RU2268062C1 - Biotransplant, method for its obtaining (variants) and method for treating dilation cardiomyopathy - Google Patents
Biotransplant, method for its obtaining (variants) and method for treating dilation cardiomyopathy Download PDFInfo
- Publication number
- RU2268062C1 RU2268062C1 RU2004116840/15A RU2004116840A RU2268062C1 RU 2268062 C1 RU2268062 C1 RU 2268062C1 RU 2004116840/15 A RU2004116840/15 A RU 2004116840/15A RU 2004116840 A RU2004116840 A RU 2004116840A RU 2268062 C1 RU2268062 C1 RU 2268062C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- fetal
- biograft
- thymus
- bone marrow
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Изобретение относится к области медицины и касается приготовления генетически немодифицированной культуры мезенхимальных стволовых клеток человека и способа лечения кардиомиопатии.The invention relates to medicine and for the preparation of a genetically unmodified culture of human mesenchymal stem cells and a method for the treatment of cardiomyopathy.
Заболевания сердечной мышцы, или кардиомиопатии (от cardio - сердце, myo - мышца и pathos - заболевание), нарушают насосную функцию сердца, уменьшают его способность эффективно перекачивать кровь и представляет серьезную опасность для здоровья человека. Кардиомиопатии входят в группу четырех наиболее распространенных заболеваний сердца. Кардиомиопатию трудно распознать, она часто поражает молодых людей и часто заканчивается трагически.Diseases of the heart muscle, or cardiomyopathy (from cardio - heart, myo - muscle and pathos - disease), disrupt the pumping function of the heart, reduce its ability to pump blood efficiently and pose a serious danger to human health. Cardiomyopathies are among the four most common heart diseases. Cardiomyopathy is difficult to recognize, it often affects young people and often ends tragically.
При дилятационной кардиомиопатии (ДКМП) разрушается мышечная ткань миокарда, причем ослабляется сократительная способность всех камер сердца. У пациентов с критическим снижением массы жизнеспособного миокарда вследствие диффузного некроза и/или апоптоза ни хирургические, ни тем более терапевтические мероприятия не эффективны, поскольку сердце относится к нерегенерируемым органам. Кардиомиоциты перестают делиться сразу после рождения человека и в дальнейшем, при их повреждении преобладают не пролиферативные процессы в паренхиме, а фибропластические реакции стромы, которые почти необратимы [3]. В подобных случаях единственным альтернативным методом лечения является лишь способ создания новых сократительных элементов путем трансплантации в миокард клеток для замещения функции погибших кардиомиоцитов или трансплантация целого органа.With dilated cardiomyopathy (DCMP), myocardial muscle tissue is destroyed, and the contractility of all the chambers of the heart is weakened. In patients with a critical decrease in viable myocardial mass due to diffuse necrosis and / or apoptosis, neither surgical nor therapeutic measures are effective, since the heart belongs to non-regenerable organs. Cardiomyocytes cease to divide immediately after the birth of a person and later on, when they are damaged, it is not proliferative processes in the parenchyma that predominate, but stromal fibroplastic reactions, which are almost irreversible [3]. In such cases, the only alternative treatment method is only to create new contractile elements by transplanting into the myocardium cells to replace the function of dead cardiomyocytes or transplanting an entire organ.
Клеточная трансплантация обладает рядом важных преимуществ по сравнению с пересадкой целого органа (сердца) [2]:Cell transplantation has several important advantages compared with transplantation of a whole organ (heart) [2]:
заместительная клеточная терапия позволяет культуральными методами избавиться от примеси сверхантигенных донорских клеток, которые в первую очередь вовлекаются в процесс иммунного отторжения;cell replacement therapy allows cultural methods to get rid of the admixture of superantigenic donor cells, which are primarily involved in the process of immune rejection;
подсадку клеток можно регулировать по дозам и многократно повторять;cell grafting can be adjusted in doses and repeated many times;
стоимость клеточной трансплантации значительно ниже, чем пересадки органа.the cost of cell transplantation is significantly lower than organ transplantation.
В настоящее время предпринимаются попытки трансплантации клеток костного мозга или специфически дифференцированных (кардиомиобласты, скелетные миобласты) клеток для улучшения сократительной функции миокарда при кардиомиопатии. Несмотря на значительное количество накопленных к настоящему времени данных, результаты пересадок противоречивы. С одной стороны, описана трансдифференцировка различных клеточных типов в кардиомиобласты, другими авторами показана невозможность нормального функционирования трансплантата, возникновение дополнительных очагов фиброза или элиминация донорских клеток.Currently, attempts are being made to transplant bone marrow cells or specifically differentiated (cardiomyoblasts, skeletal myoblasts) cells to improve myocardial contractile function in cardiomyopathy. Despite the significant amount of data accumulated to date, the results of the transplants are contradictory. On the one hand, the transdifferentiation of various cell types into cardiomyoblasts has been described; other authors have shown the impossibility of the normal functioning of the transplant, the occurrence of additional foci of fibrosis or the elimination of donor cells.
Большинство исследователей предпочитают аутогенные клетки (костный мозг, скелетные миобласты, клетки периферической крови). Преимущества аутотрансплантатов не вызывают сомнений, однако имеется ряд ограничений по их применению. В частности, длительность выращивания клеточных культур - более 2 месяцев, может являться критической для ряда пациентов; клетки, полученные от пожилых и тяжелобольных людей, обладают низкой способностью к пролиферации и самообновлению.Most researchers prefer autologous cells (bone marrow, skeletal myoblasts, peripheral blood cells). The advantages of autografts are not in doubt, but there are a number of restrictions on their use. In particular, the duration of cell culture growth - more than 2 months, may be critical for a number of patients; cells obtained from elderly and seriously ill people have a low ability to proliferate and self-renew.
