RU2247372C2 - Method for assay of blood trace by oxidation reaction of 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine - Google Patents

Method for assay of blood trace by oxidation reaction of 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Download PDF

Info

Publication number
RU2247372C2
RU2247372C2 RU2003112240/15A RU2003112240A RU2247372C2 RU 2247372 C2 RU2247372 C2 RU 2247372C2 RU 2003112240/15 A RU2003112240/15 A RU 2003112240/15A RU 2003112240 A RU2003112240 A RU 2003112240A RU 2247372 C2 RU2247372 C2 RU 2247372C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
solution
tmb
blood
assay
ethanol
Prior art date
Application number
RU2003112240/15A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
RU2003112240A (en
Inventor
С.У. Крейнгольд (RU)
С.У. Крейнгольд
К.А. Шестаков (RU)
К.А. Шестаков
М.И. Леви (RU)
М.И. Леви
Original Assignee
ГУП "Московский городской центр дезинфекции" (МГЦД)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ГУП "Московский городской центр дезинфекции" (МГЦД) filed Critical ГУП "Московский городской центр дезинфекции" (МГЦД)
Priority to RU2003112240/15A priority Critical patent/RU2247372C2/en
Publication of RU2003112240A publication Critical patent/RU2003112240A/en
Application granted granted Critical
Publication of RU2247372C2 publication Critical patent/RU2247372C2/en

Links

Images

Landscapes

  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

FIELD: medicine, analytical chemistry.
SUBSTANCE: assay of blood trace is carried out in an aqueous-ethanol medium (5-20 vol.% of ethanol) in concentrations of 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), (4-8) x 10-4 M, H2O2, -.1-0.4 M in the presence of 10-4 - 10-2 M of ethylenediaminetetraacetate. In the presence of blood trace the solution acquires a blue-green color and iron ions interfering for assay are masked by ethylenediaminetetraacetate. The parent TMB solution is prepared in ethanol that provides stability of solutions for above one month and they retain sensitivity for blood assay. The solution for carrying out the reaction is prepared before analysis immediately by mixing 5-20 volume parts of TMB ethanol solution with 80-95 volume parts of H2O2 an aqueous solution and ethylenediaminetetraacetate. This provides the stability of TMB solutions. Method is simple, safety and shows the selective capacity for assay of blood trace in the presence of iron ions.
EFFECT: improved assay method.
2 tbl, 2 dwg, 3 ex

Description

Изобретение относится к области химических методов обнаружения следов крови и может быть использовано в медицине, в том числе для контроля качества предстерилизационной очистки инструментов.The invention relates to the field of chemical methods for detecting blood traces and can be used in medicine, including for quality control of pre-sterilization cleaning instruments.

Известен способ определения следов крови с применением тетраметилбензидина (ТМБ), основанный на проведении определения в цитратном буферном растворе (Liem H.H. Anal. Biochem., 1979, 98 (2), 388). Исходный раствор ТМБ готовят в 10% уксусной кислоте. Недостатком метода является относительная сложность приготовления многокомпонентной системы растворов и неустойчивость растворов ТМБ в 10% уксусной кислоте растворы приобретают синюю окраску уже через день и становятся непригодными для анализа.A known method for determining blood traces using tetramethylbenzidine (TMB), based on the determination in citrate buffer solution (Liem H. H. Anal. Biochem., 1979, 98 (2), 388). The initial solution of TMB is prepared in 10% acetic acid. The disadvantage of this method is the relative complexity of preparing a multicomponent system of solutions and the instability of TMB solutions in 10% acetic acid, the solutions turn blue in a day and become unsuitable for analysis.

