RU2268305C2

RU2268305C2 - Method for preparing l-amino acids by using microorganisms with optimized level of gene expression

Info

Publication number: RU2268305C2
Application number: RU2003136412/13A
Authority: RU
Inventors: Жанна Иосифовна Каташкина (RU); Жанна Иосифовна Каташкина; Мари Григорьевна Лунц (RU); Мария Григорьевна Лунц; Вера Георгиевна Дорошенко (RU); Вера Георгиевна Дорошенко; Светлана Александровна Фомина (RU); Светлана Александровна Фомина; Александра Юрьевна Скороходова (RU); Александра Юрьевна Скороходова; Лирина Валерьевна Ивановска (RU); Лирина Валерьевна Ивановская; Сергей Владимирович Машко (RU); Сергей Владимирович Машко
Original assignee: Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ)
Priority date: 2003-12-18
Filing date: 2003-12-18
Publication date: 2006-01-20
Also published as: RU2003136412A

Abstract

FIELD: biotechnology, microbiology, genetic engineering, amino acids.

SUBSTANCE: invention describes a microorganism belonging to genus Escherichia used as a producer of L-amino acids with optimized level of expression of gene that effects in disposition of carbon flow, in particular, gene sucAB. Method involves stages for insertion of DNA fragments set into microorganism chromosome synthesized in vitro and comprising regulatory elements of gene expression instead the natural element of regulatory gene region to obtain population of microorganisms and selection of microorganisms showing the enhanced production of L-amino acids. Also, invention describes a method for preparing such L-amino acids as L-glutamic acid, L-proline, L-arginine, L-glutamine, L-leucine by using microorganisms with optimized level of expression of gene sucAB. Invention provides preparing L-amino acids with the high effectiveness degree.

EFFECT: improved preparing method.

15 cl, 1 dwg, 2 tbl, 5 ex

Description

Предпосылки к созданию изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION

Область техникиTechnical field

Настоящее изобретение относится к способу получения бактерии с оптимизированным уровнем генной экспрессии, полезной для продукции аминокислот или нуклеиновых кислот, и к способу получения L-аминокислот или нуклеиновых кислот с использованием указанной бактерии.The present invention relates to a method for producing bacteria with an optimized level of gene expression useful for the production of amino acids or nucleic acids, and to a method for producing L-amino acids or nucleic acids using said bacterium.

Описание предшествующего уровня техникиDescription of the Related Art

Традиционным способом повышения продукции L-аминокислот или нуклеиновых кислот штаммами - продуцентами является увеличение активности продуктов генов, вовлеченных пути биосинтеза указанных L-аминокислот или нуклеиновых кислот. Это можно сделать путем получения мутантов, устойчивых к целевому соединению или его аналогу, увеличения уровня экспрессии генов биосинтеза, уменьшения чувствительности ферментов биосинтеза к ингибированию продуктами или промежуточными соединениями по типу обратной связи, выведением штаммов бактерий, дефицитных по генам, использующим предшественники целевых соединений в других метаболических путях или создания штаммов бактерий, дефицитных по генам, участвующим в деградации целевого соединения.The traditional way to increase the production of L-amino acids or nucleic acids by producer strains is to increase the activity of the products of genes involved in the biosynthesis of these L-amino acids or nucleic acids. This can be done by obtaining mutants that are resistant to the target compound or its analogue, increasing the level of expression of biosynthesis genes, reducing the sensitivity of biosynthesis enzymes to inhibition by feedback products or intermediates, by removing strains of bacteria deficient in genes using the precursors of target compounds in other metabolic pathways or the creation of strains of bacteria deficient in genes involved in the degradation of the target compound.

Указанные выше манипуляции обычно приводят к получению штаммов, которые не способны к росту или способны расти со значительно меньшей скоростью, или штаммов, требующих наличия дополнительных питательных веществ, необходимых для роста, таких как аминокислоты. Например, повышение уровня экспрессии некоторых генов может быть чрезмерным и способно привести к серьезному ингибированию роста бактерий и, как результат, снижению способности бактерии к продукции целевого соединения.The above manipulations usually result in strains that are not able to grow or are able to grow at a much lower rate, or strains that require additional nutrients necessary for growth, such as amino acids. For example, an increase in the expression level of certain genes can be excessive and can lead to serious inhibition of bacterial growth and, as a result, a decrease in the ability of bacteria to produce the target compound.

Известно, что микроорганизмы, принадлежащие к роду Escherichia, дефицитные по активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, или микроорганизмы, в которых указанная активность снижена, приобретают способность к продукции L-глутаминовой кислоты (патенты США 5573945 и 5908768). Но подобные мутанты - продуценты глутаминовой кислоты плохо растут или вообще не способны расти на минимальной среде с глюкозой в аэробных условиях. Для восстановления роста необходимо добавление янтарной кислоты или лизина в комбинации с метионином. Таким образом, выбор оптимального уровня экспрессии α-кетоглутаратдегидрогеназы в бактерии необходим для восстановления способности к продукции глутаминовой кислоты и росту в питательной среде, не содержащей дополнительных добавок, таких как янтарная кислота, лизин или метионин.It is known that microorganisms belonging to the genus Escherichia, deficient in the activity of α-ketoglutarate dehydrogenase, or microorganisms in which this activity is reduced, acquire the ability to produce L-glutamic acid (US patents 5573945 and 5908768). But such mutants - producers of glutamic acid do not grow well or are not able to grow at all on minimal medium with glucose under aerobic conditions. To restore growth, it is necessary to add succinic acid or lysine in combination with methionine. Thus, the choice of the optimal level of expression of α-ketoglutarate dehydrogenase in bacteria is necessary to restore the ability to produce glutamic acid and growth in a nutrient medium that does not contain additional additives, such as succinic acid, lysine or methionine.

С другой стороны, известно, что гены, кодирующие сукцинатдегидрогеназу (гены sdhCDAB), в комбинации с генами, кодирующими α-кетоглутаратдегидрогеназу (гены sucAB) и сукцинил-СоА-синтазу (гены sucCD), в хромосоме Е.coli образуют кластер, содержащий два промотора: Р_sdh - sdhCDAB-P_suc-sucAB-sucCD (Park, Chao & Gunsalus, J. Bact. 179.4138-4142,1997; Cunningham & Guest, Microbiology, 144, 2113-2123,1998). Основным промотором этого оперона является регуляторная область, расположенная перед геном sdhC, Р_sdh. Наличие более слабого промотора Р_suc, узнаваемого РНК-полимеразой из Е.coli в комплексе с σ³⁸, обеспечивает дополнительный невысокий уровень конститутивной экспрессии генов sucABCD. Рост концентрации субстрата не влияет на активность второго промотора. Эффект анаэробиозиса и мутаций генов arcA и fnr также незначителен. Белок ArcA является негативным регулятором генов аэробных путей биосинтеза, а белок Fnr (fumarate and nitrate reduction - восстановление фумарата и нитрата) участвует в регуляции транскрипции генов, ответственных за аэробное и анаэробное дыхание, а также за осмотический баланс клетки. Среди потенциальных регуляторов, которые были протестированы, только IHF (integration host factor - продукт гена himA) может играть значительную роль в репрессии активности Р_suc. Белки ArcA и Fnr взаимодействуют с промотором P_sdh, а белок IHF - с более слабым P_suc промотором.On the other hand, it is known that genes encoding succinate dehydrogenase (sdhCDAB genes), in combination with genes encoding α-ketoglutarate dehydrogenase (sucAB genes) and succinyl CoA synthase (sucCD genes), form a cluster in the E. coli chromosome containing two promoter: P _sdh - sdhCDAB-P _suc -sucAB-sucCD (Park, Chao & Gunsalus, J. Bact. 179.4138-4142.1997; Cunningham & Guest, Microbiology, 144, 2113-2123.1998). The main promoter of this operon is the regulatory region located in front of the sdhC, P _sdh gene. The presence of the weaker P _suc promoter, recognized by E. coli RNA polymerase in complex with σ ³⁸ , provides an additional low level of constitutive expression of sucABCD genes. An increase in substrate concentration does not affect the activity of the second promoter. The effects of anaerobiosis and mutations of the arcA and fnr genes are also negligible. The ArcA protein is a negative regulator of the genes of aerobic pathways of biosynthesis, and the Fnr protein (fumarate and nitrate reduction - restoration of fumarate and nitrate) is involved in the regulation of transcription of genes responsible for aerobic and anaerobic respiration, as well as for the osmotic balance of the cell. Among the potential regulators that have been tested, only IHF (integration host factor - a product of the himA gene) can play a significant role in the repression of P _suc activity. The ArcA and Fnr proteins interact with the P _sdh promoter, and the IHF protein interacts with the weaker P _suc promoter.

Было описано получение библиотеки синтетических промоторов различной силы для Lactococus lactis (Jensen P.R., and Hammer K., Appl. Environ. MicrobioL, 1998, 64, No.l. 82-87 Biotechnol. Bioeng., 1998, 58, 2-3, 191-5). Библиотека состоит из 38 олигонуклеотидов, содержащих область с последовательностью нуклеотидов произвольного состава между консенсусными последовательностями в положениях между -35 по -15. Для оценки силы полученных промоторов олигонуклеотиды их библиотеки были клонированы в экспрессирующий вектор рАК80, содержащий ген β-галактозидазы. Было показано, что большинство искусственных промоторов были очень слабыми (активность ниже 500 единиц), и только три из них имели силу около 2000 условных единиц. Но практическое применение библиотеки синтетических промоторов описано не было.A library of synthetic promoters of various strengths has been described for Lactococus lactis (Jensen PR, and Hammer K., Appl. Environ. MicrobioL, 1998, 64, No. l. 82-87 Biotechnol. Bioeng., 1998, 58, 2-3, 191-5). The library consists of 38 oligonucleotides containing a region with a sequence of nucleotides of arbitrary composition between consensus sequences at positions between -35 to -15. To evaluate the strength of the obtained promoters, the oligonucleotides of their library were cloned into the pAK80 expression vector containing the β-galactosidase gene. It was shown that most of the artificial promoters were very weak (activity below 500 units), and only three of them had a force of about 2000 conventional units. But the practical use of the library of synthetic promoters has not been described.

В Европейской патентной заявке ЕР 1033407 А1 описан способ получения коринеформных бактерий, обладающих улучшенной способностью к продукции аминокислот или нуклеиновых кислот, путем введения мутаций в область промотора. До 8 различных вариантов мутантных промоторов было использовано для каждого из генов, выбранного из группы, состоящей из гена глутаматдегидрогеназы (gdh), гена цитратсинтазы (gltA), гена изоцитратсинтазы (icd), гена пируватдегидрогеназы (pdhA) и гена аргининосукцинатсинтазы (argG). Недостатком предложенной методики, предложенной в Европейской заявке ЕР 1033407 А1, является то, что каждый из указанных мутантов получали раздельно, один за другим. Кроме того, повышение продукции L-аминокислот во всех описанных примерах достигалось за счет повышения активности определенных ферментов с использованием ограниченного количества промоторов гена, кодирующего этот фермент. Подобный подход является общепринятым и традиционным в работах, нацеленных на получение бактерий - продуцентов L-аминокислот или нуклеиновых кислот, и не имеет отношения к оптимизации или «точной настройке» активности промоторов генов, важных для продукции L-аминокислот или нуклеиновых кислот.European patent application EP 1033407 A1 describes a method for producing coryneform bacteria having improved ability to produce amino acids or nucleic acids by introducing mutations in the promoter region. Up to 8 different mutant promoter variants were used for each of the genes selected from the group consisting of the glutamate dehydrogenase gene (gdh), the citrate synthase gene (gltA), the isocitrate synthase gene (icd), the pyruvate dehydrogenase gene (pdhA) and the arginginase gene. The disadvantage of the proposed methodology proposed in European application EP 1033407 A1 is that each of these mutants was obtained separately, one after the other. In addition, an increase in the production of L-amino acids in all the described examples was achieved by increasing the activity of certain enzymes using a limited number of promoters of the gene encoding this enzyme. A similar approach is generally accepted and traditional in works aimed at obtaining bacteria producing L-amino acids or nucleic acids, and is not related to the optimization or “fine tuning” of the activity of gene promoters important for the production of L-amino acids or nucleic acids.

