RU2266963C1 - Assay of strain bacillus anthracis population resistivity to anthracic bacteriophage - Google Patents
Assay of strain bacillus anthracis population resistivity to anthracic bacteriophage Download PDFInfo
- Publication number
- RU2266963C1 RU2266963C1 RU2004122265/13A RU2004122265A RU2266963C1 RU 2266963 C1 RU2266963 C1 RU 2266963C1 RU 2004122265/13 A RU2004122265/13 A RU 2004122265/13A RU 2004122265 A RU2004122265 A RU 2004122265A RU 2266963 C1 RU2266963 C1 RU 2266963C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bacteriophage
- population
- colonies
- anthracic
- anthrax
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к микробиологии, в частности к способам характеристики штаммов по количественному содержанию в их популяции клонов, резистентных к литическому действию сибиреязвенных бактериофагов.The invention relates to microbiology, in particular, to methods for characterizing strains by the quantitative content of clones in their population that are resistant to the lytic effect of anthrax bacteriophages.
Лизабельность сибиреязвенными бактериофагами является одним из основных тестов, позволяющих идентифицировать сибиреязвенные культуры, выделенные из объектов внешней среды, а также из материала от больных людей и животных. Явление фаголизабельности и фагорезистентности представляет интерес не только в плане идентификации сибиреязвенных культур и их дифференциации от близкородственных сапрофитов. В литературе описаны фагорезистентные штаммы В. anthracis и выделенные субкультуры (Ипатенко с соавт., 1987; Васильев с соавт., 1998). Некоторые авторы связывают изменение чувствительности сибиреязвенных штаммов к литическому действию специфических бактериофагов с определенными биологическими свойствами этих штаммов (Обносова, Шуляк, 1978; Thome, 1985).The anesthesia by anthrax bacteriophages is one of the main tests to identify anthrax cultures isolated from environmental objects, as well as from material from sick people and animals. The phenomenon of phagolizability and phagoresistance is of interest not only in terms of identifying anthrax cultures and their differentiation from closely related saprophytes. The phagoresistant strains of B. anthracis and isolated subcultures are described in the literature (Ipatenko et al., 1987; Vasiliev et al., 1998). Some authors attribute the change in the sensitivity of anthrax strains to the lytic action of specific bacteriophages to certain biological properties of these strains (Obnosova, Shulyak, 1978; Thome, 1985).
В настоящее время накоплено немало данных о неоднородности популяций штаммов возбудителя сибирской язвы по различным генетическим и фенотипическим признакам, в том числе и по устойчивости к бактериофагам. Это делает методы, позволяющие оценить степень однородности состава штаммов по тем или иным свойствам, ценным механизмом изучения роли отдельных клонов с измененными биологическими свойствами в сохранении вида при изменении условий существования (пассажи на питательных средах и через организм животных, воздействие физических, химических и биологических факторов).At present, a lot of data has been accumulated on the heterogeneity of the populations of anthrax pathogen strains by various genetic and phenotypic characters, including bacteriophage resistance. This makes it possible to evaluate the degree of homogeneity of the composition of the strains by various properties, a valuable mechanism for studying the role of individual clones with altered biological properties in maintaining the species when changing living conditions (passages on nutrient media and through the body of animals, exposure to physical, chemical and biological factors )
Существует целый ряд методов, позволяющих определять чувствительность культур к сибиреязвенным бактериофагам: микрометод, пробирочный метод, метод стекающей капли, метод нарастания титра фага. Все эти методы разработаны для идентификации выделенных культур, т.е. направлены на выявление чувствительных к литическому действию фагов бактериальных клеток, что служит одним из критериев их принадлежности к В. anthracis.There are a number of methods to determine the sensitivity of cultures to anthrax ulcer bacteriophages: micromethod, test tube method, dripping method, method of increasing the phage titer. All these methods are designed to identify selected cultures, i.e. aimed at identifying bacterial cell phages sensitive to the lytic effect, which serves as one of the criteria for their belonging to B. anthracis.
Наиболее близким по существу является микрометод определения чувствительности к сибиреязвенным бактериофагам (Ипатенко с соавт., 1987).The closest in essence is the micromethod of determining sensitivity to anthrax bacteriophages (Ipatenko et al., 1987).
Для сокращения срока исследования используют молодые, 3-6-часовые культуры. При исследовании агаровых культур или смыва 5-6-часовых культур готовят взвеси бактерий в физиологическом растворе с концентрацией 125-500 млн. м.к. в 1 мл по оптическому бактерийному стандарту. Бульонные культуры исследуют в такой же концентрации. Пробирки с взвесью клеток бактериальной культуры тщательно встряхивают до получения равномерного помутнения и оставляют на 5-10 мин для отстаивания комочков культуры.To reduce the duration of the study, young, 3-6-hour cultures are used. In the study of agar cultures or flushing of 5-6-hour cultures, bacterial suspensions are prepared in physiological saline with a concentration of 125-500 million m. in 1 ml according to the optical bacterial standard. Bouillon cultures are examined in the same concentration. Tubes with a suspension of bacterial culture cells are thoroughly shaken until uniform turbidity is obtained and left for 5-10 minutes to settle the lumps of culture.