В сравнении с аутологичным клеточным трансплантационным материалом донорские (в том числе фетальные) клетки обладают рядом преимуществ [4]:Compared with autologous cell transplantation material, donor (including fetal) cells have several advantages [4]:
фетальные клетки имеют больший потенциал роста и пролиферации, выраженную способность к дифференцировке и функционально более активны, продуцируют факторы роста и регенерации;fetal cells have a greater growth and proliferation potential, a pronounced ability to differentiate and are functionally more active; they produce growth and regeneration factors;
пересаженные фетальные клетки стимулируют ангиогенез [5];transplanted fetal cells stimulate angiogenesis [5];
эмбриональные и фетальные клетки и ткани лучше переносят гипоксию и холодовую консервацию;embryonic and fetal cells and tissues better tolerate hypoxia and cold preservation;
культуры донорских клеток могут быть приготовлены заранее и использоваться по первому требованию.donor cell cultures can be prepared in advance and used on demand.
Наиболее выраженным терапевтическим потенциалом при патологиях миокарда обладают мезенхимальные стволовые клетки (МСК), способные не только заместить погибшие кардиомиоциты, но и обеспечить реваскуляризацию зоны фиброза. Кардиомиоциты человека, в основном, прекращают делиться вскоре после рождения. Однако недавние исследования показали, что в сердце взрослого человека сохраняется небольшая популяция кардиомиоцитов, способная к пролиферации. Являясь уникальной «фабрикой» цитокинов и факторов роста, донорские МСК обеспечивают активизацию собственных резервов организма.The most pronounced therapeutic potential in myocardial pathologies is possessed by mesenchymal stem cells (MSCs), which can not only replace dead cardiomyocytes, but also provide revascularization of the fibrosis zone. Human cardiomyocytes generally stop dividing shortly after birth. However, recent studies have shown that a small population of cardiomyocytes capable of proliferation remains in the heart of an adult. Being a unique “factory” of cytokines and growth factors, donor MSCs provide activation of the body's own reserves.
Мезенхимальные стволовые клетки, в основном, получают из донорского костного мозга, однако существуют и другие источники - скелетные мышцы, подкожная жировая ткань, фетальные органы гемопоэза (печень, тимус, селезенка). МСК из фетальных органов гемопоэза и методики их получения практически не изучены. Описанные методики выращивания МСК из костного мозга и липоаспиратов позволяют получить гетерогенные популяции клеток стромы, лишь небольшой процент которых являются стволовыми. Клетки зрелой стромы не обладают свойством дифференцироваться в различные клеточные линии и, таким образом, терапевтически неэффективны. После трансплантации стромальные клетки мигрируют преимущественно в соединительную ткань и там накапливаются.Mesenchymal stem cells are mainly derived from donor bone marrow, but there are other sources - skeletal muscle, subcutaneous adipose tissue, fetal organs of hematopoiesis (liver, thymus, spleen). MSCs from fetal organs of hematopoiesis and methods for their preparation are practically not studied. The described methods for growing MSCs from bone marrow and lipoaspirates make it possible to obtain heterogeneous populations of stromal cells, only a small percentage of which are stem cells. The cells of the mature stroma do not possess the property of differentiating into different cell lines and, thus, are therapeutically ineffective. After transplantation, stromal cells migrate mainly to the connective tissue and accumulate there.
При стандартном пассировании в высоких посевных дозах доля зрелых стромальных клеток быстро увеличивается.With standard passage at high inoculum doses, the proportion of mature stromal cells increases rapidly.
Использование в качестве трансплантата гомогенной (не менее 80%) популяции плюрипотентных МСК позволяет повысить эффективность лечения, увеличить воспроизводимость результатов и избежать нежелательных эффектов.The use of a homogeneous (at least 80%) population of pluripotent MSCs as a transplant allows to increase the effectiveness of treatment, increase the reproducibility of the results and avoid undesirable effects.
В настоящее время существует два основных способа трансплантации клеточного материала в сердце: интрамиокардиальный и интракоронарный. При интрамиокардиальном введении часть клеток (до 45%) гибнет от ишемии, поскольку уровень васкуляризации в месте введения может оказаться недостаточным [7].Currently, there are two main methods of transplantation of cellular material in the heart: intramyocardial and intracoronary. With intramyocardial administration, part of the cells (up to 45%) die from ischemia, since the level of vascularization at the injection site may be insufficient [7].
Интрамиокардиальный способ введения не может обеспечить равномерного распределения клеточного материала в толще миокарда [6].The intramyocardial route of administration cannot ensure uniform distribution of cellular material in the thickness of the myocardium [6].
При использовании интрамиокардиального способа большинство исследователей отмечают у своих пациентов повышенную склонность к развитию различного рода аритмий в послеоперационном периоде (от желудочковой экстрасистолии до фибрилляции желудочков). Опыт свидетельствует об очень упорном течении этих аритмий и их рефрактерности к медикаментозной терапии. Подобных недостатков лишен метод интракоронарного введения клеточного трансплантата.When using the intramyocardial method, most researchers note in their patients an increased tendency to develop various kinds of arrhythmias in the postoperative period (from ventricular extrasystole to ventricular fibrillation). Experience indicates a very persistent course of these arrhythmias and their refractoriness to drug therapy. The method of intracoronary administration of a cell transplant is devoid of such disadvantages.
Задачей настоящего изобретения является получение биотрансплантата для наиболее эффективного (комплексного) воздействия на миокард человека и разработка наиболее эффективного способа введения при дилятационной кардиомиопатии.The objective of the present invention is to obtain a biograft for the most effective (complex) effects on the human myocardium and the development of the most effective method of administration in dilated cardiomyopathy.
Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенная общим изобретательским замыслом.To solve this problem, a group of inventions is proposed, united by a common inventive concept.
Биотрансплантат для лечения дилятационной кардиомиопатии, содержащий мезенхимальные стволовые клетки (МСК), полученные из фетального или донорского материала, при этом ткань дезагрегируют, далее культивируют в виде прикрепленных колоний в ростовой среде, содержащей эмбриональную телячью сыворотку и глутамин, затем неоднократно пассируют в низкой плотности с изменением состава среды, а культивирование ведут избегая накопления в культуре клеток зрелой стромы.A biograft for the treatment of dilated cardiomyopathy containing mesenchymal stem cells (MSCs) obtained from fetal or donor material, the tissue is disaggregated, then cultured as attached colonies in a growth medium containing fetal calf serum and glutamine, and then repeatedly passaged in low density with a change in the composition of the medium, and cultivation is avoided by the accumulation of mature stroma cells in the culture.