В настоящее время нет сообщений, описывающих применение методики оптимизации генной экспрессии для продукции любого метаболита методом ферментации с использованием бактерии, модифицированной с целью оптимизации экспрессии целевого гена.Currently, there are no reports describing the application of the method of optimization of gene expression for the production of any metabolite by fermentation using bacteria modified to optimize the expression of the target gene.

Описание изобретенияDescription of the invention

Целью настоящего изобретения является предоставление способа получения бактерии с оптимизированным уровнем экспрессии гена, кодирующего белок, который влияет на распределение потоков углерода и азота в метаболизме указанной бактерии, и включает в себя следующие стадии: 1) введение в хромосому указанной бактерии набора полученных in vitro фрагментов ДНК, содержащих регуляторные последовательности для экспрессии указанного гена, вместо природных регуляторных последовательностей указанного гена, и 2) отбор бактерии с желаемым фенотипом.An object of the present invention is to provide a method for producing a bacterium with an optimized expression level of a gene encoding a protein that affects the distribution of carbon and nitrogen fluxes in the metabolism of a given bacterium, and includes the following steps: 1) introducing a set of DNA fragments obtained in vitro into the chromosome of a given bacterium containing regulatory sequences for the expression of the specified gene, instead of the natural regulatory sequences of the specified gene, and 2) selection of bacteria with the desired phenotype.

Также целью настоящего изобретения является предоставление бактерии - продуцента L-аминокислоты с оптимизированным уровнем экспрессии гена, который влияет на продукцию L-аминокислоты, и где указанная бактерия получена при помощи способа, описанного в пункте 1 формулы настоящего изобретения.It is also an object of the present invention to provide an L-amino acid producing bacterium with an optimized gene expression level that affects the production of the L-amino acid, and wherein said bacterium is obtained using the method described in claim 1.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения L-аминокислоты, который включает в себя следующие стадии: 1) выращивания бактерии, как описано выше, в питательной среде с целью накопления L-аминокислоты в питательной среде, и 2) выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости.It is also an object of the present invention to provide a method for producing an L-amino acid, which includes the following steps: 1) growing a bacterium, as described above, in a nutrient medium in order to accumulate an L-amino acid in a nutrient medium, and 2) isolating the L-amino acid from the culture liquids.

Настоящее изобретение предоставляет простой способ получения в одну стадию бактерии - продуцента L-аминокислоты с оптимизированным уровнем экспрессии гена, который влияет на распределение потоков углерода и азота в бактерии и, следовательно, влияет на продукцию L-аминокислоты или нуклеиновой кислоты. The present invention provides a simple method for producing an L-amino acid producing bacterium in one step with an optimized gene expression level, which affects the distribution of carbon and nitrogen fluxes in bacteria and, therefore, affects the production of L-amino acid or nucleic acid.

Настоящее изобретение также предоставляет бактерию с оптимизированным уровнем экспрессии гена, который влияет на продукцию L-аминокислоты или нуклеиновой кислоты, увеличивая указанную продукцию, и предоставляет способ получения L-аминокислот, таких как глутаминовая кислота или L-аминокислота, получающаяся из L-глутаминовой кислоты, такая как L-аргинин, L-пролин, L-глутамин, а также L-лейцин; способ получения L-аминокислот, таких как L-лизин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-аспартат, L-аланин, L-тирозин, L-фенилаланин, для биосинтеза которых необходима L-глутаминовая кислота в качестве донора аминогруппы; и способ получения нуклеиновых кислот.The present invention also provides a bacterium with an optimized level of gene expression, which affects the production of L-amino acids or nucleic acids, increasing the specified production, and provides a method for producing L-amino acids, such as glutamic acid or L-amino acid derived from L-glutamic acid, such as L-arginine, L-proline, L-glutamine, and also L-leucine; a method for producing L-amino acids, such as L-lysine, L-isoleucine, L-valine, L-histidine, L-aspartate, L-alanine, L-tyrosine, L-phenylalanine, for the biosynthesis of which L-glutamic acid is required as amino group donor; and a method for producing nucleic acids.

Указанная цель была достигнута путем замены нативного промотора целевого гена последовательностью, подобной промотору, с последовательностью произвольного состава («рандомизированной» последовательностью) непосредственно в хромосоме бактерии. Подобная идея базируется на хорошо известном факте, что у мутантов с модифицированной областью «-35» промоторов, узнаваемых комплексом РНК-полимеразы из Е.coli с σ⁷⁰, эффективность инициации транскрипции изменялась в значительной степени. Таким образом, на основе промоторов, созданных с использованием последовательностей произвольного состава, могут быть получены промоторы различной силы, и оптимальная конструкция может быть выбрана путем прямой оценки продуктивности (или других физиологических характеристик) полученного бесплазмидного штамма.This goal was achieved by replacing the native promoter of the target gene with a sequence similar to the promoter, with a sequence of arbitrary composition ("randomized" sequence) directly on the bacterial chromosome. A similar idea is based on the well-known fact that in mutants with a modified “-35” region of promoters recognized by the E. coli RNA polymerase complex with σ ⁷⁰ , the efficiency of transcription initiation changed significantly. Thus, on the basis of promoters created using sequences of arbitrary composition, promoters of various strengths can be obtained, and the optimal design can be selected by directly evaluating the productivity (or other physiological characteristics) of the obtained plasmid-free strain.

Этот общий подход был использован для «точной настройки» уровня экспрессии генов sucAB в модельном рекомбинантном штамме Е.coli с целью повышения уровня продукции L-глутаминовой кислоты. Оптимизация, в противовес максимизации экспрессии гена или оперона, является актуальной проблемой в создании различных бактериальных штаммов - продуцентов биологически активных веществ, особенно в случаях, когда низкий уровень экспрессии целевого гена или группы генов недостаточен для достижения конкретной цели, и, с другой стороны, суперэкспрессия соответствующего гена или группы генов может дать не просто нейтральный, но даже негативный эффект. Более того, желаемый уровень экспрессии ключевого гена обычно не известен. «Точная настройка» как нельзя лучше подходит для достижения оптимизации и, кроме того, дает возможность протестировать большое количество вариантов. Традиционный подход проведения такой «точной настройки» включает в себя молекулярное клонирование целевого гена на рекомбинантную плазмиду, где ген помещается под контроль различных промоторов, после чего производится оценка свойств полученных рекомбинантных штаммов. Если же требуется получить улучшенные бесплазмидные штаммы, то после отбора лучших вариантов необходимо приложить еще массу дополнительных усилий.This general approach was used to “fine tune” the level of sucAB gene expression in the model recombinant E. coli strain to increase the level of L-glutamic acid production. Optimization, as opposed to maximizing gene or operon expression, is an urgent problem in creating various bacterial strains producing biologically active substances, especially in cases where the low level of expression of a target gene or group of genes is insufficient to achieve a specific goal, and, on the other hand, overexpression the corresponding gene or group of genes can give not only a neutral, but even a negative effect. Moreover, the desired level of key gene expression is usually not known. "Fine tuning" is the best suited to achieve optimization and, in addition, makes it possible to test a large number of options. The traditional approach of carrying out such “fine tuning” involves molecular cloning of the target gene into a recombinant plasmid, where the gene is placed under the control of various promoters, after which the properties of the obtained recombinant strains are evaluated. If you want to get improved plasmid-free strains, then after selecting the best options you need to make a lot of additional effort.

1. Способ согласно настоящему изобретению1. The method according to the present invention

Способом согласно настоящему изобретению является способ получения бактерии - продуцента L-аминокислоты с оптимизированным уровнем экспрессии гена, влияющего на распределение потоков углерода или азота в указанной бактерии, и в результате влияющего на продукцию L-аминокислоты, включающий следующие стадии:The method according to the present invention is a method for producing an L-amino acid producing bacterium with an optimized gene expression level that affects the distribution of carbon or nitrogen fluxes in said bacterium and as a result affects the L-amino acid production, which includes the following steps:

1) введение в хромосому бактерии набора ДНК фрагментов, синтезированных in vitro и содержащих регудяторные элементы генной экспрессии, вместо природного элемента регуляторной области гена с получением популяции бактерий; и 2) селекции бактерии с желаемым фенотипом.1) introducing into the bacterial chromosome a set of DNA fragments synthesized in vitro and containing the regulatory elements of gene expression, instead of the natural element of the regulatory region of the gene to obtain a bacterial population; and 2) breeding bacteria with the desired phenotype.

Термин «экспрессия», использованный здесь, означает продукцию белкового продукта, кодируемого неким геном.The term "expression", as used here, means the production of a protein product encoded by a certain gene.

Термин «оптимизированный уровень экспрессии» означает такой уровень экспрессии целевого гена или нескольких генов, при котором бактерия проявляет желаемый фенотип.The term “optimized expression level” means an expression level of a target gene or several genes at which the bacterium exhibits the desired phenotype.

Термин «желаемый фенотип» включает в себя одну или несколько характеристик бактерий, являющихся объектом для улучшения. В частности, это может быть способность бактерии к продукции L-аминокислоты в количестве, большем, чем у родительского штамма, способность к росту на минимальной среде, которая не содержит добавок, обычно используемых для комплементации ауксотрофии или других факторов, ограничивающих рост, или комбинация таких характеристик.The term “desired phenotype” includes one or more characteristics of bacteria that are the object of improvement. In particular, this may be the ability of the bacterium to produce L-amino acids in an amount greater than that of the parent strain, the ability to grow on a minimal medium that does not contain additives commonly used to complement auxotrophy or other factors limiting growth, or a combination of such characteristics.

Термин «ген, кодирующий белок, влияющий на распределение потоков углерода или азота» означает ген, кодирующий белок, вовлеченный в пути метаболизма углерода или азота. Такими генами являются гены, вовлеченные в гликолиз, ассимиляцию азота, гены пентозного цикла, цикла трикарбоновых кислот и т.д. Более конкретно, это гены, кодирующие глутаматдегидрогеназу, глутаминсинтетазу, глутаматсинтазу, изоцитратдегидрогеназу, аконитатгидратазу, цитратсинтазу, фосфоенолпируваткарбоксилазу, пируватдегидрогеназу, пируваткиназу, фосфоенолпируватсинтазу, енолазу, фосфоглицеромутазу, фосфоглицераткиназу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу,триозафосфатизомеразу, фруктозадифосфатальдолазу, фосфофруктокиназу, глюкозафосфатизомеразу, глутамин-оксоглутаратаминотрансферазу, изопропилмалатсинтазу и т.д. Бактериальные гены, вовлеченные в пути биосинтеза L-аминокислот, нуклеиновых кислот и их предшественников также относятся к таким генам.The term "gene encoding a protein that affects the distribution of carbon or nitrogen flows" means a gene encoding a protein involved in the pathway of carbon or nitrogen metabolism. Such genes are genes involved in glycolysis, nitrogen assimilation, genes of the pentose cycle, tricarboxylic acid cycle, etc. More specifically, the genes encoding glutamate dehydrogenase, glutamine synthetase, glutamate synthase, isocitrate dehydrogenase, aconitate hydratase, citrate synthase, phosphoenolpyruvate carboxylase, pyruvate dehydrogenase, pyruvate kinase, phosphoenolpyruvate synthase, enolase, phosphoglyceromutase, phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, triozafosfatizomerazu, fruktozadifosfataldolazu, phosphofructokinase, glyukozafosfatizomerazu, glutamine oksoglutarataminotransferazu , isopropyl malate synthase, etc. Bacterial genes involved in the biosynthesis of L-amino acids, nucleic acids and their precursors also belong to such genes.

