RU2240327C2

RU2240327C2 - Gene and protein of virulence and their using

Info

Publication number: RU2240327C2
Application number: RU2002119589/13A
Authority: RU
Inventors: Энда Элизабет КЛАРК (GB); Энда Элизабет КЛАРК; Ликуинг ЗХОУ (GB); Ликуинг ЗХОУ; Жаклин Элизабет ШИА (GB); Жаклин Элизабет ШИА; Роберт Грэхэм ФЕЛДМАН (GB); Роберт Грэхэм ФЕЛДМАН; Дэвид Вилль м ХОЛДЕН (GB); Дэвид Вилльям ХОЛДЕН
Original assignee: Вмакс Лимитед
Priority date: 1999-12-23
Filing date: 2000-12-22
Publication date: 2004-11-20
Also published as: RU2002119589A; RU2004119947A

Abstract

FIELD: biotechnology, medicine.

SUBSTANCE: invention can be used for treatment and prophylaxis of diseases associated with streptococcus infection or microorganism Gr⁺. Invention relates to peptide that is encoded by S. pyogenes nucleic acid with nucleotide sequence taken among the group of sequences given in the materials of claim. Also, invention involves peptide-related molecule showing at least 80% similarity degree at amino acid or nucleotide level. Both peptide and polynucleotide encoding it can be used as a medicinal agent for treatment or prophylaxis of diseases caused by streptococcus or microorganism Gr⁺. Invention relates vaccine used as mentioned above and also antibody able to bind peptide. Identification of genes encoding products associated with virulence allows producing attenuated microorganisms useful for preparing vaccines for therapeutic application.

EFFECT: valuable biological and medicinal properties of gene and protein.

14 cl, 25 ex

Description

Область, к которой относится изобретениеFIELD OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к генам и белкам вирулентности и к их использованию. Более конкретно, настоящее изобретение относится к генам и белкам/пептидам, полученным из Streptococcus pyogenes, к их использованию в терапии и в скрининге на лекарственные средства.The present invention relates to genes and proteins of virulence and to their use. More specifically, the present invention relates to genes and proteins / peptides derived from Streptococcus pyogenes, their use in therapy and in drug screening.

Предпосылки создания изобретенияBACKGROUND OF THE INVENTION

Стрептококки группы A (GAS) ответственны за большинство заболеваний, вызываемых стрептококкоками {Streptococcus}. Особый интерес представляет микроорганизм S. pyogenes, который ответственен за неинвазивные и инвазивные инфекции широкого ряда, такие как импетиго, фарингит, некротизирующий фасцит, бактериемия, синдром стрептококкового токсического шока (ССТШ), пневмония и ревматическая лихорадка.Group A streptococci (GAS) are responsible for most diseases caused by streptococci {Streptococcus}. Of particular interest is the microorganism S. pyogenes, which is responsible for non-invasive and invasive infections of a wide range, such as impetigo, pharyngitis, necrotizing fasciitis, bacteremia, streptococcal toxic shock syndrome (SCSS), pneumonia and rheumatic fever.

Некоторые GAS-инфекции могут быть подвергнуты лечению антибиотиками, включая пенициллин и эритромицин. Однако из-за проблем, связанных с вырабатыванием резистентности к антибиотикам и с возникновением у пациентов аллергии к антибиотикам, необходима разработка других терапевтических средств, которые могут быть использованы для лечения или профилактики GAS-инфекций.Some GAS infections can be treated with antibiotics, including penicillin and erythromycin. However, due to problems associated with the development of antibiotic resistance and the occurrence of allergy to antibiotics in patients, the development of other therapeutic agents that can be used to treat or prevent GAS infections is necessary.

Краткое описание изобретенияSUMMARY OF THE INVENTION

Настоящее изобретение основано на обнаружении генов вирулентности в S. pyogenes.The present invention is based on the detection of virulence genes in S. pyogenes.

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения пептидом настоящего изобретения является пептид, который кодируется опероном, включающим любую из нуклеотидных последовательностей, идентифицированных в настоящем описании как SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 и 61 S. pyogenes или его гомолог в грамположительной бактерии или его функциональный фрагмент, и который может быть использован в терапии или диагностике.In accordance with the first aspect of the present invention, the peptide of the present invention is a peptide that is encoded by an operon comprising any of the nucleotide sequences identified in the present description as SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 and 61 S. pyogenes or its homolog in gram-positive bacteria or its functional fragment, and which can be used in therapy or diagnosis.

