RU2252963C1 - Способ получения иммобилизованного многокомпонентного реагента для биолюминесцентного анализа - Google Patents
Способ получения иммобилизованного многокомпонентного реагента для биолюминесцентного анализа Download PDFInfo
- Publication number
- RU2252963C1 RU2252963C1 RU2003125836/13A RU2003125836A RU2252963C1 RU 2252963 C1 RU2252963 C1 RU 2252963C1 RU 2003125836/13 A RU2003125836/13 A RU 2003125836/13A RU 2003125836 A RU2003125836 A RU 2003125836A RU 2252963 C1 RU2252963 C1 RU 2252963C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- gel
- reagent
- nadh
- immobilized
- fmn
- Prior art date
Links
Abstract
Изобретение относится к биохимии, в частности к способам получения иммобилизованных ферментов, и может быть использовано в химии, биохимии, медицине, гистологии, микробиологии, экологии и сельском хозяйстве для анализа веществ биолюминесцентным методом. В способе получения иммобилизованного многокомпонентного реагента для биолюминесцентного анализа, заключающемся в приготовлении 3-5% геля кипячением суспензии крахмала в фосфатном буфере, охлаждении геля до 24-30°С, смешивании буферного раствора биферментной системы светящихся бактерий НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза с гелем крахмала, дозировании на лавсановую пленку и высушивании при 4-10°С, согласно изобретению компоненты биферментной реакции вводят в крахмальный гель в следующем порядке: миристиновый альдегид, никотинамидадениндинуклеотид, биферментная система НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза и флавинмононуклеотид. При этом растворы субстратов никотинамидадениндинуклеотида, флавинмононуклеотида и миристинового альдегида готовят на фосфатном буфере рН 6,8-7,0. Изобретение обеспечивает улучшение качества реагента для биолюминесцентного анализа путем уменьшения количества необходимых компонентов реакционной смеси (с четырех до одного), сокращение времени анализа в два раза и увеличение точности измерений при необходимости проведения длительных анализов. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.
Description
Изобретение относится к биохимии, в частности к способам получения иммобилизованных ферментов, и может быть использовано в химии, биохимии, медицине, гистологии, микробиологии, экологии и сельском хозяйстве для анализа веществ биолюминесцентным методом.
Известен иммобилизованный реагент для определения количества никотинамидадениндинуклеотида (НАДН), включающий биферментную систему НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, выделенную из светящихся бактерий Vibrio fischeri, диазотированное ариламинированное стекло, фосфатный буфер, дитиотрейтол (ДТТ), этилендиаминтетрауксусную кислоту и глицерин. Способ получения иммобилизованного реагента состоит в контактировании фермента с предварительно диазотированным ариламинированным пористым стеклом при температуре 3-5°С. Носитель представляет собой стеклянные бусинки, склеенные в стержни. Связывание люциферазы с носителем происходит внутри пор носителя [Oda К., Yoshida S., Hirose S., Takeda T. Photon counting determination of ultratrace levels of nicotineamide adenine dinucleotide, reduced form (NADH) by use of immobilized luciferase. //Chem. Pharm. Bull., 1984. - V.32, № 1, p.185-192].
Недостатком известного реагента и способа его приготовления является то, что получаемый реагент является малопригодным для аналитических исследований, поскольку для проведения анализа необходимо приготовление четырех растворов компонентов (3-х субстратов и буфера) с последующим их смешиванием в реакционную смесь, что существенно увеличивает время анализа и уменьшает точность измерений, в частности при проведении длительных анализов.
Наиболее близким к изобретению является иммобилизованный регент и способ его получения, включающий биферментную систему светящихся бактерий НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, выделенную из Photobacterium leiognathi, крахмальный гель и фосфатный буфер. Иммобилизация включала следующие стадии [Кратасюк В.А., Дмитриева О.Н., Белобров П.И. Свойства иммобилизованной в крахмальный гель люциферазы. //Люминесцентный анализ в медико-биологических исследованиях. Рига: Изд. РМИ, 1986. - c.93-97 (прототип)]:
1. Приготовление 2-10% геля кипячением суспензии крахмала в фосфатном буфере.
2. Смешивание препарата НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза с гелем, охлажденным до 24-47°С.
3. Нанесение полученного препарата дозами по 50-100 мкл на лавсановую пленку.
4. Высушивание при температуре 4-8°С в течение 12 часов.
Недостатком известного реагента и способа его приготовления является отсутствие в иммобилизованном реагенте субстратов биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, так что при проведении анализов необходимо приготовление четырех растворов компонентов биферментной реакции (субстратов и буфера) с последующим их добавлением к иммобилизованному препарату биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, что существенно увеличивает время анализа и уменьшает точность измерений, в частности, при проведении длительных анализов.
Технический результат изобретения состоит в улучшении качества реагента для биолюминесцентного анализа путем уменьшения количества необходимых компонентов реакционной смеси (с четырех до одного), сокращения времени анализа в два раза и увеличения точности измерений при необходимости проведения длительных анализов.