В качестве фетального материала используют ткани на сроках гестации: печень 5-8 недель, тимус 18-20 недель, костный мозг 17-20 недель, подкожная жировая ткань 17-19 недель.Tissues for gestation are used as fetal material: liver 5-8 weeks, thymus 18-20 weeks, bone marrow 17-20 weeks, subcutaneous adipose tissue 17-19 weeks.
В качестве донорского материала используют костный мозг, подкожную жировую ткань, тимус (у детей 6 лет), которые забирают у пациента для последующей аутотрансплантации и аллотрансплантации.As the donor material, bone marrow, subcutaneous adipose tissue, and thymus are used (in children 6 years old), which are taken from the patient for subsequent autologous transplantation and allotransplantation.
Предложен способ получения биотрансплантата для лечения дилятационной кардиомиопатии, заключающийся в том, что МСК выращивают в виде прикрепленных колоний на ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, селектированной для выращивания клеток в низкой плотности, 2 мМ глутамина, 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фиобластов - 2 и 8 U/мл гепарина, при этом отбирают плотные колонии мелких клеток (диаметром 7-10 мкм) с большим количеством митозов, а выращивание колоний ведут из плотности 10-50 клеток на см2, при этом используют МСК с преимущественной способностью к миогенной дифференцировке, выделенные из фетальных (костный мозг, тимус, печень, жировая ткань) тканей человека, и МСК с преимущественной способностью к миогенной дифференцировке, выделенные из тканей пациента (костный мозг, тимус, печень, жировая ткань).A method for producing a biograft for the treatment of dilated cardiomyopathy is proposed, namely, MSCs are grown in the form of attached colonies on DMEM / F12 growth medium containing 15% fetal calf serum selected for cell growth in low density, 2 mM glutamine, 10 μg / ml transferrin, 1 μg / ml insulin, 10 ng / ml phioblast growth factor - 2 and 8 U / ml heparin, while dense colonies of small cells (7-10 μm in diameter) with a large number of mitoses are selected, and colonies are grown from a density of 10 -50 cells per cm 2 , using MSCs with a primary ability for myogenic differentiation, isolated from fetal (bone marrow, thymus, liver, adipose tissue) human tissues, and MSCs with a primary ability for myogenic differentiation, isolated from patient’s tissues (bone marrow, thymus , liver, adipose tissue).
Предложен биотрансплантат для лечения дилятационной кардиомиопатии, содержащий фетальные миобласты, полученные из скелетных мышц фетусов человека 1-2 триместра беременности, и включает не менее 80% клеток, экспрессирующих маркеры раннего миогенеза (Myo D-1).A biotransplant is proposed for the treatment of dilated cardiomyopathy, containing fetal myoblasts obtained from skeletal muscle of human fetuses of the 1-2 trimester of pregnancy, and includes at least 80% of cells expressing markers of early myogenesis (Myo D-1).
Предложен также способ получения биотрансплантата для лечения дилятационной кардиомиопатии, заключающийся в том, что ткань скелетных мышц фетусов человека 1-2 триместра беременности отмывают, измельчают, далее дезагрегируют в растворе, содержащем раствор коллагеназы II типа и трипсина в течение 40-90 минут, полученную суспензию диссициированных клеток культивируют до достижения конфлюэнтного монослоя, затем осуществляют пассирование, дезагрегацию монослоя раствором трипсина, при этом процесс культивирования ведут 18-25 дней при 37°С в атмосфере 9-10% CO2.A method for producing a biograft for the treatment of dilated cardiomyopathy is also proposed, which consists in washing the tissue of skeletal muscle of human fetuses of the 1-2 trimester of pregnancy, crushing it, then disaggregating it in a solution containing a type II collagenase and trypsin solution for 40-90 minutes, the resulting suspension Dissected cells are cultured until a confluent monolayer is reached, then passaging, disaggregation of the monolayer with trypsin solution is carried out, while the cultivation process is conducted for 18-25 days at 37 ° C in the atmosphere. a sphere of 9-10% CO 2 .
Суспензию клеток засевают на среду, содержащую ростовую среду ДМЕМ/F12, 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 1% ИТС (инсулин, трансферин, селенит) и 5 нг/мл фактора роста эпидермиса и клетки засевают с плотностью не менее 1×10 кл/мл.A cell suspension is seeded on a medium containing DMEM / F12 growth medium, 20% fetal calf serum, 1% ITS (insulin, transferrin, selenite) and 5 ng / ml epidermal growth factor and cells are seeded with a density of at least 1 × 10 cells / ml .
Среду в процессе культивирования неоднократно меняют.The environment in the process of cultivation is repeatedly changed.
Способ лечения дилятационной кардиомиопатии заключается в том, что ранее указанные биотрансплантаты вводят в коронарную артерию и/или аортокоронарный шунт соответственно в виде суспензии в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов 1-15 млн клеток на 1 кг веса пациента.A method of treating dilated cardiomyopathy is that the previously mentioned biografts are introduced into the coronary artery and / or coronary artery bypass graft, respectively, in the form of a suspension in physiological solution with a concentration of cellular elements of 1-15 million cells per 1 kg of patient weight.
Биотрансплантат вводят с объемной скоростью, которая предотвращает вымывание клеток в аортальной кровоток.A biograft is injected at a volume rate that prevents leaching of cells into the aortic bloodstream.
Мезенхимальные стволовые клетки и фетальные миобласты берут в соотношениях от 1:1 до 1:15.Mesenchymal stem cells and fetal myoblasts are taken in ratios from 1: 1 to 1:15.
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК).Mesenchymal stem cells (MSCs).