Исследования проводят в бактериологических чашках, в которые заранее (за день) ровным слоем толщиной 3-5 мм наливают дрожжевой или 1,5-2%-ный мясопептонный агар (рН 7,4-7,6). Если агар разливается в день исследования, то его необходимо подсушить в термостате в течение 2-3 ч.The studies are carried out in bacteriological dishes, in which yeast or 1.5-2% meat-peptone agar (pH 7.4-7.6) is poured in advance (per day) with an even layer of 3-5 mm thick. If the agar is bottled on the day of the study, then it must be dried in a thermostat for 2-3 hours.
Подсушенную поверхность агара разделяют горизонтальными и вертикальными линиями на три участка в каждом ряду. Каждый ряд участков по вертикали нумеруют и используют для исследования одной микробной культуры. На три участка одного вертикального ряда наносят по одной бактериологической петле подготовленную к исследованию культуру и подсушивают 5 мин. Затем на первые два участка наносят пастеровской пипеткой по 1 капле цельного бактериофага, распределяя его по поверхности в пределах границ участка. Третий горизонтальный ряд служит контролем исследуемой культуры. Чашки оставляют на 10-15 мин при комнатной температуре для подсушивания, затем переворачивают крышками вниз и помещают в термостат при 37°С. Результаты учитывают через 2-4 ч (молодые 3-6-часовые культуры) или 4-6 ч инкубирования (старые культуры); учет можно производить и через 12-24 ч. В первом случае чашки просматривают при малом увеличении микроскопа, а во втором и третьем - невооруженным глазом и при помощи лупы. Результаты исследования учитывают по наличию или отсутствию лизиса бактерий на участках с бактериофагом в сравнении с ростом культуры на контрольном участке. Если на участках с бактериофагом отмечается зона лизиса культуры, то эта культура чувствительна к данному бактериофагу.The dried surface of the agar is divided by horizontal and vertical lines into three sections in each row. Each row of plots is numbered vertically and used to study one microbial culture. The culture prepared for the study is applied to three sections of the same vertical row, one bacteriological loop, and dried for 5 minutes. Then, 1 drop of a whole bacteriophage is applied to the first two sections with a Pasteur pipette, distributing it over the surface within the boundaries of the section. The third horizontal row serves as a control of the studied culture. The cups are left for 10-15 minutes at room temperature for drying, then turn the lids down and placed in a thermostat at 37 ° C. Results are taken into account after 2-4 hours (young 3-6 hour cultures) or 4-6 hours incubation (old cultures); counting can be done after 12-24 hours. In the first case, the cups are viewed at a small magnification of the microscope, and in the second and third with the naked eye and with a magnifier. The results of the study are taken into account by the presence or absence of lysis of bacteria in areas with bacteriophage in comparison with the growth of culture in the control area. If in areas with a bacteriophage a culture lysis zone is noted, then this culture is sensitive to this bacteriophage.
Близким по своей сути является также метод стекающей капли. В 6 пробирок на поверхность скошенного агара наносят по одной капле исследуемой культуры. Каплю равномерно распределяют по всей поверхности агара и пробирки ставят в термостат при температуре 37°С на 15 мин. Затем в 4 пробирки вносят по одной капле неразведенного бактериофага и пробирки вновь ставят в термостат на 6-18 ч. Если испытуемая культура чувствительна к лизирующему действию бактериофага, то по ходу стекающей капли отсутствует рост исследуемой культуры, тогда как в контрольных пробирках, куда фаг не вносили, наблюдается сплошной рост культуры. Если «дорожки» нет, то испытуемая культура не чувствительна к бактериофагу.Similar in essence is also the method of flowing drops. In 6 test tubes, one drop of the test culture is applied to the surface of the mown agar. The drop is evenly distributed over the entire surface of the agar and the tubes are placed in a thermostat at a temperature of 37 ° C for 15 minutes. Then, one drop of an undiluted bacteriophage is introduced into 4 tubes, and the tubes are again placed in the thermostat for 6-18 hours. made, there is a continuous growth of culture. If there is no “path”, then the test culture is not sensitive to the bacteriophage.