Известен способ определения следов крови с применением ТМБ в ацетатном или цитратном буферном растворе с применением в качестве стабилизатора ТМБ 40% раствора метанола (Eur. Pat. Appl. EP 279614 С1, С 12Q 1/28, 24 Aug. 1988). Данный способ мало пригоден для широкого применения из-за токсичности метанола и сложности приготовления многокомпонентной системы растворов.A known method for determining blood traces using TMB in acetate or citrate buffer solution using as stabilizer TMB 40% methanol solution (Eur. Pat. Appl. EP 279614 C1, C 12Q 1/28, 24 Aug. 1988). This method is not suitable for widespread use due to the toxicity of methanol and the complexity of preparing a multicomponent system of solutions.

Описан способ определения крови, в котором для стабилизации растворов ТМБ добавляют 5-20% N-метилпиразолона (РСТ Int. Appl. Wo 8505688 C1, G 01 N 33/54, 19 Dec. 1985). Это приводит к усложнению композиции, удорожанию анализа. Между тем, для применения в лечебно-профилактических учреждениях необходимо применение максимально простых средств, растворов с минимальным числом компонентов.A blood determination method is described in which 5-20% N-methylpyrazolone is added to stabilize TMB solutions (PCT Int. Appl. Wo 8505688 C1, G 01 N 33/54, 19 Dec. 1985). This leads to a more complicated composition, more expensive analysis. Meanwhile, for use in medical institutions, it is necessary to use the most simple means, solutions with a minimum number of components.

Известен способ определения следов крови с применением ТМБ, основанный на приготовлении исходного раствора ТМБ в ледяной уксусной кислоте и проведении реакции окисления субстрата также в ледяной уксусной кислоте. Это техническое решение является наиболее близким к заявляемому по технической сущности, поскольку предназначено для экспрессного обнаружения следов крови с применением только одного органического растворителя. Однако метод имеет существенный недостаток, так как растворы ТМБ при хранении спонтанно окисляются и синеют, при этом чувствительность обнаружения крови снижается в 10 раз за 24 часа (Garner D.D. - J. Forensic sci., 1976, 21 (4), 816). Кроме того, уксусная кислота проявляет коррелирующее действие на металлические инструменты и поэтому непригодна для медицинской практики.A known method for determining blood traces using TMB, based on the preparation of the initial solution of TMB in glacial acetic acid and the oxidation of the substrate in glacial acetic acid. This technical solution is the closest to the claimed technical essence, since it is intended for rapid detection of blood traces using only one organic solvent. However, the method has a significant drawback, since the TMB solutions during storage are spontaneously oxidized and turn blue, while the sensitivity of blood detection decreases by 10 times in 24 hours (Garner D.D. - J. Forensic sci., 1976, 21 (4), 816). In addition, acetic acid exhibits a correlating effect on metal instruments and is therefore unsuitable for medical practice.

Целью изобретения является упрощение состава растворов и процедуры анализа, достижение стабильности растворов ТМБ и избирательности обнаружения следов крови в присутствии ионов железа.The aim of the invention is to simplify the composition of the solutions and analysis procedures, to achieve the stability of TMB solutions and the selectivity of detecting traces of blood in the presence of iron ions.

Указанная цель достигается предложенным способом определения следов крови, заключающимся в том, что реакция проводится в среде этанол-вода при концентрации этанола 5-20% (объемных), исходный раствор ТМБ готовится в этаноле, реакция проводится в присутствии 10-4-10-2 М и двунатриевой соли ЭДТА.This goal is achieved by the proposed method for determining blood traces, namely, that the reaction is carried out in an ethanol-water medium at an ethanol concentration of 5-20% (volume), the initial TMB solution is prepared in ethanol, the reaction is carried out in the presence of 10 -4 -10 -2 M and disodium salt of EDTA.

Сущность предложенного способа иллюстрируется следующими примерами и графиками (фиг.1, фиг.2).The essence of the proposed method is illustrated by the following examples and graphs (figure 1, figure 2).