Термин «набор ДНК фрагментов, синтезированных in vitro» означает смесь только что синтезированных фрагментов ДНК или смесь ранее известных фрагментов ДНК, полученных из природных или мутантных микроорганизмов, библиотек ДНК, GenBank и т.п. Набор фрагментов ДНК может быть получен путем непосредственного смешения только что синтезированных фрагментов ДНК с известной последовательностью, фрагментов ДНК, полученных из различных источников, упомянутых выше, или фрагментов ДНК, полученных в ходе химического синтеза, в которых определенное положение или область «рандомизирована», т.е. содержит последовательность нуклеотидов произвольного состава.The term "set of DNA fragments synthesized in vitro" means a mixture of newly synthesized DNA fragments or a mixture of previously known DNA fragments obtained from natural or mutant microorganisms, DNA libraries, GenBank, etc. A set of DNA fragments can be obtained by directly mixing newly synthesized DNA fragments with a known sequence, DNA fragments obtained from various sources mentioned above, or DNA fragments obtained during chemical synthesis in which a certain position or region is “randomized”, t .e. contains a sequence of nucleotides of arbitrary composition.

Термин «рандомизирована» означает, что в ходе стандартного химического синтеза фрагмента ДНК в определенное положение этого фрагмента ДНК или в его некоторую область встраивают нуклеотид произвольного состава (обычно обозначаемого как N, где N - это аденин, гуанин, цитозин или тимин). Указанные фрагменты ДНК содержат последовательности, называемые регуляторными элементами.The term “randomized” means that, during standard chemical synthesis of a DNA fragment, a nucleotide of arbitrary composition (usually denoted as N, where N is adenine, guanine, cytosine or thymine) is inserted into a specific position of this DNA fragment or in a certain region of it. These DNA fragments contain sequences called regulatory elements.

Термин «регуляторный элемент» относится к последовательностям нуклеотидов, расположенным перед, внутри и/или после кодирующей области, контролирующих транскрипцию и/или экспрессию кодирующей области при взаимодействии с клеточным аппаратом биосинтеза белков. Указанный термин обычно используется для обозначения промоторов, сайтов связывания рибосомы (RBS), операторов и других элементов генома, влияющих на уровень генной экспрессии.The term "regulatory element" refers to nucleotide sequences located before, inside and / or after the coding region, controlling the transcription and / or expression of the coding region when interacting with a cellular protein biosynthesis apparatus. This term is usually used to refer to promoters, ribosome binding sites (RBS), operators, and other elements of the genome that affect the level of gene expression.

Смесь указанных фрагментов ДНК, содержащих регуляторные элементы, используется для введения в хромосому бактерии вместо природного регуляторного элемента с образованием популяции клеток бактерии с различными уровнями экспрессии целевого гена. Селекцию бактерии с желаемым фенотипом осуществляют путем непосредственной оценки количества L-аминокислоты, продуцируемой этой бактерией на стандартной минимальной питательной среде, или другими методами, подходящими для оценки характеристик, существенных для того, чтобы бактерия обладала желаемым фенотипом.A mixture of these DNA fragments containing regulatory elements is used to introduce bacteria into the chromosome instead of the natural regulatory element to form a bacterial cell population with different levels of expression of the target gene. Bacteria with the desired phenotype are selected by directly assessing the amount of L-amino acid produced by the bacterium on a standard minimum nutrient medium, or by other methods suitable for assessing the characteristics essential for the bacterium to possess the desired phenotype.

Термин «бактерия - продуцент L-аминокислоты», использованный здесь, также означает бактерию, обладающую способностью к продукции и накоплению L-аминокислоты в питательной среде в количестве, большем, чем родительский штамм или штамм дикого типа, и предпочтительно означает, что бактерия обладает способностью к продукции и накоплению в питательной среде не менее 0.5 г/л, более предпочтительно, не менее 1 г/л целевой L-аминокислоты.The term “bacterium producing L-amino acids”, as used here, also means a bacterium having the ability to produce and accumulate L-amino acids in a nutrient medium in an amount greater than the parent strain or wild-type strain, and preferably means that the bacterium has the ability to production and accumulation in a nutrient medium of at least 0.5 g / l, more preferably at least 1 g / l of the target L-amino acid.

Термин «бактерия, принадлежащая к роду Escherichia» означает, что бактерия относится к роду Escherichia в соответствии с классификацией, известной специалисту в области микробиологии. В качестве примера микроорганизма, принадлежащего к роду Escherichia, использованного в настоящем изобретении, может быть упомянута бактерия Escherichia coli (E.coli).The term "bacterium belonging to the genus Escherichia" means that the bacterium belongs to the genus Escherichia in accordance with the classification known to the person skilled in the field of microbiology. As an example of a microorganism belonging to the genus Escherichia used in the present invention, the bacterium Escherichia coli (E. coli) may be mentioned.

Для специалиста в данной области не является очевидным, какой уровень активности фермента и какой тип последовательности регуляторного элемента являются оптимальными для конкретных условий. И поэтому выбор последовательности регуляторного элемента, основанный на научном предположении или озарении, может не привести к достижению оптимального результата. Более того, приготовление даже ограниченного количества мутантов с различным уровнем активности фермента является сложным процессом, требующим значительных затрат времени, поскольку данные мутанты традиционно получают последовательно, один за одним. Напротив, способ согласно настоящему изобретению обладает тем преимуществом, что является простым, одностадийным процессом интеграции искусственных или природных фрагментов ДНК в хромосому с получением популяции клеток бактерии с широким спектром уровней экспрессии целевого гена. Например, «рандомизация» 4 нуклеотидов в определенной области химически синтезированного регуляторного элемента дает 4⁴=256 теоретически возможных варианта этой области.It is not obvious to a person skilled in the art what level of enzyme activity and what type of regulatory element sequence are optimal for specific conditions. And therefore, the choice of the sequence of the regulatory element, based on scientific assumption or insight, may not lead to an optimal result. Moreover, the preparation of even a limited number of mutants with different levels of enzyme activity is a complex process that requires a significant investment of time, since these mutants are traditionally obtained sequentially, one by one. On the contrary, the method according to the present invention has the advantage of being a simple, one-step process of integrating artificial or natural DNA fragments into the chromosome to obtain a bacterial cell population with a wide range of expression levels of the target gene. For example, the “randomization” of 4 nucleotides in a certain region of a chemically synthesized regulatory element gives 4 ⁴ = 256 theoretically possible variants of this region.

Далее, обычной практикой является первоначальная оценка активности целевого фермента путем введения гена, кодирующего этот фермент, в плазмиду, которую потом помещают в бактерию. Но уровень экспрессии гена, интегрированного в хромосому бактерии, и уровень экспрессии того же гена, введенного в плазмиду, помещенную в бактерию, не являются одинаковыми. Таким образом, другим преимуществом способа согласно настоящему изобретению является то, что указанный способ позволяет производить оценку и отбор бактерии с уровнем экспрессии целевого гена, оптимальным для данных конкретных условий, с последующим непосредственным использованием полученной бактерии для продукции L-аминокислот без каких-либо дополнительных манипуляций.Further, it is common practice to initially evaluate the activity of a target enzyme by introducing a gene encoding this enzyme into a plasmid, which is then inserted into a bacterium. But the expression level of the gene integrated into the bacterial chromosome and the expression level of the same gene introduced into the plasmid inserted into the bacterium are not the same. Thus, another advantage of the method according to the present invention is that this method allows the evaluation and selection of bacteria with the expression level of the target gene that is optimal for these specific conditions, followed by the direct use of the obtained bacteria for the production of L-amino acids without any additional manipulations .

Методы получения плазмидных ДНК, расщепления и лигирования ДНК, трансформации, подбора олигонуклеотидов в качестве затравок и подобные им являются традиционными методами, хорошо известными специалисту в данной области. Эти методы описаны, например, в Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, Т., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).Methods for obtaining plasmid DNA, DNA cleavage and ligation, transformation, selection of oligonucleotides as seeds and the like are traditional methods well known to a person skilled in the art. These methods are described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

2. Бактерия согласно настоящему изобретению2. The bacterium according to the present invention

Бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия - продуцент L-аминокислоты, обладающая оптимизированным уровнем экспрессии гена, влияющего на продукцию L-аминокислот. Подобная бактерия может быть получена способом согласно настоящему изобретению.The bacterium of the present invention is an L-amino acid producing bacterium having an optimized level of gene expression that affects the production of L-amino acids. A similar bacterium can be obtained by the method according to the present invention.

Более конкретно, бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия - продуцент L-аминокислоты, образующейся из L-глутаминовой кислоты, обладающая оптимизированным уровнем экспрессии гена, влияющего на продукцию L-глутаминовой кислоты. Из L-глутаминовой кислоты образуются L-аргинин, L-пролин и L-глутамин. Также бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия - продуцент L-глутаминовой кислоты, обладающая оптимизированньм уровнем экспрессии гена, влияющего на продукцию L-глутаминовой кислоты. Кроме того, L-глутаминовая кислота играет важную роль в биосинтезе L-лейцина, L-лизина, L-изолейцина, L-валина, L-гистидина, L-аспартата, L-аланина, L-тирозина и L-фенилаланина в качестве донора аминогруппы. Также бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия-продуцент L-лейцина с оптимизированным уровнем экспрессии гена, влияющего на продукцию L-лейцина.More specifically, the bacterium of the present invention is a bacterium producing L-amino acid derived from L-glutamic acid, having an optimized expression level of a gene that affects the production of L-glutamic acid. From L-glutamic acid, L-arginine, L-proline and L-glutamine are formed. Also, the bacterium according to the present invention is a bacterium producing L-glutamic acid, having an optimized level of gene expression that affects the production of L-glutamic acid. In addition, L-glutamic acid plays an important role in the biosynthesis of L-leucine, L-lysine, L-isoleucine, L-valine, L-histidine, L-aspartate, L-alanine, L-tyrosine and L-phenylalanine as a donor amino groups. Also, the bacterium of the present invention is an L-leucine producing bacterium with an optimized gene expression level that affects the production of L-leucine.

Таким образом, увеличение количества субстрата - доноров азота - для гена, кодирующего аминотрансферазу положительно влияет на продукцию таких аминокислот, как L-лейцин, L-лизин, L-изолейцин, L-валин, L-гистидин, L-аспартат, L-аланин, L-тирозин и L-фенилаланин.Thus, an increase in the number of substrate — nitrogen donors — for the gene encoding aminotransferase positively affects the production of amino acids such as L-leucine, L-lysine, L-isoleucine, L-valine, L-histidine, L-aspartate, L-alanine , L-tyrosine and L-phenylalanine.

