RU2215784C2 - Method for preparing l amino acids, strain escherichia coli as producer of l-amino acid (variants) - Google Patents

Method for preparing l amino acids, strain escherichia coli as producer of l-amino acid (variants) Download PDF

Info

Publication number
RU2215784C2
RU2215784C2 RU2001117632A RU2001117632A RU2215784C2 RU 2215784 C2 RU2215784 C2 RU 2215784C2 RU 2001117632 A RU2001117632 A RU 2001117632A RU 2001117632 A RU2001117632 A RU 2001117632A RU 2215784 C2 RU2215784 C2 RU 2215784C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
amino acid
amino acids
genes
strain
pygazh
Prior art date
Application number
RU2001117632A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2001117632A (en
Inventor
Е.А. Таболина
К.В. Рыбак
Е.М. Хургес
Э.Б. Ворошилова
М.М. Гусятинер
Original Assignee
Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to RU2001117632A priority Critical patent/RU2215784C2/en
Application filed by Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" filed Critical Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика"
Priority to EP04028877A priority patent/EP1526181B1/en
Priority to EP02003335A priority patent/EP1239041B1/en
Priority to DE60219968T priority patent/DE60219968T2/en
Priority to US10/073,293 priority patent/US7476531B2/en
Priority to CN2009101594504A priority patent/CN101597589B/en
Priority to CN2009101594487A priority patent/CN101597588B/en
Priority to BR122013017187A priority patent/BR122013017187B1/en
Priority to DE60219969T priority patent/DE60219969T2/en
Priority to CNB021080860A priority patent/CN100529057C/en
Priority to EP04028876A priority patent/EP1526179B9/en
Priority to BRPI0200350-3A priority patent/BR0200350B1/en
Priority to JP2002034760A priority patent/JP5087194B2/en
Priority to BR122013017189A priority patent/BR122013017189B1/en
Priority to DE60210697T priority patent/DE60210697T2/en
Publication of RU2001117632A publication Critical patent/RU2001117632A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2215784C2 publication Critical patent/RU2215784C2/en
Priority to JP2007273972A priority patent/JP2008067714A/en
Priority to JP2007273965A priority patent/JP5087362B2/en
Priority to US12/120,409 priority patent/US7618804B2/en
Priority to US12/120,404 priority patent/US7618803B2/en

Links

Images

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

FIELD: biotechnology, molecular biology, microbiology, amino acids. SUBSTANCE: L-amino acids, for example, L-methionine, L-leucine, L-proline, L-valine or L-threonine are prepared by culturing microorganism Escherichia coli where production of L- amino acid is enhanced due to elevated activity of proteins encoded by genes b2682 and b2683. After accumulation L-amino acids are extracted from cultural fluids. Strains E. coli are transformed with plasmid (pYGAZH). The application of the strain E. coli VL2054 (pYGAZH) allows the enhancement of the yield of L-threonine, the application of the strain of E. coli H-81 (pYGAZH) the yield of L-valine, the application of the strain E. coli 702ilvA (pYGAZH) the yield of L-proline, the application of the strain E. coli 505 (pYGAZH) the yield of L-leucien, and the application of the strain E. coli 73 (pYGAZH) the yield of L- methionine. EFFECT: improved and enhanced yield of L-amino acids. 18 cl, 7 tbl, 1 dwg, 7 ex

Description

Область техники
Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения L-аминокислот методом ферментации, и более конкретно к генам, полученным из бактерии Escherichia coli. Указанные гены позволяют улучшить продукцию L-аминокислот, например L-треонина, L-валина, L-пролина, L-лейцина и L-метионина.Technical field
The present invention relates to biotechnology, in particular to a method for producing L-amino acids by fermentation, and more particularly to genes derived from Escherichia coli bacteria. These genes can improve the production of L-amino acids, for example L-threonine, L-valine, L-proline, L-leucine and L-methionine.

Предшествующий уровень техники
Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.State of the art
Traditionally, L-amino acids on an industrial scale can be obtained by fermentation using strains of microorganisms obtained from natural sources or their mutants, specially modified in order to increase the production of L-amino acids.

Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например, путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4278765). Указанные методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот, и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к обратному ингибированию, продуцируемой L-аминокислотой (см. , например, выложенную патентную заявку Японии 56-18596 (1981), WO 95/16042 или патенты США 5661012 и 6040160). Numerous methods have been described to increase the production of L-amino acids, for example, by transforming a microorganism of recombinant DNA (see, for example, US patent 4,278,765). These methods are based on increasing the activity of enzymes involved in the biosynthesis of amino acids, and / or reducing the sensitivity of the target enzyme to reverse inhibition produced by the L-amino acid (see, for example, Japanese Patent Application Laid-open 56-18596 (1981), WO 95/16042 or U.S. Patents 5,661,012 and 6,040,160).

С другой стороны, повышенная экскреция L-аминокислот может увеличить продуктивность штамма, продуцирующего L-аминокислоту. Описан штамм бактерии, принадлежащей к роду Corynebacterium, обладающей повышенной экспрессией гена экскреции L-лизина (ген lysE) (WO 9723597 A2). Кроме того, описаны гены, кодирующие белки, способные к секреции L-цистеина, L-цистина, N-ацетилсерина или производных триазолидина (патент США 5972633). On the other hand, increased excretion of L-amino acids can increase the productivity of a strain producing L-amino acids. A strain of a bacterium belonging to the genus Corynebacterium having increased expression of the L-lysine excretion gene (lysE gene) (WO 9723597 A2) is described. In addition, genes encoding proteins capable of secreting L-cysteine, L-cystine, N-acetylserine or triazolidine derivatives are described (US Pat. No. 5,972,633).

К настоящему времени описаны несколько генов, кодирующих, как предполагается, мембранные белки, которые увеличивают продукцию L-аминокислот. Дополнительная копия гена rhtB делает бактерию более устойчивой к L-гомосерину и увеличивает продукцию L-гомосерина, L-треонина, L-аланина, L-валина и L-изолейцина (Европейская патентная заявка ЕР 994190 А2). Дополнительная копия гена rhtC делает бактерию более устойчивой к L-гомосерину и L-треонину и увеличивает продукцию L-гомосерина, L-треонина и L-лейцина (Европейская патентная заявка ЕР 1013765 А1). Дополнительные копии генов yahN, yeaS, yfiK, uyggA увеличивают продукцию L-глутаминовой кислоты, L-треонина, L-аланина, L-гистидина, L-пролина, L-аргинина, L-валина и L-изолейцина (Европейская патентная заявка ЕР 1016710 А2). И хотя нуклеотидная последовательность всего генома Escherichia coli К-12 описана (Blattner F.R., Plunkett G., Bloch C.A. et al., Science, 227, 1453-1474,1997; ftp://ftp.genetics.wisc.edu/pub/sequence/ecolim52.seq.gz), существует множество открытых рамок считывания, функция которых остается неизвестной. To date, several genes have been described that encode, as expected, membrane proteins that increase the production of L-amino acids. An additional copy of the rhtB gene makes the bacterium more resistant to L-homoserin and increases the production of L-homoserine, L-threonine, L-alanine, L-valine and L-isoleucine (European patent application EP 994190 A2). An additional copy of the rhtC gene makes the bacterium more resistant to L-homoserin and L-threonine and increases the production of L-homoserin, L-threonine and L-leucine (European patent application EP 1013765 A1). Additional copies of the yahN, yeaS, yfiK, uyggA genes increase the production of L-glutamic acid, L-threonine, L-alanine, L-histidine, L-proline, L-arginine, L-valine and L-isoleucine (European patent application EP 1016710 A2). Although the nucleotide sequence of the entire genome of Escherichia coli K-12 is described (Blattner FR, Plunkett G., Bloch CA et al., Science, 227, 1453-1474.1997; ftp://ftp.genetics.wisc.edu/pub/ sequence / ecolim52.seq.gz), there are many open reading frames whose function remains unknown.

Описание изобретения
Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности штаммов, продуцирующих L-аминокислоты, и предоставление способа получения L-аминокислот, например L-треонина, L-валина, L-пролина, L-лейцина или L-метионина, с использованием указанных штаммов.Description of the invention
The aim of the present invention is to increase the productivity of strains producing L-amino acids, and the provision of a method for producing L-amino acids, for example L-threonine, L-valine, L-proline, L-leucine or L-methionine, using these strains.

Данная цель была достигнута путем идентификации генов, кодирующих белки, которые не вовлечены в пути биосинтеза целевых L-аминокислот, но увеличивают их продукцию. Примером такого белка может являться мембранный белок, обладающий активностью, обеспечивающей экскрецию L-аминокислот. При анализе нуклеотидной последовательности полного генома Escherichia coli были отобраны белки с 4 или более предполагаемыми трансмембранными сегментами (ТМС). В результате тщательного исследования авторы настоящего изобретения идентифицировали среди них два гена, такие как b2682 и b2683, и тщательно изучили их. Гены b2682 и b2683 были известны как предполагаемые кодирующие последовательности, которые могут кодировать белки с неизвестной функцией (номера нуклеотидов с 92 по 829 и с 819 по 1154 в нуклеотидной последовательности под номером АЕ000353 U00096 в Genbank соответственно). Ген b2683 также известен как ygaH. Также авторы настоящего изобретения установили, что при повышении активности белков, кодируемых генами b2682 и b2683, увеличивается продуктивность штаммов, продуцирующих L-аминокислоты. Таким образом было совершено настоящее изобретение. This goal was achieved by identifying genes encoding proteins that are not involved in the biosynthesis of target L-amino acids, but increase their production. An example of such a protein may be a membrane protein having an activity for the excretion of L-amino acids. When analyzing the nucleotide sequence of the entire Escherichia coli genome, proteins with 4 or more putative transmembrane segments (TMS) were selected. As a result of a thorough study, the authors of the present invention identified two genes among them, such as b2682 and b2683, and carefully studied them. The b2682 and b2683 genes were known as putative coding sequences that can encode proteins with unknown function (nucleotide numbers 92 to 829 and 819 to 1154 in the nucleotide sequence under the number AE000353 U00096 in Genbank, respectively). The b2683 gene is also known as ygaH. The authors of the present invention also found that with an increase in the activity of proteins encoded by the b2682 and b2683 genes, the productivity of strains producing L-amino acids increases. Thus, the present invention has been completed.

Настоящее изобретение включает в себя следующее:
1. Бактерия - продуцент L-аминокислоты, принадлежащая к роду Escherichia, в которой продукция L-аминокислоты упомянутой бактерией увеличена за счет повышения активности белков, описанных в пунктах (А) или (В) и (С) или (D), в клетке упомянутой бактерии:
(A) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 3;
(B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 3, и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к L-аминокислотам и/или их аналогам;
(C) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 5;
(D) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 5, и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к L-аминокислотам и/или их аналогам;
(здесь и далее белки, описанные в вышеупомянутых пунктах (А) или (В) и (С) или (D), упоминаются как "белки согласно настоящему изобретению") (список последовательностей см. в конце описания).The present invention includes the following:
1. A bacterium is an L-amino acid producer belonging to the genus Escherichia, in which the production of an L-amino acid by said bacterium is increased by increasing the activity of the proteins described in points (A) or (B) and (C) or (D) in the cell mentioned bacteria:
(A) a protein that is represented by the amino acid sequence shown in sequence listing number 3;
(B) a protein that is represented by an amino acid sequence including deletions, substitutions, insertions, or the addition of one or more amino acids to the amino acid sequence listed in sequence number 3, and which has an activity that confers bacteria resistance to L-amino acids and / or their analogues;
(C) a protein that is represented by the amino acid sequence shown in the list of sequences at number 5;
(D) a protein that is represented by an amino acid sequence including deletions, substitutions, insertions, or the addition of one or more amino acids to the amino acid sequence listed in sequence number 5, and which has an activity that confers bacteria resistance to L-amino acids and / or their analogues;
(hereinafter, the proteins described in the above paragraphs (A) or (B) and (C) or (D) are referred to as “proteins of the present invention”) (see the list of sequences at the end of the description).