Недостатком этих двух очень близких по своей сути методов является то, что ввиду крайне малой площади поверхности, обработанной фагом, они выявляют лишь общую чувствительность микробных клеток данной популяции к литическому действию бактериофага и не способны выявлять различия в чувствительности отдельных особей. Это обусловлено и тем, что исходным посевным материалом является агаровая культура, которая при посеве в бульон или приготовлении бактериальной взвеси берется из одной или, в лучшем случае, из нескольких колоний. При посеве в бульон взвеси спор на протяжении нескольких генераций вегетативных клеток в течение 3-6 ч изменяется исходное соотношение клонов с различными биологическими свойствами, включая чувствительность к бактериофагам.The drawback of these two methods, which are very similar in nature, is that, due to the extremely small surface area treated with phage, they reveal only the general sensitivity of the microbial cells of a given population to the lytic effect of the bacteriophage and are not able to detect differences in the sensitivity of individual individuals. This is due to the fact that the initial seed is an agar culture, which, when sown in broth or preparing bacterial suspension, is taken from one or, at best, from several colonies. When sowing spore suspension in suspension over several generations of vegetative cells for 3-6 hours, the initial ratio of clones with various biological properties, including sensitivity to bacteriophages, changes.
Учитывая, что сибиреязвенные культуры в отечественных коллекциях штаммов хранятся в виде спор, определенный интерес представляет количественное определение содержания фагорезистентных клонов непосредственно в споровой взвеси без предварительных пассажей на питательных средах, изменяющих это соотношение.Considering that anthrax cultures in domestic strain collections are stored as spores, it is of certain interest to quantify the content of phage resistant clones directly in spore suspension without preliminary passages on nutrient media that change this ratio.
Целью изобретения является повышение чувствительности метода за счет увеличения числа исследуемых особей первичной популяции штамма (исследуется не менее 500 к.о.е.), увеличения достоверности, т.к. отсутствуют промежуточные генерации вегетативной культуры, а также повышение точности метода, т.е. возможности количественной характеристики исходной споровой взвеси штамма по чувствительности к бактериофагу.The aim of the invention is to increase the sensitivity of the method by increasing the number of studied individuals of the primary population of the strain (at least 500 cfu is being studied), increasing reliability, since there are no intermediate generations of a vegetative culture, as well as an increase in the accuracy of the method, i.e. the possibility of quantitative characteristics of the initial spore suspension of the strain in sensitivity to bacteriophage.
Поставленная цель достигается тем, что взвесь спор концентрацией 103 спор в 1 мл засевается на поверхность 10-20 подсушенных пластин питательного агара строго по 0,1 мл на каждую, после подсушивания поверхность 5-10 чашек обрабатывается цельным препаратом бактериофага. Посевы инкубируют 20-24 ч. Результаты учитывают, сравнивая количество колоний, выросших на контрольных чашках, не обработанных фагом (100%) с количеством колоний на чашках, обработанных тем или иным бактериофагом (х%), которые могут быть отсеяны для дальнейшего изучения.This goal is achieved in that a suspension of spores with a concentration of 10 3 spores in 1 ml is seeded on the surface of 10-20 dried plates of nutrient agar strictly 0.1 ml each, after drying, the surface of 5-10 cups is treated with a whole bacteriophage preparation. Crops are incubated for 20-24 hours. The results are taken into account by comparing the number of colonies grown on control plates not treated with phage (100%) with the number of colonies on plates treated with a particular bacteriophage (x%) that can be weeded out for further study.
По отношению к прототипу заявляемый способ имеет следующие отличительные признаки.In relation to the prototype of the claimed method has the following distinctive features.
Применение в качестве посевного материала непосредственно взвеси спор, дающей после инкубации при 37°С рост возбудителя в виде изолированных колоний, исследование на чувствительность к бактериофагу значительного количества (не менее 500) к.о.е., которые более достоверно представляют популяцию штамма, при этом исключаются промежуточные генерации вегетативного размножения, учет результатов путем подсчета фагорезистентных колоний в сравнении с общим числом колоний позволяет дать четкую количественную характеристику штаммов по данному признаку и сравнить различные штаммы.The use of spore suspension directly as seed material, which, after incubation at 37 ° C, gives rise to the pathogen in the form of isolated colonies, a study on sensitivity to bacteriophage of a significant amount (at least 500) of coe, which more reliably represent the strain population, when this excludes intermediate generations of vegetative propagation, taking into account the results by counting phage-resistant colonies in comparison with the total number of colonies allows us to give a clear quantitative characteristic of the strains for this draw and compare different strains.