Практическим воплощением настоящего изобретения является штамм Е.coli 702ilvA (ВКПМ В-8012) (Европейская патентная заявка 1772433 А1), содержащий рекомбинантную плазмиду pAYCTERl-cpg, и модифицированный с целью оптимизации экспрессии генов sucAB. Плазмида pAYCTERl-cpg является производной репликона RSF1010, содержащей природные гены, кодирующие цитратсинтазу (ген gltA), PEP карбоксилазу (ген ррс), глутаматдегидрогеназу (ген gdhA) и оперон proBA, клонированные из штамма Е.coli K-12 стандартньми методами. Оптимизация экспрессии генов sucAB осуществлялась в соответствии со способом согласно настоящему изобретению. Указанный рекомбинантный штамм 702ilvA(pAYCTERl-cpg) является дефицитным по активности треониндезаминазы, требует наличия L-изолейцина для роста и обладает способностью к продукции L-пролина и глутаминовой кислоты в ходе выращивания.A practical embodiment of the present invention is an E. coli strain 702ilvA (VKPM B-8012) (European Patent Application 1772433 A1) containing the recombinant plasmid pAYCTERl-cpg and modified to optimize the expression of sucAB genes. The plasmid pAYCTERl-cpg is a derivative of the RSF1010 replicon containing natural genes encoding citrate synthase (gltA gene), PEP carboxylase (ppc gene), glutamate dehydrogenase (gdhA gene) and proBA operon cloned from E. coli K-12 standard methods. Optimization of sucAB gene expression was carried out in accordance with the method according to the present invention. The indicated recombinant strain 702ilvA (pAYCTERl-cpg) is deficient in threonine deaminase activity, requires the presence of L-isoleucine for growth, and is capable of producing L-proline and glutamic acid during cultivation.

Примерами бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, которые обладают способностью к продукции L-глутаминовой кислоты и могут быть использованы для оптимизации генной экспрессии, являются следующие штаммы Е.coli: штаммы, обладающие устойчивостью к антиметаболитам аспарагиновой кислоты и дефицитные по активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, такой как AF13199 (FERM ВР-5807) (патент США 5908768), или штамм FERM P-12379, дополнительно характеризующийся сниженной способностью к разложению L-глутаминовой кислоты (патент США 5393671); штамм Е.coli AJ13138 (FERM BP-5565) (патент США 6110714) и подобные им. Способность к продукции L-глутаминовой кислоты может быть придана, например, введением ДНК, кодирующей любой из таких ферментов, как глутаматдегидрогеназа (выложенная патентная заявка Японии (Kokai) №61-268185/1986), глутаминсинтетаза, глутаматсинтаза, изоцитратдегидрогеназа (выложенная патентная заявка Японии (Kokai) №62-166890/1987 и №63-214189/1988), аконитатгидратаза (выложенная патентная заявка Японии (Kokai) №62-294086/1987), цитратсинтаза (выложенная патентная заявка Японии (Kokai) №62-201585/1987 и №63-119688/1988), фосфоенолпируваткарбоксилаза (выложенная латентная заявка Японии (Kokai) №60-87788/1985 и №62-55089/1987), пируватдегидрогеназа, пируваткиназа, фосфоенолпируватсинтаза, енолаза, фосфоглицеромутаза, фосфоглицераткиназа, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, триозофосфатизомераза, фруктозобифосфатальдолаза, фосфофруктокиназа (выложенная патентная заявка Японии (Kokai) №63-102692/1988), глюкозофосфатизомераза, глутаминоксоглутаратаминотрансфераза (WO 99/07853) и так далее. Более того, бактерия согласно настоящему изобретению может быть модифицирована с целью снижения активности ферментов, катализирующих реакции образования соединений, отличных от L-глутаминовой кислоты, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты. К ферментам, катализирующим реакции образования соединений, отличных от L-глутаминовой кислоты, ответвляющихся от основного пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты, относятся α-кетоглутаратдегидрогеназа, изоцитратлиаза, фосфатацетилтрансфераза, ацетаткиназа, синтаза ацетогидроксикислот, ацетолактатсинтаза, формилацетилтрансфераза, лактатдегидрогеназа, глутаматдекарбоксилаза, 1-пирролиндегидрогеназа и т.д.Examples of bacteria belonging to the genus Escherichia that are capable of producing L-glutamic acid and can be used to optimize gene expression are the following E. coli strains: strains that are resistant to aspartic acid antimetabolites and are deficient in α-ketoglutarate dehydrogenase activity, such as AF13199 (FERM BP-5807) (US patent 5908768), or strain FERM P-12379, further characterized by reduced decomposition ability of L-glutamic acid (US patent 5393671); E. coli strain AJ13138 (FERM BP-5565) (US Pat. No. 6,110,714) and the like. The ability to produce L-glutamic acid can be imparted, for example, by introducing DNA encoding any of such enzymes as glutamate dehydrogenase (Japanese Patent Application Laid-Open (Kokai) No. 61-268185 / 1986), Glutamine Synthetase, Glutamate Synthase, Japan Isocitrate Dehydrogenase (Patent Application (Kokai) No. 62-166890 / 1987 and No. 63-214189 / 1988), aconitate hydratase (Japanese Patent Application Laid-Open (Kokai) No. 62-294086 / 1987), citrate synthase (Japanese Patent Laid-open Application (Kokai) No. 62-201585 / 1987 and No. 63-119688 / 1988), phosphoenolpyruvate carboxylase (laid out latent application Yapo Research Institute (Kokai) No. 60-87788 / 1985 and No. 62-55089 / 1987), pyruvate dehydrogenase, pyruvate kinase, phosphoenolpyruvate synthase, enolase, phosphoglyceromutase, phosphoglycerate kinase, glyceraldehyde phosphate phosphate dehydrogenase (3-phosphate dehydrogenase) No. 63-102692 / 1988), glucose phosphatisomerase, glutaminoxoglutarate aminotransferase (WO 99/07853) and so on. Moreover, the bacterium according to the present invention can be modified to reduce the activity of enzymes that catalyze the formation of compounds other than L-glutamic acid, which branch off from the main biosynthesis pathway of L-glutamic acid. Enzymes that catalyze the formation of compounds other than L-glutamic acid branching from the main biosynthesis pathway of L-glutamic acid include α-ketoglutarate dehydrogenase, isocitrate lyase, phosphate acetyltransferase, acetate acetate kinase, acetyl dehydrogenacetase azinase dehydrogen acetate etc.

Также возможно использование бактерии - продуцента L-лейцина, принадлежащей к роду Escherichia, такой как штаммы E.coli H9068 (АТСС 21530), Н-9070 (FERM ВР-4704) и Н-9072 (FERM BP-4706), устойчивого к 4-азалейцину или к 5,5,5-трифлуоролейцину (патент США 5744331), штаммы Е.coli, в котором отсутствует ингибирование L-лейцином изопропилмалатсинтазы по принципу обратной связи (Европейский патент ЕР 1067191), штамм Е.coli AJ11478, устойчивый к (3-2-тиенилаланину и β-гидроксилейцину (патент США 5763231), штамм Е.coli 57 (ВКПМ В-7386, патент России №2140450) и подобные им.It is also possible to use bacteria producing L-leucine belonging to the genus Escherichia, such as strains of E. coli H9068 (ATCC 21530), H-9070 (FERM BP-4704) and H-9072 (FERM BP-4706), resistant to 4 -azaleucine or to 5,5,5-trifluoroleucine (US patent 5744331), strains of E. coli, in which there is no inhibition of feedback of isopropyl malate synthase by L-leucine (European patent EP 1067191), E. coli strain AJ11478, resistant to ( 3-2-thienylalanine and β-hydroxyleucine (US patent 5763231), strain E. coli 57 (VKPM B-7386, Russian patent No. 2140450) and the like.

Аналогичная стратегия, описанная выше для L-глутаминовой кислоты, может быть использована для получения других известных L-аминокислот.A similar strategy described above for L-glutamic acid can be used to obtain other known L-amino acids.

2. Способ получения L-аминокислот2. The method of obtaining L-amino acids

Способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-аминокислот, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-аминокислоты в питательной среде, и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости. В частности, способом согласно настоящему изобретению является способ получения L-глутаминовой кислоты, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-глутаминовой кислоты в питательной среде, и выделения L-глутаминовой кислоты из культуральной жидкости. Также способ получения L-аминокислот включает в себя способ получения L-лейцина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде (с целью продукции и накопления L-лейцина в питательной среде) и выделения L-лейцина из культуральной жидкости.The method according to the present invention is a method for producing L-amino acids, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a nutrient medium in order to produce and accumulate an L-amino acid in a nutrient medium and isolate the L-amino acid from the culture fluid. In particular, the method according to the present invention is a method for producing L-glutamic acid, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a culture medium in order to produce and accumulate L-glutamic acid in a culture medium, and isolate L-glutamic acid from the culture fluid. Also, a method for producing L-amino acids includes a method for producing L-leucine, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a culture medium (for the purpose of production and accumulation of L-leucine in a culture medium) and isolating L-leucine from the culture fluid.

В настоящем изобретении выращивание, выделение и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием бактерии.In the present invention, the cultivation, isolation and purification of an L-amino acid from a culture or similar liquid may be carried out in a manner similar to traditional fermentation methods in which the amino acid is produced using a bacterium.

Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста бактерий. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, а также различные органические кислоты. В зависимости от характера ассимиляции используемого микроорганизма, могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов, ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин и дрожжевой экстракт.The nutrient medium used for growing can be either synthetic or natural, provided that the medium contains sources of carbon, nitrogen, mineral additives and, if necessary, the appropriate amount of nutrient additives necessary for the growth of bacteria. Carbon sources include various carbohydrates such as glucose and sucrose, as well as various organic acids. Depending on the nature of the assimilation of the microorganism used, alcohols such as ethanol and glycerin may be used. Various inorganic ammonium salts, such as ammonia and ammonium sulfate, other nitrogen compounds, such as amines, natural nitrogen sources, such as peptone, soybean hydrolyzate, microorganism fermentolizate, can be used as a nitrogen source. As mineral additives, potassium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, iron sulfate, manganese sulfate, calcium chloride and the like can be used. Thiamine and yeast extract can be used as vitamins.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание культуральной жидкости на качалке, взбалтывание с аэрацией, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. рН среды поддерживают в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6.5 до 7.2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферными растворами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.The cultivation is preferably carried out under aerobic conditions, such as mixing the culture fluid on a rocking chair, shaking with aeration, at a temperature in the range from 20 to 40 ° C, preferably in the range from 30 to 38 ° C. The pH of the medium is maintained in the range from 5 to 9, preferably from 6.5 to 7.2. The pH of the medium can be adjusted by ammonia, calcium carbonate, various acids, bases and buffer solutions. Typically, growing for 1 to 5 days leads to the accumulation of the target L-amino acid in the culture fluid.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем L-аминокислота может быть выделена и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации.After growth, solid residues, such as cells, can be removed from the culture fluid by centrifugation or filtration through a membrane, and then the L-amino acid can be isolated and purified by ion exchange chromatography, concentration and crystallization.

Наилучший способ осуществления изобретенияBEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

Настоящее изобретение будет более детально описано ниже со ссылкой на Примеры.The present invention will be described in more detail below with reference to Examples.

Пример 1. Замена природной области, расположенной в хромосоме бактерии Е.coli перед генами sucAB, гибридньм регуляторным элементом, содержащим синтетический промотор P_tac* и SD_lacZ.Example 1. Replacement of the natural region located in the chromosome of the E. coli bacterium before sucAB genes, a hybrid regulatory element containing the synthetic promoter P _tac * and SD _lacZ .