2. Бактерия в соответствии с вышеупомянутой бактерией, в которой активности белков, описанных в пунктах (А) или (В) и (С) или (D), повышены путем трансформации бактерии с помощью ДНК, кодирующей белки, описанные в пунктах (А) или (В) и (С) или (D), или путем изменения регуляции экспрессии нуклеотидной последовательности в хромосоме упомянутой бактерии. 2. A bacterium in accordance with the aforementioned bacterium, in which the activity of the proteins described in points (A) or (B) and (C) or (D) is increased by transforming the bacterium using DNA encoding the proteins described in points (A) or (B) and (C) or (D), or by changing the regulation of expression of the nucleotide sequence in the chromosome of said bacterium.

3. Бактерия в соответствии с вышеупомянутой бактерией, в которой трансформация осуществляется с использованием многокопийного вектора. 3. The bacterium in accordance with the aforementioned bacterium, in which the transformation is carried out using a multi-copy vector.

4. Способ получения L-аминокислоты, включающий выращивание бактерии в соответствии с вышеупомянутой бактерией в питательной среде и сбор из культуральной жидкости полученной и накопленной в ней L-аминокислоты. 4. A method for producing an L-amino acid, comprising growing a bacterium in accordance with the aforementioned bacterium in a nutrient medium and collecting from the culture fluid the obtained and accumulated L-amino acid in it.

5. Способ в соответствии с вышеупомянутым способом, в котором L-аминокислотой является L-треонин. 5. The method in accordance with the above method, in which the L-amino acid is L-threonine.

6. Способ в соответствии с вышеупомянутым способом, в котором у указанной бактерии повышена экспрессия треонинового оперона. 6. A method in accordance with the aforementioned method, wherein said bacterium has increased expression of a threonine operon.

7. Способ в соответствии с вышеупомянутым способом, в котором L-аминокислотой является L-валин. 7. The method in accordance with the above method, in which the L-amino acid is L-valine.

8. Способ в соответствии с вышеупомянутым способом, в котором у указанной бактерии повышена экспрессия генов ilv оперона. 8. The method in accordance with the aforementioned method, wherein said bacterium has increased expression of the ilv operon genes.

9. Способ в соответствии с вышеупомянутым способом, в котором L-аминокислотой является L-пролин. 9. The method in accordance with the above method, in which the L-amino acid is L-proline.

10. Способ в соответствии с вышеупомянутым способом, в котором у указанной бактерии повышена экспрессия генов биосинтеза L-пролина. 10. The method in accordance with the aforementioned method, wherein said bacterium has increased expression of L-proline biosynthesis genes.

11. Способ в соответствии с вышеупомянутым способом, в котором L-аминокислотой является L-лейцин. 11. The method in accordance with the above method, in which the L-amino acid is L-leucine.

12. Способ в соответствии с вышеупомянутым способом, в котором у указанной бактерии повышена экспрессия генов leu оперона. 12. The method in accordance with the aforementioned method, wherein said bacterium has increased expression of the leu operon genes.

13. Способ в соответствии с вышеупомянутым способом, в котором L-аминокислотой является L-метионин. 13. The method in accordance with the above method, in which the L-amino acid is L-methionine.

14. Способ в соответствии с вышеупомянутым способом, в котором у указанной бактерии повышена экспрессия генов met регулона. 14. A method according to the aforementioned method, wherein said bacterium has increased expression of met regulatory genes.

Способ получения L-аминокислоты включает продукцию L-треонина с использованием бактерии - продуцента L-треонина, в которой повышены активности белков согласно настоящему изобретению, например, представленных аминокислотными последовательностями, приведенными под номерами 3 и 5. Также способ получения L-аминокислоты включает продукцию L-валина с использованием бактерии - продуцента L-валина, в которой повышены активности белков согласно настоящему изобретению, например, представленных аминокислотными последовательностями, приведенными под номерами 3 и 5. Кроме того, способ получения L-аминокислоты включает продукцию L-пролина с использованием бактерии - продуцента L-пролина, в которой повышены активности белков согласно настоящему изобретению, например, представленных аминокислотными последовательностями, приведенными под номерами 3 и 5. Далее способ получения L-аминокислоты включает продукцию L-лейцина с использованием бактерии - продуцента L-лейцина, в которой повышены активности белков согласно настоящему изобретению, например, представленных аминокислотными последовательностями, приведенными под номерами 3 и 5. И, наконец, способ получения L-аминокислоты включает продукцию L-метионина с использованием бактерии - продуцента L-метионина, в которой повышены активности белков согласно настоящему изобретению, например, представленных аминокислотными последовательностями, приведенными под номерами 3 и 5. The method for producing L-amino acids includes the production of L-threonine using bacteria-producer of L-threonine, in which the activity of the proteins of the present invention is increased, for example, represented by the amino acid sequences shown under numbers 3 and 5. Also, the method for producing L-amino acids includes the production of L -valine using bacteria-producer of L-valine, in which the activity of proteins according to the present invention is increased, for example, represented by the amino acid sequences shown one with numbers 3 and 5. In addition, the method for producing L-amino acids involves the production of L-proline using bacteria-producer of L-proline, in which the activity of the proteins of the present invention is increased, for example, represented by the amino acid sequences shown under numbers 3 and 5. Further, the method for producing L-amino acids includes the production of L-leucine using bacteria producing L-leucine, in which the activity of the proteins according to the present invention is increased, for example, represented by amino acid sequences The characteristics described below are numbered 3 and 5. And finally, the method for producing L-amino acids involves the production of L-methionine using a bacterium-producer of L-methionine, in which the activity of the proteins of the present invention is increased, for example, represented by the amino acid sequences shown under numbers 3 and 5.

Настоящее изобретение более детально будет описано ниже. The present invention will be described in more detail below.

Вышеуказанной бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия - продуцент L-аминокислоты, принадлежащая к роду Escherichia, в которой продукция L-аминокислоты указанной бактерией увеличена за счет повышения активностей белков согласно настоящему изобретению в клетке бактерии. The aforementioned bacterium according to the present invention is an L-amino acid producing bacterium belonging to the genus Escherichia, in which the production of the L-amino acid by said bacterium is increased by increasing the activity of the proteins of the present invention in a bacterial cell.

Вышеуказанной бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия - продуцент L-аминокислоты, принадлежащая к роду Escherichia и обладающая повышенной активностью белков, которые увеличивают продукцию целевой L-аминокислоты. Конкретно, бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия - продуцент L-аминокислоты, принадлежащая к роду Escherichia и обладающая повышенной активностью белков согласно настоящему изобретению. Более конкретно, бактерия согласно настоящему изобретению содержит ДНК, в которой повышена экспрессия генов b2682 и b2683 на хромосоме ДНК или на плазмиде в бактерии, обладает повышенной способностью к продукции L-аминокислоты, например L-треонина, L-валина, L-пролина, L-лейцина и/или L-метионина. The aforementioned bacterium according to the present invention is an L-amino acid producing bacterium belonging to the genus Escherichia and having increased activity of proteins that increase the production of the target L-amino acid. Specifically, a bacterium according to the present invention is an L-amino acid producing bacterium belonging to the genus Escherichia and having increased activity of the proteins of the present invention. More specifically, the bacterium according to the present invention contains DNA in which the expression of the b2682 and b2683 genes on the DNA chromosome or on the plasmid in bacteria is increased, has an increased ability to produce L-amino acids, for example L-threonine, L-valine, L-proline, L -leucine and / or L-methionine.

К белкам согласно настоящему изобретению относятся белки, описанные в следующих пунктах (А) или (В) и (С) или (D):
(A) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 3;
(B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 3, и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к L-аминокислотам и/или их аналогам;
(C) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 5;
(D) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 5, и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к L-аминокислотам и/или их аналогам.Proteins according to the present invention include proteins described in the following paragraphs (A) or (B) and (C) or (D):
(A) a protein that is represented by the amino acid sequence shown in sequence listing number 3;
(B) a protein that is represented by an amino acid sequence including deletions, substitutions, insertions, or the addition of one or more amino acids to the amino acid sequence listed in sequence number 3, and which has an activity that confers bacteria resistance to L-amino acids and / or their analogues;
(C) a protein that is represented by the amino acid sequence shown in the list of sequences at number 5;
(D) a protein that is represented by an amino acid sequence including deletions, substitutions, insertions, or the addition of one or more amino acids to the amino acid sequence listed in sequence number 5, and which has an activity that confers bacteria resistance to L-amino acids and / or their analogues.

Количество "нескольких" аминокислот различается в зависимости от положения и типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Оно может быть от 2 до 24, предпочтительно от 2 до 12 и более предпочтительно от 2 до 5 для белка (А), и от 2 до 11, предпочтительно от 2 до 7 и более предпочтительно от 2 до 5 для белка (С) соответственно. The number of “several” amino acids varies depending on the position and type of amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein. It can be from 2 to 24, preferably from 2 to 12, and more preferably from 2 to 5 for protein (A), and from 2 to 11, preferably from 2 to 7, and more preferably from 2 to 5 for protein (C), respectively .

Устойчивость к L-аминокислотам и/или их аналогам означает способность бактерии к росту на минимальной питательной среде, содержащей L-аминокислоту и/или ее аналог в концентрации, при которой штамм дикого типа или родительский штамм не может расти, или способность бактерии расти с большей скоростью на питательной среде, содержащей L-аминокислоту и/или ее аналог, чем штамм дикого типа или родительский штамм. Примерами аналогов L-аминокислот являются 3,4-дигидропролин, DL-тиаизолейцин, DL-o-метилсерин, 4-азалейцин, норлейцин, L-o-фторфенилаланин и DL-o-фторфенилаланин. Упомянутая выше концентрация L-аминокислоты и ее аналога варьируется значительно (от 0,5 мкг/мл в случае DL-тиаизолейцина до 9600 мкг/мл в случае DL-o-метилсерина) в зависимости от химической структуры используемого соединения. Например, указанная концентрация составляет обычно от 7 до 70 мкг/мл, предпочтительно от 20 до 25 мкг/мл в случае 3,4-дигидропролина; обычно от 0,5 до 5,0 мкг/мл, предпочтительно от 0,9 до 1,1 мкг/мл в случае DL-тиаизолейцина; обычно от 1100 до 9600 мкг/мл, предпочтительно от 3000 до 3500 мкг/мл в случае DL-o-метилсерина; обычно от 15 до 150 мкг/мл, предпочтительно от 40 до 50 мкг/мл в случае 4-азалейцина; обычно от 150 до 1500 мкг/мл, предпочтительно от 450 до 550 мкг/мл в случае норлейцина; обычно от 0,6 до 6,0 мкг/мл, предпочтительно от 1,5 до 2,0 мкг/мл в случае L-o-фторфенилаланина; обычно от 2 до 20 мкг/мл, предпочтительно от 5 до 7 мкг/мл в случае DL-o-фторфенилаланина. Resistance to L-amino acids and / or their analogs means the ability of a bacterium to grow on a minimum nutrient medium containing L-amino acid and / or its analogue in a concentration at which the wild-type strain or the parent strain cannot grow, or the ability of the bacterium to grow with a greater speed on a nutrient medium containing an L-amino acid and / or its analogue than a wild-type strain or a parent strain. Examples of L-amino acid analogs are 3,4-dihydroproline, DL-thiaisoleucine, DL-o-methylserine, 4-azaleucine, norleucine, L-o-fluorophenylalanine and DL-o-fluorophenylalanine. The above concentration of L-amino acid and its analogue varies significantly (from 0.5 μg / ml in the case of DL-thiaisoleucine to 9600 μg / ml in the case of DL-o-methylserine) depending on the chemical structure of the compound used. For example, the indicated concentration is usually from 7 to 70 μg / ml, preferably from 20 to 25 μg / ml in the case of 3,4-dihydroproline; usually from 0.5 to 5.0 μg / ml, preferably from 0.9 to 1.1 μg / ml in the case of DL-thiaisoleucine; usually from 1100 to 9600 μg / ml, preferably from 3000 to 3500 μg / ml in the case of DL-o-methylserine; usually from 15 to 150 μg / ml, preferably from 40 to 50 μg / ml in the case of 4-azaleucine; usually from 150 to 1500 μg / ml, preferably from 450 to 550 μg / ml in the case of norleucine; usually from 0.6 to 6.0 μg / ml, preferably from 1.5 to 2.0 μg / ml in the case of L-o-fluorophenylalanine; usually from 2 to 20 μg / ml, preferably from 5 to 7 μg / ml in the case of DL-o-fluorophenylalanine.