Пример 1. В пробирку вместимостью 15-20 мл приливают 0,5 мл 8·10-3 М (1,92 мг/мл) раствора ТМБ в этаноле и 9,5 мл 0,1 М (0,36%) раствора пероксида водорода, содержащего 10-4 М ЭДТА. Концентрации в рабочем растворе составляют: ТМБ - 4·10-4 М (0,096 мг/мл), этанола 5% (объемных), Н2О2 0,1 М (0,34%), ЭДТА 10-4 М. В полученный раствор прибавляют 0,1 мл раствора крови (1:1000). Через 1-2 минуты наблюдают появление окраски. Содержание крови можно определять количественно, фотометрируя растворы при длине волны 650 нм.Example 1. In a test tube with a capacity of 15-20 ml, 0.5 ml of an 8 · 10 -3 M (1.92 mg / ml) solution of TMB in ethanol and 9.5 ml of a 0.1 M (0.36%) peroxide solution are added hydrogen containing 10 -4 M EDTA. Concentrations in the working solution are: TMB - 4 · 10 -4 M (0.096 mg / ml), ethanol 5% (volumetric), N 2 O 2 0.1 M (0.34%), EDTA 10 -4 M. B the resulting solution was added 0.1 ml of a blood solution (1: 1000). After 1-2 minutes, the appearance of color is observed. The blood content can be quantified by photometric solutions at a wavelength of 650 nm.

Пример 2. В пробирку вместимостью 15-20 мл приливают 2 мл 5·10-3 М (1,2 мг/мл) раствора ТМБ в этаноле, приливают 8 мл 0,5 М (1,7%) раствора Н2О2, содержащего 1,25·10-2 М ЭДТА. В полученном рабочем растворе концентрация ТМБ составляет 1·10-3 М (0,24 мг/мл, Н2О2 - 0,4 М (1,36%), ЭДТА - 1·10-2 М.Example 2. In a test tube with a capacity of 15-20 ml, 2 ml of a 5 · 10 -3 M (1.2 mg / ml) solution of TMB in ethanol are added, 8 ml of a 0.5 M (1.7%) solution of Н 2 О 2 are added containing 1.25 · 10 -2 M EDTA. In the resulting working solution, the concentration of TMB is 1 · 10 -3 M (0.24 mg / ml, N 2 O 2 - 0.4 M (1.36%), EDTA - 1 · 10 -2 M.

В ячейки планшета из прозрачного полистирола для иммунологических исследований (объем ячеек 0,3-0,4 мл) приливают по 0,1-0,2 мл полученного рабочего раствора и добавляют соответственно 0,005; 0,01; 0,02; 0,03 и 0,05 мл раствора крови с концентрацией 100 мкг/мл. Растворы перемешивают пластмассовой палочкой и через 1 минуту наблюдают изменение окраски на белом фоне. Сине-зеленая окраска хорошо заметна глазу при содержании крови 0,5-1 мкг.0.1-0.2 ml of the resulting working solution are poured into the cells of a transparent polystyrene tablet for immunological studies (cell volume 0.3-0.4 ml) and 0.005; 0.01; 0.02; 0.03 and 0.05 ml of a blood solution with a concentration of 100 μg / ml. The solutions are mixed with a plastic stick and after 1 minute, a color change is observed on a white background. The blue-green color is clearly visible to the eye with a blood content of 0.5-1 μg.

Пример 3. В медицинский шприц набирают 0,3-0,4 мл раствора с концентрациями: этанола 20%, ТМБ 8·10-4 М, Н2О2 - 0,3 М, ЭДТА 1·10-2 М, обмывают стенки шприца раствором и вытесняют раствор в ячейку из прозрачного полистирола. При содержании крови менее 0,5 мкг через 1-2 минуты раствор остается бесцветным. При содержании крови 0,5-1,0 мкг через 1 минуту наблюдается хорошо заметная сине-зеленая окраска раствора в ячейке.Example 3. In a medical syringe, 0.3-0.4 ml of solution with the concentrations of: ethanol 20%, TMB 8 · 10 -4 M, Н 2 О 2 - 0.3 M, EDTA 1 · 10 -2 M, is washed, washed the walls of the syringe with the solution and displace the solution into the cell from transparent polystyrene. When the blood content is less than 0.5 μg, after 1-2 minutes the solution remains colorless. When the blood content of 0.5-1.0 μg after 1 minute, a clearly visible blue-green color of the solution in the cell is observed.