Модифицированный промотор Р_tac*, присоединенный к последовательности Shine-Dalgarno (SD последовательность) гена lacZ из Е.coli, был интегрирован перед кодирующей частью генов sucAB в хромосоме штамма Е.coli 702ilvA(pAYCTERl-cpg) вместо природной области с использованием методики, описанной Datsenko K.A. and Wanner B.L. (Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 97, 6640-6645, 2000), также называемой «рекомбинацией с использованием Red-системы». Модифицированный промотор Р_tac* содержал только первые 11 пар оснований из 21 пары лактозного оператора (О_lac) и поэтому был не способен взаимодействовать лактозным репрессором вследствие отсутствия нуклеотидов, существенных для такого специфического ДНК-белкового контакта. В дополнение, искусственный фрагмент ДНК, содержавший ген устойчивости к хлорамфениколу (Cm^R), необходимый для селективной интеграции полученных фрагментов в соответствующую область хромосомы бактерии, был присоединен к 5'-части модифицированного промотора Р_tac*. The modified P _tac * promoter, attached to the Shine-Dalgarno sequence (SD sequence) of the E. coli lacZ gene, was integrated upstream of the coding portion of sucAB genes in the chromosome of E. coli strain 702ilvA (pAYCTERl-cpg) instead of the native region using the technique described Datsenko KA and Wanner BL (Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 97, 6640-6645, 2000), also called “recombination using the Red system”. The modified P _tac * promoter contained only the first 11 base pairs from 21 pairs of the lactose operator (O _lac ) and therefore was not able to interact with the lactose repressor due to the lack of nucleotides essential for such a specific DNA-protein contact. In addition, an artificial DNA fragment containing the chloramphenicol resistance gene (Cm ^R ) necessary for the selective integration of the obtained fragments into the corresponding region of the bacterial chromosome was attached to the 5'-part of the modified P _tac * promoter.

Схема конструкции указанного искусственного фрагмента ДНК показана на чертеже. Последовательность нуклеотидов заменяемой природной области, расположенной перед генами sucAB, приведена в Списке последовательностей под номером 1 (SEQ ID NO: 1).A design diagram of the indicated artificial DNA fragment is shown in the drawing. The nucleotide sequence of the replaced natural region upstream of the sucAB genes is shown in Sequence Listing No. 1 (SEQ ID NO: 1).

Конструирование in vitro упомянутого искусственного фрагмента ДНК, в дополнение содержащего ген устойчивости к хлорамфениколу (Cm^R), было осуществлено в несколько стадий. На первой стадии промотор Р_tac* был амплифицирован с помощью ПЦР таким образом, что полученный фрагмент в 5'-области содержал сайт узнавания BglII (для удобства получения последующей генно-инженерной конструкции, смотри ниже) и SD последовательность и ATG-старт кодон гена lacZ из Е.coli, присоединенный непосредственно к N-концевой части кодирующей области гена sucA, в 3'-области полученного фрагмента, содержащего промотор. В качестве матрицы для ПЦР использовали коммерчески доступную рекомбинантную плазмиду pDR540 (инвентарный номер в GenBank/EMBL U13847, Pharmacia, США). В качестве затравок для ПЦР использовали химически модифицированные олигонуклеотиды PI (SEQ ID NO: 2) и Р2 (SEQID NO: 3).The in vitro construction of the aforementioned artificial DNA fragment, in addition to containing the chloramphenicol resistance gene (Cm ^R ), was carried out in several stages. In the first stage, the P _tac * promoter was amplified by PCR so that the resulting fragment in the 5'-region contained the BglII recognition site (for the convenience of obtaining the subsequent genetic engineering construct, see below) and the SD sequence and ATG start codon of the lacZ gene from E. coli, attached directly to the N-terminal part of the coding region of the sucA gene, in the 3'-region of the obtained fragment containing the promoter. A commercially available recombinant plasmid pDR540 (GenBank / EMBL U13847, Pharmacia, USA) was used as a template for PCR. Chemically modified oligonucleotides PI (SEQ ID NO: 2) and P2 (SEQID NO: 3) were used as primers for PCR.

Во всех случаях ПЦР проводили с использованием термоциклера «Perkin-Elmer 2400 GeneAmp PCR System». Реакционная смесь общим объемом 50 мкл содержала 5 мкл 10x буфера для ПЦР («Ферментас», Литва) с добавлением MgCl₂ до конечной концентрации в реакционной смеси 1.5 мМ, 200 мкМ каждого трифосфата dNTP, 400 нМ каждой из используемых затравок и 2 ед Taq-полимеразы («Ферментас», Литва). Количество ДНК, используемой в качестве матрицы для ПЦР, добавляли из расчета 0.2 нг целевого фрагмента ДНК. Температурный профиль ПЦР был следующий: стадия денатурации в течение 5 мин при 95°С с последующими 20 циклами денатурации при 95°С в течение 30 секунд, отжига при 55°С в течение 30 секунд, роста цепи при 72°С; финальная стадия полимеризации при 72°С в течение 2 минут. Время роста цепи выбиралось в соответствии рекомендациями производителя Taq-полимеразы в зависимости от длины амплифицируемого фрагмента ДНК. В частности, для данного конкретного случая время роста цепи составляло 1,5 минуты.In all cases, PCR was performed using a Perkin-Elmer 2400 GeneAmp PCR System thermal cycler. The reaction mixture with a total volume of 50 μl contained 5 μl of 10x PCR buffer (Fermentas, Lithuania) supplemented with MgCl ₂ to a final concentration of 1.5 mM, 200 μM of each dNTP triphosphate in the reaction mixture, 400 nM of each seed used and 2 units of Taq- polymerases (Fermentas, Lithuania). The amount of DNA used as a template for PCR was added at the rate of 0.2 ng of the target DNA fragment. The PCR temperature profile was as follows: denaturation step for 5 min at 95 ° С followed by 20 denaturation cycles at 95 ° С for 30 seconds, annealing at 55 ° С for 30 seconds, chain growth at 72 ° С; the final stage of polymerization at 72 ° C for 2 minutes. The chain growth time was chosen in accordance with the recommendations of the Taq polymerase manufacturer depending on the length of the amplified DNA fragment. In particular, for this particular case, the chain growth time was 1.5 minutes.

Параллельно проводили вторую стадию конструирования гибридного фрагмента ДНК. Ген Cm^R амплифицировали с использованием коммерчески доступной плазмиды pACYC184 (инвентарный номер Х06403 в GenBank, «Ферментас», Литва) в качестве матрицы и химически синтезированных олигонуклеотидов Р3 (SEQ ID NO:4) и Р4 (SEQ ID NO:5) в качестве затравок. Олигонуклеотид Р3 содержал сайт узнавания BglII, использовавшийся для присоединения к ранее полученному фрагменту ДНК с промотором Р_tac*. Олигонуклеотид Р4 содержал 36 нуклеотидов, расположенных перед регуляторной областью генов sucAB в хромосоме Е.coli, необходимых для последующей рекомбинации целевого фрагмента в хромосому бактерии с помощью Red-системы.In parallel, the second stage of the construction of the hybrid DNA fragment was carried out. The Cm ^R gene was amplified using the commercially available plasmid pACYC184 (accession number X06403 at GenBank, Fermentas, Lithuania) as a template and chemically synthesized oligonucleotides P3 (SEQ ID NO: 4) and P4 (SEQ ID NO: 5) as seeds . Oligonucleotide P3 contained the BglII recognition site used to attach to the previously obtained DNA fragment with the P _tac * promoter. P4 oligonucleotide contained 36 nucleotides located in front of the regulatory region of sucAB genes in the E. coli chromosome, which are necessary for subsequent recombination of the target fragment into the bacterial chromosome using the Red system.

Два полученных фрагмента ДНК обрабатывали эндонуклеазой рестрикции BglII, a затем лигировали с помощью Т4 ДНК-лигазы (Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). На последней стадии продукт лигирования амплифицировали с использованием затравок Р1 и Р4. Полученный фрагмент ДНК очищали осаждением в этаноле и использовали для электропорации и рекомбинации с использованием Red-системы в хромосому штамма Е.coli 702ilvA(pAYCTERl-cpg). Штамм Е.coli 702ilvA(pAYCTERl-cpg) является производным штамма Е.coli 702ilvA - продуцента L-глутаминовой кислоты (ВКПМ В-8012) (Европейская патентная заявка 1772433 А1), дополнительно несущим рекомбинантную плазмиду pAYCTERl-cpg. Плазмида pAYCTERl-cpg является производной вектора pAYCTER3, несущей природные гены, кодирующие цитратсинтазу (ген gltA), РЕР-карбоксилазу (тен ррс), глутаматдегидрогеназу (ген gdhA) и оперон proBA, клонированные из штамма Е.coli К-12 стандартными методами, такими как ПЦР с использованием хромосомной ДНК штамма Е.coli К-12 в качестве матрицы и затравок с сайтами узнавания рестриктаз, подходящих для дальнейшего клонирования и сборки продуктов ПЦР. Вектор pAYCTER3 является производным среднекопийного и очень стабильного вектора pAYC32, сконструированного на базе плазмиды RSF1010 (Christoserdov A.Y., Tsygankov Y.D., Plasmid, 1986, v.16, pp.161-167), несущей маркер устойчивости к стрептомицину. Вектор pAYCTER3 получали путем введения полилинкера из плазмиды pUC19 и сильного терминатора rrnB в плазмиду pAYC32 вместо ее промотора следующим образом. Сначала с помощью ПЦР и затравок, приведенных в Списке последовательностей под номерами 6 (SEQ ID NO: 6) и 7 (SEQ ID NO: 7), был получен полилинкер плазмиды pUC19. Полученный продукт ПЦР обрабатывали рестриктазами EcoRI и BglII. Терминатор rrnB также был получен помощью ПЦР и затравок, приведенных в Списке последовательностей под номерами 8 (SEQ ID NO: 8) и 9 (SEQ ID NO: 9). Полученный продукт ПЦР обрабатывали рестриктазами BglII и BclI. Затем эти два фрагмента ДНК лигировали в плазмиду pAYC32, предварительно обработанную рестриктазами EcoRI и BclI. Так была получена плазмида pAYCTER3.The two DNA fragments obtained were treated with BglII restriction endonuclease and then ligated with T4 DNA ligase (Maniatis T., Fritsch EF, Sambrook, J .: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2 ^nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). In the last step, the ligation product was amplified using P1 and P4 seeds. The resulting DNA fragment was purified by precipitation in ethanol and used for electroporation and recombination using the Red system into the chromosome of E. coli strain 702ilvA (pAYCTERl-cpg). The strain E. coli 702ilvA (pAYCTERl-cpg) is a derivative of the strain E. coli 702ilvA - producer of L-glutamic acid (VKPM B-8012) (European patent application 1772433 A1), additionally carrying the recombinant plasmid pAYCTERl-cpg. The plasmid pAYCTERl-cpg is a derivative of the vector pAYCTER3 carrying the natural genes encoding citrate synthase (gltA gene), PEP carboxylase (ten ppc), glutamate dehydrogenase (gdhA gene) and proBA operon cloned from E. coli K-12 using standard methods as PCR using the chromosomal DNA of E. coli K-12 strain as a template and seed with restriction enzyme recognition sites suitable for further cloning and assembly of PCR products. The vector pAYCTER3 is a derivative of the mid-copy and very stable vector pAYC32 constructed on the basis of the plasmid RSF1010 (Christoserdov AY, Tsygankov YD, Plasmid, 1986, v.16, pp. 161-167), which carries a marker of resistance to streptomycin. The pAYCTER3 vector was obtained by introducing a polylinker from plasmid pUC19 and the strong terminator rrnB into plasmid pAYC32 instead of its promoter as follows. First, using the PCR and primers shown in the List of sequences under numbers 6 (SEQ ID NO: 6) and 7 (SEQ ID NO: 7), the polylinker of plasmid pUC19 was obtained. The resulting PCR product was treated with restriction enzymes EcoRI and BglII. The rrnB terminator was also obtained using PCR and primers shown in the Sequence Listing numbers 8 (SEQ ID NO: 8) and 9 (SEQ ID NO: 9). The resulting PCR product was treated with restriction enzymes BglII and BclI. These two DNA fragments were then ligated into the pAYC32 plasmid pretreated with restriction enzymes EcoRI and BclI. So the plasmid pAYCTER3 was obtained.