Способ осуществляется следующим образом. Используя отраслевой стандарт мутности ГИСК им. Л.И.Тарасовича, готовят взвеси спор изучаемых штаммов, соответствующие 10 ед. оптической мутности, и методом десятикратных разведении титруют до разведения 10-5, с которым ведется дальнейшая работа. При равномерном посеве 0,1 мл такой взвеси спор на всю поверхность чашки Петри с плотной питательной средой, как правило, вырастает от 50 до 100 изолированных колоний.The method is as follows. Using the industry standard turbidity GISK them. L.I. Tarasovich, prepare suspensions of the spores of the studied strains, corresponding to 10 units. optical turbidity, and the method of ten-fold dilution is titrated to a dilution of 10 -5 , with which further work is ongoing. With a uniform sowing of 0.1 ml of such a suspension of spores on the entire surface of a Petri dish with a dense nutrient medium, as a rule, from 50 to 100 isolated colonies grow.
Чашки Петри с заранее разлитой любой плотной питательной средой, пригодной для культивирования сибиреязвенного микроба (агар Хоттингера с рН 7,4-7,6, селективная среда для выделения или культивирования сибиреязвенного микроба), перед засевом помещают в термостат при 37°С с приоткрытой крышкой на 1-1,5 ч для подсушивания.Petri dishes with pre-spilled any solid nutrient medium suitable for cultivation of anthrax microbe (Hottinger agar with pH 7.4-7.6, selective medium for isolation or cultivation of anthrax microbe) are placed in a thermostat at 37 ° C with ajar lid before inoculation for 1-1.5 hours for drying.
На 10-20 чашек с плотной питательной средой наносят точно по 0,1 мл подготовленной взвеси спор, которую распределяют по поверхности плавными вращательными движениями. После полного впитывания жидкости половину засеянных чашек, которые в дальнейшем служат контролем, убирают в термостат, а на оставшиеся 5-10 засеянных агаровых пластин наносят по 0,5 мл препарата бактериофага, тщательно следя за тем, чтобы вся поверхность была обработана препаратом. После этого чашки с приоткрытыми крышками помещают в термостат до полного впитывания жидкости. Затем чашки переворачивают и инкубируют при 37°С 20-24 ч так же, как и контрольные.For 10-20 cups with a dense nutrient medium, exactly 0.1 ml of the prepared suspension of spores is applied, which is distributed on the surface by smooth rotational movements. After completely absorbing the liquid, half of the seeded cups, which later serve as a control, are removed into a thermostat, and 0.5 ml of bacteriophage preparation is applied to the remaining 5-10 seeded agar plates, carefully making sure that the entire surface is treated with the preparation. After this, the cups with ajar covers are placed in a thermostat until the liquid is completely absorbed. Then the plates are turned over and incubated at 37 ° C for 20-24 hours in the same way as the control.
После инкубации в течение 20-24 ч посевы просматривают и подсчитывают количество выросших колоний на обработанных и на не обработанных бактериофагом чашках. В контрольных посевах должно быть не менее 500 колоний. Содержание фагорезистентных особей в популяции штамма выражают в процентах.After incubation for 20-24 hours, the crops are scanned and the number of colonies grown on the plates treated and not treated with the bacteriophage is counted. In control crops should be at least 500 colonies. The content of phagoresistant individuals in the strain population is expressed as a percentage.
а - процент фагорезистентных особей в популяции данного штамма;a - the percentage of phagoresistant individuals in the population of this strain;
b - количество колоний, выросших на посевах, обработанных препаратом бактериофага;b is the number of colonies grown on crops treated with a bacteriophage preparation;
с - количество колоний, выросших на посевах, не обработанных бактериофагом.c - the number of colonies grown on crops not treated with bacteriophage.
Культуры из колоний, выросших на посевах, обработанных препаратом бактериофага, при необходимости отсевают на питательные среды и используют для дальнейшего изучения их различных биологических свойств.Cultures from colonies grown on crops treated with a bacteriophage preparation, if necessary, are sown on nutrient media and used to further study their various biological properties.
Возможность практического) использования изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения.The possibility of practical) use of the invention is confirmed by examples of specific performance.
Пример 1. Из взвеси спор штамма В. anthracis 1 (CO) в 30%-ном растворе глицерина, хранившейся в ампуле при 4-6°С, приготовлена взвесь в физиологическом растворе NaCl, соответствующая 10 ед. мутности по отраслевому стандарту мутности ГИСК имени Л.И. Тарасевича, которую титровали в физиологическом растворе NaCl десятикратными разведениями до разведения 10-5.Example 1. From a suspension of spores of strain B. anthracis 1 (CO) in a 30% glycerol solution stored in an ampoule at 4-6 ° C, a suspension was prepared in physiological NaCl solution, corresponding to 10 units. turbidity according to the industry standard turbidity GISK named after L.I. Tarasevich, which was titrated in physiological NaCl solution with tenfold dilutions to a dilution of 10 -5 .