Пептиды могут иметь множество терапевтических применений для лечения инфекций, вызываемых стрептококками группы А, включая применение в качестве вакцин в целях профилактики.Peptides can have many therapeutic uses for the treatment of infections caused by group A streptococci, including use as prophylactic vaccines.

В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения полинуклеотид, кодирующий пептид, определенный выше, также может быть использован в терапии или диагностике.In accordance with a second aspect of the present invention, a polynucleotide encoding a peptide as defined above can also be used in therapy or diagnosis.

В соответствии с третьим аспектом настоящего изобретения, гены, кодирующие пептиды, могут быть использованы для продуцирования аттенуированных микроорганизмов. Аттенуированные микроорганизмы обычно имеют мутацию, которая нарушает экспрессию одного или более идентифицированных здесь генов, с получением штамма с отсутствием вирулентности. Такие микроорганизмы также могут быть использованы для терапии и диагностики.In accordance with a third aspect of the present invention, genes encoding peptides can be used to produce attenuated microorganisms. Attenuated microorganisms usually have a mutation that disrupts the expression of one or more of the genes identified here, to produce a strain with no virulence. Such microorganisms can also be used for therapy and diagnosis.

В соответствии с четвертым аспектом настоящего изобретения, пептиды, гены и аттенуированные микроорганизмы настоящего изобретения могут быть использованы для лечения или профилактики состояния, связанного с инфекцией, вызываемой стрептококками или грамположительными бактериями.In accordance with a fourth aspect of the present invention, the peptides, genes and attenuated microorganisms of the present invention can be used to treat or prevent a condition associated with an infection caused by streptococci or gram-positive bacteria.

Описание изобретенияDescription of the invention

Настоящее изобретение основано на обнаружении генов, кодирующих пептиды, ответственные за вирулентность. Поэтому пептиды и гены настоящего изобретения могут быть использованы в целях получения терапевтических агентов для лечения инфекционных заболеваний. При этом следует отметить, что понятие "терапия" также включает в себя профилактическую обработку, например вакцинацию. Кроме того, хотя продукты настоящего изобретения предназначены, в первую очередь, для лечения инфекций у человека, однако применение этих продуктов в ветеринарии также входит в объем настоящего изобретения.The present invention is based on the discovery of genes encoding the peptides responsible for virulence. Therefore, the peptides and genes of the present invention can be used to obtain therapeutic agents for the treatment of infectious diseases. It should be noted that the concept of "therapy" also includes preventive treatment, such as vaccination. In addition, although the products of the present invention are intended primarily for the treatment of infections in humans, the use of these products in veterinary medicine is also included in the scope of the present invention.

Настоящее изобретение раскрыто на основе Streptococcus pyogenes. Однако все штаммы стрептококков группы А и многие другие штаммы грамположительных бактерий, по-видимому, содержат родственные пептиды или белки, имеющие аминокислотные последовательности, идентичные или подобные идентифицированным здесь последовательностям. Микроорганизмами, которые, вероятно, содержат указанные пептиды, являются, но не ограничиваются ими, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus и Staphylococcus.The present invention is disclosed based on Streptococcus pyogenes. However, all group A streptococcal strains and many other gram-positive bacteria strains appear to contain related peptides or proteins having amino acid sequences identical or similar to the sequences identified here. The microorganisms that probably contain these peptides are, but are not limited to, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus and Staphylococcus.