Технический результат достигается тем, что в способе получения иммобилизованного многокомпонентного реагента для биолюминесцентного анализа, заключающемся в приготовлении 3-5% геля кипячением суспензии крахмала в фосфатном буфере, охлаждении геля до 24-30°С, смешивании буферного раствора биферментной системы светящихся бактерий НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза с гелем крахмала, дозировании на лавсановую пленку и высушивании при 4-10°С, согласно изобретению компоненты биферментной реакции вводят в крахмальный гель в следующем порядке: миристиновый альдегид, никотинамидадениндинуклеотид, биферментная система НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза и флавинмононуклеотид. При этом растворы субстратов никотинамидадениндинуклеотида, флавинмононуклеотида и миристинового альдегида готовят на фосфатном буфере рН 6,8-7,0.
Иммобилизованный многокомпонентный реагент для биолюминисцентного анализа готовят следующим образом (пример 1):
раствор биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза готовят на 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,0. Растворы НАДН и ФМН готовят на дистиллированной воде или 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,0. 0,002% раствор миристинового альдегида готовят из 0,2% спиртового раствора разбавлением в дистиллированной воде или 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,0. Навеску 1,1 г крахмала помещают в 30 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 7,0, интенсивно перемешивают на мешалке, и кипятят полученную смесь до получения прозрачного 3,5% раствора. К 5 мл охлажденного до 28°С геля приливают 130 мкл 0,002% раствора миристинового альдегида, 130 мкл 1,6-10-2 М раствора НАДН, 130 мкл раствора биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, содержащей 0,25 мг люциферазы и 0,7 единиц активности НАДН:ФМН-оксидоредуктазы, 130 мкл 1,3-10-3 М раствора ФМН, интенсивно перемешивают в течение 20 с. Наносят полученную смесь по 50 мкл на лавсановую пленку и высушивают при температуре 4°С в течение 12 часов. Многокомпонентный иммобилизованный реагент представляет собой диск диаметром 7-8 мм, толщиной 50-60 микрон, сухой вес 9±0,5 мг.
Активность иммобилизованного реагента определяют по максимальной интенсивности свечения в реакционной смеси, содержащей иммобилизованный реагент и 400 мкл фосфатного буфера, рН 7,0. Свечение регистрируют с помощью биолюминометра BLM 8801 (СКТБ “Наука” КНЦ СО РАН г. Красноярск), сигнал с которого подается на самописец (LKB, Швеция). Активность полученного реагента составляет 120 мВ.
Примеры 2-4 отличаются от заявляемого способа порядком добавления компонентов.
Пример 2
Иммобилизацию биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза и ее субстратов проводили аналогичным образом, добавляя компоненты в охлажденный до 28°С 3,5% гель в следующем порядке: 130 мкл раствора биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, 130 мкл раствора миристинового альдегида, 130 мкл раствора НАДН, 130 мкл раствора ФМН. Концентрации всех компонентов соответствовали концентрациям в примере 1. Активность полученного реагента составляла 10 мВ.
Пример 3
Аналогичным образом проводили иммобилизацию биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза и ее субстратов, добавляя компоненты в охлажденный до 28°С 3,5% гель в следующем порядке: 130 мкл раствора биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, 130 мкл раствора НАДН, 130 мкл раствора миристинового альдегида, 130 мкл раствора ФМН. Концентрации всех компонентов соответствовали концентрациям в примере 1. Активность полученного реагента составляла 9 мВ.
Пример 4
Аналогичным образом проводили иммобилизацию биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза и ее субстратов, добавляя компоненты в охлажденный до 28°С 3,5% гель в следующем порядке: 130 мкл раствора биферментной системы НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза, 130 мкл раствора ФМН, 130 мкл раствора НАДН, 130 мкл раствора миристинового альдегида. Концентрации всех компонентов соответствовали концентрациям в примере 1. Активность полученного реагента составляла 12 мВ.
Активность полученных в примерах 1-4 многокомпонентных иммобилизованных реагентов представлена на чертеже.
Использование описываемого реагента позволяет существенно сократить время проведения биолюминесцентного анализа. Обычный способ анализа веществ, описываемый в прототипе, требует разведения 4-х компонентов биферментной реакции с последующим введением каждого из них в реакционную смесь в процессе одиночного измерения. Процедура анализа с использованием описываемого реагента сводится к добавлению одного компонента - буфера (в качестве контрольного образца) или анализируемой смеси. Кроме того, при проведении стандартной процедуры анализа растворы субстратов биферментной реакции (миристинового альдегида и НАДН) быстро инактивируются, что приводит к уменьшению точности анализов. Описываемый реагент отличается стабильностью при хранении, что позволяет увеличить точность, в частности, при проведении длительных анализов.
