and a predicted molecular weight of 41.85 kDa. Sequence analysis of the YicM protein by standard methods (Kyte and Doolittle, J. Mol. Biol, 157.105-132, (1982), Tusnady and Simon, J. Mol. BioL, 283,489-506 (1998)) showed that it is a highly hydrophobic protein consisting of 12 predicted transmembrane segments. Protein YicM belongs to the family of transporters carrying out the transfer of substrates through the membrane by means of a proton-driving force (Drug: H ⁺ Antiporter-1 (12 Spanner) (DHA1)), which, in turn, is part of the MFS superfamily (MFS - major facilitator superfamily) (Pao, SS et al, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (I): 1-32 (1998)) and to a cluster of orthologs of arabinose efflux permeases (COG) 2814 (Tatusov, RL et al, Nucleic Acids Res., 29: 22-28 (2001)). Other proteins from E. coli belonging to this family are AraJ, YdeA and YdhP. The Bacillus subtilis genome contains 6 genes encoding the homologs of the yicM gene: ybcL, yceJ, ydhL, yfliI, ytbD, ywfA. Thus, it can be predicted that the yicM gene encodes a protein involved in the efflux of certain metabolites. The fact that overexpression of this gene imparts resistance to 6-mercaptopurine, inosine and guanosine to the cell allows us to consider inosine derivatives as possible substrates for the protein encoded by it.

Пример 4. Влияние амплификации гена yicM на продукцию инозина штаммом Е. coli - продуцентом инозина.Example 4. The effect of amplification of the yicM gene on the production of inosine by E. coli strain - producer of inosine.

Штамм FADRaddedd (pMWKQAp) - продуцент инозина был трансформирован вектором рОК.12 и плазмидой pYICM1. Так были получены штаммы FADRaddedd (pMWKQAp, pOK12) и FADRaddedd (pMWKQAp, pYICM1). Каждый из этих штаммов выращивался при 37°С в течение 18 часов в L-бульоне, содержащем 100 мг/л ампициллина и 75 мг/л канамицина, и 0.3 мл полученной культуры было перенесено в 3 мл питательной среды для ферментации, содержащей 100 мг/л ампициллина и 75 мг/л канамицина, в пробирке 20×200 мм и инкубировалось при 37°С в течение 72 часов на роторной качалке.The FADRaddedd strain (pMWKQAp), the inosine producer, was transformed with the pOK.12 vector and plasmid pYICM1. Thus, the strains FADRaddedd (pMWKQAp, pOK12) and FADRaddedd (pMWKQAp, pYICM1) were obtained. Each of these strains was grown at 37 ° C for 18 hours in L-broth containing 100 mg / l ampicillin and 75 mg / l kanamycin, and 0.3 ml of the resulting culture was transferred to 3 ml of fermentation medium containing 100 mg / l of ampicillin and 75 mg / l of kanamycin, in vitro 20 × 200 mm and incubated at 37 ° C for 72 hours on a rotary shaker.

Состав питательной среды для ферментации (г/л):The composition of the nutrient medium for fermentation (g / l):

Глюкоза Glucose 40.040.0 (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 16.016.0 КН₂PO₄ KN ₂ PO ₄ 0.10.1 MgSO₄×7H₂O MgSO ₄ × 7H ₂ O 1.01.0 FeSO₄×7H₂O FeSO ₄ × 7H ₂ O 0.010.01 MnSO₄×5Н₂О MnSO ₄ × 5H ₂ O 0.010.01 Дрожжевой экстракт Yeast extract 8.08.0 СаСО₃ CaCO ₃ 30.030.0

Глюкоза и сульфат марганца стерилизовались раздельно. СаСО₃стерилизовали нагреванием при 180°С в течение 2 часов. рН поддерживали в районе 7.0. Антибиотики добавляли в среду после стерилизации.Glucose and manganese sulfate were sterilized separately. CaCO _{3 was} sterilized by heating at 180 ° C for 2 hours. pH was maintained at 7.0. Antibiotics were added to the medium after sterilization.