Предпочтительно, чтобы пептиды, которые могут быть использованы в различных аспектах настоящего изобретения, имели более чем 40%-ное сходство с идентифицированными здесь пептидами. Более предпочтительно, чтобы указанные пептиды имели более чем 60%-ное сходство. Наиболее предпочтительно, чтобы указанные пептиды имели более чем 80%-ное сходство, например 95%-ное сходство. Что касается идентифицированных здесь полинуклеотидных последовательностей, то родственные полинуклеотиды, которые могут быть использованы в различных аспектах настоящего изобретения, могут иметь более чем 40%-ную идентичность с идентифицированными здесь последовательностями. Более предпочтительно, чтобы указанные полинуклеотидные последовательности имели более чем 60%-ную идентичность. Наиболее предпочтительно, чтобы указанные полинуклеотидные последовательности имели более чем 80%-ную идентичность, например 95%-ную идентичность.Preferably, peptides that can be used in various aspects of the present invention have more than 40% similarity with the peptides identified here. More preferably, said peptides have more than 60% similarity. Most preferably, these peptides have more than 80% similarity, for example 95% similarity. With regard to the polynucleotide sequences identified herein, related polynucleotides that can be used in various aspects of the present invention may have more than 40% identity with the sequences identified here. More preferably, said polynucleotide sequences have more than 60% identity. Most preferably, said polynucleotide sequences have more than 80% identity, for example 95% identity.

Термины "сходство" и "идентичность" известны специалистам. Термин "идентичность" используется в том случае, когда сравнение последовательностей основано на идентичных совпадениях между соответствующими идентичными положениями в сравниваемых последовательностях. Термин "сходство" используется в том случае, когда при сравнении аминокислотных последовательностей принимаются во внимание не только идентичные аминокислоты в соответствующих положениях, но также и функционально схожие аминокислоты в соответствующих положениях. Таким образом, сходство полипептидных последовательностей, помимо сходства их последовательностей, указывает и на их функциональное сходство.The terms "similarity" and "identity" are known to those skilled in the art. The term "identity" is used when the comparison of sequences is based on identical matches between the corresponding identical positions in the compared sequences. The term "similarity" is used when, when comparing amino acid sequences, not only identical amino acids in the corresponding positions are taken into account, but also functionally similar amino acids in the corresponding positions. Thus, the similarity of polypeptide sequences, in addition to the similarity of their sequences, indicates their functional similarity.

Уровни идентичности двух генных последовательностей и уровни идентичности или сходства аминокислотных последовательностей могут быть вычислены известными методами. В соответствии с настоящим изобретением общедоступными компьютерными методами для определения идентичности и сходства последовательностей являются программы BLASTP, BLASTN и FASTA (Atschul et al., J.Molec. Biol., 1990; 215:403-410), программа BLASTX, поставляемая NCBI, и программа Gap, поставляемая Genetics Computer Group, Madison WI. Описанные здесь степени сходства и идентичности были получены с использованием программы Gap, где при сравнении аминокислотных последовательностей штраф на "пробел-пропуск" составляет 12, а штраф на "пробел-удлинение" составляет 4, а при сравнении полинуклеотидных последовательностей штраф на "пробел-пропуск" составляет 50, а штраф на "пробел-удлинение" составляет 3.The levels of identity of two gene sequences and the levels of identity or similarity of amino acid sequences can be calculated by known methods. In accordance with the present invention, BLASTP, BLASTN, and FASTA programs (Atschul et al., J. Molec. Biol., 1990; 215: 403-410), the BLASTX program provided by NCBI, and Gap software supplied by Genetics Computer Group, Madison WI. The degrees of similarity and identity described here were obtained using the Gap program, where when comparing amino acid sequences, the gap-pass penalty is 12, and the gap-extension penalty is 4, and when comparing polynucleotide sequences, the gap-pass penalty "is 50, and the penalty for" space-extension "is 3.

Имея ген, охарактеризованный в соответствии с настоящим изобретением, можно использовать последовательность данного гена для поиска родственных генов или пептидов в других микроорганизмах. Это может быть осуществлено путем поиска в существующих базах данных, например в EMBL или Genbank.Having the gene characterized in accordance with the present invention, you can use the sequence of this gene to search for related genes or peptides in other microorganisms. This can be done by searching existing databases, such as EMBL or Genbank.