МСК с преимущественной способностью к миогенной дифференцировке выделяются из фетальных (костный мозг, тимус, печень, жировая ткань) или донорских (костный мозг, жировая ткань, тимус) тканей. Биоматериал от доноров получают как для аутотрансплантаций, так и для аллопересадок. Для успешного выделения МСК забирают не менее 5 мл аспирата костного мозга, от 1 см2 подкожной жировой клетчатки или от 1 см2 тимуса (у детей до 6 лет). Для выделения фетальных клеток используют абортивный материал, полученный при искусственном прерывании беременности у здоровых женщин, предварительно обследованных на наличие вирусных и бактериальных инфекций. Наиболее эффективное выделение миогенных МСК из фетального биоматериала достигается на следующих сроках гестации: печень - 5-8 недель, тимус - 18-20 недель, костный мозг - 17-20 недель, подкожная жировая ткань - 17-19 недель. Если выделение клеток производится не из аспиратов (костный мозг, липоаспират), а из плотных тканей, например тимуса, орган предварительно измельчают и ферментативно дезагрегируют. Суспензию фильтруют через мелкоячеистое сито из нержавеющей стали. Клеточную суспензию (аспират) разводят 1:1 солевым раствором Хэнкса, центрифугируют в режиме 1, 500×g, 10 минут и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, селектированной для выращивания клеток в низкой плотности, 2 мМ глутамина. Суспензию клеток высевают на пластиковые чашки Петри с диаметром 100 мм. Плотность посева первичной клеточной суспензии составляет 1-20 миллионов мононуклеарных клеток на 1 см2 в зависимости от источника выделения. Через 1 сутки неприкрепившиеся клетки удаляют, ростовую среду заменяют. Культуры инкубируют при 37°С в атмосфере 5% СО2. Через 6 дней наблюдают рост гетерогенных клеточных популяций. По достижении культурой 50% конфлуентности монослой трипсинизируют и пересевают на новые чашки с плотностью 10-30 клеток на 1 см2 в ростовой среде, дополнительно содержащей 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 U/мл гепарина. Через 7-10 дней отбирают плотные колонии мелких клеток (диаметром 7-10 мкм) с большим количеством митозов. Отобранные колонии рассевают в новые чашки с плотностью 20 клеток/см2 и выращивают до состояния преконфлуентности. Замену среды производят через каждые 2 дня. Последующие пассажи производят в том же режиме. В плотнорастущих колониях возможно появление многоядерных симпластов (миотубов), что подтверждает правильность соблюдения режима культивирования. Увеличение посевной дозы или изменение состава ростовой среды приводит к быстрому накоплению в культуре клеток зрелой стромы.MSCs with a predominant ability for myogenic differentiation are isolated from fetal (bone marrow, thymus, liver, adipose tissue) or donor (bone marrow, adipose tissue, thymus) tissues. Biomaterial from donors is obtained both for autotransplantations and for allotransplants. To successfully isolate MSCs, at least 5 ml of bone marrow aspirate, from 1 cm 2 of subcutaneous fatty tissue or from 1 cm 2 of the thymus are taken (in children under 6 years old). To isolate fetal cells using abortive material obtained by artificial termination of pregnancy in healthy women, previously examined for the presence of viral and bacterial infections. The most efficient isolation of myogenic MSCs from fetal biomaterial is achieved at the following gestational dates: liver - 5-8 weeks, thymus - 18-20 weeks, bone marrow - 17-20 weeks, subcutaneous adipose tissue - 17-19 weeks. If the cells are not extracted from aspirates (bone marrow, lipoaspirate), but from dense tissues, such as the thymus, the organ is preliminarily crushed and enzymatically disaggregated. The suspension is filtered through a fine mesh stainless steel sieve. The cell suspension (aspirate) is diluted 1: 1 with Hanks saline solution, centrifuged at 1, 500 × g, 10 minutes and resuspended in DMEM / F12 growth medium containing 15% fetal calf serum, selected for cell growth in low density, 2 mm glutamine. A cell suspension is plated on plastic Petri dishes with a diameter of 100 mm. The seeding density of the primary cell suspension is 1-20 million mononuclear cells per 1 cm 2 depending on the source of excretion. After 1 day, non-adherent cells are removed, the growth medium is replaced. The cultures are incubated at 37 ° C in an atmosphere of 5% CO 2 . After 6 days, growth of heterogeneous cell populations is observed. Once the culture reaches 50% confluency, the monolayer is trypsinized and replanted onto new plates with a density of 10-30 cells per 1 cm 2 in a growth medium additionally containing 10 μg / ml transferrin, 1 μg / ml insulin, 10 ng / ml fibroblast growth factor - 2 and 8 U / ml heparin. After 7-10 days, dense colonies of small cells (7-10 microns in diameter) with a large number of mitoses are selected. The selected colonies are seeded in new plates with a density of 20 cells / cm 2 and grown to a state of pre-confluency. The medium is replaced every 2 days. Subsequent passages are made in the same mode. In densely growing colonies, the appearance of multinucleated symplasts (myotubes) is possible, which confirms the correct observance of the cultivation regimen. An increase in the seed dose or a change in the composition of the growth medium leads to the rapid accumulation of mature stroma cells in the culture.
Экспериментально подобранные условия, объединяющие критерии отбора исходного материала и режим культивирования, являются оптимальными для достижения следующих результатов:Experimentally selected conditions that combine the selection criteria of the source material and the cultivation mode are optimal for achieving the following results:
система отбора источников получения МСК позволяет получить культуры клеток с преимущественной способностью к миогенной дифференцировке;a source selection system for MSCs allows obtaining cell cultures with a primary ability for myogenic differentiation;
режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют при многократном пассировании максимально наращивать гомогенную клеточную культуру недифференцированных клеток;the cultivation mode and selective culture media allow, upon repeated passage, to maximize the homogeneous cell culture of undifferentiated cells;
режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют сохранить плюрипотентность клеточных культур;cultivation mode and selective culture media allow to preserve the pluripotency of cell cultures;
режим культивирования и селективные культуральные среды позволяют получить большое количество клеток для трансплантации (серию), что обеспечивает воспроизводимость результатов лечения.cultivation mode and selective culture media allow to obtain a large number of cells for transplantation (series), which ensures reproducibility of treatment results.
Фетальные миобласты из скелетных мышц.Fetal skeletal muscle myoblasts.
