RU2215785C2 - Method for preparing l-amino acids, strain escherichia coli as producer of l-amino acid (variants) - Google Patents
Method for preparing l-amino acids, strain escherichia coli as producer of l-amino acid (variants) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2215785C2 RU2215785C2 RU2001117633A RU2001117633A RU2215785C2 RU 2215785 C2 RU2215785 C2 RU 2215785C2 RU 2001117633 A RU2001117633 A RU 2001117633A RU 2001117633 A RU2001117633 A RU 2001117633A RU 2215785 C2 RU2215785 C2 RU 2215785C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- amino acid
- amino acids
- protein
- producer
- strain
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Область техники
Настоящее изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу получения L-аминокислот методом ферментации, и, более конкретно, к генам, полученным из бактерии Escherichia coli. Указанные гены позволяют улучшить продукцию L-аминокислот, например L-аргинина и L-пролина.Technical field
The present invention relates to biotechnology, in particular to a method for producing L-amino acids by fermentation, and, more specifically, to genes derived from Escherichia coli bacteria. These genes can improve the production of L-amino acids, for example L-arginine and L-proline.
Предшествующий уровень техники
Традиционно L-аминокислоты в промышленном масштабе могут быть получены методом ферментации с использованием штаммов микроорганизмов, полученных из природных источников, или их мутантов, специально модифицированных для того, чтобы увеличить продукцию L-аминокислот.State of the art
Traditionally, L-amino acids on an industrial scale can be obtained by fermentation using strains of microorganisms obtained from natural sources, or their mutants, specially modified in order to increase the production of L-amino acids.
Описано множество методов увеличения продукции L-аминокислот, например путем трансформации микроорганизма рекомбинантной ДНК (см., например, патент США 4278765). Указанные методы основаны на повышении активности ферментов, вовлеченных в биосинтез аминокислот и/или уменьшении чувствительности целевого фермента к обратному ингибированию продуцируемой L-аминокислотой (см. , например, выложенную патентную заявку Японии 56-18596 (1981), WO 95/16042 или патенты США 5661012 и 6040160). Many methods have been described to increase the production of L-amino acids, for example, by transforming a microorganism of recombinant DNA (see, for example, US patent 4278765). These methods are based on increasing the activity of enzymes involved in the biosynthesis of amino acids and / or reducing the sensitivity of the target enzyme to reverse inhibition by the produced L-amino acid (see, for example, Japanese Patent Application Laid-open 56-18596 (1981), WO 95/16042 or U.S. Patents 5661012 and 6040160).
С другой стороны, повышенная экскреция L-аминокислот может увеличить продуктивность штамма, продуцирующего L-аминокислоту. Описан штамм бактерии, принадлежащей к роду Corynebacterium, обладающей повышенной экспрессией гена экскреции L-лизина (ген lysE) (WO 9723597 A2). Кроме того, описаны гены, кодирующие белки, способные к секреции L-цистеина, L-цистина, N-ацетилсерина или производных триазолидина (патент США 5972633). On the other hand, increased excretion of L-amino acids can increase the productivity of a strain producing L-amino acids. A strain of a bacterium belonging to the genus Corynebacterium having increased expression of the L-lysine excretion gene (lysE gene) (WO 9723597 A2) is described. In addition, genes encoding proteins capable of secreting L-cysteine, L-cystine, N-acetylserine or triazolidine derivatives are described (US Pat. No. 5,972,633).
К настоящему времени описаны несколько генов, кодирующих, как предполагается, мембранные белки, которые увеличивают продукцию L-аминокислот. Дополнительная копия гена rhtB делает бактерию более устойчивой к L-гомосерину и увеличивает продукцию L-гомосерина, L-треонина, L-аланина, L-валина и L-изолейцина (Европейская патентная заявка ЕР 994190 А2). Дополнительная копия гена rhtC делает бактерию более устойчивой к L-гомосерину и L-треонину и увеличивает продукцию L-гомосерина, L-треонина и L-лейцина (Европейская патентная заявка ЕР 1013765 А1). Дополнительные копии генов yahN, yeaS, yfiK и yggA увеличивают продукцию L-глутаминовой кислоты, L-треонина, L-аланина, L-гистидина, L-пролина, L-аргинина, L-валина и L-изолейцина (Европейская патентная заявка ЕР 1016710 А2). И хотя нуклеотидная последовательность всего генома Escherichia coli К-12 описана (Blattner F.R., Plunkett G., Bloch C. A. et al., Science, 227, 1453-1474, 1997; ftp://ftp.genetics.wisc. edu/pub/ sequence/ecolim52. seq. gz), существует множество открытых рамок считывания, функция которых остается неизвестной. To date, several genes have been described that encode, as expected, membrane proteins that increase the production of L-amino acids. An additional copy of the rhtB gene makes the bacterium more resistant to L-homoserin and increases the production of L-homoserine, L-threonine, L-alanine, L-valine and L-isoleucine (European patent application EP 994190 A2). An additional copy of the rhtC gene makes the bacterium more resistant to L-homoserin and L-threonine and increases the production of L-homoserin, L-threonine and L-leucine (European patent application EP 1013765 A1). Additional copies of the yahN, yeaS, yfiK, and yggA genes increase the production of L-glutamic acid, L-threonine, L-alanine, L-histidine, L-proline, L-arginine, L-valine and L-isoleucine (European patent application EP 1016710 A2). Although the nucleotide sequence of the entire genome of Escherichia coli K-12 is described (Blattner FR, Plunkett G., Bloch CA et al., Science, 227, 1453-1474, 1997; ftp: //ftp.genetics.wisc. Edu / pub / sequence / ecolim52. seq. gz), there are many open reading frames whose function remains unknown.
Описание изобретения
Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности штаммов, продуцирующих L-аминокислоты, и предоставление способа получения L-аминокислот, например L-аргинина и L-пролина, с использованием указанных штаммов.Description of the invention
The aim of the present invention is to increase the productivity of strains producing L-amino acids, and the provision of a method for producing L-amino acids, for example L-arginine and L-proline, using these strains.
Данная цель была достигнута путем идентификации генов, кодирующих белки, которые не вовлечены в пути биосинтеза целевых L-аминокислот, но увеличивают их продукцию. Примером такого белка может являться мембранный белок, обладающий активностью, обеспечивающей экскрецию L-аминокислот. При анализе нуклеотидной последовательности полного генома Escherichia coli были отобраны белки с 4 или более предполагаемыми трансмембранными сегментами (ТМС). В результате тщательного исследования авторы настоящего изобретения идентифицировали среди них ген, такой как b3434, и тщательно изучили его. Ген b3434 был известен как предполагаемая кодирующая последовательность, которая может кодировать белок с неизвестной функцией (номера нуклеотидов с 1463 по 2056 в нуклеотидной последовательности под номером АЕ000420 U00096 в Genbank). Ген b3434 также известен как ген yhgN. Также авторы настоящего изобретения установили, что при повышении активности белка, кодируемого геном b3434, увеличивается продуктивность штаммов, продуцирующих L-аминокислоты. Таким образом было совершено настоящее изобретение. This goal was achieved by identifying genes encoding proteins that are not involved in the biosynthesis of target L-amino acids, but increase their production. An example of such a protein may be a membrane protein having an activity for the excretion of L-amino acids. When analyzing the nucleotide sequence of the entire Escherichia coli genome, proteins with 4 or more putative transmembrane segments (TMS) were selected. As a result of a thorough study, the authors of the present invention identified among them a gene, such as b3434, and carefully studied it. The b3434 gene was known as a putative coding sequence that can encode a protein with an unknown function (nucleotide numbers from 1463 to 2056 in the nucleotide sequence under the number AE000420 U00096 in Genbank). The b3434 gene is also known as the yhgN gene. The authors of the present invention also found that with an increase in the activity of the protein encoded by the b3434 gene, the productivity of strains producing L-amino acids increases. Thus, the present invention has been completed.