Рекомбинантная плазмида pKD46 (Datsenko, K.A., Wanner, B.L., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 97, 6640-6645, 2000) с термочувствительным репликоном использовали в качестве донора генов фага λ, необходимых для Red-системы рекомбинации. Клетки штамма 702ilvA(pAYCTERl-cpg) трансформировали плазмидой pKD46 в соответствии со стандартным протоколом Са-трансформации (Maniatis Т., Fritsch E.F., Sambrook, J.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) с последующей селекцией трансформантов на чашках с L-агаром (Триптон, 10 г/л; дрожжевой экстракт, 5 г/л; NaCl, 10 г/л; агар 1,5%), содержащим ампициллин (100 мкг/мл). Чашки инкубировали в течение ночи при 30°С и полученные клоны использовали для приготовления электрокомпетентной культуры. Для этого клетки выращивали в течение ночи при 30°С в жидкой среде LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и стрептомицин (25 мкг/мл), затем разбавляли в отношении 1:100 средой SOB (дрожжевой экстракт, 5 г/л; NaCl, 0.5 г/л; Триптон, 20 г/л, KCl, 2,5 мМ; MgCl₂, 10 мМ), содержащей ампициллин (100 мкг/мл), стрептомицин (25 мкг/мл) и арабинозу (10 мМ) (арабиноза использовалась для индукции плазмиды, кодирующей гены системы гомологичной рекомбинации фага X), и выращивали при 30°С до достижения оптической плотности бактериальной культуры OD₆₀₀=0.8-1.0. Клетки из 10 мл полученной бактериальной культуры отмывали 3 раза деионизированной водой, охлажденной во льду, затем 200 мл глицерина (10%) и ресуспендировали в 40 мкл глицерина (10%). 0.5 мкг амплифицированного фрагмента ДНК, описанного выше, растворяли в 5 мкл деионизованной воды и добавляли к бактериальной культуре непосредственно перед проведением процедуры электропорации. Электропорацию проводили с помощью прибора для электротрансформации бактерий "Bio-Rad" (США) (№165-2098, версия 2-89) в соответствии с рекомендациями производителя для клеток Е.coli (время импульса - 4-5 миллисекунды, интенсивность электрического поля - 12,5 кВ/см).The recombinant plasmid pKD46 (Datsenko, KA, Wanner, BL, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 97, 6640-6645, 2000) with a heat-sensitive replicon was used as a donor of phage λ genes necessary for the Red recombination system. Cells of strain 702ilvA (pAYCTERl-cpg) were transformed with plasmid pKD46 according to the standard Ca transformation protocol (Maniatis T., Fritsch EF, Sambrook, J .: Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2 ^nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) followed by selection of transformants on L-agar plates (Tryptone, 10 g / L; yeast extract, 5 g / L; NaCl, 10 g / L; agar 1.5%) containing ampicillin ( 100 μg / ml). The plates were incubated overnight at 30 ° C and the resulting clones were used to prepare an electrocompetent culture. For this, cells were grown overnight at 30 ° C in LB liquid medium containing ampicillin (100 μg / ml) and streptomycin (25 μg / ml), then diluted in a ratio of 1: 100 with SOB medium (yeast extract, 5 g / l ; NaCl, 0.5 g / L; Trypton, 20 g / L, KCl, 2.5 mm; MgCl ₂ , 10 mm) containing ampicillin (100 μg / ml), streptomycin (25 μg / ml) and arabinose (10 mm ) (arabinose was used to induce a plasmid encoding the genes of the phage X homologous recombination system) and grown at 30 ° C until the optical density of the bacterial culture was OD ₆₀₀ = 0.8-1.0. Cells from 10 ml of the obtained bacterial culture were washed 3 times with deionized water, cooled in ice, then 200 ml of glycerol (10%) and resuspended in 40 μl of glycerol (10%). 0.5 μg of the amplified DNA fragment described above was dissolved in 5 μl of deionized water and added to the bacterial culture immediately prior to electroporation. Electroporation was carried out using the Bio-Rad device for electro-transformation of bacteria (USA) (No. 165-2098, version 2-89) in accordance with the manufacturer's recommendations for E. coli cells (pulse time - 4-5 milliseconds, electric field intensity - 12.5 kV / cm).

Сразу после электропорации к клеточной суспензии добавляли 1 мл среды SOC (дрожжевой экстракт, 5 г/л; NaCl, 0.5 г/л; Триптон, 20 г/л, KCl, 2,5 мМ; MgCl₂, 10 мМ; глюкоза, 20 мМ). Затем полученные клетки выращивали с перемешиванием в течение 2 часов при 37°С и проводили селекцию интегрантов на чашках с L-агаром, содержащим хлорамфеникол (25 мкг/мл) и стрептомицин (25 мкг/мл), выращивая их в течение ночи при 37°С.Immediately after electroporation, 1 ml of SOC medium was added to the cell suspension (yeast extract, 5 g / L; NaCl, 0.5 g / L; Tryptone, 20 g / L, KCl, 2.5 mm; MgCl ₂ , 10 mm; glucose, 20 mm). Then, the obtained cells were grown with stirring for 2 hours at 37 ° C and the integrands were selected on L-agar plates containing chloramphenicol (25 μg / ml) and streptomycin (25 μg / ml), growing them overnight at 37 ° FROM.

Полученные клоны Cm^R, Sm^R переносили методом реплики на чашки с L-агаром и выращивали в течение ночи при 42°С для того, чтобы элиминировать термочувствительную вспомогательную плазмиду pKD46. Наличие замены природной регуляторной области генов sucAB на искусственный гибридный фрагмент ДНК, сконструированный in vitro, в клонах Ар^S Cm^R Sm^R, полученных из штамма 702ilvA(pAYCTERl-cpg), подтверждали методом ПЦР.The obtained Cm ^R , Sm ^R clones were replicated onto L-agar plates and grown overnight at 42 ° C in order to eliminate the heat-sensitive auxiliary plasmid pKD46. The replacement of the natural regulatory region of sucAB genes with an artificial in vitro hybrid DNA fragment in Ap ^S Cm ^R Sm ^R clones obtained from strain 702ilvA (pAYCTERl-cpg) was confirmed by PCR.

Пример 2. Влияние промотора P_tac* на активность α-кетоглутаратдегидрогеназы и продукцию L-глутаминовой кислоты и L-пролина.Example 2. The effect of the promoter P _tac * on the activity of α-ketoglutarate dehydrogenase and the production of L-glutamic acid and L-proline.

Одной петлей каждого из штаммов 702ilvA(pAYCTERl-cpg) и 702ilvA tac* (pAYCTERl-cpg), выросших на чашках с L-агаром, инокулировали колбы Эрленмейера, содержащие 75 мл питательной среды, содержащей Триптон 10 г/л; дрожжевой экстракт 5 г/л; NaCl 4 г/л и стрептомицин (25 мкг/мл) для стабилизации рекомбинантной плазмиды pAYCTER1-cpg, и выращивали в течение 6 часов при 37°С с перемешиванием (140 об/мин). Затем 50 мл выросшей культуры инокулировали Jar-ферментер («Marubishi», Япония). Состав питательной среды для ферментации (общий объем 500 мл) следующий: глюкоза 100 г/л; (NH₄)₂SO₄ 2 г/л; КН₂PO₄1 г/л; MgSO₄*7H₂O 0.4 г/л; FeSO₄*7H₂O 0.01 г/л; MnSO₄*5H₂O 0.01 г/л; L-изолейцин, 0.2 г/л; Mameno 0.2 г/л (общий азот); тиамин^*HCl 0.0004 г/л; рН 6,7. В ходе ферментации с аэрацией и перемешиванием (900 об/мин) при 35°С рН среды поддерживали добавлением раствора NH₄OH.One loop of each of the strains 702ilvA (pAYCTERl-cpg) and 702ilvA tac * (pAYCTERl-cpg) grown on L-agar plates inoculated Erlenmeyer flasks containing 75 ml of culture medium containing Tryptone 10 g / l; yeast extract 5 g / l; NaCl 4 g / l and streptomycin (25 μg / ml) to stabilize the recombinant plasmid pAYCTER1-cpg, and were grown for 6 hours at 37 ° C with stirring (140 rpm). Then, 50 ml of the grown culture was inoculated with a Jar fermenter (Marubishi, Japan). The composition of the nutrient medium for fermentation (total volume 500 ml) is as follows: glucose 100 g / l; (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 2 g / l; KH ₂ PO ₄ 1 g / l; MgSO ₄ * 7H ₂ O 0.4 g / l; FeSO ₄ * 7H ₂ O 0.01 g / l; MnSO ₄ * 5H ₂ O 0.01 g / l; L-isoleucine, 0.2 g / l; Mameno 0.2 g / l (total nitrogen); thiamine ^* HCl 0.0004 g / l; pH 6.7. During fermentation with aeration and stirring (900 rpm) at 35 ° C, the pH of the medium was maintained by adding a solution of NH ₄ OH.

Количество L-глутаминовой кислоты и L-пролина определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Условия для ВЭЖХ: колонка Luna C₁₈(2), 150×3 мм, 5U, температура 17°С. Элюент: CH₃CN - 0,8% (v/v), Н₃PO₄ 0,1% (v/v), KH₂PO₄ - 10 мМ, n-C₈H₁₇SO₃Na - 3 мМ. Скорость потока 0.4 мл/мин, объем нанесения 10 мкл. Детекция при 200 нм. Времена удерживания: глутаминовая кислота 9,3; пролин 12,1.The amount of L-glutamic acid and L-proline was determined by high performance liquid chromatography (HPLC). Conditions for HPLC: Luna C ₁₈ (2) column, 150 × 3 mm, 5U, temperature 17 ° C. Eluent: CH ₃ CN - 0.8% (v / v), H ₃ PO ₄ 0.1% (v / v), KH ₂ PO ₄ - 10 mM, nC ₈ H ₁₇ SO ₃ Na - 3 mM. The flow rate of 0.4 ml / min, the application volume of 10 μl. Detection at 200 nm. Retention times: glutamic acid 9.3; proline 12.1.

Уровень активности α-кетоглутаратдегидрогеназы в полученных штаммах определяли в соответствии со стандартной методикой (Amarasingham & Davis // J.Biol.Chem. 1965. 240, 3664-3668) после выращивания клеток в условиях, в которых определяли уровень накопления L-глутаминовой кислоты и L-пролина. Данные приведены в Таблице 1.The level of activity of α-ketoglutarate dehydrogenase in the obtained strains was determined in accordance with the standard method (Amarasingham & Davis // J. Biol. Chem. 1965. 240, 3664-3668) after cell growth under conditions in which the level of accumulation of L-glutamic acid and L-proline. The data are shown in Table 1.

Как видно из данных, приведенных в Таблице 1, замена природного промотора P_suc* более сильным промотором Р_tac* приводит к повышению до 3-х раз специфической активности α-кетоглутаратдегидрогеназы в клетках нового штамма по сравнению с его предшественником.As can be seen from the data shown in Table 1, the replacement of the natural promoter P _suc * with the stronger promoter P _tac * leads to an increase of up to 3 times the specific activity of α-ketoglutarate dehydrogenase in the cells of the new strain compared to its predecessor.

В то же время клетки нового штамма частично утратили способность к суперпродукции L-глутаминовой кислоты. И хотя уровень накопления L-пролина новым штаммом по сравнению с немодифицированным штаммом слегка повысился, общая конверсия углерода из глюкозы в аминокислоты семейства L-глутаминовой кислоты (в данном случае L-глутаминовой кислоты и L-пролина) значительно снизилась.At the same time, the cells of the new strain partially lost the ability to superproduce L-glutamic acid. Although the level of accumulation of L-proline by the new strain slightly increased compared to the unmodified strain, the total conversion of carbon from glucose to amino acids of the L-glutamic acid family (in this case, L-glutamic acid and L-proline) decreased significantly.

