RU2572572C1 - Method of determining saprophytic bacteria stimulating growth of listeria monocytogenes in marine microbial communities - Google Patents
Method of determining saprophytic bacteria stimulating growth of listeria monocytogenes in marine microbial communities Download PDFInfo
- Publication number
- RU2572572C1 RU2572572C1 RU2014145720/10A RU2014145720A RU2572572C1 RU 2572572 C1 RU2572572 C1 RU 2572572C1 RU 2014145720/10 A RU2014145720/10 A RU 2014145720/10A RU 2014145720 A RU2014145720 A RU 2014145720A RU 2572572 C1 RU2572572 C1 RU 2572572C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- growth
- listeria
- marine
- saprophytic
- bacteria
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к микробиологии, а именно к экологическому и санитарно-гигиеническому контролю за инфицированностью Listeria monocytogenes морской воды и морепродуктов.The invention relates to microbiology, in particular to environmental and sanitary-hygienic control of the infection of Listeria monocytogenes with sea water and seafood.
Известно, что водная среда является одной из экологических ниш обитания Listeria monocytogenes. Начиная с конца 80-х годов и до настоящего времени в ряде стран Европы и Америки были отмечены многочисленные вспышки листериоза у людей, связанные с употреблением в пищу инфицированных морских продуктов [1].It is known that the aquatic environment is one of the ecological niches for Listeria monocytogenes. From the end of the 80s to the present, numerous outbreaks of listeriosis in people associated with eating infected seafood have been observed in several countries of Europe and America [1].
С современных позиций изучение биологической активности, в том числе, и вирулентных свойств отдельно выделенных штаммов листерий из морской среды и морских животных не является достаточным для определения угрозы и возможных масштабов возникновения серьезных эколого-эпидемических ситуаций.From modern perspectives, the study of biological activity, including the virulent properties of separately isolated strains of listeria from the marine environment and marine animals, is not sufficient to determine the threat and possible scale of serious environmental and epidemic situations.
В настоящее время не ясны механизмы регуляции численности листерий в морских экосистемах. Рассматривая морскую воду как экологическую нишу, занимаемую листериями, как правило, основное внимание исследователей уделяется изучению динамики численности патогенных бактерий под влиянием определенных абиотических факторов, используя математическое моделирование данных параметров в морских субстратах [2].Currently, the mechanisms for regulating the number of listeria in marine ecosystems are not clear. Considering sea water as an ecological niche occupied by Listeria, as a rule, the main attention of researchers is paid to studying the dynamics of the number of pathogenic bacteria under the influence of certain abiotic factors, using mathematical modeling of these parameters in marine substrates [2].
Помимо абиотических, на биологию возбудителя оказывают влияние и биотические факторы среды, так как листерии входят в состав биоценозов с сапрофитными микроорганизмами, обитающими в морской воде. Известно, что метаболиты бактерий усиливают размножение других микроорганизмов или растений [3, 4]. И если в морских микробных сообществах встречаются в большинстве своем сапрофиты, выделяющие в среду вещества, стимулирующие размножение листерий, то последние могут длительно существовать в морской среде. Невозможно оценить эпидемиологическую ситуацию в этом случае, основываясь только на выделении возбудителя из среды.In addition to abiotic, biotic environmental factors also influence the biology of the pathogen, since listeria are part of biocenoses with saprophytic microorganisms living in sea water. It is known that bacterial metabolites enhance the reproduction of other microorganisms or plants [3, 4]. And if in marine microbial communities saprophytes are found for the most part, they release substances that stimulate the propagation of listeria into the environment, then the latter can exist for a long time in the marine environment. It is impossible to assess the epidemiological situation in this case, based only on the isolation of the pathogen from the environment.
Одним из возможных способов контроля эколого-эпидемических ситуаций может быть учет сапрофитных морских бактерий, стимулирующих рост и размножение листерий в морских микробных сообществах через выделяемые ими в среду экзометаболиты. Это позволяет более реально оценить эколого-эпидемиологическую ситуацию в отношении длительности выживания листерий в морской воде изучаемой акватории.One of the possible ways to control ecological and epidemic situations may be to take into account saprophytic marine bacteria, which stimulate the growth and reproduction of listeria in marine microbial communities through exometabolites released into the environment. This allows a more realistic assessment of the ecological and epidemiological situation with respect to the duration of the survival of listeria in the sea water of the study area.