Настоящее изобретение включает в себя следующее:
1. Бактерия-продуцент L-аминокислоты, принадлежащая к роду Escherichia, в которой продукция L-аминокислоты упомянутой бактерией увеличена за счет повышения активности белков, описанных в пунктах (А) или (В), в клетке упомянутой бактерии:
(A) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 3;
(B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 3, и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к L-аминокислотам и/или их аналогам, таким как DL-o-метилсерин, 6-диазо-5-oксо-L-норлейцин и DL-β-гидроксинорвалин, а также придающей бактерии чувствительность к S-(2-аминоэтил)цистеину.The present invention includes the following:
1. The bacterium producing L-amino acids belonging to the genus Escherichia, in which the production of L-amino acids by said bacterium is increased by increasing the activity of the proteins described in points (A) or (B) in the cell of said bacterium:
(A) a protein that is represented by the amino acid sequence shown in
(B) a protein that is represented by an amino acid sequence including deletions, substitutions, insertions, or the addition of one or more amino acids to the amino acid sequence listed in
(Здесь и далее, белки, описанные в вышеупомянутых пунктах (А) или (В), упоминаются как "белки согласно настоящему изобретению".)
2. Бактерия в соответствии с вышеупомянутой бактерией, в которой активности белков, описанных в пунктах (А) или (В), повышены путем трансформации бактерии с помощью ДНК, кодирующей белки, описанные в пунктах (А) или (В), или путем изменения регуляции экспрессии нуклеотидной последовательности в хромосоме упомянутой бактерии.(Hereinafter, the proteins described in the above (A) or (B) are referred to as “the proteins of the present invention.”)
2. A bacterium in accordance with the aforementioned bacterium, in which the activity of the proteins described in points (A) or (B) is increased by transforming the bacterium using DNA encoding the proteins described in points (A) or (B), or by changing regulation of the expression of the nucleotide sequence in the chromosome of said bacterium.
3. Бактерия в соответствии с вышеупомянутой бактерией, в которой трансформация осуществляется с использованием многокопийного вектора. 3. The bacterium in accordance with the aforementioned bacterium, in which the transformation is carried out using a multi-copy vector.
4. Способ получения L-аминокислоты, включающий выращивание бактерии в соответствии с вышеупомянутой бактерией в питательной среде и сбор из культуральной жидкости полученной и накопленной в ней L-аминокислоты. 4. A method for producing an L-amino acid, comprising growing a bacterium in accordance with the aforementioned bacterium in a nutrient medium and collecting from the culture fluid the obtained and accumulated L-amino acid in it.
5. Способ в соответствии с вышеупомянутым способом, в котором L-аминокислотой является L-аргинин. 5. The method in accordance with the above method, in which the L-amino acid is L-arginine.
6. Способ в соответствии с вышеупомянутым способом, в котором у указанной бактерии повышена экспрессия генов аргининового регулона. 6. The method in accordance with the aforementioned method, wherein said bacterium has increased expression of arginine regulon genes.
7. Способ в соответствии с вышеупомянутым способом, в котором L-аминокислотой является L-пролин. 7. The method in accordance with the above method, in which the L-amino acid is L-proline.
8. Способ в соответствии с вышеупомянутым способом, в котором у указанной бактерии повышена экспрессия генов биосинтеза L-пролина. 8. The method in accordance with the aforementioned method, wherein said bacterium has increased expression of L-proline biosynthesis genes.
Способ получения L-аминокислоты включает продукцию L-аргинина с использованием бактерии-продуцента L-аргинина, в которой повышена активность белка согласно настоящему изобретению, например, представленного аминокислотной последовательностью, приведенной под номером 3. Также, способ получения L-аминокислоты включает продукцию L-пролина с использованием бактерии-продуцента L-пролина, в которой повышена активность белка согласно настоящему изобретению, например, представленного аминокислотной последовательностью, приведенной под номером 3. The method for producing L-amino acid includes the production of L-arginine using the bacterium-producer of L-arginine, in which the activity of the protein according to the present invention is increased, for example, represented by the amino acid sequence shown under
Настоящее изобретение более детально будет описано ниже. The present invention will be described in more detail below.
Вышеуказанной бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия-продуцент L-аминокислоты, принадлежащая к роду Escherichia, в которой продукция L-аминокислоты указанной бактерией увеличена за счет повышения активностей белков согласно настоящему изобретению в клетке бактерии. The aforementioned bacterium according to the present invention is an L-amino acid producing bacterium belonging to the genus Escherichia, in which the production of an L-amino acid by said bacterium is increased by increasing the activity of the proteins of the present invention in a bacterial cell.
Вышеуказанной бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия-продуцент L-аминокислоты, принадлежащая к роду Escherichia и обладающая повышенной активностью белков, которые увеличивают продукцию целевой L-аминокислоты. Конкретно, бактерией согласно настоящему изобретению является бактерия-продуцент L-аминокислоты, принадлежащая к роду Escherichia и обладающая повышенной активностью белков согласно настоящему изобретению. Более конкретно, бактерия согласно настоящему изобретению содержит ДНК, в которой повышена экспрессия гена b3434 на хромосоме ДНК или на плазмиде в бактерии, и обладает повышенной способностью к продукции L-аминокислоты, например L-аргинина и/или L-пролина. The aforementioned bacterium according to the present invention is an L-amino acid producing bacterium belonging to the genus Escherichia and having an increased activity of proteins that increase the production of the target L-amino acid. Specifically, the bacterium of the present invention is an L-amino acid producing bacterium belonging to the genus Escherichia and having increased activity of the proteins of the present invention. More specifically, the bacterium of the present invention contains DNA in which the expression of the b3434 gene on the DNA chromosome or on the plasmid in bacteria is increased, and has an increased ability to produce L-amino acids, for example L-arginine and / or L-proline.
К белкам согласно настоящему изобретению относятся белки, описанные в следующих пунктах (А) или (В):
(A) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 3;
(B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 3, и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к L-аминокислотам и/или их аналогам, таким как DL-o-метилсерин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин и DL-β-гидроксинорвалин, а также придающей бактерии чувствительность к S-(2-аминоэтил)цистеину.Proteins according to the present invention include proteins described in the following paragraphs (A) or (B):
(A) a protein that is represented by the amino acid sequence shown in
(B) a protein that is represented by an amino acid sequence including deletions, substitutions, insertions, or the addition of one or more amino acids to the amino acid sequence listed in
Количество "нескольких" аминокислот различается в зависимости от положения и типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка. Оно может быть от 2 до 20, предпочтительно от 2 до 10 и более предпочтительно от 2 до 5 для белка (А). The number of “several” amino acids varies depending on the position and type of amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein. It can be from 2 to 20, preferably from 2 to 10, and more preferably from 2 to 5 for protein (A).