Полученные результаты ясно указывают на тот факт, что использование сильного конститутивного промотора Р_tac*, содержащего консенсусные области «-10» и «-35», приводит к повышению в 3 раза активности α-кетоглутаратдегидрогеназы и соответственно к снижению способности к продукции L-глутаминовой кислоты. Наблюдалось некоторое повышение скорости роста полученного штамма по сравнению со штаммом, содержащим природный промотор Р_suc (Таблица 1). Вероятно, это происходит ввиду увеличения потока углерода через цикл трикарбоновых кислот и, следовательно, более высокому уровню синтеза АТФ в этом штамме.The results clearly indicate that the use of the strong constitutive promoter P _tac * containing the consensus regions “-10” and “-35” leads to a 3-fold increase in the activity of α-ketoglutarate dehydrogenase and, accordingly, to a decrease in the ability to produce L-glutamine acids. There was a slight increase in the growth rate of the obtained strain compared with the strain containing the natural promoter P _suc (table 1). This is probably due to an increase in the carbon flux through the tricarboxylic acid cycle and, consequently, to a higher level of ATP synthesis in this strain.

С другой стороны, как было упомянуто в описании предшествующего уровня техники, мутанты, принадлежащие к роду Escherichia, - продуценты глутаминовой кислоты, у которых отсутствует или снижена активность α-кетоглутаратдегидрогеназы, не способны к росту или способны расти с низкой скоростью на минимальной среде с глюкозой в аэробных условиях. Для восстановления способности к росту необходимо подавление янтарной кислоты или лизина в комбинации с метионином. Таким образом, необходим подбор оптимального уровня экспрессии α-кетоглутаратдегидрогеназы в бактерии для того, чтобы такая бактерия обладала способностью к продукции глутаминовой кислоты и способностью к росту в питательной среде, не содержащей дополнительных питательных добавок, таких как янтарная кислота, лизин или метионин.On the other hand, as mentioned in the description of the prior art, mutants belonging to the genus Escherichia are producers of glutamic acid, which lack or reduce the activity of α-ketoglutarate dehydrogenase, are not able to grow or are able to grow at a low rate in a minimal environment with glucose under aerobic conditions. To restore the ability to grow, suppression of succinic acid or lysine in combination with methionine is necessary. Thus, it is necessary to select the optimal level of expression of α-ketoglutarate dehydrogenase in bacteria in order for such a bacterium to be able to produce glutamic acid and grow in a nutrient medium that does not contain additional nutritional supplements, such as succinic acid, lysine or methionine.

Для получения прототрофного штамма, обладающего высоким уровнем продукции L-глутаминовой кислоты и хорошей скоростью роста, было решено оптимизировать экспрессию генов sucAB путем «рандомизации» консенсусной области «-35» промотора Р_tac* с целью понижения эффективности инициации транскрипции (в сравнении с промотором P_tac*) и, как следствие, снижения активности α-кетоглутаратдегидрогеназы и повышения выхода L-глутаминовой кислоты.To obtain a prototrophic strain with a high level of L-glutamic acid production and good growth rate, it was decided to optimize the expression of sucAB genes by “randomizing” the consensus region “-35” of the P _tac * promoter in order to decrease the efficiency of transcription initiation (in comparison with the P promoter _tac *) and, as a result, a decrease in the activity of α-ketoglutarate dehydrogenase and an increase in the yield of L-glutamic acid.

Пример 3. Получение искусственного регуляторного элемента, содержащего область с последовательностью нуклеотидов случайного состава («рандомизированную» область), и замена природного участка перед генами sucAB в хромосоме Е.coli таким искусственным элементом.Example 3. Obtaining an artificial regulatory element containing a region with a sequence of nucleotides of random composition ("randomized" region), and replacing the natural site in front of sucAB genes in the E. coli chromosome with such an artificial element.

Набор искусственных регуляторных элементов, содержащих «рандомизированную» область «-35», получали методом ПЦР с использованием синтетических олигонуклеотидов PI (SEQ ID NO: 2) и PS (SEQ ID NO: 10) в качестве затравок и плазмиды pDR540 в качестве матрицы. Затравка PS (SEQ ID NO: 10) состоит из 51 нуклеотида и содержит участок с 4 нуклеотидами случайного состава, обозначенных в последовательности SEQ ID NO: 10 буквой «n». Таким образом, искусственный фрагмент ДНК содержал гибридный регуляторный элемент с «рандомизированной» областью и ген устойчивости к хлорамфениколу (Cm^R), a последующую интеграцию этого фрагмента в хромосому проводили, как описано в Примере 1.A set of artificial regulatory elements containing a “-35” randomized region was obtained by PCR using synthetic oligonucleotides PI (SEQ ID NO: 2) and PS (SEQ ID NO: 10) as seeds and plasmid pDR540 as a template. The PS seed (SEQ ID NO: 10) consists of 51 nucleotides and contains a region with 4 nucleotides of random composition, designated in the sequence SEQ ID NO: 10 by the letter "n". Thus, the artificial DNA fragment contained a hybrid regulatory element with a "randomized" region and a chloramphenicol resistance gene (Cm ^R ), and the subsequent integration of this fragment into the chromosome was carried out as described in Example 1.

Колонии полученных интегрантов, выросшие на L-агаре, имели различные размеры и обладали разной скоростью роста. Селекцию проводили по продуктивности L-глутаминовой кислоты. Были отобраны два наилучших клона, №2 и №21, обладающие наибольшей продукцией L-глутаминовой кислоты. В то же время эти клоны обладали высоким уровнем общей конверсии углерода глюкозы в аминокислоты семейства L-глутаминовой кислоты (в данной случае - L-глутаминовой кислоты и L-пролина). Геномную ДНК из этих клонов выделяли с использованием "Genomic DNA isolation kit" (Sigma, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Для амплификации искусственного регуляторного элемента, содержащего «рандомизированную» область, проводили ПЦР с использованием выделенной ДНК в качестве матрицы и олигонуклеотидов PI (SEQ ID NO: 2) и Р4 (SEQ ID NO: 5) в качестве затравок. Последовательности обоих продуктов амплификации определяли методом Сенгера. Искусственные промоторы из клонов 2 и 21 обозначили P_tac-2 и P_tac21 соответственно. Последовательности тетрамеров, полученных «рандомизацией», приведены в Списке последовательностей под номерами 11 (SEQ ID NO: 11) и 12 (SEQ ID NO: 12) соответственно.The colonies of the obtained integrants grown on L-agar had different sizes and had different growth rates. Selection was carried out by the productivity of L-glutamic acid. Two of the best clones, No. 2 and No. 21, with the highest L-glutamic acid production, were selected. At the same time, these clones had a high overall conversion of glucose carbon to amino acids of the L-glutamic acid family (in this case, L-glutamic acid and L-proline). Genomic DNA from these clones was isolated using the "Genomic DNA isolation kit" (Sigma, USA) in accordance with the manufacturer's recommendations. To amplify an artificial regulatory element containing a "randomized" region, PCR was performed using isolated DNA as a template and oligonucleotides PI (SEQ ID NO: 2) and P4 (SEQ ID NO: 5) as seeds. The sequences of both amplification products were determined by the Senger method. Artificial promoters from clones 2 and 21 were designated P _tac-2 and P _tac21, respectively. The sequences of tetramers obtained by "randomization" are shown in the List of sequences under the numbers 11 (SEQ ID NO: 11) and 12 (SEQ ID NO: 12), respectively.

Пример 4. Влияние искусственного регуляторного элемента на активность α-кетоглутаратдегидрогеназы и продукцию L-глутаминовой кислоты и L-пролина.Example 4. The effect of an artificial regulatory element on the activity of α-ketoglutarate dehydrogenase and the production of L-glutamic acid and L-proline.

Ферментацию клонов 2 и 21, измерение количества L-глутаминовой кислоты и L-пролина, а также определение активности α-кетоглутаратдегидрогеназы проводили, как описано в Примере 2.The fermentation of clones 2 and 21, the measurement of the amount of L-glutamic acid and L-proline, as well as the determination of the activity of α-ketoglutarate dehydrogenase was carried out as described in Example 2.

Как видно из Таблицы 1, можно считать, что введение конститутивного промотора, подобного P_tac, с оптимизированной силой, меньшей, чем у P_tac, вместо природного промотора P_suc позволяет выбрать варианты штаммов с улучшенной продукцией L-глутаминовой кислоты и более высокой конверсией углерода из глюкозы в аминокислоты семейства L-глутаминовой кислоты (в данном случае -L-глутаминовой кислоты и L-пролина). Более того, варианты штаммов проявляют способность к хорошему росту на минимальной среде, не содержащей дополнительных добавок, таких как янтарная кислота, лизин или метионин, с глюкозой в качестве источника углерода. Как видно из Таблицы 1, оптические плотности культур в стандартных условиях ферментации для штаммов, содержащих промоторы P_tac-2 и P_tac21, были не намного ниже, чем у штамма с природным промотором P_suc.As can be seen from Table 1, we can assume that the introduction of a constitutive promoter, such as P _tac , with an optimized strength lower than that of P _tac , instead of the natural promoter P _suc, allows _one to choose strain variants with improved production of L-glutamic acid and higher carbon conversion from glucose to amino acids of the L-glutamic acid family (in this case, -L-glutamic acid and L-proline). Moreover, strain variants exhibit the ability to grow well on minimal medium that does not contain additional additives, such as succinic acid, lysine or methionine, with glucose as a carbon source. As can be seen from Table 1, the optical density of the cultures under standard fermentation conditions for strains containing the P _tac-2 and P _{tac21 promoters} was not much lower than that of the strain with the natural P _suc promoter.

Таблица 1Table 1 ШтаммStrain ПромоторPromoter Активность SucAB, отн.ед.SucAB activity, rel. OD₅₄₀ OD ₅₄₀ Время выращивания, чGrowing time, h Количествоamount Общий выход кислот семейства глутаминовой кислоты из глюкозы*, %The total yield of glutamic acid from glucose *,% L-пролина, г/лL-proline, g / l L-глутаминовой кислоты, г/лL-glutamic acid, g / l 702ilvA [pAYCTER1-cpg]702ilvA [pAYCTER1-cpg] P_suc P _suc 9090 37.837.8 25.525.5 18.018.0 8.18.1 37.337.3 702ilvA tac* [pAYCTER1-cpg]702ilvA tac * [pAYCTER1-cpg] Р_tac*P _tac * 300300 41.441.4 27.127.1 21.121.1 00 33.833.8 22 P_tac-2 P _tac-2 8080 33.033.0 26.326.3 14.014.0 20.520.5 44.144.1 2121 Р_tac-21 P _tac-21 5555 33.033.0 27.027.0 12.512.5 25.225.2 46.546.5 * Выход рассчитывали по L-глутаминовой кислоте, принимая во внимание молекулярные веса (MW) L-глутаминовой кислоты и L-пролина, по следующей формуле: Общий выход = количество L-глутаминовой кислоты ^* 100 / количество глюкозы + (количество L-пролина * MW L-глутаминовой кислоты * 100) / (количество глюкозы * MW L-пролина)* The yield was calculated by L-glutamic acid, taking into account the molecular weights (MW) of L-glutamic acid and L-proline, according to the following formula: Total yield = amount of L-glutamic acid ^* 100 / amount of glucose + (amount of L-proline * MW L-glutamic acid * 100) / (amount of glucose * MW L-proline)

Пример 5. Влияние искусственного промотора Р_tac-21 на активность α-кетоглутаратдегидрогеназы и продукцию L-лейцина.Example 5. The effect of the artificial promoter P _tac-21 on the activity of α-ketoglutarate dehydrogenase and the production of L-leucine.