Пептиды или белки настоящего изобретения могут быть очищены и выделены известными методами. В частности, имея идентифицированную генную последовательность, можно использовать рекомбинантные методы для экспрессии генов в соответствующем хозяине. Активные фрагменты и родственные молекулы могут быть идентифицированы и использованы в терапии. Так, например, пептиды или их активные фрагменты могут быть использованы в качестве антигенных детерминант в вакцине для выработки иммунного ответа. Они могут быть также использованы для получения антител для пассивной иммунизации или диагностики. Подходящими антителами являются моноклональные антитела или их фрагменты, включая одноцепочечные Fv-фрагменты. Методы получения антител известны каждому специалисту в данной области.The peptides or proteins of the present invention can be purified and isolated by known methods. In particular, having an identified gene sequence, recombinant methods can be used to express genes in an appropriate host. Active fragments and related molecules can be identified and used in therapy. For example, peptides or their active fragments can be used as antigenic determinants in a vaccine to generate an immune response. They can also be used to produce antibodies for passive immunization or diagnosis. Suitable antibodies are monoclonal antibodies or fragments thereof, including single chain Fv fragments. Methods for producing antibodies are known to every person skilled in the art.

Активными фрагментами пептидов являются фрагменты, которые сохраняют биологическую функцию указанного пептида. Так, например, при использовании в целях вырабатывания иммунного ответа фрагмент должен иметь достаточный размер, такой, чтобы антитела, генерированные из указанного фрагмента, могли отличать один пептид от другого пептида бактериального микроорганизма. Обычно фрагмент должен иметь, по крайней мере, 30 нуклеотидов (10 аминокислот), предпочтительно 60 нуклеотидов (20 аминокислот), а наиболее предпочтительно более чем 90 нуклеотидов (30 аминокислот).Active fragments of peptides are fragments that retain the biological function of the specified peptide. So, for example, when used in order to generate an immune response, the fragment must be of sufficient size such that the antibodies generated from the indicated fragment can distinguish one peptide from another peptide of a bacterial microorganism. Typically, the fragment should have at least 30 nucleotides (10 amino acids), preferably 60 nucleotides (20 amino acids), and most preferably more than 90 nucleotides (30 amino acids).

При этом следует отметить, что помимо родственных молекул, происходящих от других микроорганизмов, настоящее изобретение охватывает модификации, внесенные в идентифицированные здесь пептиды и полинуклеотиды, которые, в основном, не изменяют их биологическую функцию. Для специалиста в данной области очевидно, что вырожденность генетического кода может приводить к образованию полинуклеотидов, которые по сравнению с определенными здесь полинуклеотидами имеют небольшие различия в основаниях, но которые, тем не менее, кодируют те же самые пептиды. Комплементарные полинуклеотиды также входят в объем настоящего изобретения. Рассматриваются также консервативные замены на аминокислотном уровне, т.е. различные кислотные или основные аминокислоты могут быть заменены в том случае, если эти замены не будут приводить к значительной потере их функции.It should be noted that in addition to related molecules originating from other microorganisms, the present invention encompasses modifications made to the peptides and polynucleotides identified here, which basically do not change their biological function. It is obvious to a person skilled in the art that the degeneracy of the genetic code can lead to the formation of polynucleotides which, compared to the polynucleotides defined here, have slight differences in bases, but which nonetheless encode the same peptides. Complementary polynucleotides are also included in the scope of the present invention. Conservative substitutions at the amino acid level, i.e. various acidic or basic amino acids can be replaced if these replacements do not lead to a significant loss of their function.