Устойчивость к L-аминокислотам и/или их аналогам означает способность бактерии к росту на минимальной питательной среде, содержащей L-аминокислоту и/или ее аналог в концентрации, при которой штамм дикого типа или родительский штамм не может расти, или способность бактерии расти с большей скоростью на питательной среде, содержащей L-аминокислоту и/или ее аналог, чем штамм дикого типа или родительский штамм. Примерами аналогов L-аминокислот являются DL-o-метилсерин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, DL-β-гидроксинорвалин и подобные их соединения. Упомянутая выше концентрация L-аминокислоты или ее аналога составляет обычно от 1100 до 9600 мкг/мл, предпочтительно от 3000 до 3500 мкг/мл в случае DL-o-метилсерина; обычно от 5 до 50 мкг/мл, предпочтительно от 12 до 18 мкг/мл в случае 6-диазо-5-оксо-L-норлейцина и обычно от 25 до 250 мкг/мл, предпочтительно от 70 до 90 мкг/мл в случае DL-β-гидроксинорвалина. Resistance to L-amino acids and / or their analogs means the ability of a bacterium to grow on a minimum nutrient medium containing L-amino acid and / or its analogue in a concentration at which the wild-type strain or the parent strain cannot grow, or the ability of the bacterium to grow with a greater speed on a nutrient medium containing an L-amino acid and / or its analogue than a wild-type strain or a parent strain. Examples of analogs of L-amino acids are DL-o-methylserine, 6-diazo-5-oxo-L-norleucine, DL-β-hydroxynorvaline and the like. The above concentration of L-amino acid or its analogue is usually from 1100 to 9600 μg / ml, preferably from 3000 to 3500 μg / ml in the case of DL-o-methylserine; usually from 5 to 50 μg / ml, preferably from 12 to 18 μg / ml in the case of 6-diazo-5-oxo-L-norleucine and usually from 25 to 250 μg / ml, preferably from 70 to 90 μg / ml in the case DL-β-hydroxyquinorvaline.
Чувствительность к L-аминокислотам и/или их аналогам означает способность бактерии к росту с большим временем генерации, чем родительский штамм или штамм дикого типа, на минимальной питательной среде, содержащей некоторое количество L-аминокислоты и/или ее аналога. С другой стороны, чувствительность к L-аминокислотам и/или их аналогам означает отсутствие роста бактерии на минимальной питательной среде, содержащей L-аминокислоту и/или ее аналог в концентрации, при которой родительский штамм или штамм дикого типа обладают способностью к росту. Примером такого аналога L-аминокислоты является S-(2-аминоэтил)цистеин. Упомянутая выше концентрация составляет обычно от 0,2 до 2,0 мкг/мл, предпочтительно от 0,5 до 1,0 мкг/мл в случае S-(2-аминоэтил)цистеина. Sensitivity to L-amino acids and / or their analogues means the ability of a bacterium to grow with a longer generation time than the parent strain or wild-type strain on a minimal nutrient medium containing a certain amount of L-amino acid and / or its analogue. On the other hand, sensitivity to L-amino acids and / or their analogs means the absence of bacterial growth on a minimal nutrient medium containing L-amino acid and / or its analogue at a concentration at which the parent strain or wild-type strain is capable of growth. An example of such an L-amino acid analogue is S- (2-aminoethyl) cysteine. The concentration mentioned above is usually from 0.2 to 2.0 μg / ml, preferably from 0.5 to 1.0 μg / ml in the case of S- (2-aminoethyl) cysteine.
К бактерии согласно настоящему изобретению также относятся бактерии, в которых активности белков согласно настоящему изобретению повышены путем трансформации бактерии с помощью ДНК, кодирующей белки, описанные в пунктах (А) или (В), или путем изменения регуляции экспрессии последовательности указанной ДНК в хромосоме упомянутой бактерии. Bacteria according to the present invention also include bacteria in which the activity of the proteins according to the present invention is increased by transforming the bacterium with the help of DNA encoding the proteins described in points (A) or (B), or by changing the regulation of expression of the sequence of said DNA in the chromosome of said bacterium .
Упомянутая ДНК, использующаяся для модификации бактерии согласно настоящему изобретению, кодирует, как предполагается, мембранный белок. Конкретно, упомянутая ДНК кодирует белок с 4 или более трансмембранными сегментами. Такая ДНК может кодировать белки, обладающие активностью по экскреции L-аминокислот. Более конкретно, ген b3434 является такой ДНК. Ген b3434 может быть получен, например, с помощью ПЦР с использованием затравок с нуклеотидной последовательностью, приведенной под номерами 1 и 2. Said DNA used to modify the bacterium of the present invention encodes, as expected, a membrane protein. Specifically, said DNA encodes a protein with 4 or more transmembrane segments. Such DNA can encode proteins having L-amino acid excretion activity. More specifically, the b3434 gene is such a DNA. The b3434 gene can be obtained, for example, by PCR using seeds with the nucleotide sequence shown under
Анализ последовательности полного генома Escherichia coli позволил выбрать гены, кодирующие белки с 4 и более предполагаемыми ТМС. Белки с известной функцией и транспортеры, описанные Paulsen I.T., Sliwinski M.I., Saier M.H. (J.Mol.Biol., 1998, 277, 573) и Linton K.J., Higgins C.F. (Molecular Microbiology, 1998, 28(1), 5), исключили из группы, подлежащей изучению. В результате тщательного отбора среди оставшихся генов были выбраны несколько генов, кодирующих, как предполагалось, мембранные экспортеры. И было обнаружено, что повышенная экспрессия гена b3434 увеличивает продукцию L-аминокислот штаммами-продуцентами L-аминокислот. Sequence analysis of the full genome of Escherichia coli allowed us to select genes encoding for proteins with 4 or more putative TMS. Proteins with known function and transporters described by Paulsen I.T., Sliwinski M.I., Saier M.H. (J. Mol. Biol., 1998, 277, 573) and Linton K.J., Higgins C.F. (Molecular Microbiology, 1998, 28 (1), 5), were excluded from the group to be studied. As a result of careful selection, several genes were selected from the remaining genes encoding, as expected, membrane exporters. And it was found that increased expression of the b3434 gene increases L-amino acid production by L-amino acid producer strains.
К ДНК согласно настоящему изобретению относится ДНК, кодирующая белок, включающий делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в одно или несколько положений белка (А) или (С) при условии, что они не приводят к утрате активности указанного белка. Хотя количество "нескольких" аминокислот различается в зависимости от положения и типа аминокислотного остатка в трехмерной структуре белка, оно может быть от 2 до 20, предпочтительно от 2 до 10 и более предпочтительно от 2 до 5 для белка (А). ДНК, кодирующая практически такой же белок, как белок, описанный в пункте (А), может быть получена, например, путем модификации нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, описанный в пункте (А), с использованием сайт-направленного мутагенеза таким образом, что один или несколько аминокислотных остатков будут удалены, заменены, введены или добавлены. Модифицированная подобным образом ДНК может быть получена традиционными методами, использующими обработку химическими реагентами и содержание в условиях, вызывающих мутации. К подобного рода обработкам относятся обработка ДНК, кодирующей белки согласно настоящему изобретению, с помощью гидроксиламина или обработка бактерии, содержащей ДНК, с помощью УФ-излучения или химического реагента, такого как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин или азотистая кислота. The DNA of the present invention includes DNA that encodes a protein, including deletions, substitutions, insertions, or the addition of one or more amino acids to one or more positions of the protein (A) or (C), provided that they do not lead to a loss of activity of the specified protein. Although the number of “several” amino acids varies depending on the position and type of amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein, it can be from 2 to 20, preferably from 2 to 10, and more preferably from 2 to 5 for protein (A). DNA encoding almost the same protein as the protein described in paragraph (A) can be obtained, for example, by modifying the nucleotide sequence encoding the protein described in paragraph (A) using site-directed mutagenesis so that one or several amino acid residues will be removed, replaced, introduced or added. DNA modified in this way can be obtained by traditional methods using chemical reagent treatment and content under conditions that cause mutations. Treatments of this kind include treating the DNA encoding the proteins of the present invention with hydroxylamine or treating the bacterium containing the DNA with UV light or a chemical reagent such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine or nitrous acid .