В таблице 1 приведена сравнительная характеристика предлагаемого способа и прототипа (Garner D.D. - J. Forensic sci., 1976, 21 (4), 816) по чувствительности и устойчивости растворов ТМБ в уксусной кислоте (прототип) и этаноле (предлагаемый способ).Table 1 shows the comparative characteristics of the proposed method and prototype (Garner D.D. - J. Forensic sci., 1976, 21 (4), 816) in terms of sensitivity and stability of solutions of TMB in acetic acid (prototype) and ethanol (proposed method).

Таблица 1.Table 1. Влияние времени хранения растворов ТМБ в уксусной кислоте (Garner D.D. - J. Forensic sci., 1976, 21 (4), 816) и этаноле на чувствительность обнаружения кровиThe effect of the storage time of TMB solutions in acetic acid (Garner D.D. - J. Forensic sci., 1976, 21 (4), 816) and ethanol on the sensitivity of blood detection Прототип /4/Prototype / 4 / Предлагаемый методProposed method время, суткиtime, day чувствительностьsensitivity время, суткиtime, day чувствительность, Мsensitivity, M 11 1·10-6 1 · 10 -6 11 1·10-6 1 · 10 -6 22 1·10-5 1 · 10 -5 22 1·10-6 1 · 10 -6 55 1·10-5 1 · 10 -5 55 1·10-6 1 · 10 -6 88 1·10-4 1 · 10 -4 88 1·10-6 1 · 10 -6     30thirty 1·10-6 1 · 10 -6

Из таблицы видно, что устойчивость растворов ТМБ в этаноле более 1 месяца. В уксусной кислоте чувствительность ТМБ снижается в 100 раз уже через 8 дней.The table shows that the stability of solutions of TMB in ethanol is more than 1 month. In acetic acid, the sensitivity of TMB decreases by 100 times after 8 days.

Изучено влияние концентрации этанола, ТМБ и пероксида водорода на увеличение оптической плотности растворов в ходе реакции. Оптическую плотность растворов измеряли на фотоколориметре КФК-2 в кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см со светофильтром, имеющим максимум пропускания в области 670 нм. Объем раствора 5 мл. Предварительно было установлено, что продукты окисления ТМБ имеют максимум в области 650 нм, что совпадает с данными (Антитела. Методы. Кн. 2, ред. Д.Кэтти. М., Мир, 1991, с.156).The effect of the concentration of ethanol, TMB, and hydrogen peroxide on the increase in the optical density of solutions during the reaction was studied. The optical density of the solutions was measured on a KFK-2 photocolorimeter in a cuvette with an absorbing layer thickness of 1 cm with a light filter having a transmission maximum in the region of 670 nm. The volume of the solution is 5 ml. It was previously established that the products of TMB oxidation have a maximum in the region of 650 nm, which coincides with the data (Antibodies. Methods. Book 2, ed. D. Catty. M., Mir, 1991, p.156).

Зависимость оптической плотности растворов через 1 минуту после начала реакции от концентрации этанола, ТМБ и Н2О2 показана на фиг.1 и 2. В интервале концентраций этанола 5-20% достигается максимальное значение А670 и соответственно чувствительность определения крови.The dependence of the optical density of the solutions 1 minute after the start of the reaction on the concentration of ethanol, TMB and H 2 O 2 is shown in Figs. 1 and 2. In the range of ethanol concentrations of 5-20%, the maximum value of A 670 and, accordingly, the sensitivity of blood determination are reached.