Культура получена из скелетных мышц фетусов человека 1-2 триместра беременности и содержит не менее 80% клеток, экспрессирующих маркеры раннего миогенеза (Myo D-1) и не более 20% примесных клеток (фибробластов и эндотелиальных клеток).The culture was obtained from skeletal muscle of human fetuses of the 1-2 trimester of pregnancy and contains at least 80% of cells expressing markers of early myogenesis (Myo D-1) and not more than 20% of impurity cells (fibroblasts and endothelial cells).
Способ получения культуры скелетных миобластов характеризуется тем, что мышечную ткань фетусов человека 1-2 триместра беременности отмывают, механически измельчают и подвергают ферментативной дезагрегации в течение 40-90 минут в растворе, содержащем 0,01-0,1% раствор коллагеназы II типа, 0,25% раствор трипсина. Суспензию первичных диссоциированных клеток засевают с плотностью не менее 1×106 кл./мл и культивируют в среде, содержащей ростовую среду DMEM/F12, 20% эмбриональной телячьей сыворотки с добавлением 1% ИТС (инсулин, трансферин, селенит, НПП «ПанЭко») и фактора роста эпидермиса EGF (5-10 нг/мл).A method of obtaining a culture of skeletal myoblasts is characterized in that the muscle tissue of human fetuses of 1-2 trimesters of pregnancy is washed, mechanically crushed and subjected to enzymatic disaggregation for 40-90 minutes in a solution containing 0.01-0.1% type II collagenase solution, 0 , 25% trypsin solution. A suspension of primary dissociated cells is seeded with a density of at least 1 × 10 6 cells / ml and cultured in a medium containing DMEM / F12 growth medium, 20% fetal calf serum with the addition of 1% ITS (insulin, transferrin, selenite, NPE PanEco) ) and epidermal growth factor EGF (5-10 ng / ml).
Среду неоднократно меняют. При достижении клеточной культуры конфлюэнтного состояния осуществляют пассирование с использованием раствора трипсина для дезагрегации монослоя. Плотность посева - 5×105 кл./мл.The environment is repeatedly changed. Upon reaching the cell culture of the confluent state, passaging is carried out using a trypsin solution to disaggregate the monolayer. Sowing density - 5 × 10 5 cells / ml.
Клетки культивируют 18-25 дней при 37°С в атмосфере 9-10% углекислого газа.Cells are cultured for 18-25 days at 37 ° C in an atmosphere of 9-10% carbon dioxide.
Трансплантацию осуществляют в условиях стерильной рентгеноперационной путем введения гомогенной взвеси клеток в нативные коронарные артерии и/или аортокоронарные шунты. Взвесь суспендирована в физиологическом растворе с концентрацией клеточных элементов, предотвращающей их быструю агрегацию.The transplantation is carried out under sterile x-ray conditions by introducing a homogeneous suspension of cells into native coronary arteries and / or aortocoronary shunts. The suspension is suspended in physiological saline with a concentration of cellular elements that prevents their rapid aggregation.
В процессе выполнения процедуры необходимо постоянное перемешивание суспензии для поддержания клеток во взвешенном состоянии.During the procedure, constant stirring of the suspension is necessary to maintain the cells in suspension.
Доступ к коронарным артериям и/или аортокоронарным шунтам осуществляется по стандартной методике через бедренную артерию с использованием катетеров Judkins и Sones. После выполнения коронаро- и/или шунтографии по стандартной методике, оценивается объем миокарда левого желудочка, кровоснабжаемого каждым из коронарных сосудов и/или аортокоронарных шунтов. Распределение общей дозы клеток для введения в каждый из коронарных сосудов и/или аортокоронарных шунтов производится прямо пропорционально этому объему. Введение клеток осуществляют стерильным шприцом.Access to the coronary arteries and / or coronary artery bypass grafts is done according to standard procedures through the femoral artery using Judkins and Sones catheters. After coronary and / or shuntography is performed according to a standard method, the volume of the left ventricular myocardium, supplied by each of the coronary vessels and / or coronary artery bypass grafts, is estimated. The distribution of the total dose of cells for administration into each of the coronary vessels and / or coronary artery bypass grafts is directly proportional to this volume. The introduction of cells is carried out with a sterile syringe.
Введение клеточного трансплантата осуществляется в три этапа:The introduction of a cell transplant is carried out in three stages:
1. Первый этап - установка катетера в устье коронарной артерии. На этом этапе следует подобрать такой диаметр катетера, который позволял бы установить его кончик на расстояние не менее 4-5 мм дистальнее устья коронарной артерии или аортокоронарного шунта без значимого нарушения коронарного кровообращения (т.е. при отсутствии у пациента загрудинных болей).1. The first stage is the installation of a catheter at the mouth of the coronary artery. At this stage, you should choose a catheter diameter that allows you to set its tip at a distance of at least 4-5 mm distal to the mouth of the coronary artery or coronary artery bypass graft without significant impairment of coronary circulation (i.e. if the patient has no chest pains).
2. Второй этап - подбор оптимальной объемной скорости введения клеточной взвеси. Для этого в установленный согласно п.1 катетер хирург с помощью инфузомата вводит контрастное вещество. Объемная скорость введения подбирается такой, какая предотвращает вымывание контраста в аортальный кровоток.2. The second stage is the selection of the optimal volumetric rate of introduction of cell suspension. For this, the surgeon introduces a contrast agent into the catheter installed according to claim 1. The volumetric rate of administration is selected such that it prevents leaching of contrast into the aortic bloodstream.
3. Третий этап - собственно введение клеточной взвеси с помощью инфузомата с объемной скоростью, определенной на этапе 2.3. The third stage - the actual introduction of cell suspension using an infusomat with the volumetric velocity determined in stage 2.
Окончание процедуры не отличается от такового после рутинной коронарографии.The end of the procedure does not differ from that after routine coronary angiography.
В течение 16 часов после операции пациента наблюдают в отделении интенсивной терапии с мониторингом электрокардиограммы и артериального давления. Выписка на 2-е сутки с рекомендацией контрольного осмотра через 1 месяц.Within 16 hours after surgery, the patient is observed in the intensive care unit with monitoring of the electrocardiogram and blood pressure. Extract on the 2nd day with the recommendation of a follow-up examination after 1 month.