К бактерии согласно настоящему изобретению также относятся бактерии, в которой активности белков согласно настоящему изобретению повышены путем трансформации бактерии с помощью ДНК, кодирующей белки, описанные в пунктах (А) или (В) и (С) или (D), или путем изменения регуляции экспрессии последовательности указанной ДНК в хромосоме упомянутой бактерии. Bacteria according to the present invention also include bacteria in which the activity of the proteins according to the present invention is increased by transforming the bacterium using DNA encoding the proteins described in points (A) or (B) and (C) or (D), or by changing the regulation expressing the sequence of said DNA on the chromosome of said bacterium.

Упомянутая ДНК, использующаяся для модификации бактерии согласно настоящему изобретению, кодирует, как предполагается, мембранный белок. Конкретно, упомянутая ДНК кодирует белок с 4 или более трансмембранными сегментами. Такая ДНК может кодировать белки, обладающие активностью по экскреции L-аминокислот. Более конкретно, гены b2682 и b2683 являются такой ДНК. Необходимо отметить, что кодирующий участок гена b2682 в области 728-738 и кодирующий участок гена b2683 в области 1-11 перекрываются. Оба гена могут быть получены, например, с помощью ПЦР с использованием затравок с нуклеотидной последовательностью, приведенной под номерами 1 и 2, в виде единственного продукта. Said DNA used to modify the bacterium of the present invention encodes, as expected, a membrane protein. Specifically, said DNA encodes a protein with 4 or more transmembrane segments. Such DNA can encode proteins having L-amino acid excretion activity. More specifically, the b2682 and b2683 genes are such DNA. It should be noted that the coding region of the b2682 gene in the region 728-738 and the coding region of the b2683 gene in the region 1-11 overlap. Both genes can be obtained, for example, by PCR using seeds with the nucleotide sequence shown under numbers 1 and 2, as a single product.

Анализ последовательности полного генома Escherichia coli позволил выбрать гены, кодирующие белки с 4 и более предполагаемыми ТМС. Белки с известной функцией и транспортеры, описанные Paulsen I.T., Sliwinski M.I., Saier M.H. (J.Mol.Biol., 1998, 277, 573) и Linton K.J., Higgins C.F. (Molecular Microbiology, 1998, 28(1), 5), исключили из группы, подлежащей изучению. В результате тщательного отбора среди оставшихся генов были выбраны несколько генов, кодирующих, как предполагалось, мембранные экспортеры. И было обнаружено, что повышенная экспрессия генов b2682 и b2683 увеличивает продукцию L-аминокислот штаммами - продуцентами L-аминокислот. Sequence analysis of the full genome of Escherichia coli allowed us to select genes encoding for proteins with 4 or more putative TMS. Proteins with known function and transporters described by Paulsen I.T., Sliwinski M.I., Saier M.H. (J. Mol. Biol., 1998, 277, 573) and Linton K.J., Higgins C.F. (Molecular Microbiology, 1998, 28 (1), 5), were excluded from the group to be studied. As a result of careful selection, several genes were selected from the remaining genes encoding, as expected, membrane exporters. And it was found that increased expression of the b2682 and b2683 genes increases the production of L-amino acids by strains producing L-amino acids.

К ДНК согласно настоящему изобретению относится ДНК, кодирующая белок, включающий делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в одно или несколько положений белка (А) или (С), при условии, что они не приводят к утрате активности указанного белка. Хотя количество "нескольких" аминокислот различается в зависимости от положения и типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка, оно может быть от 2 до 24, предпочтительно от 2 до 12 и более предпочтительно от 2 до 5 для белка (А) и от 2 до 11, предпочтительно от 2 до 7 и более предпочтительно от 2 до 5 для белка (С) соответственно. ДНК, кодирующая практически такой же белок, как белок, описанный в пунктах (А) и (С), может быть получена, например, путем модификации нуклеотидной последовательности, кодирующей белки, описанные в пунктах (А) и (С), с использованием сайт-направленного мутагенеза таким образом, что один или несколько аминокислотных остатков будут удалены, заменены, введены или добавлены. Модифицированная подобным образом ДНК может быть получена традиционными методами, использующими обработку химическими реагентами и содержание в условиях, вызывающих мутации. К подобного рода обработкам относятся обработка ДНК, кодирующей белки согласно настоящему изобретению, с помощью гидроксиламина или обработка бактерии, содержащей ДНК, с помощью УФ-излучения или химического реагента, такого как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин или азотистая кислота. The DNA of the present invention includes DNA that encodes a protein, including deletions, substitutions, insertions or addition of one or more amino acids to one or more positions of the protein (A) or (C), provided that they do not lead to a loss of activity of the specified protein. Although the number of “several” amino acids varies depending on the position and type of amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein, it can be from 2 to 24, preferably from 2 to 12, and more preferably from 2 to 5 for protein (A) and from 2 to 11 preferably from 2 to 7 and more preferably from 2 to 5 for protein (C), respectively. DNA encoding almost the same protein as the protein described in points (A) and (C) can be obtained, for example, by modifying the nucleotide sequence encoding the proteins described in points (A) and (C) using the site - directed mutagenesis in such a way that one or more amino acid residues are deleted, replaced, introduced or added. DNA modified in this way can be obtained by traditional methods using chemical reagent treatment and content under conditions that cause mutations. Treatments of this kind include treating the DNA encoding the proteins of the present invention with hydroxylamine or treating the bacterium containing the DNA with UV light or a chemical reagent such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine or nitrous acid .

К ДНК согласно настоящему изобретению относятся варианты, которые могут быть найдены в различных штаммах или вариантах бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, ввиду природного разнообразия. ДНК, кодирующая подобные варианты, может быть получена путем выделения ДНК, которая гибридизуется с генами b2682 и b2683 или частью указанных генов в жестких условиях и которая кодирует белок, увеличивающий продукцию L-аминокислот. Термин "жесткие условия", упомянутый здесь, означает условия, при которых образуются так называемые специфические гибриды, а неспецифические не образуются. Например, к жестким условиям относятся условия, при которых гибридизуются ДНК, обладающие высокой степенью гомологии, к примеру ДНК, обладающие гомологией не менее 70% друг относительно друга. В качестве варианта примером жестких условий являются условия, соответствующие условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например 60oС, 1xSSC, 0,1% SDS, предпочтительно O,lxSSC, 0,1% SDS. В качестве зонда для ДНК, кодирующей варианты и гибридизующейся с генами b2682 и b2683, также может быть использована часть нуклеотидной последовательности под номером 3 или номером 5 соответственно. Зонд подобного рода может быть получен в результате ПЦР с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, полученных на основе нуклеотидной последовательности под номером 3 или номером 5, и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность под номером 3 или номером 5, в качестве матрицы. В случае, когда в качестве зонда используется фрагмент ДНК длиной около 300 пар оснований, условия отмывки при гибридизации соответствуют, например, 50oС, 2xSSC и 0,1% SDS.DNA according to the present invention includes variants that can be found in various strains or variants of bacteria belonging to the genus Escherichia, due to natural diversity. DNA encoding such variants can be obtained by isolating DNA that hybridizes with the b2682 and b2683 genes or part of these genes under stringent conditions and which encodes a protein that increases the production of L-amino acids. The term "stringent conditions", referred to here, means the conditions under which the so-called specific hybrids are formed, and non-specific ones are not formed. For example, harsh conditions include conditions under which DNA with a high degree of homology hybridizes, for example, DNA with a homology of at least 70% relative to each other. Alternatively, stringent conditions are exemplified by conditions corresponding to Southern hybridization washing conditions, for example 60 ° C. , 1xSSC, 0.1% SDS, preferably O, lxSSC, 0.1% SDS. As a probe for DNA encoding variants and hybridizing with the b2682 and b2683 genes, a part of the nucleotide sequence numbered 3 or 5, respectively, can also be used. A probe of this kind can be obtained by PCR using as seeds the oligonucleotides obtained on the basis of the nucleotide sequence at number 3 or number 5, and a DNA fragment containing the nucleotide sequence at number 3 or number 5, as a matrix. When a DNA fragment with a length of about 300 base pairs is used as a probe, the washing conditions during hybridization correspond, for example, to 50 ° C, 2xSSC and 0.1% SDS.

Трансформация бактерии с помощью ДНК, кодирующей белок, означает введение указанной ДНК в клетку-бактерию, например, с помощью традиционных методов для того, чтобы усилить экспрессию генов, кодирующих белок согласно настоящему изобретению, и повысить активность белка в клетке-бактерии. Transformation of a bacterium using DNA encoding a protein means introducing said DNA into a bacterial cell, for example, using traditional methods in order to enhance the expression of the genes encoding the protein of the present invention and increase the activity of the protein in the bacterial cell.

К методам увеличения экспрессии генов относятся методы увеличения числа копий гена. Введение гена в вектор, способный к функционированию в бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, увеличивает число копий указанного гена. Для подобных целей могут быть предпочтительно использованы многокопийные векторы. Примерами многокопийных векторов являются pBR322, pMWl19, pUC19, pET22b и подобные им. Methods for increasing gene expression include methods for increasing the number of copies of a gene. The introduction of a gene into a vector capable of functioning in bacteria belonging to the genus Escherichia increases the number of copies of the specified gene. For such purposes, multi-copy vectors can preferably be used. Examples of multi-copy vectors are pBR322, pMWl19, pUC19, pET22b and the like.

Кроме того, усиление экспрессии гена может быть достигнуто путем введения некоторого числа копий гена в бактериальную хромосому, например, методом гомологичной рекомбинации или подобным. In addition, enhancing gene expression can be achieved by introducing a certain number of copies of the gene into the bacterial chromosome, for example, by homologous recombination or the like.

В случае, когда добиваются усиления экспрессии двух или более генов, указанные гены могут быть расположены вместе на одной и той же плазмиде или раздельно на различных плазмидах. Также допустимо, чтобы одни из генов располагались в хромосоме, а другие гены располагались на плазмиде. In the case when they achieve enhanced expression of two or more genes, these genes can be located together on the same plasmid or separately on different plasmids. It is also permissible that some of the genes are located on the chromosome, and other genes are located on the plasmid.

С другой стороны, усиление экспрессии генов может быть достигнуто помещением ДНК согласно настоящему изобретению под контроль сильного промотора. Например, в качестве сильных промоторов известны lac промотор, trp промотор, trc промотор, PL и PR промоторы фага лямбда. Использование сильного промотора может быть совмещено с увеличением числа копий гена.Alternatively, increased gene expression can be achieved by placing the DNA of the present invention under the control of a strong promoter. For example, lac promoter, trp promoter, trc promoter, P L and P R lambda phage promoters are known as strong promoters. Using a strong promoter can be combined with an increase in the number of copies of the gene.

Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения вышеуказанных ДНК в бактерию, уже обладающую способностью к продукции L-аминокислоты. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей указанные ДНК, способности к продукции L-аминокислоты. В качестве родительских штаммов, в которых активности белков согласно настоящему изобретению будут повышены, могут быть использованы бактерии - продуценты L-треонина, принадлежащие к роду Escherichia, такие как VL2054 (ВКПМ В-8067), ВНИИГенетика 472Т23 (патент США 5631157), ВКПМ В-3996 (патенты США 5175107 и 5976843), КССМ-10132 (WО 009660 A1), КССМ-10133 (WО 009661 A1) или подобные им. Также в качестве родительских штаммов, в которых активности белков согласно настоящему изобретению будут повышены, могут быть использованы бактерии - продуценты L-валина, принадлежащие к роду Escherichia, такие как Н-81 (ВКПМ В-8066), NRRL В-12287 и NRRL В-12288 (патент США 4391907), ВКПМ В-4411 (патент США 5658766), ВКПМ В-7707 (европейская патентная заявка ЕР 1016710 А2) или подобные им. Кроме того, в качестве родительских штаммов, в которых активности белков согласно настоящему изобретению будут повышены, могут быть использованы бактерии - продуценты L-пролина, принадлежащие к роду Escherichia, такие как NRRL В-12403 и NRRL В-12404 (патент Великобритании GB 2075056), ВКПМ В-8012 (Российская патентная заявка 2000124295), мутанты, содержащие плазмиды, описанные в патенте Германии DE 3127361, мутанты, содержащие плазмиды, описанные в Bloom F. R. et al (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34) и подобные им. Также в качестве родительских штаммов, в которых активности белков согласно настоящему изобретению будут повышены, могут быть использованы бактерии - продуценты L-лейцина, принадлежащие к роду Escherichia, такие как Н-9070 (FERM ВР-4704) и Н-9072 (FERM ВР-4706) (патент США 5744331), ВКПМ В-7386 и ВКПМ В-7388 (патент РФ 2140450), W1485atpA401/pMWdAR6, W1485lip2/pMWdAR6 и AJ12631/pMWdAR6 (Европейский патент 0872547) или подобные им. И, наконец, в качестве родительских штаммов, в которых активности белков согласно настоящему изобретению будут повышены, могут быть использованы бактерии - продуценты L-метионина, принадлежащие к роду Escherichia, такие как АJ 11539 (NRRL В-12399), АJ 11540 (NRRL В-12400), АJ 11541 (NRRL В-12401), АJ 11542 (NRRL В-12402) (патент Великобритании GB 2075055) или подобные им.The bacterium according to the present invention can be obtained by introducing the above DNA into a bacterium already possessing the ability to produce L-amino acids. On the other hand, a bacterium according to the present invention can be obtained by giving the bacterium already containing said DNA the ability to produce L-amino acids. As parent strains in which the activity of the proteins according to the present invention will be increased, bacteria producing L-threonine belonging to the genus Escherichia can be used, such as VL2054 (VKPM B-8067), VNII Genetika 472T23 (US patent 5631157), VKPM B -3996 (US patents 5175107 and 5976843), KSSM-10132 (WO 009660 A1), KSSM-10133 (WO 009661 A1) or the like. Also, as parental strains in which the activity of the proteins of the present invention will be increased, bacteria producing L-valine belonging to the genus Escherichia, such as H-81 (VKPM B-8066), NRRL B-12287 and NRRL B, can be used -12288 (US patent 4391907), VKPM B-4411 (US patent 5658766), VKPM B-7707 (European patent application EP 1016710 A2) or the like. In addition, as parent strains in which the activity of the proteins of the present invention will be enhanced, bacteria producing L-proline belonging to the genus Escherichia, such as NRRL B-12403 and NRRL B-12404 (GB Patent GB 2075056) can be used. VKPM B-8012 (Russian Patent Application 2000124295), mutants containing the plasmids described in German Patent DE 3127361, mutants containing the plasmids described in Bloom FR et al (The 15 th Miami winter symposium, 1983, p. 34) and like them. Also, as parental strains in which the activity of the proteins of the present invention will be increased, bacteria producing L-leucine belonging to the genus Escherichia, such as H-9070 (FERM BP-4704) and H-9072 (FERM BP- 4706) (US patent 5744331), VKPM B-7386 and VKPM B-7388 (RF patent 2140450), W1485atpA401 / pMWdAR6, W1485lip2 / pMWdAR6 and AJ12631 / pMWdAR6 (European patent 0872547) or the like. And finally, as parental strains in which the activity of the proteins of the present invention will be increased, bacteria producing L-methionine belonging to the genus Escherichia, such as AJ 11539 (NRRL B-12399), AJ 11540 (NRRL B, can be used) -12400), AJ 11541 (NRRL B-12401), AJ 11542 (NRRL B-12402) (GB Patent GB 2075055) or the like.

В бактерии согласно настоящему изобретению в дальнейшем может быть усилена экспрессия одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-аминокислот. Примерами таких генов для бактерии - продуцента L-треонина являются гены треонинового оперона, предпочтительно ген, кодирующий аспартаткиназу - гомосериндегидрогеназу, чувствительность к ингибированию L-треонином по типу обратной связи в которой утрачена (патент Японии 1-29559). Примерами таких генов для бактерии - продуцента L-валина являются гены оперона ilvGMEDA, в котором предпочтительно не экспрессируется треониндезаминаза и аттенуация которого подавлена (выложенная патентная заявка Японии 8-47397). Примерами таких генов для бактерии - продуцента L-пролина являются гены биосинтеза пролина, предпочтительно ген рrоВ, кодирующий глутаматкиназу, чувствительность к ингибированию L-пролином по типу обратной связи в которой утрачена (патент Германии DЕ 3127361). Также примерами таких генов для бактерии - продуцента L-лейцина являются гены лейцинового оперона, leu оперона, предпочтительно ген, кодирующий изопропилмалатсинтазу, чувствительность к ингибированию L-лейцином по типу обратной связи в которой утрачена (Российская патентная заявка 99114325). Также примерами таких генов для бактерии - продуцента L-метионина являются гены метионинового регулона. Указанный метиониновый регулон может содержать мутантные гены, кодирующие белки с пониженной активностью в репрессии биосинтеза аминокислоты. Примером такого гена является вариантный тип гена metJ из E.coli, кодирующий репрессор биосинтеза L-метионина, активность которого в репрессии биосинтеза L-метионина понижена (выложенная патентная заявка Японии JP 2000157267 A2). In the bacteria of the present invention, expression of one or more genes involved in the L-amino acid biosynthesis can be further enhanced. Examples of such genes for a bacterium producing L-threonine are the genes of a threonine operon, preferably a gene encoding aspartate kinase homoserine dehydrogenase, the sensitivity of which is lost to feedback by L-threonine inhibition (Japanese Patent 1-29559). Examples of such genes for an L-valine producing bacterium are the ilvGMEDA operon genes, in which threonine deaminase is preferably not expressed and whose attenuation is suppressed (Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-47397). Examples of such genes for a bacterium producing L-proline are proline biosynthesis genes, preferably a pRoB gene encoding glutamate kinase, which has lost its sensitivity to L-proline inhibition by feedback type (German patent DE 3127361). Also examples of such genes for the bacterium producing L-leucine are the genes of the leucine operon, the leu operon, preferably a gene encoding isopropyl malate synthase, which lost feedback sensitivity with L-leucine (Russian Patent Application 99114325). Also examples of such genes for bacteria producing L-methionine are methionine regulon genes. The specified methionine regulon may contain mutant genes encoding proteins with reduced activity in the repression of amino acid biosynthesis. An example of such a gene is a variant type of metJ gene from E. coli encoding a L-methionine biosynthesis repressor whose activity in the repression of L-methionine biosynthesis is reduced (Japanese Patent Application Laid-Open JP 2000157267 A2).

К способам согласно настоящему изобретению относится способ продукции L-треонина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-треонина в указанной питательной среде и сбора L-треонина из культуральной жидкости. Также к способам согласно настоящему изобретению относится способ продукции L-валина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-валина в указанной питательной среде и сбора L-валина из культуральной жидкости. Кроме того, к способам согласно настоящему изобретению относится способ продукции L-пролина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-пролина в указанной питательной среде и сбора L-пролина из культуральной жидкости. Также к способам согласно настоящему изобретению относится способ продукции L-лейцина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-лейцина в указанной питательной среде и сбора L-лейцина из культуральной жидкости. И, наконец, к способам согласно настоящему изобретению относится способ продукции L-метионина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-метионина в указанной питательной среде и сбора L-метионина из культуральной жидкости. The methods of the present invention include a method for producing L-threonine, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a culture medium for the purpose of producing and accumulating L-threonine in said culture medium and collecting L-threonine from the culture fluid. Also included in the methods of the present invention is a method of producing L-valine, comprising the steps of growing a bacterium of the present invention in a culture medium to produce and store L-valine in said culture medium and collect L-valine from the culture fluid. In addition, the methods according to the present invention relates to a method for producing L-proline, which includes the steps of growing the bacteria according to the present invention in a culture medium for the purpose of production and accumulation of L-proline in said culture medium and collecting L-proline from the culture fluid. Also included in the methods of the present invention is a method for producing L-leucine, comprising the steps of growing the bacterium of the present invention in a culture medium to produce and store L-leucine in said culture medium and collect L-leucine from the culture fluid. And finally, to the methods according to the present invention relates to a method for producing L-methionine, which includes the steps of growing the bacteria according to the present invention in a nutrient medium in order to produce and accumulate L-methionine in the specified medium and collect L-methionine from the culture fluid.

Согласно настоящему изобретению выращивание, сбор и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием микроорганизма. Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, которые требуются микроорганизму для роста. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, и различные органические кислоты. В зависимости от степени ассимиляции используемого микроорганизма могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов и ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок используются монофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные соединения. According to the present invention, the cultivation, collection and purification of an L-amino acid from a culture or similar liquid may be carried out in a manner similar to traditional fermentation methods in which the amino acid is produced using a microorganism. The nutrient medium used for growing can be either synthetic or natural, provided that the medium contains sources of carbon, nitrogen, mineral additives and, if necessary, the appropriate amount of nutrient additives that the microorganism needs for growth. Carbon sources include various carbohydrates, such as glucose and sucrose, and various organic acids. Depending on the degree of assimilation of the microorganism used, alcohols such as ethanol and glycerin may be used. Various ammonium salts, such as ammonia and ammonium sulfate, other nitrogen compounds, such as amines, natural nitrogen sources, such as peptone, soybean hydrolyzate, and microorganism fermentolizate, can be used as a nitrogen source. As mineral additives, potassium monophosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, iron sulfate, manganese sulfate, calcium chloride and the like are used.

Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание, ферментация с аэрацией, при температуре от 20 до 40oС, предпочтительно от 30 до 38oС. рН питательной среды находится в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6,5 до 7,2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.The cultivation is preferably carried out under aerobic conditions, such as stirring, fermentation with aeration, at a temperature of from 20 to 40 o C, preferably from 30 to 38 o C. the pH of the nutrient medium is in the range from 5 to 9, preferably from 6.5 to 7 , 2. The pH of the medium can be adjusted by ammonia, calcium carbonate, various acids, bases and buffers. Typically, growing for 1 to 5 days leads to the accumulation of the target L-amino acid in the culture fluid.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем целевая L-аминокислота может быть собрана и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации. After cultivation, solid residues, such as cells, can be removed from the culture fluid by centrifugation or filtration through a membrane, and then the target L-amino acid can be collected and purified by ion exchange chromatography, concentration and crystallization.

На чертеже показана схема конструирования плазмиды pΔlacZ. The drawing shows the construction scheme of the plasmid pΔlacZ.

Наилучший способ осуществления изобретения
Настоящее изобретение более детально описано со ссылкой на примеры. В указанных примерах аминокислоты являются аминокислотами L-конфигурации, если не указано иное.BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present invention is described in more detail with reference to examples. In these examples, amino acids are amino acids of the L configuration, unless otherwise indicated.

Пример 1. Клонирование генов b2682 и b2683 на плазмиде pΔlacZ. Example 1. Cloning of the b2682 and b2683 genes on plasmid pΔlacZ.

Для клонирования генов b2682 и b2683 был использован вектор pΔlacZ. Вектор pΔlacZ является производным вектора pET-22b(+) (Novagen, Madison, WI, USA). Вектор pET-22b(+) был обработан рестриктазами BglII и XbaI и лигирован с фрагментом полимеразной цепной реакции (ПЦР), полученным на плазмиде рМВ9-lас (Fuller F., Gene, 19, 43-54, 1982), обработанным теми же рестриктазами, и содержащим промотор PlacUV5. Для амплификации с помощью ПЦР фрагмента с промотором PlacUV5 использовались затравки, приведенные под номерами 7 и 8. В полученную плазмиду была вставлена структурная часть гена lacZ (237 пар оснований без промотора) путем клонирования SalI-BamHI фрагмента плазмиды pJEL250 (Дымакова Е. и др.. Генетика, 35, 2, 181-186, 1999). Схема конструкции вектора pΔlacZ показана на чертеже.For cloning the b2682 and b2683 genes, the pΔlacZ vector was used. The pΔlacZ vector is a derivative of the pET-22b (+) vector (Novagen, Madison, WI, USA). The vector pET-22b (+) was digested with restriction enzymes BglII and XbaI and ligated with a fragment of the polymerase chain reaction (PCR) obtained on plasmid pMB9-lac (Fuller F., Gene, 19, 43-54, 1982), treated with the same restriction enzymes , and containing the promoter P lac UV5. For amplification by PCR fragment with the P lac UV5 promoter, the seeds were used, numbered 7 and 8. The structural part of the lacZ gene (237 base pairs without promoter) was inserted into the obtained plasmid by cloning the SalI-BamHI fragment of plasmid pJEL250 (E. Dymakova and dr. Genetics, 35, 2, 181-186, 1999). The design scheme of the vector pΔlacZ is shown in the drawing.