В чашки Петри разливали расплавленный агар Хоттингера (рН 7,4). Чашки с агаром подсушивали в термостате с приоткрытой крышкой в течение 1 ч. На поверхность агара в 14 чашках Петри наносили по 0,1 мл взвеси спор из разведения 10-5 после тщательного ее перемешивания путем пипетирования. Вращательными движениями чашек распределяли взвесь по поверхности среды.Hottinger molten agar (pH 7.4) was poured into Petri dishes. The agar plates were dried in a thermostat with the lid ajar for 1 h. 0.1 ml of spore suspension from 10 -5 dilution was applied to the agar surface in 14 Petri dishes after thorough mixing by pipetting. By rotational movements of the cups, the suspension was distributed over the surface of the medium.
После полного впитывания жидкости 7 чашек помещали в термостат для инкубирования. На поверхность остальных 7 агаровых пластин наносили по 0,5 мл бактериофага К-ВИЭВ (титр по Апельману 4×10-8). Плавно наклоняя чашку, смачивали всю поверхность питательной среды препаратом. Посевы помещали в термостат с приоткрытой крышкой до полного впитывания жидкости, после чего чашки переворачивали крышкой вниз и оставляли при 37°С. Учет результатов проводили через 20 ч. На 7 чашках, обработанных бактериофагом К-ВИЭВ, количество выросших колоний составило: 0+3+2+2+5+2+3=17. На контрольных посевах, не обработанных препаратом бактериофага, количество ( выросших колоний составило: 67+80+90+89+79+83+87=601. Содержание особей, резистентных к литическому действию сибиреязвенного бактериофага К-ВИЭВ, в популяции штамма В. anthracis 1(CO) составило:After completely absorbing the liquid, 7 cups were placed in an incubation thermostat. 0.5 ml of the bacteriophage K-VIEV (Apelman titer 4 × 10 -8 ) was applied to the surface of the remaining 7 agar plates. Gently tilting the cup, they moistened the entire surface of the nutrient medium with the preparation. Crops were placed in a thermostat with the lid ajar until the liquid was completely absorbed, after which the cups were turned upside down and left at 37 ° C. The results were taken into account after 20 hours. On 7 plates treated with the bacteriophage K-VIEV, the number of grown colonies was 0 + 3 + 2 + 2 + 5 + 2 + 3 = 17. On the control crops not treated with the bacteriophage preparation, the number (of colonies grown: 67 + 80 + 90 + 89 + 79 + 79 + 83 + 87 = 601. The content of individuals resistant to the lytic effect of the anthrax bacteriophage K-VIEV in the population of strain B. anthracis 1 (CO) was:
Пример 2. Из взвеси спор штамма В. anthracis 81/1 в 30%-ном растворе глицерина, хранившейся запаянной в ампуле при 4-6°С, приготовлена взвесь в дистиллированной воде, соответствующая 10 ед. мутности по отраслевому стандарту мутности ГИСК имени Л.И. Тарасевича, которую титровали в дистиллированной воде десятикратными разведениями до разведения 10-5.Example 2. From a suspension of spores of strain B. anthracis 81/1 in a 30% solution of glycerol stored sealed in an ampoule at 4-6 ° C, a suspension in distilled water corresponding to 10 units was prepared. turbidity according to the industry standard turbidity GISK named after L.I. Tarasevich, which was titrated in distilled water with tenfold dilutions to a dilution of 10 -5 .
В чашки Петри разливали расплавленную среду для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба с добавлением фенолфталеинфосфата натрия. Перед использованием чашки со средой подсушивали в термостате с приоткрытой крышкой в течение 1 ч 20 мин. На поверхность агара в 20 чашках Петри наносили по 0,1 мл взвеси спор из разведения 10-5 после тщательного ее перемешивания путем пипетирования. Вращательными движениями чашек распределяли взвесь по поверхности среды. После полного впитывания жидкости 10 чашек помещали в термостат для инкубирования. На поверхность остальных 10 агаровых пластин наносили по 0,5 мл цельного препарата бактериофага К-ВИЭВ (титр по Аппельману 4×10-8). Плавно наклоняя чашку, смачивали всю поверхность питательной среды препаратом бактериофага. Посевы помещали в термостат с приоткрытой крышкой до полного впитывания жидкости, после чего чашки переворачивали крышками вниз и оставляли при 37°С.Molten medium was poured into Petri dishes to isolate and cultivate the anthrax microbe with the addition of sodium phenolphthalein phosphate. Before use, plates with medium were dried in a thermostat with ajar lid for 1 h 20 min. On the surface of the agar in 20 Petri dishes, 0.1 ml of suspension of spores from a 10 -5 dilution was applied after thoroughly mixing it by pipetting. By rotational movements of the cups, the suspension was distributed over the surface of the medium. After completely absorbing the liquid, 10 cups were placed in an incubation thermostat. On the surface of the remaining 10 agar plates, 0.5 ml of a whole preparation of the bacteriophage K-VIEV was applied (Appelman titer 4 × 10 -8 ). Gently tilting the cup, they moistened the entire surface of the nutrient medium with a bacteriophage preparation. Crops were placed in a thermostat with the lid ajar until the liquid was completely absorbed, after which the cups were turned upside down and left at 37 ° C.