По предложенному способу лечения в Самарском областном кардиологическом диспансере проведено 3 операции интракоронарного введения аллогенных фетальных скелетных миобластов и МСК пациентам, с дилатационной кардиомиопатией.According to the proposed method of treatment, 3 operations of intracoronary administration of allogeneic fetal skeletal myoblasts and MSCs to patients with dilated cardiomyopathy were performed in the Samara Regional Cardiology Dispensary.
В период проведения исследования все пациенты получали стабильную медикаментозную терапию средними терапевтическими дозами ингибиторов АПФ, β-адреноблокаторами, диуретиками.During the study period, all patients received stable drug therapy with average therapeutic doses of ACE inhibitors, β-blockers, and diuretics.
В группу больных (средний возраст 48±4,5 года) с ДКМП включены пациенты с неясной (неалкогольной, нетоксической) этиологией заболевания, с хронической сердечной недостаточностью 2б функционального класса (3-4 класса по NYHA).The group of patients (mean age 48 ± 4.5 years) with DCMP included patients with an unclear (non-alcoholic, non-toxic) etiology of the disease, with chronic heart failure of functional class 2b (grade 3-4 according to NYHA).
На протяжении всего исследования пациенты не получали иммуносупрессивной терапии.Throughout the study, patients did not receive immunosuppressive therapy.
В контрольную группу включены пациенты с аналогичным диагнозом, с хронической сердечной недостаточностью 2б функционального класса, получающие соответствующую стабильную медикаментозную терапию - 6 пациентов с ДКМП.The control group included patients with a similar diagnosis, with chronic heart failure 2b functional class, receiving appropriate stable drug therapy - 6 patients with DCMP.
Во время исследования проводилось динамическое обследование пациентов: общий анализ крови, мочи, биохимический анализ крови, ЭКГ, ЭхоКГ, ангиокардиография, в том числе по методике Centraline.During the study, a dynamic examination of patients was carried out: a general blood test, urine test, biochemical blood test, ECG, echocardiography, angiocardiography, including the Centraline technique.
Имплантацию осуществляли в условиях стерильной рентгеноперационной путем введения суспензии аллогенных скелетных миобластов 10 млн кл./кг массы тела в 100 мл физиологического раствора в аортокоронарные шунты. Доступ к коронарным артериям и аортокоронарным шунтам осуществляли по стандартной методике через бедренную артерию. В течение 16 часов после операции пациента наблюдают в отделении интенсивной терапии с мониторингом электрокардиограммы и артериального давления.Implantation was performed under sterile x-ray conditions by introducing a suspension of allogeneic skeletal myoblasts of 10 million cells / kg body weight in 100 ml of physiological solution into aortocoronary shunts. Access to the coronary arteries and coronary artery bypass grafts was performed according to the standard technique through the femoral artery. Within 16 hours after surgery, the patient is observed in the intensive care unit with monitoring of the electrocardiogram and blood pressure.
В раннем послеоперационном периоде ни у одного из пациентов не наблюдалось каких-либо реакций, побочных эффектов или осложнений, связанных с процедурой.In the early postoperative period, none of the patients had any reactions, side effects or complications associated with the procedure.
Через 1-3 месяца после имплантации все пациенты отмечали улучшение самочувствия, объективно наблюдалось улучшение общего состояния, повышение толерантности к физическим нагрузкам, уменьшение одышки, периферических отеков, гепатомегалии, при инструментальном обследовании выявлено незначительное уменьшение объемов сердца, размеров зон гипокинетичного миокарда, увеличение ФВ ЛЖ. В контрольной группе, в условиях стабильной медикаментозной терапии, состояние и клинико-лабораторные показатели пациентов не изменились или отмечалась отрицательная динамика.1-3 months after implantation, all patients noted improvement in well-being, objectively improved general condition, increased exercise tolerance, decreased dyspnea, peripheral edema, hepatomegaly, instrumental examination revealed a slight decrease in heart volumes, sizes of hypokinetic myocardial zones, increased LVEF . In the control group, under conditions of stable drug therapy, the condition and clinical and laboratory parameters of patients did not change or negative dynamics were noted.
Больная Ф., 36 лет, поступила в Самарский областной клинический кардиологический диспансер с жалобами на выраженную общую слабость, быструю утомляемость, одышку при незначительной физической нагрузке, отеки на нижних конечностях, доходящие до уровня верхней трети голеней, чувство дискомфорта в области правого подреберья.Patient F., 36 years old, was admitted to the Samara Regional Clinical Cardiology Dispensary with complaints of severe general weakness, fatigue, shortness of breath with little physical exertion, swelling on the lower extremities, reaching the level of the upper third of the legs, a feeling of discomfort in the right hypochondrium.
При объективном исследовании отмечен цианоз кожи и видимых слизистых оболочек, похолодание кожи конечностей. Аускультативно в легких - на фоне жесткого дыхания в нижних отделах выслушиваются влажные мелкопузырчатые хрипы. Тоны сердца глухие, ритм неправильный. ЧСС 90-96 в 1 мин. Печень выступает из-под края реберной дуги на 5 см, болезненна при пальпации, гладкая, край ее закруглен.An objective study noted cyanosis of the skin and visible mucous membranes, cooling of the skin of the extremities. Auscultatory in the lungs - against the background of hard breathing in the lower sections, moist small-bubbling rales are heard. Heart sounds are deaf, the rhythm is wrong. Heart rate 90-96 in 1 min. The liver protrudes from the edge of the costal arch by 5 cm, is painful to palpation, smooth, its edge is rounded.
ЭКГ: синусовая тахикардия, горизонтальное положение ЭОС, гипертрофия ЛЖ с изменениями комплекса QRS, гипертрофия ПЖ.ECG: sinus tachycardia, horizontal position of EOS, LV hypertrophy with changes in the QRS complex, pancreatic hypertrophy.