К ДНК согласно настоящему изобретению относятся варианты, которые могут быть найдены в различных штаммах или вариантах бактерий, принадлежащих к роду Escherichia, ввиду природного разнообразия. ДНК, кодирующая подобные варианты, может быть получена путем выделения ДНК, которая гибридизуется с геном b3434 или частью указанного гена в жестких условиях, и которая кодирует белок, увеличивающий продукцию L-аминокислот. Термин "жесткие условия", упомянутый здесь, означает условия, при которых образуются так называемые специфические гибриды, а неспецифические - не образуются. Например, к жестким условиям относятся условия, при которых гибридизуются ДНК, обладающие высокой степенью гомологии, к примеру ДНК, обладающие гомологией не менее 70% друг относительно друга. В качестве варианта, примером жестких условий являются условия соответствующие условиям отмывки при гибридизации по Саузерну, например, 60oС, 1xSSC, 0,1% SDS, предпочтительно 0,1xSSC, 0,1% SDS. В качестве зонда для ДНК, кодирующей варианты и гибридизующейся с геном b3434, также может быть использована часть нуклеотидной последовательности под номером 3. Зонд подобного рода может быть получен в результате ПЦР с использованием в качестве затравок олигонуклеотидов, полученных на основе нуклеотидной последовательности под номером 3, и фрагмента ДНК, содержащего нуклеотидную последовательность под номером 3, в качестве матрицы. В случае, когда в качестве зонда используется фрагмент ДНК длиной около 300 пар оснований, условия отмывки при гибридизации соответствуют, например, 50oС, 2xSSC и 0,1% SDS.DNA according to the present invention includes variants that can be found in various strains or variants of bacteria belonging to the genus Escherichia, due to natural diversity. DNA encoding such variants can be obtained by isolating DNA that hybridizes with the b3434 gene or part of the specified gene under stringent conditions, and which encodes a protein that increases the production of L-amino acids. The term "stringent conditions", mentioned here, means the conditions under which the so-called specific hybrids are formed, and non-specific ones are not formed. For example, harsh conditions include conditions under which DNA with a high degree of homology hybridizes, for example, DNA with a homology of at least 70% relative to each other. Alternatively, stringent conditions are exemplified by conditions corresponding to the washing conditions for Southern hybridization, for example 60 ° C, 1xSSC, 0.1% SDS, preferably 0.1xSSC, 0.1% SDS. Part of the nucleotide sequence numbered 3 can also be used as a probe for DNA encoding variants and hybridizing with the b3434 gene. A probe of this kind can be obtained by PCR using oligonucleotides obtained from the nucleotide sequence numbered 3 as seeds, and a DNA fragment containing the nucleotide sequence at
Трансформация бактерии с помощью ДНК, кодирующей белок, означает введение указанной ДНК в клетку бактерии, например, с помощью традиционных методов для того, чтобы усилить экспрессию генов, кодирующих белок согласно настоящему изобретению, и повысить активность белка в клетке бактерии. Transformation of a bacterium using DNA encoding a protein means introducing said DNA into a bacterial cell, for example, using traditional methods in order to enhance the expression of genes encoding the protein of the present invention and increase the activity of the protein in the bacterial cell.
К методам увеличения экспрессии генов относятся методы увеличения числа копий гена. Введение гена в вектор, способный к функционированию в бактерии, принадлежащей к роду Escherichia, увеличивает число копий указанного гена. Для подобных целей могут быть предпочтительно использованы многокопийные векторы. Примерами многокопийных векторов являются pBR322, pMWl19, pUC19, pET22b и подобные им. Methods for increasing gene expression include methods for increasing the number of copies of a gene. The introduction of a gene into a vector capable of functioning in bacteria belonging to the genus Escherichia increases the number of copies of the specified gene. For such purposes, multi-copy vectors can preferably be used. Examples of multi-copy vectors are pBR322, pMWl19, pUC19, pET22b and the like.
Кроме того, усиление экспрессии гена может быть достигнуто путем введения некоторого числа копий гена в бактериальную хромосому, например, методом гомологичной рекомбинации или подобным. In addition, enhancing gene expression can be achieved by introducing a certain number of copies of the gene into the bacterial chromosome, for example, by homologous recombination or the like.
В случае, когда добиваются усиления экспрессии двух или более генов, указанные гены могут быть расположены вместе на одной и той же плазмиде или раздельно на различных плазмидах. Также допустимо, чтобы одни из генов располагались в хромосоме, а другие гены располагались на плазмиде. In the case when they achieve enhanced expression of two or more genes, these genes can be located together on the same plasmid or separately on different plasmids. It is also permissible that some of the genes are located on the chromosome, and other genes are located on the plasmid.
С другой стороны, усиление экспрессии генов может быть достигнуто помещением ДНК согласно настоящему изобретению под контроль сильного промотора. Например, в качестве сильных промоторов известны lac промотор, trp промотор, trc промотор, PL и PR промоторы фага лямбда. Использование сильного промотора может быть совмещено с увеличением числа копий гена.Alternatively, increased gene expression can be achieved by placing the DNA of the present invention under the control of a strong promoter. For example, lac promoter, trp promoter, trc promoter, P L and P R lambda phage promoters are known as strong promoters. Using a strong promoter can be combined with an increase in the number of copies of the gene.
Бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем введения вышеуказанных ДНК в бактерию, уже обладающую способностью к продукции L-аминокислоты. С другой стороны, бактерия согласно настоящему изобретению может быть получена путем придания бактерии, уже содержащей указанные ДНК, способности к продукции L-аминокислоты. В качестве родительских штаммов, в которых активности белков согласно настоящему изобретению будут повышены, могут быть использованы бактерии-продуценты L-аргинина, принадлежащие к роду Escherichia, такие как штаммы AJ11531 и АJ11538 (JP 56106598 A2), АJ11593 (FERM Р-5616) и АJ11594 (FERM Р-5617) (выложенная патентная заявка Японии 57-5693) или подобные. Также, в качестве родительских штаммов, в которых активности белков согласно настоящему изобретению будут повышены, могут быть использованы бактерии-продуценты L-пролина, принадлежащие к роду Escherichia, такие как штаммы NRRL В-12403 и NRRL В-12404 (патент Великобритании GB 2075056), ВКПМ В-8012 (Российская патентная заявка 2000124295), мутанты, содержащие плазмиды, описанные в патенте Германии DE 3127361, мутанты, содержащие плазмиды, описанные в Bloom F.R. et al. (The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34) и подобные им.The bacterium according to the present invention can be obtained by introducing the above DNA into a bacterium already possessing the ability to produce L-amino acids. On the other hand, a bacterium according to the present invention can be obtained by giving the bacterium already containing said DNA the ability to produce L-amino acids. As parent strains in which the activity of the proteins of the present invention will be enhanced, bacteria producing L-arginine belonging to the genus Escherichia, such as strains AJ11531 and AJ11538 (JP 56106598 A2), AJ11593 (FERM P-5616) and AJ11594 (FERM P-5617) (Japanese Patent Application Laid-Open No. 57-5693) or the like. Also, as parental strains in which the activity of the proteins of the present invention will be increased, L-proline producing bacteria belonging to the genus Escherichia, such as NRRL B-12403 and NRRL B-12404 strains (GB 2075056, UK) can be used. VKPM B-8012 (Russian Patent Application 2000124295), mutants containing the plasmids described in German Patent DE 3127361, mutants containing the plasmids described in Bloom FR et al. (The 15 th Miami winter symposium, 1983, p. 34) and the like.