Наиболее близким аналогом количественной оценки межмикробных взаимодействий в микробных сообществах к заявляемому способу по совокупности существенных признаков и достигаемому результату является способ определения стимулирующей активности почвенных сапрофитных бактерий (Торотенкова В.Н., Тирранен Л.С., Сысоева О.В. Взаимодействия микроорганизмов через продуцируемые ими летучие вещества, Вестник КрасГАУ, Красноярск, 2009, вып. 12, с. 150-154), предусматривающий засев одной половины чашки Петри с агаризованной средой испытуемыми микроорганизмами, а другую половинку чашки Петри тест-культурами [5]. Воздействие испытуемой культуры оценивают как положительное (стимулирующее) или отрицательное (ингибирующее), когда размер колоний тест-культур в опыте соответственно достоверно увеличен или снижен по сравнению с контролем. Если размер колоний в опыте достоверно не отличается от контроля, действие испытуемой культуры оценивают как нулевое. Способ-прототип позволяет посмотреть в целом «картину взаимоотношений» микроорганизмов в морском микробном сообществе, дать оценку межмикробным взаимодействиям в микробных сообществах, но не позволяет определить, какие из испытуемых стимулирующих культур эффективны в отношении истинной стимуляции роста тест-бактерий. The closest analogue to the quantitative assessment of intermicrobial interactions in microbial communities to the claimed method according to the set of essential features and the achieved result is a method for determining the stimulating activity of soil saprophytic bacteria (Torotenkova V.N., Tyranen L.S., Sysoeva O.V. Interactions of microorganisms through produced them volatile substances, Vestnik KrasGAU, Krasnoyarsk, 2009, issue 12, pp. 150-154), which provides for the inoculation of one half of a Petri dish with an agar medium by test microorganisms zmami, and the other half of the Petri dish with test cultures [5]. The impact of the test culture is evaluated as positive (stimulating) or negative (inhibiting), when the size of the colonies of the test cultures in the experiment, respectively, significantly increased or decreased compared with the control. If the size of the colonies in the experiment is not significantly different from the control, the effect of the test culture is evaluated as zero. The prototype method allows you to see the whole "picture of the relationship" of microorganisms in the marine microbial community, to evaluate the intermicrobial interactions in microbial communities, but it does not allow to determine which of the tested stimulating cultures are effective in relation to the true stimulation of growth of test bacteria.
Недостатки способа-прототипа:The disadvantages of the prototype method:
- отсутствует точная количественная оценка эффекта стимуляции испытуемой культуры на тест микроорганизм;- there is no accurate quantitative assessment of the effect of stimulation of the test culture on the test microorganism;
- метод не применяют для изучения влияния метаболитов морских бактерий на рост патогенных бактерий;- the method is not used to study the effect of metabolites of marine bacteria on the growth of pathogenic bacteria;
- использование репликатора значительно усложняет осуществление метода, т.к. этот прибор требует специального изготовления [6].- the use of a replicator greatly complicates the implementation of the method, because This device requires special manufacture [6].
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка эффективного способа выявления и учета активных сапрофитных бактерий, стимулирующих размножение и рост Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) в морских микробных сообществах.The problem to which the invention is directed, is to develop an effective method for identifying and accounting for active saprophytic bacteria that stimulate the reproduction and growth of Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) in marine microbial communities.
Техническими результатами заявляемого изобретения являются повышение возможности выявления из большого массива данных активных сапрофитных морских бактерий, стимулирующих рост патогенных бактерий, и увеличение точности, экономичности и простоты их учета при проведении санитарных и экологических мониторинговых исследований, в том числе и в экспедиционных условиях.The technical results of the claimed invention are to increase the possibility of identifying active saprophytic marine bacteria from a large array of data that stimulate the growth of pathogenic bacteria, and to increase the accuracy, cost-effectiveness and ease of taking them into account when conducting sanitary and environmental monitoring studies, including in field conditions.
Решение поставленной задачи обеспечивается предлагаемым способом количественного учета биологически активных сапрофитных морских бактерий, стимулирующих рост L. monocytogenes. Способ предполагает использование известной агаризованной среды СММ (среда для морских микроорганизмов) [7], имеющей состав (г/л): СаСО3 - 1 г, К2НРО4 - 0.2 г, MgSO4 - 1 г, дрожжевой экстракт - 5 г, пептон - 5 г, глюкоза - 1 г, морская вода - 500 мл, дистиллированная - 500 мл, агар - 15 г и включает в себя: смыв испытуемой культуры сапрофитных морских микроорганизмов с косого агара СММ; засев «газоном» полученной суспензией культуры бактерий одной половины чашки Петри с агаровой средой (среда СММ);нанесение на другую половину чашки Петри с ГРМ-агаром бумажных дисков из фильтровальной бумаги (d=0,5 см), смоченных смывом патогенных бактерий (концентрация листерий 109 КОЕ/мл по стандарту мутности), используемых в качестве тест-объектов; дальнейшее состыковывание двух половинок чашки Петри с испытуемой культурой (морские штаммы) и тест-микроорганизмами (патогенные бактерии) и культивирование при температуре 18-20°C в течение 3-4 суток. Стимулирующий эффект определяют по величине зоны роста тест-культуры вокруг бумажного диска относительно контроля.The solution to this problem is provided by the proposed method for the quantitative accounting of biologically active saprophytic marine bacteria that stimulate the growth of L. monocytogenes. The method involves the use of the known agarized medium SMM (medium for marine microorganisms) [7], having the composition (g / l): CaCO 3 - 1 g, K 2 NRA 4 - 0.2 g, MgSO 4 - 1 g, yeast extract - 5 g peptone - 5 g, glucose - 1 g, seawater - 500 ml, distilled - 500 ml, agar - 15 g and includes: washing the test culture of saprophytic marine microorganisms from oblique SMM agar; inoculation with a “lawn” of a suspension of a culture of bacteria from one half of a Petri dish with agar medium (SMM medium); applying to the other half of the Petri dish with timing belt agar paper disks from filter paper (d = 0.5 cm) moistened with a flush of pathogenic bacteria (
При этом тест-культуры засевали с помощью станины-репликатора. In this test culture was seeded using a bed-replicator.
На фиг. 1 представлен репликатор, изготовленный по индивидуальному заказу: вверху - ручка со штырьками, внизу - станина с лунками. На фиг.2 представлен рост тест-культур: слева - контроль, справа - опыт.In FIG. Figure 1 shows a custom made replicator: at the top is a handle with pins, at the bottom is a bed with holes. Figure 2 shows the growth of test cultures: on the left - control, on the right - experience.