Как видно из Таблицы 1, искусственный промотор P_tac-21 обеспечивает самый низкий уровень активности α-кетоглутаратдегидрогеназы, результатом чего является максимальный выход L-глутаминовой кислоты. Сниженная активность белка SucAB, участвующего в работе цикла трикарбоновых кислот (ТСА), приводит к уменьшению потребления ацетил-СоА в цикле ТСА. Ацетил-СоА является предшественником L-лейцина, следовательно, повышенный пул ацетил-СоА может быть использован для биосинтеза L-лейцина, и, в конечном итоге, может положительно влиять на продукцию L-лейцина.As can be seen from Table 1, the artificial promoter P _tac-21 provides the lowest level of α-ketoglutarate dehydrogenase activity, resulting in a maximum yield of L-glutamic acid. The reduced activity of the SucAB protein involved in the tricarboxylic acid (TCA) cycle leads to a decrease in acetyl CoA consumption in the TCA cycle. Acetyl-CoA is a precursor of L-leucine, therefore, an increased pool of acetyl-CoA can be used for biosynthesis of L-leucine, and, ultimately, can positively affect the production of L-leucine.

Для проверки этой гипотезы искусственный промотор Р_tac-21 перед генами sucAB был перенесен стандартной Р1 трансдукцией (Sambrook et al, "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) в штамм-продуцент L-лейцина E.coli и отобран по устойчивости к Cm, при этом штамм Е.coli 21 использовался в качестве донора. Поскольку эффект повышения продукции L-лейцина заметен только у штамма-продуцента с высоким выходом L-лейцина, способность к продукции L-лейцина у штамма-продуцент L-лейцина E.coli 57 (ВКПМ В-7386, патент России №2140450) была дополнительно усилена. Штамм 57 продуцирует 1.5-1.7 г/л L-лейцина при ферментации в пробирках. Для этой цели из штамма Е.coli C600 (leu^-) (Appleyard R.K., Genetics, 39, 440-452 (1954)) в хромосому штамма 57 трансдукцией фага PI была перенесена лейциновая ауксотрофность, как описано выше. Далее, полученную ауксотрофность по лейцину в штамме 57lеu^-комплементарно заменили генами leuA^*BCD из штамма-донора Е.coli 55 аналогичной Р1 трансдукцией. Штамм 55 содержит ген leuA^*, кодирующий мутантную альфаизопропилмалатсинтазу, устойчивую к ингибированию лейцином по принципу обратной связи (патент России №2201454). После того, как ген ilνE, кодирующий белок с активностью трансаминазы разветвленных аминокислот, был инактивирован в полученном штамме 57lеuА^* и активность трансаминазы ароматических аминокислот, кодируемой геном tyrB, была повышена в штамме 57leuA^*ilvE^-трансформацией рекомбинантной плазмидой pACYC-tyrB (патентная заявка России 2002116773). Полученный штамм 57leuA^*ilvE^-/pACYC-tyrB продуцировал около 9 г/л L-лейцина в пробирочной ферментации.To test this hypothesis, the artificial P _tac-21 promoter before sucAB genes was transferred by standard P1 transduction (Sambrook et al, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) to the L-leucine producer strain E. coli and selected for resistance to Cm, while E. coli strain 21 was used as a donor. Since the effect of increasing the production of L-leucine is noticeable only in the producer strain with a high yield of L-leucine, the ability to produce L-leucine in the strain producing L-leucine E. coli 57 (VKPM B-7386, Russian patent No. 2140450) was additionally reinforced. Strain 57 produces 1.5-1.7 g / L of L-leucine by fermentation in vitro. For this purpose, leucine auxotrophy was transferred from strain E. coli C600 (leu ^- ) (Appleyard RK, Genetics, 39, 440-452 (1954)) to the chromosome of strain 57 by transduction of phage PI, as described above. Further, the obtained leucine auxotrophy in strain 57leu ^was complementarily replaced by the leuA ^* BCD genes from the E. coli 55 donor strain by analogous P1 transduction. Strain 55 contains the leuA ^* gene encoding mutant alphaisopropylmalate synthase resistant to leucine inhibition by the feedback principle (Russian patent No. 2201454). After gene ilνE, encoding a protein with the activity of transaminase branched amino acids was inactivated in the resulting strain 57leuA ^* and the activity of transaminase aromatic amino acids encoded by the genome of tyrB, was enhanced in the strain 57leuA ^* ilvE ^- transforming the recombinant plasmid pACYC-tyrB (patent Russian Application 2002116773). The resulting strain 57leuA ^* ilvE ^- / pACYC-tyrB produced about 9 g / L L-leucine in vitro fermentation.

Промотор Р_tac-21 был введен в хромосому полученного штамма 57leuA^*ilvE^-/pACYC-tyrB с помощью стандартной Р1 трансдукции. Продукция L-лейцина, полученного в результате штамма 57sucleuA^*ilvE^-/pACYC-tyrB, возросла до 11.4 г/л L-лейцина при ферментации в пробирках.The promoter P _tac-21 was introduced into the chromosome of the obtained strain 57leuA ^* ilvE ^- / pACYC-tyrB using standard P1 transduction. The production of L-leucine obtained as a result of strain 57sucleuA ^* ilvE ^- / pACYC-tyrB increased to 11.4 g / l of L-leucine by fermentation in vitro.

По одной полной микробиологической петле каждого из штаммов 57leuA^*ilvE^-/pACYC-tyrB и 57suc leuA*ilvE^-/pACYC-tyrB, выращенных на чашках с L-агаром, внесли в ферментационные пробирки 20×200 мм, содержащие 2 мл среды следующего состава: глюкоза - 60 г/л, (NH₄)₂SO₄- 15 г/л, KH₄РО₄- 1.5 г/л, MgSO₄*7H₂O - 1 г/л, тиамин*HCl - 0.1 г/л, СаСО₃- 2 г/л, и инкубировали в течение 72 часов при температуре +34°С на роторной качалке (250 об/мин).One complete microbiological loop of each of the 57leuA ^* ilvE ^- / pACYC-tyrB and 57suc leuA * ilvE ^- / pACYC-tyrB strains grown on L-agar plates was added to 20 × 200 mm fermentation tubes containing 2 ml of medium of the following composition : glucose - 60 g / l, (NH ₄ ) ₂ SO ₄ - 15 g / l, KH ₄ PO ₄ - 1.5 g / l, MgSO ₄ * 7H ₂ O - 1 g / l, thiamine * HCl - 0.1 g / l, CaCO ₃ - 2 g / l, and incubated for 72 hours at a temperature of + 34 ° C on a rotary shaker (250 rpm).

Количество L-лейцина определялось с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Использовались следующие условия HPLC: Separon SGX C₁₈, 150×3.3 мм, 5 мкм, темп: 22°С. Элюэнт: СН₃СМ-15% (v/v), Cu(СН₃СОО)₂- 0,1 М. Скорость потока - 0.3 мл/мм, объем пробы - 0,5 μл. Длина волны 232 нм.The amount of L-leucine was determined using high performance liquid chromatography (HPLC). The following HPLC conditions were used: Separon SGX C ₁₈ , 150 × 3.3 mm, 5 μm, temp: 22 ° C. Eluent: СН ₃ СМ-15% (v / v), Cu (СН ₃ СОО) ₂ - 0.1 M. Flow rate - 0.3 ml / mm, sample volume - 0.5 μl. The wavelength is 232 nm.

Как видно из Таблицы 2, замена природного промотора искусственным промотором P_tac-21 в хромосоме штамма 57suc leuA*ilvE^-/pACYC-tyrB выражается в уменьшении активности кетоглутаратдегидрогеназы и в увеличении продукции L-лейцина.As can be seen from Table 2, the replacement of the natural promoter with the artificial promoter P _tac-21 in the chromosome of strain 57suc leuA * ilvE ^- / pACYC-tyrB is expressed in a decrease in the activity of ketoglutarate dehydrogenase and in an increase in the production of L-leucine.

Таблица 2table 2 ШтаммStrain ПромоторPromoter SucAB активность, относительные единицыSucAB activity, relative units Концентрация L-лейцина, г/лThe concentration of L-leucine, g / l 57leuA*ilvE^-/pACYC-tyrB57leuA * ilvE ^- / pACYC-tyrB Природный Р_suc Natural P _suc 9090 9.19.1 57leuA*ilvE^-suc/pACYC-tyrB57leuA * ilvE ^- suc / pACYC-tyrB P_tac-21 P _tac-21 3636 11.411.4

Claims

1. A method of producing a bacterium belonging to the genus Escherichia, with an optimized expression level of a gene encoding a protein, affecting the distribution of carbon and nitrogen fluxes in said bacterium, comprising the steps of:

but. introducing into the chromosome of the bacterium a set of DNA fragments synthesized in vitro and containing elements that regulate the expression of the specified gene, instead of the natural element of the regulatory region of the specified gene to obtain a population of bacteria and

b. breeding bacteria with the desired phenotype.

2. The method according to claim 1, characterized in that said bacterium is a bacterium producing L-amino acids.

3. The method according to claim 2, characterized in that the L-amino acid is selected from the group consisting of L-glutamic acid, L-glutamine, L-proline, L-arginine and L-leucine.

4. The method according to claim 1, characterized in that said bacterium is a bacterium producing a nucleic acid.

5. The method according to claim 4, characterized in that the nucleic acid is selected from the group consisting of inosine, guanosine and adenosine.

6. The method according to claim 1, characterized in that the DNA fragment contains one or more regulatory elements selected from the group consisting of a promoter, a ribosome binding site (RBS) and an operator.

7. The method according to claim 6, characterized in that the set of DNA fragments contains regulatory elements with a sequence of nucleotides of arbitrary composition.

8. The method according to claim 7, characterized in that the set of DNA fragments is composed of regulatory elements with a known sequence and known strength.

9. A bacterium belonging to the genus Escherichia is a producer of an L-amino acid belonging to the L-glutamic acid family with an optimized expression level of a gene encoding a protein that affects the production of the L-amino acid, and such a bacterium is obtained by the method according to any one of claims. 1-8.

10. The bacterium according to claim 9, characterized in that the sequence of the “-35” region of the sucAB gene promoter contains the sequence shown in the List of sequences numbered 11 or 12.

11. The bacterium according to claim 9, characterized in that the L-amino acid belonging to the L-glutamic acid family is selected from the group consisting of L-glutamic acid, L-glutamine, L-proline and L-arginine

12. A bacterium belonging to the genus Escherichia is a producer of an L-amino acid, preferably L-leucine, with an optimized expression level of a gene encoding a protein that affects the production of an L-amino acid, which bacterium is obtained by the method according to any one of claims 1 to 8 .

13. A method for producing an L-amino acid belonging to the L-glutamic acid family, comprising the steps of growing the bacterium of claim 9 in a nutrient medium, causing production and accumulation of the L-amino acid in the nutrient medium, and isolating the L-amino acid from the culture fluid.

14. The method according to item 13, wherein the L-amino acid belonging to the L-glutamic acid family is selected from the group consisting of L-glutamic acid, L-glutamine, L-proline and L-arginine.

15. A method for producing an L-amino acid, preferably L-leucine, comprising the steps of growing the bacterium of claim 12 in a culture medium, causing production and accumulation of the L-amino acid in the culture medium, and isolating the L-amino acid from the culture fluid.

Priority on points:

03/12/2003 according to claims 1-11, 13, 14;

12/18/2003 according to paragraphs 12, 15.