Учет результатов проводили через 22 ч. На 10 чашках, обработанных бактериофагом К-ВИЭВ, количество выросших колоний составило: 3+3+2+3+2+4+3+1+4+2=27. Количество колоний на чашках, не обработанных бактериофагом, составило: 48+66+57+44+67+50+63+58+49+62=564. Содержание особей, резистентных к литическому действию сибиреязвенного бактериофага К-ВИЭВ, в популяции штамма В. anthracis 81/1 составило:The results were taken into account after 22 hours. On 10 plates treated with the bacteriophage K-VIEV, the number of colonies grown was 3 + 3 + 2 + 3 + 2 + 4 + 3 + 1 + 4 + 2 = 27. The number of colonies on plates not treated with a bacteriophage was: 48 + 66 + 57 + 44 + 67 + 50 + 63 + 58 + 49 + 62 = 564. The content of individuals resistant to the lytic effect of the anthrax bacteriophage K-VIEV in the population of strain B. anthracis 81/1 was:
Поскольку в данном примере посевы производились на селективную среду, содержащую ингибиторы посторонней микрофлоры, а также фенолфталеинфосфат натрия, чашки с посевами обрабатывали в парах аммиака, что позволило на основании отрицательного теста на фосфатазу с достаточной долей уверенности исключить принадлежность фагорезистентных колоний к спорообразующим сапрофитам.Since in this example, inoculations were performed on a selective medium containing extraneous microflora inhibitors, as well as sodium phenolphthalein phosphate, the inoculated plates were processed in ammonia vapors, which made it possible to exclude the presence of phage-resistant colonies from spore-forming saprophytes on the basis of a negative phosphatase test.
Пример 3. Из взвеси спор штамма В. anthracis 1(CO) в 30%-ном растворе глицерина, хранившейся в запаянной ампуле при 4-6°С, готовили взвесь в физиологическом растворе NaCl, соответствующую 10 ед. мутности по отраслевому стандарту мутности ГИСК имени Л.И. Тарасовича, которую титровали в физиологическом растворе NaCl десятикратными разведениями до разведения 10-5.Example 3. From a suspension of spores of strain B. anthracis 1 (CO) in a 30% glycerol solution stored in a sealed ampoule at 4-6 ° C, a suspension was prepared in physiological NaCl solution, corresponding to 10 units. turbidity according to the industry standard turbidity GISK named after L.I. Tarasovich, which was titrated in physiological NaCl solution with tenfold dilutions to a dilution of 10 -5 .
В чашки Петри разливали расплавленный агар Хоттингера (рН 7,4). Чашки с агаром подсушивали в термостате с приоткрытой крышкой в течение 2 ч. На поверхность агара в 20 чашках Петри наносили по 0,1 мл взвеси спор после тщательного ее перемешивания путем пипетирования. Вращательным движением чашек распределяли взвесь по поверхности среды. После полного впитывания жидкости 10 чашек помещали в термостат для инкубирования. На поверхность остальных 10 агаровых пластин наносили по 0,5 мл цельного препарата бактериофага ВА-9 (титр по Аппельману 2×10-9). Плавно наклоняя чашку, смачивали всю поверхность среды препаратом бактериофага. Посевы помещали в термостат с приоткрытой крышкой до полного впитывания жидкости, после чего чашки переворачивали крышкой вниз и оставляли при 37°С.Hottinger molten agar (pH 7.4) was poured into Petri dishes. The agar plates were dried in a thermostat with the lid ajar for 2 hours. 0.1 ml of spore suspension was applied to the agar surface in 20 Petri dishes after thorough mixing by pipetting. By rotating the cups, the suspension was distributed over the surface of the medium. After completely absorbing the liquid, 10 cups were placed in an incubation thermostat. On the surface of the remaining 10 agar plates, 0.5 ml of a whole preparation of the bacteriophage VA-9 was applied (Appelman titer 2 × 10 -9 ). Gently tilting the cup, they wetted the entire surface of the medium with a bacteriophage preparation. Crops were placed in a thermostat with the lid ajar until the liquid was completely absorbed, after which the cups were turned upside down and left at 37 ° C.