Основой предлагаемого способа является методика Торотенковой В.Н., Тирранен Л.С., О.В. Сысоева. [5]. На фиг. 3 показан рост тест-организмов листерий в зависимости от действия летучих метаболитов морских сапрофитов, которые продуцирует испытуемая культура, выросшая на противоположной стороне чашки, и представлен метод определения активности летучих метаболитов с помощью бумажных дисков: А) посев сапрофита газоном; Б) пример роста штаммов L. monocytogenes; В) скрепленные чашки. Оценку результата проводят путем замера величины зоны роста культуры вокруг места нанесения тест-микроорганизмов, которую соотносят со значением контроля. Контролем служит чашка Петри, где не используют испытуемую культуру (одну половину чашки Петри не засевают сапрофитами - это просто агаровая среда без культуры бактерий), а другая половина чашки Петри - со свеженанесенными методом дисков тест-культурами листерий. Если по результатам замера величина зоны роста тест-культуры, выраженная в см, достоверно выше контроля, то это положительный результат.The basis of the proposed method is the method of Torotenkova V.N., Tirranen L.S., O.V. Sysoeva. [5]. In FIG. Figure 3 shows the growth of Listeria test organisms depending on the action of volatile metabolites of marine saprophytes produced by the test culture grown on the opposite side of the cup, and a method for determining the activity of volatile metabolites using paper discs is presented: A) sowing of saprophyte with a lawn; B) an example of the growth of strains of L. monocytogenes; C) bonded cups. Evaluation of the result is carried out by measuring the size of the growth zone of the culture around the place of application of the test microorganisms, which is correlated with the control value. A Petri dish is used as a control, where the test culture is not used (one half of the Petri dish is not inoculated with saprophytes - it’s just an agar medium without a bacterial culture), and the other half of the Petri dish is fresh with the Listeria test cultures freshly applied by the disc method. If, according to the results of measurement, the size of the test culture growth zone, expressed in cm, is significantly higher than the control, then this is a positive result.
Отличает заявленный способ от известного способа то, что:Distinguishes the claimed method from the known method in that:
- используют агаризованную среду не для почвенных, а для морских микроорганизмов (среда СММ);- use agar medium not for soil but for marine microorganisms (SMM medium);
- для нанесения тест-культур используют бумажные диски, пропитанные суспензией Listeria monocytogenes в концентрации 109 КОЕ/мл;- for applying test cultures using paper disks impregnated with a suspension of Listeria monocytogenes at a concentration of 10 9 CFU / ml;
- критерием стимулирующей активности штаммов сапрофитных бактерий считают величину зоны роста тест-культур листерий вокруг бумажного диска, равную или большую 0,9 см за вычетом размера диска.- the criterion of the stimulating activity of strains of saprophytic bacteria is considered the size of the growth zone of the Listeria test cultures around the paper disk, equal to or greater than 0.9 cm minus the disk size.
Экспериментальным путем было установлено, что не все испытуемые культуры сапрофитных бактерий, положительно влияющие на увеличение зон роста тест-культур, по сравнению с контролем, действительно стимулируют рост листерий. Это справедливо только в тех случаях, когда зона роста тест-культуры вокруг диска равна 0,9 см и более (с вычетом размера диска), что было доказано при построении кривых роста листерий на среде, содержащей экзометаболиты испытуемых культур (спектрофотометрический метод). Статистический анализ результатов исследований показал, что данные о стимулирующем эффекте сапрофитных бактерий на культуры листерий, полученные при изучении влияния летучих метаболитов (чашечный метод), достоверны и коррелируют с данными, полученными при изучении влияния растворенных в среде экзометаболитов (спектрофотометрический метод), только, когда зона роста тест-культуры вокруг диска равна 0,9 см и более (с вычетом размера диска). It was experimentally established that not all test cultures of saprophytic bacteria, which positively affect the growth zones of test cultures, compared with the control, actually stimulate the growth of listeria. This is true only in those cases when the growth zone of the test culture around the disk is 0.9 cm or more (minus the size of the disk), which was proved by constructing the growth curves of listeria on a medium containing exometabolites of the tested cultures (spectrophotometric method). A statistical analysis of the research results showed that the data on the stimulating effect of saprophytic bacteria on Listeria cultures obtained by studying the influence of volatile metabolites (the cup method) are reliable and correlate with the data obtained by studying the effect of exometabolites dissolved in the medium (spectrophotometric method) only when the growth area of the test culture around the disc is 0.9 cm or more (minus the size of the disc).
Определение стимулирующего действия испытуемых культур проводят в 2 этапа.Determination of the stimulating effect of the test cultures is carried out in 2 stages.
1-й этап скрининговый - выявление сапрофитных бактерий, влияющих на увеличение зоны роста листерий на агаризованной среде за счет синтеза летучих метаболитов;Screening stage 1 - identification of saprophytic bacteria that affect the increase in the growth zone of listeria on an agarized medium due to the synthesis of volatile metabolites;
2-й этап - определение стимулирующего действия экзометаболитов сапрофитных бактерий путем построения кривых роста листерий спектрофотометрическим методом.Stage 2 - determination of the stimulating effect of exometabolites of saprophytic bacteria by constructing the growth curves of listeria by spectrophotometric method.