Исходным материалом для клонирования предполагаемых рамок считывания b2682 и b2683 из Е.coli (генов b2682 и b2683) был фрагмент ПЦР, полученный с использованием ДНК из штамма Е. coli TG1 в качестве матрицы. Для синтеза этого фрагмента были использованы две затравки, нуклеотидная последовательность которых приведена под номерами 1 и 2. ПЦР осуществлялась на "Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400" в следующих условиях: 40 секунд при 95oС, 40 секунд при 47oС, 40 секунд при 72oС, 30 циклов. Таким образом был получен линейный фрагмент ДНК длиной 1158 пар оснований, содержащий гены b2682 и b2683. Данный фрагмент ПЦР был обработан рестриктазами ХbaI и ВаmHI и введен в многокопийный вектор pΔlacZ, предварительно обработанный теми же рестриктазами.The starting material for cloning the putative reading frames b2682 and b2683 from E. coli (genes b2682 and b2683) was a PCR fragment obtained using DNA from E. coli TG1 strain as a template. For the synthesis of this fragment, two seeds were used, the nucleotide sequence of which is given as numbers 1 and 2. PCR was performed on a Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400 under the following conditions: 40 seconds at 95 ° C, 40 seconds at 47 ° C, 40 seconds at 72 o C, 30 cycles. Thus, a linear DNA fragment of 1,158 base pairs in length containing the b2682 and b2683 genes was obtained. This PCR fragment was digested with restriction enzymes XbaI and BamHI and introduced into the multiple copy vector pΔlacZ, pretreated with the same restriction enzymes.

Полученная плазмида, содержащая фрагмент ПЦР, была названа как pYGAZH и содержала гены b2682 и b2683 под контролем лактозного промотора (PlacUV5).The resulting plasmid containing the PCR fragment was named pYGAZH and the like contained b2682 and b2683 genes under the control of the lactose promoter (P lac UV5).

Пример 2. Влияние амплифицированных генов b2682 и b2683 на устойчивость штамма Е.coli TG1 к аминокислотам и их аналогам. Example 2. The effect of amplified genes b2682 and b2683 on the resistance of E. coli TG1 strain to amino acids and their analogues.

Штамм Е. coli TG1 (pYGAZH) и штамм Е.coli TG1, содержащий вектор без вставки (контрольный штамм), выращивались в течение ночи в среде LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ночные культуры всех штаммов были разбавлены в 25 раз свежей средой LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и ИПТГ (0,5 мМ), и инкубировались в течение 2 часов при 37oС с аэрацией. Культуры в фазе логарифмического роста были разбавлены 0,9%-ным раствором хлорида натрия и около 1000 клеток были высеяны на чашки с твердой питательной средой Адамса, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), ИПТГ (0,5 мМ) и аминокислоту или ее аналог. После 2-4 дней инкубации при 37oС определялись различия в размере колоний или их числе между штаммом TG1, содержащим гибридную плазмиду, и контрольньм штаммом TG1. Результаты экспериментов представлены в таблице 1.The E. coli TG1 strain (pYGAZH) and the E. coli TG1 strain containing the vector without insertion (control strain) were grown overnight in LB medium containing ampicillin (100 μg / ml). The overnight cultures of all strains were diluted 25 times with fresh LB medium containing ampicillin (100 μg / ml) and IPTG (0.5 mM), and were incubated for 2 hours at 37 ° C with aeration. The cultures in the logarithmic growth phase were diluted with a 0.9% sodium chloride solution and about 1000 cells were plated on plates with Adams solid nutrient medium containing ampicillin (100 μg / ml), IPTG (0.5 mM) and an amino acid or its analogue. After 2-4 days of incubation at 37 ° C. , differences in the size of the colonies or their number between the strain TG1 containing the hybrid plasmid and the control strain TG1 were determined. The experimental results are presented in table 1.

Пример 3. Продукция треонина штаммом, содержащим плазмиду pYGAZH. Example 3. Production of threonine by a strain containing the plasmid pYGAZH.

Штамм VL2054 - продуцент треонина был трансформирован плазмидой pYGAZH, содержащей гены b2682 и b2683 под контролем промотора PlacUV5. Полученный штамм был назван VL2054(pYGAZH). Штамм VL2054 является производным штамма ВКПМ В-3996 и содержит на хромосоме:
а) интегрированный треониновый оперон под контролем промотора PR;
б) нативный ген rhtA;
в) инактивированный хромосомный ген, кодирующий треониндегидрогеназу (ген tdh), и инактивированный ген устойчивости к канамицину (ген kan) в Тn5 (tdh::Tn5,Kans);
г) мутацию ilvA442.The strain VL2054 - producing threonine was transformed with plasmid pYGAZH, containing genes b2682 and b2683 under the control of the promoter P lac UV5. The resulting strain was named VL2054 (pYGAZH). Strain VL2054 is a derivative of the strain VKPM B-3996 and contains on the chromosome:
a) an integrated threonine operon under the control of the promoter P R ;
b) native rhtA gene;
c) inactivated chromosomal gene encoding threonine dehydrogenase (tdh gene) and inactivated kanamycin resistance gene (kan gene) in Tn5 (tdh :: Tn5, Kan s );
d) mutation ilvA 442 .

Штамм VL2054 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 30 января 2001 года под инвентарньм номером ВКПМ В-8067. Strain VL2054 was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 113545 Moscow, 1st Dorozhniy proezd, 1) on January 30, 2001 under inventory number VKPM B-8067.

5 колоний каждого из штаммов VL2054, VL2054(pΔlacZ) в качестве контрольного штамма, содержащего плазмиду без вставки, и VL2054(pYGAZH) были суспендированы в 2 мл минимальной питательной среды ((NH4)2SО4 - 11 г/л, NaCl - 0,4 г/л, MgSО4 - 0,4 г/л, К2НРО4 - 1 г/л, FeSО4 - 10 мг/л, MnSО4 - 10 мг/л, тиамин - 0,1 мг/л, дрожжевой экстракт - 0,5 г/л, глюкоза - 40 г/л, ампициллин - 300 мг/л, если необходимо) в 20 мл пробирках и инкубировались в течение ночи с аэрацией при 32oС. 0,2 мл каждой ночной культуры были перенесены в три 20 мл пробирки с 2 мл свежей среды для ферментации с или без ИПТГ и выращивались при 32oС в течение 48 или 72 часов на роторной качалке.5 colonies of each of the strains VL2054, VL2054 (pΔlacZ) as a control strain containing a plasmid without insert, and VL2054 (pYGAZH) were suspended in 2 ml of minimal nutrient medium ((NH 4 ) 2 SO 4 - 11 g / l, NaCl - 0.4 g / l, MgSO 4 - 0.4 g / l, K 2 NRA 4 - 1 g / l, FeSO 4 - 10 mg / l, MnSO 4 - 10 mg / l, thiamine - 0.1 mg / l, yeast extract - 0.5 g / l, glucose - 40 g / l, ampicillin - 300 mg / l, if necessary) in 20 ml tubes and incubated overnight with aeration at 32 o C. 0.2 ml each overnight cultures were transferred to three 20 ml tubes with 2 ml of fresh fermentation medium with or without IPTG and grown at 32 o C for 48 or 72 hours on a rotary rocking chair.

Состав среды для ферментации:
(NH4)2SО4 - 22 г/л
NaCl - 0,8 г/л
MgSО4 - 0,8 г/л
К2НРО4 - 2,0 г/л
FeSО4 - 20 мг/л
MnSО4 - 20 мг/л
Тиамин - 0,2 мг/л
Дрожжевой экстракт - 1,0 г/л
СаСО3 - 30 г/л
Глюкоза - 80 г/л
Ампициллин - 300 мг/л, если необходимо
ИПТГ - 0,5 мМ, если необходимо
После выращивания стабильность плазмиды и оптическая плотность культуральной жидкости при 540 нм были определены традиционными методами. Накопленное в культуральной жидкости количество треонина было определено с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ). Состав подвижной фазы для ТСХ следующий: изопропанол - 50 мл, ацетон - 50 мл, NH4ОH (30%) - 12 мл, Н2О - 8 мл. Результаты приведены в таблице 2. Как видно, гибридная плазмида pYGAZH увеличивала накопление треонина штаммом VL2054 - продуцентом треонина.The composition of the medium for fermentation:
(NH 4 ) 2 SO 4 - 22 g / l
NaCl - 0.8 g / l
MgSO 4 - 0.8 g / l
K 2 NRA 4 - 2.0 g / l
FeSO 4 - 20 mg / l
MnSO 4 - 20 mg / l
Thiamine - 0.2 mg / L
Yeast extract - 1.0 g / l
CaCO 3 - 30 g / l
Glucose - 80 g / l
Ampicillin - 300 mg / l, if necessary
IPTG - 0.5 mm, if necessary
After cultivation, plasmid stability and optical density of the culture fluid at 540 nm were determined by conventional methods. The amount of threonine accumulated in the culture fluid was determined by thin layer chromatography (TLC). The composition of the mobile phase for TLC is as follows: isopropanol - 50 ml, acetone - 50 ml, NH 4 OH (30%) - 12 ml, H 2 O - 8 ml. The results are shown in Table 2. As can be seen, the hybrid plasmid pYGAZH increased the accumulation of threonine by strain VL2054, a producer of threonine.

Пример 4. Продукция валина штаммом, содержащим плазмиду pYGAZH. Example 4. Production of valine by a strain containing the plasmid pYGAZH.

Штамм Н-81 - продуцент валина был трансформирован плазмидой pYGAZH, содержащей гены b2682 и b2683 под контролем промотора PlacUV5.The strain H-81 - valine producer was transformed with the plasmid pYGAZH, comprising b2682 and b2683 genes under the control of promoter P lac UV5.

Штамм Н-81 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 30 января 2001 года под инвентарньм номером ВКПМ В-8066. Strain N-81 was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russia, 113545 Moscow, 1st Dorozhniy proezd, 1) on January 30, 2001 under inventory number VKPM B-8066.

5 колоний каждого из штаммов Н-18, H-81(pΔlacZ) в качестве контрольного штамма, содержащего плазмиду без вставки, и Н-81 (pYGAZH) были суспендированы в 2 мл минимальной питательной среды ((NH4)2SО4 - 18 г/л, K2HPО4 - 1,8 г/л, MgSО4 - 1,2 г/л, тиамин - 0,1 мг/л, дрожжевой экстракт - 0,5 г/л, глюкоза - 60 г/л, ампициллин - 300 мг/л, если необходимо) в 20 мл пробирках и инкубировались в течение ночи с аэрацией при 32oС. 0,2 мл каждой ночной культуры были перенесены в три 20 мл пробирки с 2 мл свежей среды для ферментации с или без ИПТГ и выращивались при 32oС в течение 48 или 72 часов на роторной качалке.5 colonies of each of the strains H-18, H-81 (pΔlacZ) as a control strain containing the plasmid without insert, and H-81 (pYGAZH) were suspended in 2 ml of minimal nutrient medium ((NH 4 ) 2 SO 4 - 18 g / l, K 2 HPO 4 - 1.8 g / l, MgSO 4 - 1.2 g / l, thiamine - 0.1 mg / l, yeast extract - 0.5 g / l, glucose - 60 g / l, ampicillin - 300 mg / l, if necessary) in 20 ml tubes and incubated overnight with aeration at 32 o C. 0.2 ml of each overnight culture were transferred to three 20 ml tubes with 2 ml of fresh medium for fermentation with or without IPTG and cultivated at 32 o C for 48 or 72 hours on a rotary rocking.