ЭхоКГ: Регургитация на митральном клапане 2 ст. Диаметр основания аорты 35 мм. Регургитация на аортальном клапане. Градиент между ЛЖ и аортой 12 мм рт.ст. Регургитация на трехстворчатом клапане 1 ст. Систолический градиент на трехстворчатом клапане 48 мм рт.ст. Диаметр легочной артерии 30 мм. Давление в легочной артерии 43 мм рт.ст. Переднезадний размер ЛП 50 мм. Медиально-латеральный размер ЛП 49 мм. Верхненижний размер ЛП 62 мм. КДРЛЖ 78 мм, КСРЛЖ 65 мм, КДОЛЖ 170 мл, КСОЛЖ 98 мл, ФВ 31%. Гипокинезия апикально-латерального сегмента, апикального сегмента предсердной стенки. Акинезия верхушки, апикально-септального сегмента.Echocardiography: Regurgitation on the mitral valve 2 tbsp. The diameter of the base of the aorta is 35 mm. Aortic valve regurgitation. The gradient between the LV and the aorta is 12 mmHg. Regurgitation on the tricuspid valve 1 tbsp. Systolic gradient on the tricuspid valve 48 mm Hg The diameter of the pulmonary artery is 30 mm. Pulmonary pressure 43 mmHg The anteroposterior size of the drug is 50 mm. Medial lateral size of the drug is 49 mm. Upper lower lip size 62 mm. КДЛЖ 78 mm, КСЛЖ 65 mm, КДЛЖ 170 ml, КСЛЖ 98 ml, ФВ 31%. Hypokinesia of the apical-lateral segment, apical segment of the atrial wall. Akinesia of the apex, apical-septal segment.
Ангиокардиография: КДО 320 мл, КСО 242 мл, УО 60 мл, ФВ 25%. При исследовании по методике Centraline 50% сегментов миокарда асинергичны с явлениями гипо- и акинезии, а уровень сократимости остальных 50% миокарда находился на нижней границе нормы.Angiocardiography: BWW 320 ml, KSO 242 ml, UO 60 ml, PV 25%. In a study using the Centraline technique, 50% of myocardial segments are asinergic with the effects of hypo- and akinesia, and the contractility level of the remaining 50% of the myocardium was at the lower limit of normal.
15 декабря 2003 года пациентке проведена операция коронаровентрикулография с интракоронарным введением клеточного биотрансплантата.On December 15, 2003, the patient underwent coronary ventriculography surgery with intracoronary administration of a cell biotransplant.
В течение 16 часов после операции пациентка наблюдалась в отделении интенсивной терапии с мониторингом электрокардиограммы и артериального давления. Послеоперационное течение гладкое. Больная выписана на 2-е сутки.Within 16 hours after surgery, the patient was observed in the intensive care unit with monitoring of the electrocardiogram and blood pressure. The postoperative course is smooth. The patient was discharged on the 2nd day.
При контрольном осмотре через 8 месяцев пациентка отмечает значительное улучшение состояния, уменьшение слабости, утомляемости. Одышка возникает только при физической нагрузке. Отеков нет.At the follow-up examination after 8 months, the patient noted a significant improvement, a decrease in weakness, fatigue. Shortness of breath occurs only during physical exertion. No swelling.
При осмотре кожа и видимые слизистые обычной окраски. Аускультативно в легких дыхание жесткое, хрипов нет. Тоны сердца глухие, ритм правильный. ЧСС 88 в 1 мин, печень выступает из-под края реберной дуги на 1,5 см.On examination, the skin and visible mucous membranes of normal color. Auscultation in the lungs harsh breathing, no wheezing. Heart sounds are deaf, the rhythm is correct. Heart rate 88 in 1 min, the liver protrudes from the edge of the costal arch by 1.5 cm.
Лабораторные показатели крови без существенной динамики.Laboratory blood counts without significant dynamics.
ЭхоКГ: ФВ возросла на 15%, КДОЛЖ уменьшился на 3%, ангиокардиография - КДО - 190 мл, КСО - 136 мл. УО - 112 мл, ФВ 38%. При исследовании по методике Centraline 25% сегментов миокарда асинергичны с явлениями гипокинезии, уровень сократимости 25% миокарда на нижней границе нормы, а сократимость 45% сегментов миокарда была нормальной.Echocardiography: PV increased by 15%, CEDAW decreased by 3%, angiocardiography - BWW - 190 ml, CSR - 136 ml. UO - 112 ml, PV 38%. In the Centraline study, 25% of the myocardial segments are asinergic with the phenomena of hypokinesia, the contractility level is 25% of the myocardium at the lower normal range, and the contractility of 45% of the myocardial segments was normal.
Источники информации:Information sources:
1. В.Ю. Мареев, Ю.Н. Беленков, Перспективы в лечении хронической сердечной недостаточности.1. V.Yu. Mareev, Yu.N. Belenkov, Perspectives in the treatment of chronic heart failure.
2. Репин В.С., Сухих Г.Т. Медицинская клеточная биология. М., РАМН: БЭБиМ, 1998. - 200 с.2. Repin V.S., Sukhikh G.T. Medical cell biology. M., RAMS: BEBiM, 1998 .-- 200 p.
3. Саркисов Д.С. Регенерация и ее клиническое значение. М., Медицина, 1979. - 284 с.3. Sarkisov D.S. Regeneration and its clinical significance. M., Medicine, 1979.- 284 p.
4. Сухих Г.Т. Трансплантация фетальных тканей и клеток: настоящее и будущее. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 1998; 126 (приложение 1): 3-13.4. Sukhikh G.T. Transplantation of fetal tissues and cells: present and future. Bulletin of Experimental Biology and Medicine 1998; 126 (Appendix 1): 3-13.
5. Leor J., Patterson М., Qumones M.J. et al. Transplantation of Fetal Myocardial Tissue Into the Infarcted Myocardium of Rat A Potential Method for Repair of Infarcted Myocardium? Circulation 1996; 94 [suppl II]: II-332-II-336.5. Leor J., Patterson M., Qumones M.J. et al. Transplantation of Fetal Myocardial Tissue Into the Infarcted Myocardium of Rat A Potential Method for Repair of Infarcted Myocardium? Circulation 1996; 94 [suppl II]: II-332-II-336.