Экзометаболиты сапрофитных бактерий получают в жидкой среде. Для построения кривых роста листерий определяют динамику их численности в среде, содержащей экзометаболиты испытуемых культур, с использованием спектрофотометра Т70 UV/VIS Spectrometer PG Instruments Ltd (Англия) при длине волны 590 нм (примеры 1-4, таблица 4).Exometabolites of saprophytic bacteria are obtained in a liquid medium. To build the growth curves of listeria, the dynamics of their numbers in a medium containing exometabolites of the tested cultures was determined using a T70 UV / VIS Spectrometer PG Instruments Ltd (England) spectrophotometer at a wavelength of 590 nm (examples 1-4, table 4).
Из данных, представленных на фиг. 4-7 и в таблице 4, следует, что если зона роста культуры листерий на плотном агаре вокруг диска равна 0,9 см и более за вычетом размера диска, то ее можно считать критерием, характеризующим стимулирующую активность морских сапрофитных штаммов, и именно эти штаммы можно считать биологически активными. Поскольку определение стимулирующей активности метаболитов, безусловно точнее при использовании спектрофотометрического метода, но он очень громоздкий и использовать его для больших выборок изолятов практически невозможно, особенно в полевых условиях. Для этого вполне приемлем метод летучих метаболитов, но он, как показала наша проверка, не точный в том варианте, когда его используют по примеру методики Торотенковой В.Н., Тирранен Л.С., О.В. Сысоева. [5]. Введение критерия 0,9 см и более позволяет использовать удобный для исследования большого количества изолятов метод, но при этом точно отбирать те из них, которые объективно стимулируют рост листерий.From the data presented in FIG. 4-7 and in table 4, it follows that if the growth zone of the Listeria culture on dense agar around the disk is 0.9 cm or more minus the disk size, then it can be considered a criterion characterizing the stimulating activity of marine saprophytic strains, and it is these strains can be considered biologically active. Since the determination of the stimulating activity of metabolites is certainly more accurate when using the spectrophotometric method, it is very cumbersome and it is practically impossible to use it for large samples of isolates, especially in the field. For this, the method of volatile metabolites is quite acceptable, but, as our verification has shown, it is not accurate in the case when it is used according to the example of the method of Torotenkova V.N., Tirranen L.S., O.V. Sysoeva. [5]. The introduction of a criterion of 0.9 cm or more allows you to use the method convenient for the study of a large number of isolates, but at the same time accurately select those that objectively stimulate the growth of listeria.
Таким образом, предлагаемый способ учета штаммов активных сапрофитов, стимулирующих рост патогенных бактерий, является более точным за счет введения критерия учета - размера зоны роста листерий вокруг диска, выраженного в см. Применение бумажных дисков для нанесения тест-культуры патогенных бактерий позволяет значительно упростить эту процедуру, при этом не требуется проводить сравнение с контролем, что также делает способ более простым и экономичным.Thus, the proposed method of accounting for strains of active saprophytes that stimulate the growth of pathogenic bacteria is more accurate by introducing an accounting criterion - the size of the growth area of listeria around the disk, expressed in cm. Using paper disks for applying a test culture of pathogenic bacteria can significantly simplify this procedure , it does not require comparison with the control, which also makes the method simpler and more economical.
Преимуществами разработанного способа являются возможность его применения для мониторинга размножения патогенных бактерий в морской среде и прогнозирование ситуаций эпидемиологического риска, в том числе - в экспедиционных условиях или при проведении масштабных санитарно-гигиенических исследований.The advantages of the developed method are the possibility of its use for monitoring the propagation of pathogenic bacteria in the marine environment and predicting situations of epidemiological risk, including in expeditionary conditions or when conducting large-scale sanitary and hygienic studies.
Способ прост в осуществлении, не требует использования специального оборудования и химических реактивов, но при этом обеспечивает достаточно высокую точность определения штаммов - стимуляторов роста Listeria monocytogenes в морских микробных сообществах.The method is simple to implement, does not require the use of special equipment and chemical reagents, but it provides a sufficiently high accuracy in the determination of strains - growth stimulators of Listeria monocytogenes in marine microbial communities.
Сведений об известности указанного выше критерия, определяющего активность штаммов по их влиянию на величину зон роста тест-культур, выраженную в см, а не в соотношении с контролем, из уровня техники не выявлено.Information about the fame of the above criterion that determines the activity of the strains by their influence on the size of the growth zones of test cultures, expressed in cm, and not in relation to the control, is not revealed from the prior art.
Существенные отличия заявляемого способа:Significant differences of the proposed method:
- использование агаризованной среды СММ (среда для морских микроорганизмов) [7],- the use of agar medium SMM (environment for marine microorganisms) [7],
- использование значения ≥0,9 см (с вычетом размера бумажного диска) при определении зоны роста тест-микроорганизмов вокруг диска в качестве критерия для выявления штаммов биологически активных сапрофитов, стимулирующих размножение листерий в морских микробных сообществах;- using a value of ≥0.9 cm (minus the size of the paper disk) when determining the growth zone of test microorganisms around the disk as a criterion for identifying strains of biologically active saprophytes that stimulate the propagation of listeria in marine microbial communities;
- использование бумажных дисков из фильтровальной бумаги для нанесения тест-культуры в концентрации листерий 109 КОЕ/мл по стандарту мутности;- the use of paper disks from filter paper for applying a test culture in a concentration of Listeria 10 9 CFU / ml according to the turbidity standard;
- в качестве исследуемого материала используют морские микроорганизмы.- marine microorganisms are used as the test material.