Состав среды для ферментации:
(NH4)2SО4 - 18 г/л
К2НРО4 - 1,8 г/л
MgSО4 - 1,2 г/л
СаСО3 - 20 г/л
Тиамин - 0,1 мг/л
Глюкоза - 60 г/л
Ампициллин - 300 мг/л, если необходимо
ИПТГ - 0,5 мМ, если необходимо
После выращивания стабильность плазмиды и оптическая плотность культуральной жидкости при 540 нм были определены традиционными методами. Накопленное в культуральной жидкости количество валина было определено с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ). Состав подвижной фазы для ТСХ следующий: изопропанол - 80 мл, этилацетат - 80 мл, NH4ОH (30%) - 15 мл, Н2О - 45 мл. Результаты приведены в таблице 3. Как видно, гибридная плазмида pYGAZH увеличивала накопление валина штаммом Н-81 - продуцентом валина.The composition of the medium for fermentation:
(NH 4 ) 2 SO 4 - 18 g / l
K 2 NRA 4 - 1.8 g / l
MgSO 4 - 1.2 g / l
CaCO 3 - 20 g / l
Thiamine - 0.1 mg / L
Glucose - 60 g / l
Ampicillin - 300 mg / l, if necessary
IPTG - 0.5 mm, if necessary
After cultivation, plasmid stability and optical density of the culture fluid at 540 nm were determined by conventional methods. The amount of valine accumulated in the culture fluid was determined by thin layer chromatography (TLC). The composition of the mobile phase for TLC is as follows: isopropanol - 80 ml, ethyl acetate - 80 ml, NH 4 OH (30%) - 15 ml, H 2 O - 45 ml. The results are shown in Table 3. As can be seen, the hybrid plasmid pYGAZH increased the accumulation of valine by strain H-81, the producer of valine.

Клетки природного штамма Е.coli К12 (ВКПМ В-7) были обработаны мутагеном, N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином (0,1 мг/мл), в течение 20 минут при 37oС, отмыты и помещены на минимальную агаризованную среду М9, дополненную 1,25 мг/мл триптона, 10 мг/мл L-пролина и 0,05 мг/мл хлорида 2,3,5-трифенилтетразолина. Большинство колоний, выросших после 3 дней инкубации при 37oС, были окрашены красным. Несколько колоний, не способных окислять L-пролин, были белыми. Одна из этих колоний была использована в качестве исходной для получения мутантов, устойчивых к аналогам пролина (3,4-дегидроксипролин и азетидин-2-карбоксилат), каждый из которых был добавлен в агаризованную среду М9 в концентрации 2 мг/мл.Cells of the natural E. coli K12 strain (VKPM B-7) were treated with mutagen, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (0.1 mg / ml), for 20 minutes at 37 ° C, washed and placed on the minimum agar medium M9 supplemented with 1.25 mg / ml tryptone, 10 mg / ml L-proline and 0.05 mg / ml 2,3,5-triphenyltetrazoline chloride. Most colonies grown after 3 days of incubation at 37 ° C were stained red. Several colonies incapable of oxidizing L-proline were white. One of these colonies was used as the starting one to obtain mutants resistant to proline analogs (3,4-dehydroxyproline and azetidine-2-carboxylate), each of which was added to the M9 agar medium at a concentration of 2 mg / ml.

Некоторые из выросших мутантов могли продуцировать L-пролин. Наилучший продуцент L-пролина 702 был обработан бактериофагом Р1, выращенным на клетках штамма TG1, в котором ген ilvA был разрушен путем вставки гена устойчивости (Cmr) к хлорамфениколу (Cm). Один из устойчивых к Cm трансдуктантов, 702ilvA, который стал ауксотрофным по L-изолейцину, был гораздо более эффективным продуцентом L-пролина, чем исходный прототрофный по L-изолейцину штамм 702 (таблица 4). Питательная среда для ферментации содержала 60 г/л глюкозы, 25 г/л (NH4)2SО4, 2 г/л КН2РО4, 1 г/л MgSО4, 0,1 мг/л тиамина, 50 мг/л L-изолейцина и 25 г/л мела (рН 7,2). Глюкоза и мел были стерилизованы раздельно. 2 Мл питательной среды были помещены в пробирки и инокулированы одной петлей исследуемых микроорганизмов, затем выращивание производилось при 37oС в течение 2 дней на качалке.Some of the grown mutants could produce L-proline. The best producer of L-proline 702 was treated with bacteriophage P1 grown on cells of strain TG1 in which the ilvA gene was destroyed by inserting the resistance gene (Cm r ) to chloramphenicol (Cm). One of the Cm-resistant transductants, 702ilvA, which became L-isoleucine auxotrophic, was a much more effective producer of L-proline than the initial L-isoleucine prototrophic strain 702 (Table 4). The fermentation medium contained 60 g / l glucose, 25 g / l (NH 4 ) 2 SO 4 , 2 g / l KH 2 PO 4 , 1 g / l MgSO 4 , 0.1 mg / l thiamine, 50 mg / l of L-isoleucine and 25 g / l of chalk (pH 7.2). Glucose and chalk were sterilized separately. 2 ml of the nutrient medium were placed in test tubes and inoculated with one loop of the studied microorganisms, then the cultivation was carried out at 37 o C for 2 days on a rocking chair.

Штаммы 702 и 702ilvA были депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) 25 июля 2000 г. под инвентарньми номерами ВКПМ В-8011 и ВКПМ В-8012 соответственно. Strains 702 and 702ilvA were deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) on July 25, 2000 under inventory numbers VKPM V-8011 and VKPM V-8012, respectively.

Пример 5. Продукция пролина штаммом, содержащим плазмиду pYGAZH. Example 5. The production of proline strain containing the plasmid pYGAZH.

Штамм E. coli 702ilvA - продуцент пролина был трансформирован плазмидой pYGAZH, содержащей гены b2682 и b2683 под контролем промотора PlacUV5.The strain E. coli 702ilvA - producing proline was transformed with the plasmid pYGAZH, comprising b2682 and b2683 genes under the control of promoter P lac UV5.

5 колоний каждого из штаммов 702ilvA, 702ilvA (pΔlacZ) в качестве контрольного штамма, содержащего плазмиду без вставки, и 702ilvA(pYGAZH) были суспендированы в 2 мл минимальной питательной среды ((NH4)2SO4 - 18 г/л, К2НРО4 - 1,8 г/л, MgSО4 - 1,2 г/л, тиамин - 0,1 мг/л, дрожжевой экстракт - 0,5 г/л, глюкоза - 60 г/л, изолейцин - 50 мг/л, ампициллин - 300 мг/л, если необходимо) в 20 мл пробирках и инкубировались в течение ночи с аэрацией при 32oС. 0,2 мл каждой ночной культуры были перенесены в три 20 мл пробирки с 2 мл свежей среды для ферментации с или без ИПТГ и выращивались при 32oС в течение 40 часов на роторной качалке.5 colonies of each of the strains 702ilvA, 702ilvA (pΔlacZ) as a control strain containing the plasmid without insertion, and 702ilvA (pYGAZH) were suspended in 2 ml of minimal nutrient medium ((NH 4 ) 2 SO 4 - 18 g / l, K 2 NRA 4 - 1.8 g / l, MgSO 4 - 1.2 g / l, thiamine - 0.1 mg / l, yeast extract - 0.5 g / l, glucose - 60 g / l, isoleucine - 50 mg / l, ampicillin - 300 mg / l, if necessary) in 20 ml tubes and incubated overnight with aeration at 32 o C. 0.2 ml of each overnight culture were transferred to three 20 ml tubes with 2 ml of fresh fermentation medium with or without IPTG and grown at 32 o C for 40 hours on a rotary rocking chair.

Состав среды для ферментации:
(NH4)2SО4 - 18 г/л
К2НРО4 - 1,8 г/л
MgSО4 - 1,2 г/л
СаСО3 - 20 г/л
Тиамин - 0,1 мг/л
Глюкоза - 60 г/л
Изолейцин - 50 мг/л
Ампициллин - 300 мг/л, если необходимо
ИПТГ - 0,5 мМ, если необходимо
После выращивания стабильность плазмиды и оптическая плотность культуральной жидкости при 540 нм были определены традиционными методами. Накопленное в культуральной жидкости количество пролина было определено с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ). Состав подвижной фазы для ТСХ следующий: этанол - 80 мл, NH4OH (30%) - 5 мл, Н2О - 25 мл. Результаты приведены в таблице 5. Как видно, гибридная плазмида pYGAZH увеличивала накопление пролина штаммом 702ilvA - продуцентом пролина.The composition of the medium for fermentation:
(NH 4 ) 2 SO 4 - 18 g / l
K 2 NRA 4 - 1.8 g / l
MgSO 4 - 1.2 g / l
CaCO 3 - 20 g / l
Thiamine - 0.1 mg / L
Glucose - 60 g / l
Isoleucine - 50 mg / L
Ampicillin - 300 mg / l, if necessary
IPTG - 0.5 mm, if necessary
After cultivation, plasmid stability and optical density of the culture fluid at 540 nm were determined by conventional methods. The amount of proline accumulated in the culture fluid was determined by thin layer chromatography (TLC). The composition of the mobile phase for TLC is as follows: ethanol - 80 ml, NH 4 OH (30%) - 5 ml, H 2 O - 25 ml. The results are shown in Table 5. As can be seen, the hybrid plasmid pYGAZH increased proline accumulation by strain 702ilvA, a proline producer.

Клетки природного штамма Е.coli K12 (ВКПМ В-7) были обработаны мутагеном, N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином (0,05 мг/мл), в течение 20 минут при 37oС, отмыты 4 раза физиологическим раствором и помещены на минимальную агаризованную среду М9, дополненную 4,0 мг/мл DL-4-азалейцина. Чашки инкубировались в течение 5 дней при 37oС. Выросшие на чашках колонии были собраны и очищены путем рассева до отдельных колоний на чашках с L-агаром. Один из полученных мутантов, устойчивых к DL-4-азалейцину, был использован для индукции двойной ауксотрофности по L-изолейцину и L-валину. Было получено большое количество двойных ауксотрофов, требующих для роста L-изолейцин и L- валин. Было показано, что двойная ауксотрофность по L-изолейцину и L-валину обуславливалась мутацией в гене ilvE. Среди полученных двойных ауксотрофов был выбран наилучший продуцент L-лейцина - штамм 505, продуцирующий 1,8 г/л L-лейцина. Питательная среда для ферментации содержала 60 г/л глюкозы, 25 г/л (NH4)2SО4, 2 г/л КН2РО4, 1 г/л MgSО4, 0,1 мг/л тиамина, 100 мг/л изолейцина, 100 мг/л валина и 25 г/л мела (рН 7,2). Глюкоза и мел были стерилизованы раздельно. 2 мл питательной среды были помещены в пробирки и инокулированы одной петлей исследуемых микроорганизмов, затем выращивание производилось при 37oС в течение 2 дней на качалке.Cells of the natural E. coli K12 strain (VKPM B-7) were treated with mutagen, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (0.05 mg / ml), for 20 minutes at 37 ° C, washed 4 times saline and placed on a minimum agar medium M9, supplemented with 4.0 mg / ml DL-4-azaleucine. The plates were incubated for 5 days at 37 ° C. The colonies grown on the plates were collected and purified by sieving to individual colonies on L-agar plates. One of the obtained mutants that are resistant to DL-4-azaleucine was used to induce double auxotrophy in L-isoleucine and L-valine. A large number of double auxotrophs were obtained, requiring L-isoleucine and L-valine for growth. It was shown that double auxotrophy in L-isoleucine and L-valine was caused by a mutation in the ilvE gene. Among the obtained double auxotrophs, the best producer of L-leucine was selected - strain 505, producing 1.8 g / l of L-leucine. The fermentation medium contained 60 g / l glucose, 25 g / l (NH 4 ) 2 SO 4 , 2 g / l KH 2 PO 4 , 1 g / l MgSO 4 , 0.1 mg / l thiamine, 100 mg / l of isoleucine, 100 mg / l of valine and 25 g / l of chalk (pH 7.2). Glucose and chalk were sterilized separately. 2 ml of culture medium were placed in test tubes and inoculated with one loop of the studied microorganisms, then cultivation was carried out at 37 o C for 2 days on a rocking chair.

Штамм 505 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 113545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 14 мая 2001 г. под инвентарным номером ВКПМ В-8124. Strain 505 was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (RF, 113545, Moscow, 1st Dorozhniy proezd, 1) on May 14, 2001 under accession number VKPM V-8124.

Пример 6. Продукция лейцина штаммом, содержащим плазмиду pYGAZH. Example 6. Production of leucine with a strain containing the plasmid pYGAZH.

Штамм E.coli 505 - продуцент лейцина был трансформирован плазмидой pYGAZH, содержащей гены b2682 и b2683 под контролем промотора PlacUV5.E.coli strain 505 - producing leucine was transformed with the plasmid pYGAZH, comprising b2682 and b2683 genes under the control of promoter P lac UV5.