Получение вакцин на основе аттенуированных микроорганизмов известно специалистам. Вакцинные композиции могут быть изготовлены с использованием подходящих носителей или адъювантов, например квасцов, если это необходимо для эффективной иммунизации против инфекции. Получение вакцинных препаратов известно специалисту. Аттенуированные микроорганизмы могут быть получены путем введения мутаций, которые нарушают экспрессию любых раскрытых здесь генов. Специалистам должны быть известны методики нарушения экспрессии конкретных генов. Способы, которые могут быть использованы в этих целях, предусматривают инсерционную инактивацию или делецию генов. Аттенуированные микроорганизмы настоящего изобретения могут также включать дополнительные мутации в других генах, например во втором идентифицируемом здесь гене или в отдельном гене, необходимом для роста микроорганизма, например мутации в гене аrо. Аттенуированные микроорганизмы могут быть также использованы в качестве систем-носителей для доставки гетерологичных антигенов, терапевтических белков или нуклеиновых кислот (ДНК или РНК). В этом варианте осуществления изобретения аттенуированные микроорганизмы используются для доставки гетерологичного антигена, белка или нуклеиновой кислоты в конкретный участок in vivo. Введение гетерологичного антигена, пептида или нуклеиновой кислоты в аттенуированный микроорганизм может быть осуществлено стандартными методами, предусматривающими использование рекомбинантных конструкций, например векторов, которые содержат полинуклеотиды, экспрессирующие гетерологичный антиген или терапевтический белок, а также подходящие промоторные последовательности. Альтернативно, ген, кодирующий гетерологичный антиген или белок, может быть встроен в геном организма, а эндогенные промоторы могут быть использованы для контрольной экспрессии.The preparation of vaccines based on attenuated microorganisms is known to those skilled in the art. Vaccine compositions can be prepared using suitable carriers or adjuvants, such as alum, if necessary for effective immunization against infection. The preparation of vaccine preparations is known to the skilled person. Attenuated microorganisms can be obtained by introducing mutations that disrupt the expression of any of the genes disclosed herein. Professionals should be aware of the techniques for impairing the expression of specific genes. Methods that can be used for this purpose include insertional inactivation or deletion of genes. The attenuated microorganisms of the present invention may also include additional mutations in other genes, for example, in the second gene identified here or in a separate gene necessary for the growth of a microorganism, for example, mutations in the apo gene. Attenuated microorganisms can also be used as carrier systems for the delivery of heterologous antigens, therapeutic proteins or nucleic acids (DNA or RNA). In this embodiment, attenuated microorganisms are used to deliver a heterologous antigen, protein, or nucleic acid to a specific site in vivo. The introduction of a heterologous antigen, peptide or nucleic acid into an attenuated microorganism can be carried out by standard methods involving the use of recombinant constructs, for example, vectors that contain polynucleotides expressing a heterologous antigen or therapeutic protein, as well as suitable promoter sequences. Alternatively, a gene encoding a heterologous antigen or protein can be inserted into the body’s genome, and endogenous promoters can be used for control expression.

В более общем смысле, и как это хорошо известно специалистам, подходящее количество активного компонента настоящего изобретения может быть выбрано в соответствии с его терапевтическим применением, а также могут быть выбраны подходящие носители или наполнители и способы введения. Эти факторы должны быть выбраны или определены в соответствии с известными критериями, такими как природа/тяжесть состояния, подвергаемого лечению, типа и/или состояния здоровья индивидуума и т.п.In a more general sense, and as is well known to those skilled in the art, a suitable amount of the active component of the present invention can be selected according to its therapeutic use, and suitable carriers or excipients and modes of administration may also be selected. These factors must be selected or determined in accordance with known criteria, such as the nature / severity of the condition being treated, the type and / or health status of the individual, and the like.

В одном из вариантов осуществления изобретения продукты настоящего изобретения могут быть использованы в анализе-скрининге, проводимом для идентификации потенциальных противомикробных лекарственных средств и для детекции вирулентности. Рутинные анализы-скрининги известны специалистам и могут быть соответствующим способом адаптированы с использованием продуктов настоящего изобретения. Так, например, продукты настоящего изобретения могут быть использованы в качестве мишеней для потенциальных лекарственных средств, где способность данного лекарственного средства инактивировать данную мишень или связываться с ней указывает на его потенциальную противомикробную активность.In one embodiment, the products of the present invention can be used in screening assays to identify potential antimicrobials and to detect virulence. Routine screening assays are known to those skilled in the art and can be adapted accordingly using the products of the present invention. For example, the products of the present invention can be used as targets for potential drugs, where the ability of a given drug to inactivate or bind to this target indicates its potential antimicrobial activity.

Различные продукты настоящего изобретения могут быть также использованы в ветеринарии.Various products of the present invention can also be used in veterinary medicine.

Ниже приведен краткий обзор экспериментальной процедуры, используемый для идентификации генов вирулентности. Гены вирулентности в S. pyogenes были идентифицированы посредством мутагенеза с использованием индексных маркеров (STM) для скрининга банка мутантов S. pyogenes в целях поиска аттенуированных мутантов (Hensel et al., 1995, Science 269 (5222):400-3).The following is a brief overview of the experimental procedure used to identify virulence genes. The virulence genes in S. pyogenes were identified by mutagenesis using index markers (STMs) for screening the mutant bank of S. pyogenes to search for attenuated mutants (Hensel et al., 1995, Science 269 (5222): 400-3).