В бактерии согласно настоящему изобретению в дальнейшем может быть усилена экспрессия одного или нескольких генов, вовлеченных в биосинтез L-аминокислоты. Примерами таких генов являются гены аргининового регулона, предпочтительно ген, кодирующий N-ацетилглутаматсинтазу, чувствительность к ингибированию L-аргинином по типу обратной связи, в которой утрачена (Rajagopal B. S. et al. , Appl. Environ. Microbiol., 1998, v.64, No.5, p. 1805-1811). Примерами таких генов для бактерии-продуцента L-пролина являются гены биосинтеза пролина, предпочтительно ген proВ, кодирующий глутаматкиназу, чувствительность к ингибированию L-пролином по типу обратной связи в которой утрачена (патент Германии DE 3127361). In the bacteria according to the present invention, expression of one or more genes involved in the L-amino acid biosynthesis can be further enhanced. Examples of such genes are arginine regulon genes, preferably a gene encoding N-acetylglutamate synthase, a feedback sensitivity of L-arginine that has been lost (Rajagopal BS et al., Appl. Environ. Microbiol., 1998, v. 64, No.5, p. 1805-1811). Examples of such genes for an L-proline producing bacterium are proline biosynthesis genes, preferably a proB gene encoding glutamate kinase, which lost feedback sensitivity to L-proline inhibition (German patent DE 3127361).
К способам согласно настоящему изобретению относится способ продукции L-аргинина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-аргинина в указанной питательной среде, и сбора L-аргинина из культуральной жидкости. Также, к способам согласно настоящему изобретению относится способ продукции L-пролина, включающий стадии выращивания бактерии согласно настоящему изобретению в питательной среде с целью продукции и накопления L-пролина в указанной питательной среде, и сбора L-пролина из культуральной жидкости. The methods of the present invention include a method for producing L-arginine, comprising the steps of growing the bacterium of the present invention in a culture medium to produce and accumulate L-arginine in said culture medium and collect L-arginine from the culture fluid. Also, methods of the present invention include a method for producing L-proline, comprising the steps of growing a bacterium according to the present invention in a culture medium to produce and accumulate L-proline in said culture medium and collect L-proline from the culture fluid.
Согласно настоящему изобретению выращивание, сбор и очистка L-аминокислоты из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам ферментации, в которых аминокислота продуцируется с использованием микроорганизма. Питательная среда, используемая для выращивания, может быть как синтетической, так и натуральной при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, которые требуются микроорганизму для роста. К источникам углерода относятся различные углеводы, такие как глюкоза и сахароза, и различные органические кислоты. В зависимости от степени ассимиляции используемого микроорганизма могут использоваться спирты, такие как этанол и глицерин. В качестве источника азота могут использоваться различные соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота, такие как пептон, гидролизат соевых бобов и ферментолизат микроорганизмов. В качестве минеральных добавок используются монофосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные соединения. According to the present invention, the cultivation, collection and purification of an L-amino acid from a culture or similar liquid may be carried out in a manner similar to traditional fermentation methods in which the amino acid is produced using a microorganism. The nutrient medium used for growing can be either synthetic or natural, provided that the medium contains sources of carbon, nitrogen, mineral additives and, if necessary, the appropriate amount of nutrient additives that the microorganism needs for growth. Carbon sources include various carbohydrates, such as glucose and sucrose, and various organic acids. Depending on the degree of assimilation of the microorganism used, alcohols such as ethanol and glycerin may be used. Various ammonium salts, such as ammonia and ammonium sulfate, other nitrogen compounds, such as amines, natural nitrogen sources, such as peptone, soybean hydrolyzate, and microorganism fermentolizate, can be used as a nitrogen source. As mineral additives, potassium monophosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, iron sulfate, manganese sulfate, calcium chloride and the like are used.
Выращивание осуществляется предпочтительно в аэробных условиях, таких как перемешивание, ферментация с аэрацией, при температуре от 20 до 40oС, предпочтительно от 30 до 38oС. рН питательной среды находится в пределах от 5 до 9, предпочтительно от 6,5 до 7,2. рН среды может регулироваться аммиаком, карбонатом кальция, различными кислотами, основаниями и буферами. Обычно выращивание в течение от 1 до 5 дней приводит к накоплению целевой L-аминокислоты в культуральной жидкости.The cultivation is preferably carried out under aerobic conditions, such as stirring, fermentation with aeration, at a temperature of from 20 to 40 o C, preferably from 30 to 38 o C. the pH of the nutrient medium is in the range from 5 to 9, preferably from 6.5 to 7 , 2. The pH of the medium can be adjusted by ammonia, calcium carbonate, various acids, bases and buffers. Typically, growing for 1 to 5 days leads to the accumulation of the target L-amino acid in the culture fluid.
После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования или фильтрацией через мембрану, а затем целевая L-аминокислота может быть собрана и очищена методами ионообменной хроматографии, концентрирования и кристаллизации. After cultivation, solid residues, such as cells, can be removed from the culture fluid by centrifugation or filtration through a membrane, and then the target L-amino acid can be collected and purified by ion exchange chromatography, concentration and crystallization.
Краткое описание чертежей
На чертеже показана схема конструирования плазмиды pΔlacZ.Brief Description of the Drawings
The drawing shows the construction scheme of the plasmid pΔlacZ.
Наилучший способ осуществления изобретения
Настоящее изобретение более детально описано со ссылкой на примеры. В указанных примерах аминокислоты являются аминокислотами L-конфигурации, если не указано иное.BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present invention is described in more detail with reference to examples. In these examples, amino acids are amino acids of the L configuration, unless otherwise indicated.
Пример 1. Клонирование гена b3434 на плазмиде pΔlacZ. Example 1. Cloning of the b3434 gene on plasmid pΔlacZ.
Для клонирования гена b3434 был использован вектор pΔlacZ. Вектор pΔlacZ является производным вектора pET-22b(+) (Novagen, Madison, WI, USA). Вектор рЕТ- 22b(+) был обработан рестриктазами BglII и ХbaI и лигирован с фрагментом полимеразной цепной реакции (ПЦР), полученным на плазмиде рМВ9-lac (Fuller F., Gene, 19, 43-54, 1982), обработанным теми же рестриктазами и содержащим промотор PlacUV5. Для амплификации с помощью ПЦР фрагмента с промотором PlacUV5 использовались затравки, приведенные под номерами 5 и 6. В полученную плазмиду была вставлена структурная часть гена lacZ (237 пар оснований без промотора) путем клонирования SalI-BaHI фрагмента плазмиды pJEL250 (Дымакова Е. и др. Генетика, 35,2,181-186,1999). Схема конструкции вектора pΔlacZ показана на чертеже.The vector pΔlacZ was used to clone the b3434 gene. The pΔlacZ vector is a derivative of the pET-22b (+) vector (Novagen, Madison, WI, USA). The pET-22b (+) vector was digested with restriction enzymes BglII and XbaI and ligated with a fragment of the polymerase chain reaction (PCR) obtained on the plasmid pMB9-lac (Fuller F., Gene, 19, 43-54, 1982), treated with the same restriction enzymes and containing the promoter P lac UV5. For amplification using a PCR fragment with the P lac UV5 promoter, seeds were used, numbered 5 and 6. The structural part of the lacZ gene (237 base pairs without promoter) was inserted into the obtained plasmid by cloning the SalI-BaHI fragment of plasmid pJEL250 (E. Dymakova and Dr. Genetics, 35,2,181-186,1999). The design scheme of the vector pΔlacZ is shown in the drawing.