Возможность осуществления изобретения подтверждается следующими примерами.The possibility of carrying out the invention is confirmed by the following examples.
Бумажные диски из фильтровальной бумаги, предлагаемые для осуществления способа, можно заготовить впрок с помощью дырокола (диски получаются одинаковые по размеру - 0,5 см), простерилизовать их при 0,5 атм в бюксах или любой другой стеклянной посуде и хранить при комнатной температуре.Paper disks from filter paper, proposed for the implementation of the method, can be prepared for future use with a hole punch (the disks are the same in size - 0.5 cm), sterilized at 0.5 atm in bucks or any other glassware and stored at room temperature.
Пример 1. В качестве объектов исследования были использованы штаммы сапрофитных бактерий, выделенные из поверхностных морских вод залива Петра Великого (Японское море); таблица 1.Example 1. As objects of study, strains of saprophytic bacteria isolated from the surface sea waters of Peter the Great Bay (Sea of Japan) were used; Table 1.
Выделение сапрофитной микрофлоры в колонии осуществляли путем высева морской воды на среду СММ (среда для морских микроорганизмов). Посевы помещали в термостат при температуре 22°C на сутки; выросшие колонии откалывали на косой агар. Всего было выделено 26 изолятов морских бактерий, которые использовали как испытуемые культуры и засевали газоном на СММ агар одной из половин чашки Петри. На вторую половину чашки Петри с ГРМ-агаром помещали бумажные диски, пропитанные культурой листерий в концентрации 109 КОЕ/мл по стандарту мутности (из коллекции музея НИИЭМ им. Г.П. Сомова СО РАМН); таблица 2.The isolation of saprophytic microflora in the colony was carried out by seeding seawater on a medium SMM (medium for marine microorganisms). Crops were placed in a thermostat at a temperature of 22 ° C for a day; grown colonies split into oblique agar. A total of 26 isolates of marine bacteria were isolated, which were used as test cultures and were seeded with lawn on the SMM agar of one of the half Petri dishes. Paper disks impregnated with a Listeria culture at a concentration of 10 9 CFU / ml according to the turbidity standard (from the collection of the GPI Somov Museum of the Siberian Branch of the Russian Academy of Medical Sciences) were placed on the second half of the Petri dish with timing agar; table 2.
Отобранные из полученного массива штаммы сапрофитов, которые способствовали достоверному увеличению зоны роста колоний по отношению к контролю в месте нанесения диска культуры листерий на поверхности агара, были использованы на втором этапе исследований. По данным таблицы 4 видно, что выраженной активностью, стимулирующей рост листерий (5642/6 №313, 12731/8-8097, 9156/2, 12734/13-8097), обладали сапрофитные штаммы 4-1, 9-2, 2-1, 5-3.Saprophyte strains selected from the resulting array, which contributed to a significant increase in the colony growth zone relative to the control at the site of application of the Listeria culture disc on the agar surface, were used at the second stage of the studies. According to table 4, it is seen that saprophytic strains 4-1, 9-2, 2- possessed pronounced activity that stimulated the growth of listeria (5642/6 No. 313, 12731 / 8-8097, 9156/2, 12734 / 13-8097). 1, 5-3.
Из 11 штаммов Listeria monocytogenes наибольшую стимуляцию роста наблюдали в основном у четырех листерий (№8, 9, 10, 11 - таблица 3). При этом, из всех взятых в эксперимент сапрофитных бактерий положительный (стимулирующий) эффект в большей степени наблюдался у всех штаммов - от 75 до 80%.Of the 11 strains of Listeria monocytogenes, the greatest growth stimulation was observed mainly in four listeria (No. 8, 9, 10, 11 - table 3). Moreover, of all the saprophytic bacteria taken in the experiment, a positive (stimulating) effect was observed to a greater extent in all strains - from 75 to 80%.
Более точный метод, позволяющий определить биологическую активность метаболитов, - это построение кривых роста с помощью спектрофотометрического метода. С этой целью в качестве исходной среды для роста L. monocytogenes, в которой осуществляется оценка роста листерий, использовали экзометаболиты сапрофитных бактерий в жидкой среде. Для этого сапрофиты выращивали в минеральной среде Патерсона-Кука (pH 7,2-7,4) сутки. Затем отделяли от культуральной жидкости (КЖ) центрифугированием при 6000 об/мин и фильтровали с помощью бактериальных фильтров с диаметром пор 0,22 мкм. В фильтрат вносили культуру L. monocytogenes по оптической плотности, равной 0,1, и вели наблюдение в течение 11 суток при температуре 20°C. Численность листерий определяли спектрофотометрически по оптической плотности (ОП) культуральной среды при λ=590 нм на спектрофотометре Т70 UV/VIS Spectrometer PG Instruments Ltd (Англия). Продолжительность фаз роста определяли графическим методом. Биологическую активность экзометаболитов морских бактерий определяли по изменению роста штаммов Listeria monocytogenes, выраженному в процентах по отношению к контролю: ОПо590/ОПк590×100%-100%; контроль принимался за 100%; в качестве контроля использовали среду Патерсона-Кука.A more accurate method for determining the biological activity of metabolites is the construction of growth curves using the spectrophotometric method. For this purpose, exometabolites of saprophytic bacteria in a liquid medium were used as the initial medium for the growth of L. monocytogenes, in which the listeria growth was evaluated. For this, saprophytes were grown in the mineral medium of Paterson-Cook (pH 7.2-7.4) a day. Then it was separated from the culture fluid (QL) by centrifugation at 6000 rpm and filtered using bacterial filters with a pore diameter of 0.22 μm. A culture of L. monocytogenes was introduced into the filtrate at an optical density of 0.1, and observation was carried out for 11 days at a temperature of 20 ° C. The number of listeria was determined spectrophotometrically from the optical density (OD) of the culture medium at λ = 590 nm on a T70 UV / VIS Spectrometer PG Instruments Ltd spectrophotometer (England). The duration of the growth phases was determined graphically. The biological activity of exometabolites of marine bacteria was determined by the change in the growth of strains of Listeria monocytogenes, expressed as a percentage in relation to the control: OPO590 / OPK590 × 100% -100%; control was taken as 100%; Paterson-Cook medium was used as a control.