Увеличение концентрации ТМБ в интервале (4-10)·10-4 М и Н2О2 в интервале 0,1-0,4 М лишь незначительно увеличивает оптическую плотность растворов. Эти условия являются оптимальными для определения следов крови.An increase in the concentration of TMB in the range (4-10) · 10 -4 M and Н 2 О 2 in the range of 0.1-0.4 M only slightly increases the optical density of the solutions. These conditions are optimal for determining traces of blood.

Влияние концентрации ЭДТА на определение крови в присутствии ионов железа (II, III) показано в таблице 2. Видно, что в присутствии 10-4-10-2 М ЭДТА мешающее влияние ионов железа устраняется.The effect of the concentration of EDTA on the determination of blood in the presence of iron ions (II, III) is shown in Table 2. It is seen that in the presence of 10 -4 -10 -2 M EDTA, the interfering effect of iron ions is eliminated.

Таблица 2table 2 Маскирующее действие ЭДТА при определении крови. Концентрации ТМБ - 4·10-4 М, Н2O2 - 0,3 М, объем раствора 5 мл.The masking effect of EDTA in determining blood. The concentration of TMB - 4 · 10 -4 M, N 2 O 2 - 0.3 M, the solution volume of 5 ml. Введено Fe (III), мкгIntroduced Fe (III), mcg Введено крови, мкг/млIntroduced blood, mcg / ml Введено ЭДТА МIntroduced EDTA M Найдено крови, мкг/млFound blood, mcg / ml -- 55 1·10-4 1 · 10 -4 5,3±0,45.3 ± 0.4 -- 1010 1·10-2 1 · 10 -2 10,1±0,510.1 ± 0.5 11 -- -- 200200 11 55 1·10-4 1 · 10 -4 5,6±0,55.6 ± 0.5 22 -- 1·10-4 1 · 10 -4 0,0±0,10,0 ± 0,1 22 55 1·10-4 1 · 10 -4 5,2±0,35.2 ± 0.3 22 55 1·10-3 1 · 10 -3 5,1±0,25.1 ± 0.2 22 1010 1·10-2 1 · 10 -2 11,1±0,511.1 ± 0.5 11 55 1·10-2 1 · 10 -2 5,2±0,45.2 ± 0.4

ЛИТЕРАТУРАLITERATURE

1. Liem H.H. Anal. Biochem., 1979, 98 (2), 388.1. Liem H.H. Anal. Biochem., 1979, 98 (2), 388.

2. Eur. Pat. Appl. EP 279614 C1, С 12 Q 1/28, 24 Aug. 1988.2. Eur. Pat. Appl. EP 279614 C1, C 12 Q 1/28, 24 Aug. 1988.

3. PCT Int. Appl. Wo 85 05.688 C1, G 01 N 33/54, 19 Dec. 1985.3. PCT Int. Appl. Wo 85 05.688 C1, G 01 N 33/54, 19 Dec. 1985.

4. Garner D.D. - J. Forensic sci., 1976, 21 (4), 816.4. Garner D.D. - J. Forensic sci., 1976, 21 (4), 816.

5. Антитела. Методы. Кн. 2, ред. Д.Кэтти. М.: Мир, 1991, с.156.5. Antibodies. Methods Prince 2, ed. D.Catty. M.: Mir, 1991, p. 156.

Claims (2)