Учет результатов проводили через 24 ч. На 10 чашках, обработанных бактериофагом ВА-9, количество выросших колоний составило: 7+9+9+11+7+13+7+7+10+4+=83. Количество колоний на чашках, не обработанных бактериофагом, составило: 67+58+60+64+53+57+65+69+58+61=612. Содержание особей, резистентных к литическому действию сибиреязвенного бактериофага ВА-9, в популяции штамма В. anthracis 1(CO) составило:The results were taken into account after 24 hours. On 10 plates treated with the bacteriophage VA-9, the number of grown colonies was: 7 + 9 + 9 + 11 + 7 + 13 + 7 + 7 + 10 + 4 + = 83. The number of colonies on plates not treated with a bacteriophage was: 67 + 58 + 60 + 64 + 53 + 57 + 65 + 69 + 58 + 61 = 612. The content of individuals resistant to the lytic action of the anthrax bacteriophage VA-9 in the population of strain B. anthracis 1 (CO) was:
Как показали эксперименты, 7-10 засеянных чашек с питательной средой достаточно для исследования не менее 500 к.о.е. (спор) при указанном методе подготовки споровых взвесей. Применение споровых взвесей более высокой концентрации приводит к образованию сливного роста культуры на контрольных посевах, что делает невозможными точные подсчеты. Снижение концентрации спор в исследуемой взвеси требует увеличения количества засеваемых чашек, что делает исследования более трудоемкими и увеличивает материальные затраты. При одновременном изучении популяционного состава штамма В. anthracis по резистентности к нескольким бактериофагам контрольные посевы являются общими, и их количество должно соответствовать количеству опытных посевов для каждого бактериофага.As experiments have shown, 7-10 seeded cups with a nutrient medium are sufficient for research at least 500 k.o.e. (dispute) with the specified method for the preparation of spore suspensions. The use of spore suspensions of a higher concentration leads to the formation of confluent growth of the culture in the control crops, which makes accurate calculations impossible. Reducing the concentration of spores in the studied suspension requires an increase in the number of seeded cups, which makes research more time-consuming and increases material costs. While studying the population composition of the strain B. anthracis by resistance to several bacteriophages, the control crops are common, and their number should correspond to the number of experimental crops for each bacteriophage.
Время менее 20 ч недостаточно для формирования на посевах, обработанных бактериофагом, колоний, достаточных по величине не только для визуального учета, но и для отсева на питательные среды для дальнейшего изучения их биологических свойств. Инкубирование посевов более 24 ч может привести к слиянию колоний при их росте на более частых контрольных посевах, что затрудняет учет результатов.A time of less than 20 hours is not enough to form colonies on crops treated with a bacteriophage that are large enough not only for visual counting, but also for screening on nutrient media to further study their biological properties. Incubation of crops for more than 24 hours can lead to the fusion of colonies when they grow on more frequent control crops, which makes it difficult to account for the results.
Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование позволит увеличить чувствительность, точность и достоверность характеристики исходных популяций штаммов В. anthracis по количественному содержанию в них особей (спор), резистентных к литическому действию различных сибиреязвенных бактериофагов, а возможность отбора фагорезистентных клонов позволит изучить комплекс их биологических свойств.Thus, the invention is practicable, its use will increase the sensitivity, accuracy and reliability of the characteristics of the initial populations of B. anthracis strains by the quantitative content of individuals (spores) resistant to the lytic effect of various anthrax bacteriophages, and the possibility of selecting phage-resistant clones will allow us to study their complex biological properties.
ЛИТЕРАТУРАLITERATURE
1. Ипатенко Н.Г., Седов В.А., Зелепукин B.C. и др. Сибирская язва сельскохозяйственных животных // М.: Агропромиздат, 1987. С.175-177.1. Ipatenko N.G., Sedov V.A., Zelepukin B.C. and other anthrax of farm animals // M .: Agropromizdat, 1987. S.175-177.
2. Васильев П.Г., Иванов Ю.И., Садыков Н.С., Кожухов В.В., Зиганшин Р.Ш., Дербина Л.М., Сенькин А.В. Чувствительность штаммов В. anthracis, выделенных из разных источников внешней среды, к видоспецифическим сибиреязвенным бактериофагам // Диагн., лечение и проф. опасных инф. заболеваний. Биотехнология. Ветеринария. Мат. юбилейной науч. конф. посвящ. 70-летию НИИ Микробиологии МОРФ. - Киров, 1998. - С.64.2. Vasiliev P.G., Ivanov Yu.I., Sadykov N.S., Kozhukhov V.V., Ziganshin R.Sh., Derbina L.M., Senkin A.V. The sensitivity of B. anthracis strains isolated from various environmental sources to species-specific anthrax bacteriophages // Diagn., Treatment and prof. dangerous inf. diseases. Biotechnology. Veterinary Medicine Mat. anniversary scientific conf. initiation 70th anniversary of the Research Institute of Microbiology, MORF. - Kirov, 1998 .-- P.64.