На фиг. 4 показано влияние штаммов сапрофитных морских бактерий 4-1 и 9-2 на размножение штамма L. monocytogenes 12731/8 (n=3), где ОП - оптическая плотность, К3 - контроль, 05, 06 - номер опыта. Из представленных данных видно, что штамм 4-1 стимулировал рост L. monocytogenes 12731/8 на 150%, а штамм 9-2 - на 205% относительно контроля, при этом сапрофитные микроорганизмы имели одинаковые показатели влияния на размеры зон роста L. monocytogenes 12731/8 - 2,5 см соответственно.In FIG. Figure 4 shows the effect of strains of saprophytic marine bacteria 4-1 and 9-2 on the propagation of the strain L. monocytogenes 12731/8 (n = 3), where OD is the optical density, K3 is the control, 05, 06 is the experiment number. From the presented data it can be seen that strain 4-1 stimulated the growth of L. monocytogenes 12731/8 by 150%, and strain 9-2 by 205% relative to the control, while saprophytic microorganisms had the same indicators of influence on the size of the growth zones of L. monocytogenes 12731 / 8 - 2.5 cm, respectively.
Пример 2. Кривую роста L. monocytogenes 9156/2 строили, как указано в примере 1. При этом величина зоны роста штамма листерий при совместном культивировании со штаммом 4-1 составила 1 см, со штаммом 9-2-0,9 см. На фиг. 5 показано влияние штаммов сапрофитных морских бактерий 4-1 и 9-2 на размножение штамма L. monocytogenes 9156/2 (n=3); где ОП - оптическая плотность, К4 - контроль, 07, 08 - номер опыта. Как видно из данных, представленных на фиг. 5, штаммы сапрофитных морских бактерий 4-1 и 9-2 в одинаковой степени стимулировали рост штамма листерий 9156/2 по сравнению с контролем (прирост биомассы ко вторым суткам культивирования в обоих случаях составил 161% по сравнению с контролем).Example 2. The growth curve of L. monocytogenes 9156/2 was constructed as described in example 1. In this case, the size of the growth zone of the listeria strain when co-cultured with strain 4-1 was 1 cm, with strain 9-2-0.9 cm. FIG. Figure 5 shows the effect of saprophytic marine bacteria strains 4-1 and 9-2 on the propagation of the strain L. monocytogenes 9156/2 (n = 3); where OP is the optical density, K4 is the control, 07, 08 is the experiment number. As can be seen from the data presented in FIG. 5, the saprophytic marine bacteria strains 4-1 and 9-2 equally stimulated the growth of the Listeria strain 9156/2 as compared to the control (the biomass increase by the second day of cultivation in both cases was 161% compared to the control).
Пример 3. Кривую роста L. monocytogenes 5642/6 №313 строили, как указано в примере 1. При этом величина зоны роста штамма листерий при совместном культивировании со штаммом 4-1 составила 0,3 см, со штаммом 9-2 - 0,5 см. На фиг. 6 показано влияние штаммов сапрофитных морских бактерий 4-1 и 9-2 на размножение штамма L. monocytogenes 5642/6 №313 (n=3), где ОП - оптическая плотность, К4 - контроль, 07, 08 - номер опыта. Из данных видно, что оба штамма сапрофитных микроорганизмов практически не стимулировали рост L. monocytogenes и активность оставалась в пределах контроля.Example 3. The growth curve of L. monocytogenes 5642/6 No. 313 was constructed as described in example 1. The magnitude of the growth zone of the listeria strain when co-cultured with strain 4-1 was 0.3 cm, with strain 9-2 - 0, 5 cm. In FIG. Figure 6 shows the effect of saprophytic marine bacteria strains 4-1 and 9-2 on the propagation of the strain L. monocytogenes 5642/6 No. 313 (n = 3), where OD is the optical density, K4 is the control, 07, 08 is the experiment number. From the data it is seen that both strains of saprophytic microorganisms practically did not stimulate the growth of L. monocytogenes and activity remained within the control.