1. Способ определения следов крови, отличающийся тем, что определение проводят раствором, содержащим 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (4-8)·10-4 М, пероксид водорода - 0,1-0,4 М, этилендиаминтетраацетат 1·10-4 - 1·10-2 М, этанол 5-20% и по изменению цвета раствора на сине-зеленый определяют наличие следов крови.1. The method of determining blood traces, characterized in that the determination is carried out with a solution containing 3.3 ', 5.5'-tetramethylbenzidine (4-8) · 10 -4 M, hydrogen peroxide - 0.1-0.4 M, ethylenediaminetetraacetate 1 · 10 -4 - 1 · 10 -2 M, ethanol 5-20% and the presence of traces of blood is determined by the color change of the solution to blue-green. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что раствор для определения готовят непосредственно перед анализом путем смешивания 5-20 объемов спиртового раствора 3,3',5,5'-тетраметилбензидина с 95-80 объемами водного раствора пероксида водорода, содержащего этилендиаминтетраацетат.2. The method according to claim 1, characterized in that the solution for determination is prepared immediately before analysis by mixing 5-20 volumes of an alcohol solution of 3.3 ', 5.5'-tetramethylbenzidine with 95-80 volumes of an aqueous solution of hydrogen peroxide containing ethylene diamine tetraacetate .
RU2003112240/15A 2003-04-28 2003-04-28 Method for assay of blood trace by oxidation reaction of 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine RU2247372C2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2003112240/15A RU2247372C2 (en) 2003-04-28 2003-04-28 Method for assay of blood trace by oxidation reaction of 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2003112240/15A RU2247372C2 (en) 2003-04-28 2003-04-28 Method for assay of blood trace by oxidation reaction of 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2003112240A RU2003112240A (en) 2004-11-27
RU2247372C2 true RU2247372C2 (en) 2005-02-27

Family

ID=35286606

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2003112240/15A RU2247372C2 (en) 2003-04-28 2003-04-28 Method for assay of blood trace by oxidation reaction of 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2247372C2 (en)

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GARNER D.D. et. al. An Evaluation of Tetramethylbenzidine as a Presumptive Test for Blood. J. Forensic sci. 1976, 21(4), р.816. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA1319596C (en) Carbon dioxide sensor
JP2002525619A (en) Diagnostic composition and device using the same
CN107807244B (en) A kind of urine Hemoccult and preparation method thereof
CN110243794A (en) A kind of fluorescence probe for detecting sulfur dioxide and its application based on graphene quantum dot
CN106146526A (en) Fluorescent probe compound and preparation method and application thereof
Nagashima Simultaneous reaction rate spectrophotometric determination of cyanide and thiocyanate by use of the pyridine-barbituric acid method
CN108689933A (en) A kind of hypochlorous fluorescence probe of quick high-selectivity analysis
CN113956274B (en) Fluorescent probe design and synthesis method for dual response to viscosity and peroxynitrite change in epileptic diseases
US6731379B2 (en) Method and device for determining the concentration of heparin in a sample of fluid
RU2247372C2 (en) Method for assay of blood trace by oxidation reaction of 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine
CN108558801A (en) A kind of long wavelength's hypersensitive carbon monoxide colorimetric fluorescence probe
CN103115882B (en) Detect H2O2Method (2)
CN108623522A (en) A kind of hypochlorous method of quick high-selectivity detection
CN108801993A (en) A kind of hypochlorous kit of quick high-selectivity analysis
CN110849869A (en) Color development method and kit for detecting copper ion concentration limit in radioactive injection
CN112457286A (en) Application of compound containing oxyanion in preparation of fluorescent molecular probe for detecting nitroso peroxide ion
RU2017137C1 (en) Method for photometric determination of cobalt in oxidizing baths of producing acetic anhydride and acetic acid
RU2340891C1 (en) Quantitative analysis of indolyl-3-acetic acid in aqueous solutions
CN108864029A (en) A kind of highly sensitive carbon monoxide colorimetric fluorescence probe
SU1163221A1 (en) Method of quantitative determining of novocain
SU1320749A1 (en) Method of determining electron-donor activity of chemical compounds
SU828038A1 (en) Method of formaldehyde quantitative determination
SU1642379A1 (en) Method of qualitative determination of mercasolyl
Scardi et al. Simultaneous determination of isoniazid and d-cycloserine by sodium pentacyanoammineferroate
SU998952A1 (en) Method of determination of urobilin quantity in urine

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20110429