20 колоний каждого из штаммов 505, 505 (pΔlacZ) в качестве контрольного штамма, содержащего плазмиду без вставки, и 505(pYGAZH) были перенесены петлей в 20 мл пробирки в L-бульоном с ампициллином (300 мг/л) или без него и инкубировались в течение ночи с аэрацией при 32oС. 0,1 мл каждой ночной культуры были перенесены в три 20 мл пробирки с 2 мл среды для ферментации с или без ИПТГ и выращивались при 32oС в течение 72 часов на роторной качалке.20 colonies of each of the strains 505, 505 (pΔlacZ) as a control strain containing a plasmid without insertion, and 505 (pYGAZH) were looped into a 20 ml tube in or without L-broth with ampicillin (300 mg / L) and incubated overnight with aeration at 32 o C. 0.1 ml of each overnight culture were transferred to three 20 ml tubes with 2 ml of fermentation medium with or without IPTG and grown at 32 o C for 72 hours on a rotary shaker.

Состав среды для ферментации:
(NH4)2SО4 - 15 г/л
К2НРО4 - 1,5 г/л
MgS04•7Н2О - 1,0 г/л
СаСО3 - 20 г/л (стерилизован отдельно)
Тиамин - 0,1 мг/л
Глюкоза - 60 г/л (стерилизована отдельно)
Изолейцин - 0,3 г/л
Валин - 0,3 г/л
Ампициллин - 150 мг/л, если необходимо
ИПТГ - 0,5 мМ, если необходимо
После выращивания стабильность плазмиды была определена традиционными методами. Накопленное в культуральной жидкости количество лейцина было определено с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ). Состав подвижной фазы для ТСХ следующий: изопропанол - 80 мл, этилацетат - 80 мл, NH4ОН (30%) - 25 мл, Н2О - 50 мл. Результаты приведены в таблице 6. Как видно, гибридная плазмида pYGAZH увеличивала накопление лейцина штаммом 505 - продуцентом лейцина.The composition of the medium for fermentation:
(NH 4 ) 2 SO 4 - 15 g / l
K 2 NRA 4 - 1.5 g / l
MgS0 4 • 7H 2 O - 1.0 g / l
CaCO 3 - 20 g / l (sterilized separately)
Thiamine - 0.1 mg / L
Glucose - 60 g / l (sterilized separately)
Isoleucine - 0.3 g / l
Valine - 0.3 g / l
Ampicillin - 150 mg / l, if necessary
IPTG - 0.5 mm, if necessary
After cultivation, plasmid stability was determined by conventional methods. The amount of leucine accumulated in the culture fluid was determined by thin layer chromatography (TLC). The composition of the mobile phase for TLC is as follows: isopropanol - 80 ml, ethyl acetate - 80 ml, NH 4 OH (30%) - 25 ml, H 2 O - 50 ml. The results are shown in Table 6. As can be seen, the hybrid plasmid pYGAZH increased the accumulation of leucine by strain 505, the producer of leucine.

В качестве исходного штамма был использован бесплазмидный штамм E.coli С600, дефицитный по треонину и валину. Сначала, путем трансдукции фагом Р1, выросшим на штамме E.coli К-12, были получены Leu+ варианты штамма E.coli C600. Затем после обработки полученных вариантов N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином (0,1 мг/мл) был выделен мутантный штамм 44, устойчивый к 8 г/л L-гомосерина. Указанный штамм 44 являлся дефицитным по L-треонину и был устойчив к высокой концентрации L-гомосерина. Штамм 44 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под инвентарным номером ВКПМ В-2175.A plasmid-free E. coli C600 strain deficient in threonine and valine was used as the initial strain. First, by transduction with phage P1 grown on the E. coli K-12 strain, Leu + variants of the E. coli C600 strain were obtained. Then, after processing the obtained variants with N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (0.1 mg / ml), the mutant strain 44, resistant to 8 g / L L-homoserine, was isolated. The specified strain 44 was deficient in L-threonine and was resistant to high concentrations of L-homoserine. Strain 44 was deposited in the All-Russian collection of industrial microorganisms (VKPM) under inventory number VKPM B-2175.

Затем с помощью мутагенеза с использованием N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина (NTG) из штамма 44 были получены мутанты, устойчивые к аналогу метионина, норлейцину. Клетки ночной культуры штамма 44, выросшие в L-бульоне, были осаждены и ресуспендированы в физиологическом растворе (0,9% NaCl), содержащем 50 мкг/мл NTG. После обработки NTG в течение 30 минут при 37oС клетки были осаждены, отмыты 4 раза физиологическим раствором и помещены на минимальную агаризованную среду М9, содержащую 0,5 мг/мл треонина и 2,5 или 5,0 мг/мл норлейцина. Чашки инкубировались в течение 5 дней при 37oС. Выросшие на чашках колонии были собраны и очищены путем рассева до отдельных колоний на чашках с L-агаром. Наилучшим продуцентом L-метионина среди них оказался штамм 218. Выращивание нового штамма 218 в пробирках, осуществленное при 32oС в течение 3 дней, привело к накоплению в питательной среде 1,1 г/л L-метионина. В качестве питательной среды для ферментации была использована минимальная среда, содержащая 15 г/л (NH4)2SО4, 1,5 г/л КН2РО4, 1,0 г/л MgSО4, 0,1 мг/л тиамина, 40 г/л глюкозы, 0,5 г/л треонина и 20 г/л карбоната кальция. Глюкоза и мел были стерилизованы раздельно.Then, mutants resistant to methionine analogue, norleucine, were obtained from strain 44 using mutagenesis using N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG). The night culture cells of strain 44 grown in L-broth were precipitated and resuspended in physiological saline (0.9% NaCl) containing 50 μg / ml NTG. After treatment with NTG for 30 minutes at 37 ° C., the cells were pelleted, washed 4 times with physiological saline and placed on M9 minimal agar medium containing 0.5 mg / ml threonine and 2.5 or 5.0 mg / ml norleucine. The plates were incubated for 5 days at 37 ° C. The colonies grown on the plates were collected and purified by sieving to individual colonies on L-agar plates. The best producer of L-methionine among them was strain 218. The growth of a new strain of 218 in test tubes, carried out at 32 ° C for 3 days, resulted in the accumulation of 1.1 g / l of L-methionine in the nutrient medium. As a nutrient medium for fermentation was used the minimum medium containing 15 g / l (NH 4 ) 2 SO 4 , 1.5 g / l KH 2 PO 4 , 1.0 g / l MgSO 4 , 0.1 mg / l thiamine, 40 g / l glucose, 0.5 g / l threonine and 20 g / l calcium carbonate. Glucose and chalk were sterilized separately.

Штамм 218 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) 14 мая 2001 г. под инвентарным номером ВКПМ В-8125. Strain 218 was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) on May 14, 2001 under accession number VKPM B-8125.

Затем с помощью фага Р1 в ген ррс штамма 218 была введена делеция с последующей интеграцией в полученный штамм гена русА из Bacillus subtilis (Российская патентная заявка 99121636). Полученный штамм 218русА утратил устойчивость к норлейцину. Поэтому устойчивость штамма к норлейцину была получена заново, как описано выше. Среди полученных штаммов наилучшим продуцентом L-метионина оказался штамм E.coli 73, продуцировавший 1,0 г/л L-метионина в условиях, описанных выше. Then, using phage P1, a deletion was introduced into the PPC gene of strain 218, followed by integration into the resulting strain of the RusA gene from Bacillus subtilis (Russian Patent Application 99121636). The resulting strain 218rusA lost resistance to norleucine. Therefore, the resistance of the strain to norleucine was obtained again, as described above. Among the obtained strains, the best producer of L-methionine was E. coli 73 strain, which produced 1.0 g / l of L-methionine under the conditions described above.

Штамм E.coli 73 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (РФ, 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 14 мая 2001 г. под инвентарным номером ВКПМ В-8126. Strain E.coli 73 was deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russian Federation, 113545 Moscow, 1st Dorozhniy proezd, 1) on May 14, 2001 under accession number VKPM B-8126.

Пример 7. Продукция метионина штаммом, содержащим плазмиду pYGAZH. Example 7. Production of methionine by a strain containing plasmid pYGAZH.

Штамм E. coli 73 - продуцент метионина был трансформирован плазмидой pYGAZH, содержащей гены b2682 и b2683 под контролем промотора PlacUV5.The strain E. coli 73 - producing methionine was transformed with the plasmid pYGAZH, comprising b2682 and b2683 genes under the control of promoter P lac UV5.

5 колоний каждого из штаммов 73, 73 (pΔlacZ) в качестве контрольного штамма, содержащего плазмиду без вставки, и 73 (pYGAZH) были суспендированы в 2 мл минимальной питательной среды ((NH4)2SО4 - 18 г/л, K2HPO4 - 1,8 г/л, MgSО4 - 1,2 г/л, тиамин - 0,1 мг/л, дрожжевой экстракт - 10 г/л, глюкоза - 60 г/л, треонин - 400 мг/л, ампициллин - 300 мг/л, если необходимо) в 20 мл пробирках и инкубировались в течение ночи с аэрацией при 32oС. 0,2 мл каждой ночной культуры были перенесены в три 20 мл пробирки с 2 мл свежей среды для ферментации с или без ИПТГ и выращивались при 32oС в течение 48 часов на роторной качалке.5 colonies of each of the strains 73, 73 (pΔlacZ) as a control strain containing the plasmid without insertion, and 73 (pYGAZH) were suspended in 2 ml of minimal nutrient medium ((NH 4 ) 2 SO 4 - 18 g / l, K 2 HPO 4 - 1.8 g / l, MgSO 4 - 1.2 g / l, thiamine - 0.1 mg / l, yeast extract - 10 g / l, glucose - 60 g / l, threonine - 400 mg / l , ampicillin - 300 mg / l, if necessary) in 20 ml tubes and incubated overnight with aeration at 32 o C. 0.2 ml of each overnight culture were transferred to three 20 ml tubes with 2 ml of fresh medium for fermentation with or without IPTG and grown at 32 o C for 48 hours on ro rocking chair.

Состав среды для ферментации:
(NH4)2SО4 - 18 г/л
К2НРО4 - 1,8 г/л
MgSО4 - 1,2 г/л
СаСО3 - 20 г/л
Тиамин - 0,1 мг/л
Глюкоза - 60 г/л
Треонин - 400 мг/л
Дрожжевой экстракт - 1,0 г/л
Ампициллин - 300 мг/л, если необходимо
ИПТГ - 0,5 мМ, если необходимо
После выращивания стабильность плазмиды и оптическая плотность культуральной жидкости при 540 нм были определены традиционными методами. Накопленное в культуральной жидкости количество метионина было определено с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ). Состав подвижной фазы для ТСХ следующий: изопропанол - 80 мл, этилацетат - 80 мл, NH4ОH (30%) - 15 мл, Н2О - 45 мл. Результаты приведены в таблице 7. Как видно, гибридная плазмида pYGAZH увеличивала накопление метионина штаммом 73 - продуцентом метионина.The composition of the medium for fermentation:
(NH 4 ) 2 SO 4 - 18 g / l
K 2 NRA 4 - 1.8 g / l
MgSO 4 - 1.2 g / l
CaCO 3 - 20 g / l
Thiamine - 0.1 mg / L
Glucose - 60 g / l
Threonine - 400 mg / L
Yeast extract - 1.0 g / l
Ampicillin - 300 mg / l, if necessary
IPTG - 0.5 mm, if necessary
After cultivation, plasmid stability and optical density of the culture fluid at 540 nm were determined by conventional methods. The amount of methionine accumulated in the culture fluid was determined by thin layer chromatography (TLC). The composition of the mobile phase for TLC is as follows: isopropanol - 80 ml, ethyl acetate - 80 ml, NH 4 OH (30%) - 15 ml, H 2 O - 45 ml. The results are shown in table 7. As can be seen, the hybrid plasmid pYGAZH increased the accumulation of methionine by strain 73 - methionine producer.