Пример 4. Кривую роста для L.monocytogenes 12734/13а строили, как указано в примере 1. При этом величина зоны роста штамма 12734/13а при совместном культивировании со штаммом 4-1 составила 0,8 см, со штаммом 9-2 - 0,5 см. На фиг. 7 показано влияние штаммов сапрофитных морских бактерий 4-1 и 9-2 на размножение штамма L. monocytogenes 12734/13 а (n=3), где ОП - оптическая плотность, К4 - контроль, 07, 08 - номер опыта 7. Из данных видно, что оба штамма сапрофитных микроорганизмов практически не стимулировали рост L. monocytogenes и активность оставалась в пределах контроля.Example 4. The growth curve for L.monocytogenes 12734 / 13a was constructed as described in example 1. The size of the growth zone of strain 12734 / 13a when co-cultured with strain 4-1 was 0.8 cm, with strain 9-2 - 0 5 cm. In FIG. Figure 7 shows the effect of saprophytic marine bacteria strains 4-1 and 9-2 on the propagation of L. monocytogenes strain 12734/13 а (n = 3), where OD is the optical density, K4 is the control, 07, 08 is experiment number 7. From the data it is seen that both strains of saprophytic microorganisms practically did not stimulate the growth of L. monocytogenes and the activity remained within the control.
Данные экспериментальных исследований, подтверждающие возможность осуществления заявляемого способа, приведены в таблице 4.Data from experimental studies confirming the feasibility of the proposed method are shown in table 4.
Сравнительные данные исследований по активности летучих метаболитов, полученных предлагаемым способом и спектрофотометрическим методом, показали (таблица 4), что, в случае если величина зоны роста тест-культуры равна или больше 0,9 см за вычетом размера бумажного диска, то данные, полученные «методом дисков», совпадают с данными активности экзометаболитов, полученными спектрофотометрическим методом (выделены жирным шрифтом). В остальных случаях таких совпадений нет.Comparative research data on the activity of volatile metabolites obtained by the proposed method and spectrophotometric method showed (table 4) that, if the size of the growth zone of the test culture is equal to or greater than 0.9 cm minus the size of the paper disk, then the data obtained " by the method of disks ”, coincide with the activity data of exometabolites obtained by the spectrophotometric method (in bold). In other cases, there are no such coincidences.
Таким образом, предлагается точный и простой в осуществлении метод для мониторинга размножения патогенных бактерий в морской среде, позволяющий прогнозировать ситуации эпидемиологического риска, в том числе - в экспедиционных условиях или при проведении масштабных санитарно-гигиенических исследований.Thus, an accurate and easy-to-implement method is proposed for monitoring the propagation of pathogenic bacteria in the marine environment, which makes it possible to predict situations of epidemiological risk, including in field conditions or during large-scale sanitary and hygienic studies.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫBIBLIOGRAPHY
1. Мухина Л.Б., Дмитриева Е.Ю. Возбудитель листериоза - показатель биологической опасности рыбной продукции // Технология. 2002. С. 50-51.1. Mukhina LB, Dmitrieva E.Yu. The causative agent of listeriosis is an indicator of the biological hazard of fish products // Technology. 2002.S. 50-51.
2. Schaffher D.W. Mathematical frameworks for modeling Listeria cross-contamination in food-processing plants. J. Food Science. 2004. Vol. 69 (6). P. 155-159.Schaffher, 2004.2. Schaffher D.W. Mathematical frameworks for modeling Listeria cross-contamination in food-processing plants. J. Food Science. 2004. Vol. 69 (6). P. 155-159. Schaffher, 2004.
3. Сидоренко М.Л. Влияние летучих метаболитов бактерий рода Pseudomonas на размножение патогенных бактерий.//Тихоокеанский медицинский журнал. 2001. №7. С. 131.3. Sidorenko M.L. The effect of volatile metabolites of bacteria of the genus Pseudomonas on the propagation of pathogenic bacteria. // Pacific Medical Journal. 2001. No. 7. S. 131.
4. Тамбиев А.Х., Телитченко М.М. Роль летучих и водорастворимых биологически активных соединений биогенного происхождения. - М.: Изд-во МГУ, 1971. - С. 14-27.4. Tambiev A.Kh., Telitchenko M.M. The role of volatile and water-soluble biologically active compounds of biogenic origin. - M.: Publishing House of Moscow State University, 1971. - S. 14-27.
5. Торотенкова В.Н., Тирранен Л.С., О.В. Сысоева. Взаимодействия микроорганизмов через продуцируемые ими летучие вещества. Вестник КрасГАУ, Красноярск, 2009, вып. 12, с. 150-154.5. Torotenkova V.N., Tyrranen L.S., O.V. Sysoeva. Interactions of microorganisms through the volatiles they produce. Bulletin of the Krasnodar State Agrarian University, Krasnoyarsk, 2009, no. 12, p. 150-154.