3. Обносова Н.В., Шуляк В.П. О патогенных свойствах возбудителя сибирской язвы в разных очагах // Достижения и перспективы борьбы с сибирской язвой в СССР: Тез. докл. Х Пленарного заседания межведомственной научно-методической комиссии по борьбе с сибирской язвой (28-29 сентября 1978 г., г. Баку. - Москва, 1978. - С.123-124.3. Obnosova N.V., Shulyak V.P. On the pathogenic properties of the causative agent of anthrax in different foci // Achievements and prospects for the fight against anthrax in the USSR: Abstract. doc. X Plenary meeting of the interagency scientific and methodological commission for the fight against anthrax (September 28-29, 1978, Baku. - Moscow, 1978. - P.123-124.
4. Thome C.B. Genetics of Bacillus anthracis // In Leive L. (Ed.). Microbiology. - 1985. - Amer. Soc. Microbiol, Washington D.C. - 1985. - P. 56-62.4. Thome C.B. Genetics of Bacillus anthracis // In Leive L. (Ed.). Microbiology. - 1985. - Amer. Soc. Microbiol, Washington D.C. - 1985. - P. 56-62.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004122265/13A RU2266963C1 (en) | 2004-07-19 | 2004-07-19 | Assay of strain bacillus anthracis population resistivity to anthracic bacteriophage |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2004122265/13A RU2266963C1 (en) | 2004-07-19 | 2004-07-19 | Assay of strain bacillus anthracis population resistivity to anthracic bacteriophage |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2266963C1 true RU2266963C1 (en) | 2005-12-27 |
Family
ID=35870393
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2004122265/13A RU2266963C1 (en) | 2004-07-19 | 2004-07-19 | Assay of strain bacillus anthracis population resistivity to anthracic bacteriophage |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2266963C1 (en) |
-
2004
- 2004-07-19 RU RU2004122265/13A patent/RU2266963C1/en not_active IP Right Cessation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wilson | The proportion of viable bacteria in young cultures with especial reference to the technique employed in counting | |
| Sachivkina et al. | The evaluation of intensity of formation of biomembrane by microscopic fungi of the Candida genus | |
| Begum et al. | Detection of biofilm producing coagulase positive Staphylococcus aureus from bovine mastitis, their pigment production, hemolytic activity and antibiotic sensitivity pattern | |
| CN112961805B (en) | Salmonella typhimurium with quinolone drug resistance genes gyrA and parE mutated simultaneously and application thereof | |
| Eloff et al. | Toxicological studies on Microcystis | |
| Dudchik et al. | Bacterial profiles and phenotypic biomarkers of microbiota isolates in habitat: hazard identification factors | |
| RU2266963C1 (en) | Assay of strain bacillus anthracis population resistivity to anthracic bacteriophage | |
| Vaksman et al. | Myxococcus xanthus growth, development, and isolation | |
| RU2360969C1 (en) | Method of erythrocyte analysis for bacteria fixing activity | |
| RU2400746C2 (en) | Method of determining quantity of mesophilic aerobic and optionally-anaerobic microorganisms in food products | |
| RU2337360C1 (en) | Method of determination of bacteriostatic properties of antibodies to virulence factors burkholderia pseudomallei | |
| RU2572572C1 (en) | Method of determining saprophytic bacteria stimulating growth of listeria monocytogenes in marine microbial communities | |
| Marine et al. | Antimicrobial Sensitivity Assay for Bdellovibrio bacteriovorus | |
| RU2818369C1 (en) | Method for assessing lactobacillus viability preservation under effect of various antiseptic concentrations | |
| RU2485183C1 (en) | Method of diagnostics of candidiasis of upper respiratory tract in workers of agroindustrial complex | |
| Murthy | Introductory Microbiology-I | |
| Kovalenko et al. | Sanitary microbiology: learning guide | |
| Maroff | Determination of the inhibitory activity of some biological extracts agaiast multi rrsistans antibiotic Staphylococcus specis which and isolated from different sources of infechtion | |
| AL-Jumaa et al. | Laboratory diagnosis of Mycoplasma spp. from the upper respiratory tract and conjunctival infections in shelter cats | |
| Priya et al. | Biofilm formation by Streptococcus serotypes on dental plaques | |
| Slominski et al. | Quantitation of Microorganisms | |
| RU2123532C1 (en) | Method of selection of anthrax vaccine strain cultures and vaccines prepared of thereof | |
| OHUNYON | PREVALENCE OF Staphylococcus aureus AND Bacillus cereus IN READY-TO-EAT GAME MEAT SOLID IN DIFFERENT CITIES IN SOUTHWESTERN NIGERIA | |
| RU2587636C1 (en) | Method of quantitative assessment of lytic activity of bacteriophages | |
| Shamshad | Exploration of yeast candida zeylonoides with special references to probiotic activity isolated from mozzarella cheese |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20060720 |