Claims (18)

I. Способ получения L-аминокислот методом ферментации, включающий стадии выращивания бактерии Escherichia coli-продуцента L-аминокислоты в питательной среде и выделения L-аминокислоты из культуральной жидкости, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют E. coli, способность к продукции L-аминокислоты которой дополнительно увеличена за счет увеличения активности белка, описанного в пункте (А) или (В) и (С) или (D): (A) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 3; (B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 3, и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к L-аминокислотам и/или их аналогам; (C) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 5; (D) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 5, и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к L-аминокислотам и/или их аналогам. I. A method for producing L-amino acids by fermentation, which includes the steps of growing the bacteria Escherichia coli-producer of L-amino acids in a nutrient medium and isolating L-amino acids from the culture fluid, characterized in that E. coli is used as a producer, the ability to produce L- the amino acid of which is further increased by increasing the activity of the protein described in paragraph (A) or (B) and (C) or (D): (A) a protein that is represented by the amino acid sequence shown in the list of sequences under number 3; (B) a protein that is represented by an amino acid sequence including deletions, substitutions, insertions, or the addition of one or more amino acids to the amino acid sequence listed in sequence number 3, and which has an activity that confers bacteria resistance to L-amino acids and / or their analogues; (C) a protein that is represented by the amino acid sequence shown in the list of sequences at number 5; (D) a protein that is represented by an amino acid sequence including deletions, substitutions, insertions, or the addition of one or more amino acids to the amino acid sequence shown in sequence listing number 5, and which has an activity that confers bacteria resistance to L-amino acids and / or their analogues. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что активность белка повышена путем трансформации бактерии с помощью ДНК, кодирующей белок, описанный в пункте (А) или (В) и (С) или (D), или путем изменения регуляции экспрессии последовательности указанной ДНК в хромосоме упомянутой бактерии. 2. The method according to p. 1, characterized in that the activity of the protein is increased by transforming the bacterium using DNA encoding the protein described in paragraph (A) or (B) and (C) or (D), or by changing the regulation of expression of the sequence said DNA in the chromosome of said bacterium. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что трансформация осуществляется с использованием многокопийного вектора. 3. The method according to p. 2, characterized in that the transformation is carried out using a multi-copy vector. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что упомянутой L-аминокислотой является L-треонин. 4. The method according to p. 1, characterized in that the said L-amino acid is L-threonine. 5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что у упомянутой бактерии повышена экспрессия генов треонинового оперона. 5. The method according to p. 4, characterized in that the said bacteria have increased expression of the genes of the threonine operon. 6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что упомянутой L-аминокислотой является L-валин. 6. The method according to p. 1, characterized in that the said L-amino acid is L-valine. 7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что у упомянутой бактерии повышена экспрессия генов ilv оперона. 7. The method according to p. 6, characterized in that the said bacteria have increased expression of the ilv operon genes. 8. Способ по п. 1, отличающийся тем, что упомянутой L-аминокислотой является L-пролин. 8. The method according to p. 1, characterized in that the said L-amino acid is L-proline. 9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что у упомянутой бактерии повышена экспрессия генов биосинтеза пролина. 9. The method according to p. 8, characterized in that the said bacteria have increased expression of proline biosynthesis genes. 10. Способ по п. 1, отличающийся тем, что упомянутой L-аминокислотой является L-лейцин. 10. The method according to p. 1, characterized in that the said L-amino acid is L-leucine. 11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что у упомянутой бактерии повышена экспрессия генов leu оперона. 11. The method according to p. 10, characterized in that the said bacteria have increased expression of the leu operon genes. 12. Способ по п. 1, отличающийся тем, что упомянутой L-аминокислотой является L-метионин. 12. The method according to p. 1, characterized in that the said L-amino acid is L-methionine. 13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что у упомянутой бактерии повышена экспрессия генов met регулона. 13. The method according to p. 12, characterized in that said bacterium has increased expression of met regulatory genes. 14. Штамм Escherichia coli VL2054(pYGAZH), трансформированный плазмидой, содержащей гены b2682 и b2683, кодирующие белки по п. 1, - продуцент L-треонина. 14. The strain Escherichia coli VL2054 (pYGAZH), transformed with a plasmid containing the b2682 and b2683 genes encoding the proteins of claim 1, is a producer of L-threonine. 15. Штамм Escherichia coli H-81(pYGAZH), трансформированный плазмидой, содержащей гены b2682 и b2683, кодирующие белки по п. 1, - продуцент L-валина. 15. The strain Escherichia coli H-81 (pYGAZH), transformed with a plasmid containing the b2682 and b2683 genes encoding the proteins of claim 1, is a producer of L-valine. 16. Штамм Escherichia coli 702ilvA(pYGAZH), трансформированный плазмидой, содержащей гены b2682 и b2683, кодирующие белки по п. 1, - продуцент L-пролина. 16. The strain Escherichia coli 702ilvA (pYGAZH), transformed with a plasmid containing the b2682 and b2683 genes encoding the proteins of claim 1, is a producer of L-proline. 17. Штамм Escherichia coli 505(pYGAZH), трансформированный плазмидой, содержащей гены b2682 и b2683, кодирующие белки по п. 1, - продуцент L-лейцина. 17. The strain Escherichia coli 505 (pYGAZH), transformed with a plasmid containing the b2682 and b2683 genes encoding the proteins of claim 1, is a producer of L-leucine. 18. Штамм Escherichia coli 73(pYGAZH), трансформированный плазмидой, содержащей гены b2682 и b2683, кодирующие белки по п. 1, - продуцент L-метионина. 18. The strain Escherichia coli 73 (pYGAZH), transformed with a plasmid containing the b2682 and b2683 genes encoding the proteins of claim 1, is a producer of L-methionine.
RU2001117632A 2001-02-13 2001-06-28 Method for preparing l amino acids, strain escherichia coli as producer of l-amino acid (variants) RU2215784C2 (en)

Priority Applications (19)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2001117632A RU2215784C2 (en) 2001-06-28 2001-06-28 Method for preparing l amino acids, strain escherichia coli as producer of l-amino acid (variants)
JP2002034760A JP5087194B2 (en) 2001-02-13 2002-02-13 Method for producing L-amino acid using Escherichia bacterium
DE60219968T DE60219968T2 (en) 2001-02-13 2002-02-13 Process for the production of L-amino acids by means of bacteria of the genus Escherichia
US10/073,293 US7476531B2 (en) 2001-02-13 2002-02-13 Method for producing L-amino acid using bacteria belonging to the genus Escherichia
CN2009101594504A CN101597589B (en) 2001-02-13 2002-02-13 Method for producing l-amino acid using bacteria belonging to the genus escherichia
CN2009101594487A CN101597588B (en) 2001-02-13 2002-02-13 Method for producing l-amino acid using bacteria belonging to the genus escherichia
BR122013017187A BR122013017187B1 (en) 2001-02-13 2002-02-13 transgenic l-amino acid producing bacterium belonging to the genus escherichia, and method for producing l-amino acid
DE60219969T DE60219969T2 (en) 2001-02-13 2002-02-13 Method for the production of L-amino acids by means of bacteria of the genus Escherichia
EP04028877A EP1526181B1 (en) 2001-02-13 2002-02-13 Method for producing l-amino acid using bacteria belonging to the genus escherichia
EP04028876A EP1526179B9 (en) 2001-02-13 2002-02-13 Method for producing l-amino acid using bacteria belonging to the genus escherichia
BRPI0200350-3A BR0200350B1 (en) 2001-02-13 2002-02-13 Transgenic bacterium producing L-amino acid belonging to the genus Escherichia and method for producing L-amino acid
EP02003335A EP1239041B1 (en) 2001-02-13 2002-02-13 Method for producing L-amino acid using bacteria belonging to the genus Escherichia
BR122013017189A BR122013017189B1 (en) 2001-02-13 2002-02-13 l-amino acid producing bacterium belonging to the genus escherichia, and method for producing l-amino acid
DE60210697T DE60210697T2 (en) 2001-02-13 2002-02-13 Process for the production of L-amino acids by means of bacteria of the genus Escherichia
CNB021080860A CN100529057C (en) 2001-02-13 2002-02-13 Method for producing L-amino acid by colibacillus bacteria
JP2007273972A JP2008067714A (en) 2001-02-13 2007-10-22 Method for producing l-amino acid using bacteria belonging to genus escherichia
JP2007273965A JP5087362B2 (en) 2001-02-13 2007-10-22 Method for producing L-amino acid using Escherichia bacterium
US12/120,409 US7618804B2 (en) 2001-02-13 2008-05-14 Method for producing L-amino acid using bacteria belonging to the genus Escherichia
US12/120,404 US7618803B2 (en) 2001-02-13 2008-05-14 Method for producing L-amino acid using bacteria belonging to the genus Escherichia

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2001117632A RU2215784C2 (en) 2001-06-28 2001-06-28 Method for preparing l amino acids, strain escherichia coli as producer of l-amino acid (variants)

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2001103865 Substitution 2001-02-13 2001-02-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2001117632A RU2001117632A (en) 2003-03-10
RU2215784C2 true RU2215784C2 (en) 2003-11-10

Family

ID=32026691

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2001117632A RU2215784C2 (en) 2001-02-13 2001-06-28 Method for preparing l amino acids, strain escherichia coli as producer of l-amino acid (variants)

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2215784C2 (en)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2651511C2 (en) * 2011-01-20 2018-04-19 Эвоник Дегусса Гмбх Method for enzymatic production of sulfur-containing amino acids
RU2678757C2 (en) * 2013-08-30 2019-01-31 Эвоник Дегусса Гмбх Microorganism for methionine production with enhanced methionine efflux
RU2723183C2 (en) * 2014-04-10 2020-06-09 СиДжей ЧЕЙЛЖЕДАНГ КОРП. O-succinyl homoserine-producing microorganism and method of producing o-succinyl homoserine using thereof
RU2723714C2 (en) * 2014-09-01 2020-06-17 Эвоник Оперейшнс Гмбх Method and microorganism for enzymatic production of methionine with improved output of methionine

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2651511C2 (en) * 2011-01-20 2018-04-19 Эвоник Дегусса Гмбх Method for enzymatic production of sulfur-containing amino acids
RU2678757C2 (en) * 2013-08-30 2019-01-31 Эвоник Дегусса Гмбх Microorganism for methionine production with enhanced methionine efflux
RU2723183C2 (en) * 2014-04-10 2020-06-09 СиДжей ЧЕЙЛЖЕДАНГ КОРП. O-succinyl homoserine-producing microorganism and method of producing o-succinyl homoserine using thereof
RU2723714C2 (en) * 2014-09-01 2020-06-17 Эвоник Оперейшнс Гмбх Method and microorganism for enzymatic production of methionine with improved output of methionine

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5087194B2 (en) Method for producing L-amino acid using Escherichia bacterium
RU2148642C1 (en) Dna rhtc fragment encoding synthesis of rhtc protein that determines enhanced resistance of bacterium escherichia coli to l-threonine and method of l-amino acid producing
US6887691B2 (en) DNA coding for protein which confers on bacterium Escherichia coli resistance to L-homoserine, and method for producing L-amino acids
EP1149911B1 (en) Amino acid producing strains belonging to the genus Escherichia and method for producing an amino acid
US6214591B1 (en) Methods for producing L-valine and L-leucine
EP2186881B1 (en) A method for producing an L-amino acid using bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small RNA
RU2215782C2 (en) Method for preparing l-amino acids, strain escherichia coli as producer of l-amino acid (variants)
MXPA04008302A (en) Process for producing l-threonine with the use of bacterium beloniging to the genus escherichia.
CN110418843A (en) The method that Novel L-tryptophan exports albumen and produces L-Trp using it
RU2395580C2 (en) Method of building (2s,3r,4s)-4-hydroxy-l-isoleucine producing bacteria, (2s, 3r, 4s)-4-hydroxy-l-isoleucine producing bacteria and method of producing (2s, 3r, 4s)-hydroxy-l-isoleucine or salt thereof
RU2215784C2 (en) Method for preparing l amino acids, strain escherichia coli as producer of l-amino acid (variants)
RU2333950C2 (en) METHOD OF PRODUCTION OF AROMATIC L-AMINO ACIDS USING BACTERIUM BELONGING TO GENUS Methylophilus
CN111763699A (en) Recombinant DNA (deoxyribonucleic acid) for producing 1, 5-pentanediamine through fermentation, strain and application of recombinant DNA
CN101597588B (en) Method for producing l-amino acid using bacteria belonging to the genus escherichia
RU2215785C2 (en) Method for preparing l-amino acids, strain escherichia coli as producer of l-amino acid (variants)
US20060040364A1 (en) DNA coding for a protein which imparts L-homoserine resistance to Escherichia coli bacterium, and a method for producing L-amino acids