6. 1565882 А1, МКЛ С12М 1/22. Устройство для выращивания микроорганизмов на агаризованных средах - В.И. Безруких Л.С.Тиранен, Г.Д. Кропачев, М.М. Сатаров Изобретения. Официальный патентный бюллетень.1990. - №19.6. 1565882 A1,
7. Youchimizu М., Kimura Т. Study of intestinal microflora of Salmonids // Fish Pathol. 1976. V. 10. №2. P. 243-259.7. Youchimizu M., Kimura T. Study of intestinal microflora of Salmonids // Fish Pathol. 1976. V. 10. No. 2. P. 243-259.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014145720/10A RU2572572C1 (en) | 2014-11-13 | 2014-11-13 | Method of determining saprophytic bacteria stimulating growth of listeria monocytogenes in marine microbial communities |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2014145720/10A RU2572572C1 (en) | 2014-11-13 | 2014-11-13 | Method of determining saprophytic bacteria stimulating growth of listeria monocytogenes in marine microbial communities |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2572572C1 true RU2572572C1 (en) | 2016-01-20 |
Family
ID=55086977
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2014145720/10A RU2572572C1 (en) | 2014-11-13 | 2014-11-13 | Method of determining saprophytic bacteria stimulating growth of listeria monocytogenes in marine microbial communities |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2572572C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111411164A (en) * | 2020-05-26 | 2020-07-14 | 中国检验检疫科学研究院 | Method for detecting tomato canker pathogen by using digital PCR and kit reagent used by method |
-
2014
- 2014-11-13 RU RU2014145720/10A patent/RU2572572C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ТОРОТЕНКОВА В.Н., ТИРРАНЕН Л.С., СЫСОЕВА О.В., Взаимодействия микроорганизмов через продуцируемые ими летучие вещества,Вестник КрасГАУ, Красноярск, 2009, Вып.12, стр. 150-154. БУЗОЛЕВА Л.С., Влияние ээкзометаболитов микрофлоры, обсеменяющей пищевые продукты, на пролиферативные свойства ассоциированной с ними L. Monocytogenes, Материалы Всероссийской научной школы для молодежи.Перспективы развития инноваций в биологии, Владивосток, 2010, стр. 9-18. ТИРРАНЕН Л.С., ТОРОТЕНКОВА В.Н., Ауксанографический метод количественной оценки межмикробных взаимодействий,Вестник КрасГАУ, Красноярск, 2009, Вып.11, с. 140-145. БУЗОЛЕВА Л.С., СИДОРЕНКО М.Л., Влияние летучих метаболитов сапрофитной микрофлоры разных типов почв на размножение L. Monocytogenes, Международный журнал экспериментального образования. Биологические науки, 2013, N10, стр.288-291. ЛИ Н.Г., БУЗОЛЕВА Л.С., СИДОРЕНКО М.Л., Влияние экзометаболитов почвенных бактерий на размножение L.Monocytogenes, Бюллетень СО РАМН, 2013, т. 33, N2, стр * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111411164A (en) * | 2020-05-26 | 2020-07-14 | 中国检验检疫科学研究院 | Method for detecting tomato canker pathogen by using digital PCR and kit reagent used by method |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gram et al. | Antibacterial activity of marine culturable bacteria collected from a global sampling of ocean surface waters and surface swabs of marine organisms | |
| Shikuma et al. | Marine biofilms on submerged surfaces are a reservoir for Escherichia coli and Vibrio cholerae | |
| Makovcova et al. | The water environment as a source of potentially pathogenic mycobacteria | |
| RU2573934C2 (en) | Method for obtaining bacteriophage strain, specific strains of bacteriophages and their application | |
| Ndlela et al. | A laboratory based exposure of Microcystis and Oscillatoria cyanobacterial isolates to heterotrophic bacteria | |
| Kosel et al. | Evaluating the xerophilic potential of moulds on selected egg tempera paints on glass and wooden supports using fluorescent microscopy | |
| Silva et al. | Sampling methods for outdoor sculptures: comparison of swabs and cryogels by flow cytometry as novel alternatives for assessment and quantification of microbial contamination | |
| RU2572572C1 (en) | Method of determining saprophytic bacteria stimulating growth of listeria monocytogenes in marine microbial communities | |
| Heins et al. | Cultivation of particle-associated heterotrophic bacteria during a spring phytoplankton bloom in the North Sea | |
| Majewska et al. | For better, for worse: manatee‐associated Tursiocola (Bacillariophyta) remain faithful to their host | |
| SETYATI et al. | Enzyme-producing symbiotic bacteria in gastropods and bivalves molluscs: Candidates for bioindustry materials | |
| CN106544296B (en) | Promote the growth of Gambia algae, photosynthesis and microorganism, method and the kit of secreting ciguatoxin | |
| Gordeev et al. | Methods for screening live cells | |
| Boundy-Mills | Methods for the isolation and investigation of the diversity of cold-adapted yeasts and their ex situ preservation in worldwide collections | |
| Aboagye et al. | Optimisation of decontamination method and influence of culture media on the recovery of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis from spiked water sediments | |
| Sapkota et al. | Prevelance and associated risk factor of escherichia coli from the cases of Poultry at Regional Veterinary Laboratory (RVL) Surkhet, Nepal | |
| Skerratt | Bacterial and algal interactions in a Tasmanian estuary | |
| Zvyaginsev | Microbial ecology as studied by luminiscence microscopy in incident light | |
| Hatem et al. | Morphological and Molecular Identification of Four Blue-Green Algae Isolated from Some Water Bodies in Basrah Governorate, Southern Iraq | |
| Moldoveanu | THE INFLUENCE OF MYTILUS EXTRACT ON BIOFILM CELLS ATTACHMENT. | |
| Ray et al. | Environment, Development and Sustainability | |
| RU2730658C1 (en) | Kit for detecting pathogenic microorganisms of listeria monocytogenes type and method for detection thereof in samples of biomaterial, in samples of fodders, in objects of external environment | |
| Basak et al. | STUDIES ON PATHOGENIC BACTERIAL DIVERSITY IN SUBHAS SAROBAR, KOLKATA CONCERNING PUBLIC HEALTH | |
| Nawar | Biodiversity of bacteria and protists along a salinity gradient in the Fraser River estuary | |
| NADU | A MULTI WATER QUALITY PARAMETER STUDIES FORM VELLAR RIVER, TAMIL NADU |