6. Suzuki K., Brand N.J., Morrison K.J. et al. Development of a Novel Method for Cell Transplantation via Coronary Artery. Circulation 1999; 100 (suppl I): I-164.6. Suzuki K., Brand N.J., Morrison K.J. et al. Development of a Novel Method for Cell Transplantation via Coronary Artery. Circulation 1999; 100 (suppl I): I-164.
7. Zhang М., Murry C.E. Death of Grafted Cardiomyoctyes Limits Formation of New Myocardium in Injured Hearts. Circulation 1999; 100 (suppl I): I-837.7. Zhang M., Murry C.E. Death of Grafted Cardiomyoctyes Limits Formation of New Myocardium in Injured Hearts. Circulation 1999; 100 (suppl I): I-837.
Claims (14)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004116840/15A RU2268062C1 (en) | 2004-06-04 | 2004-06-04 | Biotransplant, method for its obtaining (variants) and method for treating dilation cardiomyopathy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004116840/15A RU2268062C1 (en) | 2004-06-04 | 2004-06-04 | Biotransplant, method for its obtaining (variants) and method for treating dilation cardiomyopathy |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2004116840A RU2004116840A (en) | 2005-11-10 |
| RU2268062C1 true RU2268062C1 (en) | 2006-01-20 |
Family
ID=35865305
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004116840/15A RU2268062C1 (en) | 2004-06-04 | 2004-06-04 | Biotransplant, method for its obtaining (variants) and method for treating dilation cardiomyopathy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2268062C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2573946C2 (en) * | 2010-06-08 | 2016-01-27 | Роберто ПАРРАВИЧИНИ | Device for cardiac ventricle |
| RU2574364C2 (en) * | 2010-05-07 | 2016-02-10 | Юниверсити Оф Норт Каролина Эт Чепел Хилл | Method for transplanting cells from dense tissues |
| RU2722669C1 (en) * | 2019-07-01 | 2020-06-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации - Институт медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ - ИМБП РАН) | Method for producing associates of hematopoietic and stromal progenitor cells capable of suppressing activation and proliferation of allogenic lymphocytes |
-
2004
- 2004-06-04 RU RU2004116840/15A patent/RU2268062C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Suzuki К. et al. Circulation, 1999; 100 (Suppl. I): 1-104. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2574364C2 (en) * | 2010-05-07 | 2016-02-10 | Юниверсити Оф Норт Каролина Эт Чепел Хилл | Method for transplanting cells from dense tissues |
| RU2573946C2 (en) * | 2010-06-08 | 2016-01-27 | Роберто ПАРРАВИЧИНИ | Device for cardiac ventricle |
| RU2722669C1 (en) * | 2019-07-01 | 2020-06-02 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр Российской Федерации - Институт медико-биологических проблем Российской академии наук (ГНЦ РФ - ИМБП РАН) | Method for producing associates of hematopoietic and stromal progenitor cells capable of suppressing activation and proliferation of allogenic lymphocytes |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2004116840A (en) | 2005-11-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7658951B2 (en) | Method of improving cardiac function of a diseased heart | |
| US9439931B2 (en) | Administering umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells to treat nerve injury | |
| DE69937888T2 (en) | Process for the preparation of mesenchymal stem cells | |
| US6251383B1 (en) | Method for ex-vivo expansion of hematopoietic cells | |
| US11821005B2 (en) | Umbilical cord mesenchymal stem cells (MSCs) and culture method and application thereof | |
| RU2323252C1 (en) | Method for culturing human mesenchymal stem cells ex vivo | |
| MXPA06013985A (en) | In vitro techniques for use with stem cells. | |
| CN108865986B (en) | Mesenchymal stem cell preparation for repairing articular cartilage damage/defect and preparation method and application thereof | |
| Globus | Neurotrophic contribution to a proposed tripartite control of the mitotic cycle in the regeneration blastema of the newt, Notophthalmus (Triturus) viridescens | |
| AU2007265862A1 (en) | Soft tissue filler composition comprising autologous dermis-derived cell culture product and hyaluronic acid | |
| KR20120095022A (en) | Cell therapy composition for preventing or treating graft-versus-host disease comprising mesenchymal stem cell and regulatory t cell | |
| KR100959995B1 (en) | Composition for inducing differentiation and proliferation of neural precursor cells or neural stem cells to neural cells, comprising a human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell as an active ingredient | |
| US20110177170A1 (en) | implantable neuroendoprosthetic system, a method of production thereof and a method of reconstructive neurosurgical operation | |
| CN107858329A (en) | The method of fractionation of fatty mescenchymal stem cell and the test solution used from fat | |
| US20220347346A1 (en) | Mesenchymal stem cell sheet and use thereof | |
| KR20090055691A (en) | Composition for inducing differentiation and proliferation of neural precursor cells or neural stem cells to neural cells, comprising a human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell as an active ingredient | |
| CN105456293A (en) | Stem cell-based medicinal product for treating diabetes and preparing method thereof | |
| KR20080091874A (en) | Medium for culturing autologous human progenitor stem cells and applications thereof | |
| CN112402458A (en) | Application of mesenchymal stem cell and exosome combined preparation in preparation of myocardial infarction medicament | |
| RU2268062C1 (en) | Biotransplant, method for its obtaining (variants) and method for treating dilation cardiomyopathy | |
| RU2418571C1 (en) | Biotransplant, method of its obtaining and method of treating periodontal diseases | |
| RU2428996C2 (en) | Biotransplant for correction of soft tissue defects (versions), method of biotransplant obtaining (versions) and method of correction of soft tissue defects | |
| CN108066824A (en) | A kind of new method for preparing skin blemish medicine | |
| RU2268061C1 (en) | Biotransplant, method for its obtaining (variants) and method for treating ischemic cardiac disease | |
| RU2299073C1 (en) | Biotransplant and method for treating chronic cardiac failure (variants) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| QB4A | Licence on use of patent |
Free format text: LICENCE Effective date: 20120126 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150605 |