Исходным материалом для клонирования предполагаемой рамки считывания b3434 из Е.coli (гена b3434) был фрагмент ПЦР, полученный с использованием ДНК из штамма Е.coli TG1 в качестве матрицы. Для синтеза этого фрагмента были использованы две затравки, нуклеотидная последовательность которых приведена под номерами 1 и 2. ПЦР осуществлялась на "Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400" в следующих условиях: 40 секунд при 95oС, 40 секунд при 47oС, 40 секунд при 72oС, 30 циклов. Таким образом был получен линейный фрагмент ДНК длиной 647 пар оснований, содержащий ген b3434. Данный фрагмент ПЦР был обработан рестриктазами XbaI и BamHI и введен в многокопийный вектор pΔlacZ, предварительно обработанный теми же рестриктазами.The source material for cloning the proposed reading frame b3434 from E. coli (gene b3434) was a PCR fragment obtained using DNA from E. coli strain TG1 as a template. For the synthesis of this fragment, two seeds were used, the nucleotide sequence of which is given as
Полученная плазмида, содержащая фрагмент ПЦР, была названа как pYHGN и содержала ген b3434 под контролем лактозного промотора (PlacUV5).The resulting plasmid containing the PCR fragment was named pYHGN and contained as the b3434 gene under the control of the lactose promoter (P lac UV5).
Пример 2. Влияние амплифицированного гена b3434 на устойчивость штамма Е.coli TG1 к аминокислотам и их аналогам. Example 2. The effect of the amplified gene b3434 on the resistance of E. coli TG1 strain to amino acids and their analogues.
Штамм Е. coli TG1 (pYHGN) и штамм Е.coli TG1, содержащий вектор без вставки (контрольный штамм), выращивались в течение ночи в среде LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Ночные культуры всех штаммов были разбавлены в 25 раз свежей средой LB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл) и ИПТГ (0,5 мМ), и инкубировались в течение 2 часов при 37oС с аэрацией. Культуры в фазе логарифмического роста были разбавлены 0,9% раствором хлорида натрия и около 1000 клеток были высеяны на чашки с твердой питательной средой Адамса, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), ИПТГ (0,5 мМ) и аминокислоту или ее аналог. После 2-4 дней инкубации при 37oС определялись различия в размере колоний или их числе между штаммом TG1, содержащим гибридную плазмиду, и контрольным штаммом TG1. Результаты экспериментов представлены в Таблице 1.The E. coli TG1 strain (pYHGN) and the E. coli TG1 strain containing the vector without insertion (control strain) were grown overnight in LB medium containing ampicillin (100 μg / ml). The overnight cultures of all strains were diluted 25 times with fresh LB medium containing ampicillin (100 μg / ml) and IPTG (0.5 mM), and were incubated for 2 hours at 37 ° C with aeration. The cultures in the logarithmic growth phase were diluted with a 0.9% sodium chloride solution and about 1000 cells were plated on plates with Adams solid nutrient medium containing ampicillin (100 μg / ml), IPTG (0.5 mM) and an amino acid or its analogue. After 2-4 days of incubation at 37 ° C. , differences in the size of the colonies or their number between the strain TG1 containing the hybrid plasmid and the control strain TG1 were determined. The experimental results are presented in Table 1.
Пример 3. Продукция аргинина штаммом, содержащим плазмиду pYHGN. Example 3. Production of arginine strain containing plasmid pYHGN.
Штамм 382-продуцент аргинина был трансформирован плазмидой pYHGN, содержащей ген b3434 под контролем промотора PlacUV5. Штамм 382 был депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 113545 Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 10 апреля 2000 года под инвентарным номером ВКПМ В-7926.Strain 382-producer of arginine was transformed with plasmid pYHGN containing the b3434 gene under the control of the promoter P lac UV5.
5 колоний каждого из штаммов 382, 382 (рΔlасZ) в качестве контрольного штамма, содержащего плазмиду без вставки, и 382 (pYHGN) были суспендированы в 2 мл минимальной питательной среды ((NH4)2SO4 - 25,0 г/л, К2НРO4 - 2,0 г/л, MgSO4•7Н2О - 1,0 г/л, тиамин - 0,2 мг/л, дрожжевой экстракт - 5,0 г/л, глюкоза - 60 г/л и ампициллин - 100 мг/л, если необходимо) в 20 мл пробирках и инкубировались в течение ночи с аэрацией при 32oС. 0,2 мл каждой ночной культуры были перенесены в три 20 мл пробирки с 2 мл свежей среды для ферментации с или без ИПТГ и выращивались при 32oС в течение 72 часов на роторной качалке.5 colonies of each of
Состав среды для ферментации:
(NH4)2SO4 - 25 г/л
К2НРO4 - 2,0 г/л
MgSO4•7Н2O - 1,0 г/л
Тиамин - 0,2 мг/л
Дрожжевой экстракт - 5,0 г/л
Глюкоза - 60 г/л
СаСО3 - 20 г/л
Ампициллин - 300 мг/л, если необходимо
ИПТГ - 0,5 мМ, если необходимо
После выращивания стабильность плазмиды и оптическая плотность культуральной жидкости при 540 нм были определены традиционными методами. Накопленное в культуральной жидкости количество аргинина было определено с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ). Состав подвижной фазы для ТСХ следующий: изопропанол - 80 мл, этилацетат - 40 мл, NH4OH (30%) - 25 мл, Н2О - 50 мл. Результаты приведены в Таблице 2. Как видно, гибридная плазмида pYHGN увеличивала накопление аргинина штаммом 382 - продуцентом аргинина.The composition of the medium for fermentation:
(NH 4 ) 2 SO 4 - 25 g / l
K 2 HPO 4 - 2.0 g / l
MgSO 4 • 7H 2 O - 1.0 g / l
Thiamine - 0.2 mg / L
Yeast extract - 5.0 g / l
Glucose - 60 g / l
CaCO 3 - 20 g / l
Ampicillin - 300 mg / l, if necessary
IPTG - 0.5 mm, if necessary
After cultivation, plasmid stability and optical density of the culture fluid at 540 nm were determined by conventional methods. The amount of arginine accumulated in the culture fluid was determined by thin layer chromatography (TLC). The composition of the mobile phase for TLC is as follows: isopropanol - 80 ml, ethyl acetate - 40 ml, NH 4 OH (30%) - 25 ml, H 2 O - 50 ml. The results are shown in Table 2. As can be seen, the hybrid plasmid pYHGN increased the accumulation of arginine by
Пример-ссылка. Продукция L-пролина продуцентом L-пролина, дефицитным по гену ilvA. Example link. Production of L-Proline by the L-Proline Producer Deficient in the ilvA Gene.