После выращивания количество инозина, накопленное в среде, определялось методом ВЭЖХ. Образец культуральной жидкости (500 мкл) был отцентрифугирован при 15000 об/мин в течение 5 мин, супернатант был разбавлен водой в 4 раза и проанализирован с помощью ВЭЖХ.After growing, the amount of inosine accumulated in the medium was determined by HPLC. A culture fluid sample (500 μl) was centrifuged at 15,000 rpm for 5 min, the supernatant was diluted 4 times with water and analyzed by HPLC.

Условия для анализа с помощью ВЭЖХ:Conditions for analysis using HPLC:

Колонка: Luna С 18(2) 250×3 мм, 5 u (Phenomenex, USA). Буфер: 2% v/v C₂H₅OH; 0.8% v/v триэтиламин, 0.5% v/v уксусная кислота (ледяная), рН 4.5. Температура: 30°С. Скорость потока: 0.3 мл/мин. Объем пробы: 5 мкл. УФ-детектор: 250 нм.Column: Luna C 18 (2) 250 × 3 mm, 5 u (Phenomenex, USA). Buffer: 2% v / v C ₂ H ₅ OH; 0.8% v / v triethylamine, 0.5% v / v acetic acid (glacial), pH 4.5. Temperature: 30 ° C. Flow rate: 0.3 ml / min. Sample volume: 5 μl. UV detector: 250 nm.

Время удерживания (мин):Retention Time (min):

Ксантозин Xanthosine 13.713.7 Инозин Inosine 9.69.6 Гипоксантин Hypoxanthine 5.25.2 Гуанозин Guanosine 11.411.4 Аденозин Adenosine 28.228.2

Результаты представлены в Таблице 3.The results are presented in Table 3.

Таблица 3.Table 3. ШтаммStrain OD540OD540 Инозин, г/лInosine, g / l FADRaddedd (pMWKQAp, pOK12)FADRaddedd (pMWKQAp, pOK12) 8.68.6 1.11.1 FADRaddedd (pMWKQAp, pYICM1)FADRaddedd (pMWKQAp, pYICM1) 9.09.0 1.51.5

Как видно из Таблицы 3, амплификация гена yicM увеличивала продукцию инозина штаммом FADRaddedd (pMWKQAp).As can be seen from Table 3, amplification of the yicM gene increased inosine production by the FADRaddedd strain (pMWKQAp).

Claims

1. A bacterium belonging to the genus Escherichia, with the ability to produce inosine, in which the activity of the YicM protein is increased.

2. The bacterium according to claim 1, characterized in that the activity of the protein described in points (A) or (B) in the cell of the aforementioned bacterium is increased:

(A) a protein that is represented by the amino acid sequence shown in sequence listing number 2;

(B) a protein that is represented by an amino acid sequence including deletions, substitutions, insertions, or the addition of one or more amino acids to the amino acid sequence listed in sequence number 2, and which has an activity that confers enhanced resistance to bacteria on 6-mercaptopurine, inosine, and guanosine.

3. The bacterium according to claim 2, characterized in that the activity of the proteins described in points (A) or (B) is increased by transforming the bacterium using DNA encoding the proteins described in points (A) or (B), or by changes in the regulation of expression of said DNA in the chromosome of said bacterium.

4. The bacterium according to claim 3, in which the transformation is carried out using a multi-copy vector.

5. A method of producing inosine, characterized in that it includes the steps of growing the bacterium according to any one of claims 1 to 4 in a nutrient medium and isolating the obtained and accumulated inosine from the culture fluid.

6. The method according to claim 5, characterized in that the bacterium has increased expression of purine nucleoside biosynthesis genes.

7. A method of producing 5'-inosinic acid, characterized in that it includes the steps of growing the bacterium according to any one of claims 1 to 4 in a nutrient medium, phosphorylation of the obtained and accumulated inosine.

8. The method according to claim 7, characterized in that the bacterium is modified to increase expression of purine nucleoside biosynthesis genes.