Claims (2)
1. Способ получения иммобилизованного многокомпонентного реагента для биолюминесцентного анализа, заключающийся в приготовлении 3-5% геля кипячением суспензии крахмала в фосфатном буфере, охлаждении геля до 24-30°С, смешивании буферного раствора биферментной системы светящихся бактерий НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза с гелем крахмала, дозировании на лавсановую пленку и высушивании при 4-10°С, отличающийся тем, что компоненты биферментной реакции вводят в крахмальный гель в следующем порядке: миристиновый альдегид, никотинамидадениндинуклеотид, биферментная система НАДН:ФМН-оксидоредуктаза-люцифераза и флавинмононуклеотид.
2. Способ получения по п.1, отличающийся тем, что растворы субстратов никотинамидадениндинуклеотида, флавинмононуклеотида и миристинового альдегида готовят на фосфатном буфере рН 6,8-7,0.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003125836/13A RU2252963C1 (ru) | 2003-08-21 | 2003-08-21 | Способ получения иммобилизованного многокомпонентного реагента для биолюминесцентного анализа |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2003125836/13A RU2252963C1 (ru) | 2003-08-21 | 2003-08-21 | Способ получения иммобилизованного многокомпонентного реагента для биолюминесцентного анализа |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2003125836A RU2003125836A (ru) | 2005-02-20 |
| RU2252963C1 true RU2252963C1 (ru) | 2005-05-27 |
Family
ID=35218430
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2003125836/13A RU2252963C1 (ru) | 2003-08-21 | 2003-08-21 | Способ получения иммобилизованного многокомпонентного реагента для биолюминесцентного анализа |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2252963C1 (ru) |
-
2003
- 2003-08-21 RU RU2003125836/13A patent/RU2252963C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| КРАТАСЮК В.А., ДМИТРИЕВА О.Н., БЕЛОБРОВ П.И. Свойства иммобилизованной в крахмальный гель люциферазы. Люминесцентный анализ в медико-биологических исследованиях. Рига: РМИ, 1986, с.93-97. ПЕТУШКОВ В.Н., ГУСЕЙНОВ О.А. Биолюминесцентный метод определения активности НАД-зависимой гидрогеназы. Прикладная биохимия и микробиология. - М.: Наука, 1992, т.28, вып. 6, с.907-911. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2003125836A (ru) | 2005-02-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cahn | Biosensors | |
| Harrison et al. | Fluorimetric technique for monitoring changes in the level of reduced nicotinamide nucleotides in continuous cultures of microorganisms | |
| Watanabe et al. | Determination of hypoxanthine in fish meat with an enzyme sensor | |
| Wang et al. | Optical ATP biosensor for extracellular ATP measurement | |
| Weinbach et al. | Entamoeba histolytica: I. Aerobic metabolism | |
| Rahni et al. | Immobilized enzyme electrode for the determination of oxalate in urine | |
| Lippi et al. | A new colorimetric ultramicromethod for serum glutamicoxalacetic and glutamic-pyruvic transaminase determination | |
| Wollenberger et al. | A specific enzyme electrode for L-glutamate-development and application | |
| Esimbekova et al. | Disk-shaped immobilized multicomponent reagent for bioluminescent analyses: correlation between activity and composition | |
| Dı́az et al. | Horseradish peroxidase sol–gel immobilized for chemiluminescence measurements of alkaline-phosphatase activity | |
| US4080265A (en) | Method for the determination of creative phosphokinase enzyme | |
| Racek et al. | Biosensor for lactate determination in biological fluids. I. Construction and properties of the biosensor | |
| RU2252963C1 (ru) | Способ получения иммобилизованного многокомпонентного реагента для биолюминесцентного анализа | |
| US4001088A (en) | Method for the determination of creatine phosphokinase enzyme | |
| JP2528457B2 (ja) | 過酸化水素の定量法 | |
| US4278761A (en) | Enzyme assay and kit therefor | |
| CN109423509A (zh) | 一种葡萄糖检测方法、试剂盒及其应用 | |
| CN104535511A (zh) | 基于单酶反应的l-谷氨酰胺的比色测定方法以及测定试剂盒 | |
| Shin et al. | Development of an octopine biosensor and its application to the estimation of scallop freshness | |
| Hosseinkhani et al. | Adsorptive immobilization of bacterial luciferases on alkyl-substituted Sepharose 4B | |
| Endo et al. | Optical enzyme sensor for determining L-lysine content using L-lysine oxidase from the rockfish Sebastes schlegeli | |
| RU2413772C2 (ru) | Биолюминесцентный биомодуль для анализа токсичности различных сред и способ его приготовления | |
| RU2654672C1 (ru) | Комплекс реагентов для количественного анализа аденозин-5'-трифосфата | |
| CN112195218A (zh) | 基于荧光素酶报告基因的生物活性检测试剂 | |
| Ho et al. | Potentiometric system for selective formate measurement and improvement of response characteristics by permeation of cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| QB4A | Licence on use of patent |
Effective date: 20061207 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20140822 |