Клетки природного штамма Е.coli К12 (ВКПМ В-7) были обработаны мутагеном, N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидином (0,1 мг/мл), в течение 20 минут при 37oС, отмыты и помещены на минимальную агаризованную среду М9, дополненную 1,25 мг/мл триптона, 10 мг/мл L-пролина и 0,05 мг/мл хлорида 2,3,5-трифенилтетразолина. Большинство колоний, выросших после 3 дней инкубации при 37oС, были окрашены красным. Несколько колоний, не способных окислять L-пролин, были белыми. Одна из этих колоний была использована в качестве исходной для получения мутантов, устойчивых к аналогам пролина (3,4-дегидроксипролин и азетидин-2-карбоксилат), каждый из которых был добавлен в агаризованную среду М9 в концентрации 2 мг/мл.Cells of the natural E. coli K12 strain (VKPM B-7) were treated with mutagen, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (0.1 mg / ml), for 20 minutes at 37 ° C, washed and placed on the minimum agar medium M9 supplemented with 1.25 mg / ml tryptone, 10 mg / ml L-proline and 0.05 mg /
Некоторые из выросших мутантов могли продуцировать L-пролин. Наилучший продуцент L-пролина 702 был обработан бактериофагом Р1, выращенным на клетках штамма TG1, в котором ген ilvA был разрушен путем вставки гена устойчивости (Cmr) к хлорамфениколу (Cm). Один из устойчивых к Cm трансдуктантов, 702ilvA, который стал ауксотрофным по L-изолейцину, был гораздо более эффективным продуцентом L-пролина, чем исходный прототрофный по L-изолейцину штамм 702 (Таблица 3). Питательная среда для ферментации содержала 60 г/л глюкозы, 25 г/л (NH4)2SO4, 2 г/л КН2РO4, 1 г/л MgSO4, 0,1 мг/л тиамина, 50 мг/л L-изолейцина и 25 г/л мела (рН 7,2). Глюкоза и мел были стерилизованы раздельно. 2 мл питательной среды были помещены в пробирки и инокулированы одной петлей исследуемых микроорганизмов, затем выращивание производилось при 37oС в течение 2 дней на качалке.Some of the grown mutants could produce L-proline. The best producer of L-proline 702 was treated with bacteriophage P1 grown on cells of strain TG1 in which the ilvA gene was destroyed by inserting the resistance gene (Cm r ) to chloramphenicol (Cm). One of the Cm-resistant transductants, 702ilvA, which became L-isoleucine auxotrophic, was a much more efficient producer of L-proline than the original L-isoleucine prototrophic strain 702 (Table 3). The fermentation medium contained 60 g / l glucose, 25 g / l (NH 4 ) 2 SO 4 , 2 g / l KH 2 PO 4 , 1 g / l MgSO 4 , 0.1 mg / l thiamine, 50 mg / l of L-isoleucine and 25 g / l of chalk (pH 7.2). Glucose and chalk were sterilized separately. 2 ml of culture medium were placed in test tubes and inoculated with one loop of the studied microorganisms, then cultivation was carried out at 37 o C for 2 days on a rocking chair.
Штаммы 702 и 702ilvA были депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) 25 июля 2000 под инвентарными номерами ВКПМ В-8011 и ВКПМ В-8012 соответственно. Strains 702 and 702ilvA were deposited in the All-Russian Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) on July 25, 2000 under inventory numbers VKPM B-8011 and VKPM B-8012, respectively.
Пример 4. Продукция пролина штаммом, содержащим плазмиду pYHGN. Example 4. The production of proline strain containing the plasmid pYHGN.
Штамм E. coli 702ilvA - продуцент пролина был трансформирован плазмидой pYHGN, содержащей ген b3434 под контролем промотора PlacUV5.The strain E. coli 702ilvA - producing proline was transformed with plasmid pYHGN, comprising b3434 gene under the control of promoter P lac UV5.
5 колоний каждого из штаммов 702ilvA, 702ilvA (pΔlacZ) в качестве контрольного штамма, содержащего плазмиду без вставки, и 702ilvA (pYHGN) были суспендированы в 2 мл минимальной питательной среды ((NH4)2SO4 - 18 г/л, К2НРO4 - 1,8 г/л, MgSO4 - 1,2 г/л, тиамин - 0,1 мг/л, дрожжевой экстракт - 0,5 г/л, глюкоза - 60 г/л, изолейцин - 50 мг/л, ампициллин - 300 мг/л, если необходимо) в 20 мл пробирках и инкубировались в течение ночи с аэрацией при 32oС. 0,2 мл каждой ночной культуры были перенесены в три 20 мл пробирки с 2 мл свежей среды для ферментации с или без ИПТГ и выращивались при 32oС в течение 40 часов на роторной качалке.5 colonies of each of the strains 702ilvA, 702ilvA (pΔlacZ) as a control strain containing a plasmid without insert, and 702ilvA (pYHGN) were suspended in 2 ml of minimal nutrient medium ((NH 4 ) 2 SO 4 - 18 g / l, K 2 HPO 4 - 1.8 g / l, MgSO 4 - 1.2 g / l, thiamine - 0.1 mg / l, yeast extract - 0.5 g / l, glucose - 60 g / l, isoleucine - 50 mg / l, ampicillin - 300 mg / l, if necessary) in 20 ml tubes and incubated overnight with aeration at 32 o C. 0.2 ml of each overnight culture were transferred to three 20 ml tubes with 2 ml of fresh fermentation medium with or without IPTG and cultivated at 32 o C for 40 aces on a rotary shaker.
Состав среды для ферментации:
(NH4)2SO4 - 18 г/л
К2НРO4 - 1,8 г/л
MgSO4 - 1,2 г/л
СаСО3 - 20 г/л
Тиамин - 0,1 мг/л
Глюкоза - 60 г/л
Изолейцин - 50 мг/л
Ампициллин - 300 мг/л, если необходимо
ИПТГ - 0,5 мМ, если необходимо
После выращивания стабильность плазмиды и оптическая плотность культуральной жидкости при 540 нм были определены традиционными методами. Накопленное в культуральной жидкости количество пролина было определено с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ). Состав подвижной фазы для ТСХ следующий: этанол - 80 мл, NH4OH (30%) - 5 мл, H2O - 25 мл. Результаты приведены в Таблице 4. Как видно, гибридная плазмида pYHGN увеличивала накопление пролина штаммом 702ilvA - продуцентом пролина.The composition of the medium for fermentation:
(NH 4 ) 2 SO 4 - 18 g / l
K 2 HPO 4 - 1.8 g / l
MgSO 4 - 1.2 g / l
CaCO 3 - 20 g / l
Thiamine - 0.1 mg / L
Glucose - 60 g / l
Isoleucine - 50 mg / L
Ampicillin - 300 mg / l, if necessary
IPTG - 0.5 mm, if necessary
After cultivation, plasmid stability and optical density of the culture fluid at 540 nm were determined by conventional methods. The amount of proline accumulated in the culture fluid was determined by thin layer chromatography (TLC). The composition of the mobile phase for TLC is as follows: ethanol - 80 ml, NH 4 OH (30%) - 5 ml, H 2 O - 25 ml. The results are shown in Table 4. As can be seen, the hybrid plasmid pYHGN increased proline accumulation by strain 702ilvA, a proline producer.
Claims (9)
(A) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, приведенной в списке последовательностей под номером 3;
(B) белок, который представлен аминокислотной последовательностью, включающей делеции, замены, вставки или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотную последовательность, приведенную в списке последовательностей под номером 3, и который обладает активностью, придающей бактерии устойчивость к L-аминокислотам и/или их аналогам, таким, как DL-О-метилсерин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин и DL-β-гидроксинорвалин, а также придающей бактерии чувствительность к S-(2-аминоэтил)цистеину.1. A method for producing the L-amino acid of the L-glutamic acid family by fermentation, which includes the steps of growing the bacteria Escherichia coli, the producer of the L-amino acid in a nutrient medium, and isolating the L-amino acid from the culture fluid, characterized in that E. is used as the producer strain. coli, the ability to produce L-amino acids of which is additionally increased by increasing the activity of the protein described in paragraph (A) or (B):
(A) a protein that is represented by the amino acid sequence shown in sequence listing number 3;
(B) a protein that is represented by an amino acid sequence including deletions, substitutions, insertions, or the addition of one or more amino acids to the amino acid sequence listed in sequence number 3, and which has an activity that confers bacteria resistance to L-amino acids and / or their analogues, such as DL-O-methylserine, 6-diazo-5-oxo-L-norleucine and DL-β-hydroxyquinorvaline, as well as giving the bacteria sensitivity to S- (2-aminoethyl) cysteine.
Priority Applications (19)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001117633A RU2215785C2 (en) | 2001-06-28 | 2001-06-28 | Method for preparing l-amino acids, strain escherichia coli as producer of l-amino acid (variants) |
| US10/073,293 US7476531B2 (en) | 2001-02-13 | 2002-02-13 | Method for producing L-amino acid using bacteria belonging to the genus Escherichia |
| EP04028876A EP1526179B9 (en) | 2001-02-13 | 2002-02-13 | Method for producing l-amino acid using bacteria belonging to the genus escherichia |
| DE60210697T DE60210697T2 (en) | 2001-02-13 | 2002-02-13 | Process for the production of L-amino acids by means of bacteria of the genus Escherichia |
| EP04028877A EP1526181B1 (en) | 2001-02-13 | 2002-02-13 | Method for producing l-amino acid using bacteria belonging to the genus escherichia |
| BR122013017189A BR122013017189B1 (en) | 2001-02-13 | 2002-02-13 | l-amino acid producing bacterium belonging to the genus escherichia, and method for producing l-amino acid |
| CN2009101594504A CN101597589B (en) | 2001-02-13 | 2002-02-13 | Method for producing l-amino acid using bacteria belonging to the genus escherichia |
| BRPI0200350-3A BR0200350B1 (en) | 2001-02-13 | 2002-02-13 | Transgenic bacterium producing L-amino acid belonging to the genus Escherichia and method for producing L-amino acid |
| JP2002034760A JP5087194B2 (en) | 2001-02-13 | 2002-02-13 | Method for producing L-amino acid using Escherichia bacterium |
| DE60219969T DE60219969T2 (en) | 2001-02-13 | 2002-02-13 | Method for the production of L-amino acids by means of bacteria of the genus Escherichia |
| BR122013017187A BR122013017187B1 (en) | 2001-02-13 | 2002-02-13 | transgenic l-amino acid producing bacterium belonging to the genus escherichia, and method for producing l-amino acid |
| CN2009101594487A CN101597588B (en) | 2001-02-13 | 2002-02-13 | Method for producing l-amino acid using bacteria belonging to the genus escherichia |
| DE60219968T DE60219968T2 (en) | 2001-02-13 | 2002-02-13 | Process for the production of L-amino acids by means of bacteria of the genus Escherichia |
| EP02003335A EP1239041B1 (en) | 2001-02-13 | 2002-02-13 | Method for producing L-amino acid using bacteria belonging to the genus Escherichia |
| CNB021080860A CN100529057C (en) | 2001-02-13 | 2002-02-13 | Method for producing L-amino acid by colibacillus bacteria |
| JP2007273972A JP2008067714A (en) | 2001-02-13 | 2007-10-22 | Method for producing l-amino acid using bacteria belonging to genus escherichia |
| JP2007273965A JP5087362B2 (en) | 2001-02-13 | 2007-10-22 | Method for producing L-amino acid using Escherichia bacterium |
| US12/120,409 US7618804B2 (en) | 2001-02-13 | 2008-05-14 | Method for producing L-amino acid using bacteria belonging to the genus Escherichia |
| US12/120,404 US7618803B2 (en) | 2001-02-13 | 2008-05-14 | Method for producing L-amino acid using bacteria belonging to the genus Escherichia |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001117633A RU2215785C2 (en) | 2001-06-28 | 2001-06-28 | Method for preparing l-amino acids, strain escherichia coli as producer of l-amino acid (variants) |
Related Parent Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001104998A Substitution RU2215782C2 (en) | 2001-02-13 | 2001-02-26 | Method for preparing l-amino acids, strain escherichia coli as producer of l-amino acid (variants) |
| RU2001104999 Substitution | 2001-02-13 | 2001-02-26 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2001117633A RU2001117633A (en) | 2003-04-10 |
| RU2215785C2 true RU2215785C2 (en) | 2003-11-10 |
Family
ID=32026692
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001117633A RU2215785C2 (en) | 2001-02-13 | 2001-06-28 | Method for preparing l-amino acids, strain escherichia coli as producer of l-amino acid (variants) |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2215785C2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2471868C2 (en) * | 2010-02-18 | 2013-01-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Mutant adenylate cyclase, dna coding it, bacteria of enterobacteriaceae family containing said dan and method for preparing l-amino acids |
-
2001
- 2001-06-28 RU RU2001117633A patent/RU2215785C2/en active
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2471868C2 (en) * | 2010-02-18 | 2013-01-10 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Mutant adenylate cyclase, dna coding it, bacteria of enterobacteriaceae family containing said dan and method for preparing l-amino acids |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5087194B2 (en) | Method for producing L-amino acid using Escherichia bacterium | |
| RU2207376C2 (en) | Method for preparing l-amino acid by fermentation method, strain of bacterium escherichia coli as producer of l-amino acid (variants) | |
| US6887691B2 (en) | DNA coding for protein which confers on bacterium Escherichia coli resistance to L-homoserine, and method for producing L-amino acids | |
| RU2175351C2 (en) | Escherichia coli dna fragment determining enhanced production of l-amino acids (variants) and method of l-amino acid producing | |
| EP1149911B1 (en) | Amino acid producing strains belonging to the genus Escherichia and method for producing an amino acid | |
| RU2231552C2 (en) | Method for microbiological preparing amino acids of family aspartates and/or glutamates and agents used in method | |
| RU2148642C1 (en) | Dna rhtc fragment encoding synthesis of rhtc protein that determines enhanced resistance of bacterium escherichia coli to l-threonine and method of l-amino acid producing | |
| RU2215782C2 (en) | Method for preparing l-amino acids, strain escherichia coli as producer of l-amino acid (variants) | |
| RU2276687C2 (en) | Bacterium belonging to genus escherichia as producer of l-histidine and method for preparing l-histidine | |
| EP1170361A2 (en) | New mutant N-Acetylglutamate synthase and method for L-Arginine production | |
| KR101142885B1 (en) | E.coli mutant strain containing mutant genes related with Tryptophan biosynthesis and Production method of Tryptophan by using the same | |
| JP2012120536A (en) | Increased lysine production by gene amplification | |
| CN101760441B (en) | A method for producing l-arginine using a bacterium of enterobacteriaceae family, having attenuated expression of a gene encoding an l-arginine transporter | |
| CN110418843A (en) | The method that Novel L-tryptophan exports albumen and produces L-Trp using it | |
| RU2395580C2 (en) | Method of building (2s,3r,4s)-4-hydroxy-l-isoleucine producing bacteria, (2s, 3r, 4s)-4-hydroxy-l-isoleucine producing bacteria and method of producing (2s, 3r, 4s)-hydroxy-l-isoleucine or salt thereof | |
| RU2333950C2 (en) | METHOD OF PRODUCTION OF AROMATIC L-AMINO ACIDS USING BACTERIUM BELONGING TO GENUS Methylophilus | |
| KR900004424B1 (en) | Process for producing amino acids | |
| RU2215784C2 (en) | Method for preparing l amino acids, strain escherichia coli as producer of l-amino acid (variants) | |
| CN111763699A (en) | Recombinant DNA (deoxyribonucleic acid) for producing 1, 5-pentanediamine through fermentation, strain and application of recombinant DNA | |
| RU2215785C2 (en) | Method for preparing l-amino acids, strain escherichia coli as producer of l-amino acid (variants) | |
| US20060040364A1 (en) | DNA coding for a protein which imparts L-homoserine resistance to Escherichia coli bacterium, and a method for producing L-amino acids | |
| CN101597589A (en) | Produce the amino acid whose method of L-by the Escherichia bacterium | |
| RU2268305C2 (en) | Method for preparing l-amino acids by using microorganisms with optimized level of gene expression |