Мутанты генерировали посредством встраивания транспозона Тn917 с использованием плазмидного вектора. Помимо фрагмента Тn917 этот вектор содержал ген резистентности к спектромицину, ген резистентности к хлорамфениколу (ген CAT) с синтетическим промотором, сайт инициации репликации грамотрицательной бактерии (rop.ori) и сайт клонирования для STM-меток. После лигирования меток в вектор осуществляли трансформацию Е. coli и отбирали 96 плазмид, которые гибридизовались с исходными метками.Mutants were generated by insertion of the transposon Tn917 using a plasmid vector. In addition to the Tn917 fragment, this vector contained a spectromycin resistance gene, a chloramphenicol resistance gene (CAT gene) with a synthetic promoter, a gram-negative bacterial replication initiation site (rop.ori), and a cloning site for STM tags. After ligation of the labels into a vector, E. coli was transformed and 96 plasmids were selected that hybridized with the original labels.

Штамм S. pyogenes B514-SM (тип М50) был трансформирован каждой из 96 меченных плазмид, и трансформанты отбирали по их резистентности к спектиномицину и хлорамфениколу. Для каждого из трансформированных штаммов S. pyogenes посредством встраивания транспозона Тn917 было генерировано 20 мутантов для создания банка мутантов.Strain S. pyogenes B514-SM (type M50) was transformed with each of the 96 labeled plasmids, and transformants were selected for their resistance to spectinomycin and chloramphenicol. For each of the transformed S. pyogenes strains, 20 mutants were generated by inserting the Tn917 transposon to create a mutant bank.

Банк мутантов скринировали либо на мышиной модели инфицирования с инвазивным поражением кожи (Schrager et al., J. Clinical Investigation 1996; 98:1954-1958), либо на мышиной модели инфицирования с бактериальной колонизацией глотки (Husmann et al., Infection and Immunity, 1997; 65 (4):935-944).The mutant bank was screened either in a mouse infection model with invasive skin lesion (Schrager et al., J. Clinical Investigation 1996; 98: 1954-1958) or in a mouse infection model with bacterial pharyngeal colonization (Husmann et al., Infection and Immunity, 1997; 65 (4): 935-944).

Для кожной модели каждую из пяти мышей CD1 внутрикожно инокулировали 1х10⁸ клеток в объеме 50 мкл культуры, представляющей собой коллекцию из 96 различных и легко различимых мутантов. Через 48 часов после инокуляции брали образцы и выделяли бактерии. Повреждения кожи подвергали мацерации в 2хВНI-среде, и бактерии высвобождались из участка поражения путем обработки в искусственном желудке в течение 10 минут. Выделенные бактерии высевали, и минимум от 3 мышей выделяли минимум 10000 колоний. Из этих образцов выделяли ДНК и использовали для амплификации меченной ДНК, присутствующей в выделенных бактериях. ДНК, выделенную из каждого полученного пула, использовали в качестве гибридизационного зонда для выявления в каждом пуле тех мутантов, которые не удалось выделить у животных, и которые поэтому являются аттенуированными у данной животной модели инфицирования.For the skin model, each of the five CD1 mice was intradermally inoculated with 1x10 ⁸ cells in a volume of 50 μl of culture, which is a collection of 96 different and easily distinguishable mutants. 48 hours after inoculation, samples were taken and bacteria isolated. Skin lesions were macerated in a 2xBHI medium, and bacteria were released from the lesion site by treatment in an artificial stomach for 10 minutes. Isolated bacteria were plated, and at least 10,000 colonies were isolated from at least 3 mice. DNA was isolated from these samples and used to amplify labeled DNA present in the isolated bacteria. DNA isolated from each obtained pool was used as a hybridization probe to identify in each pool those mutants that could not be isolated in animals, and which are therefore attenuated in this animal model of infection.

Для модели бактериальной колонизации глотки 2х10⁸ клеток интраназально инокулировали шести мышам C57BL/6 и через 48 часов брали образцы. Как в случае кожной модели бактерии, содержащие встроенный транспозон Тn917 в гене вирулентности, не были выделены у мышей, инокулированных смешанной популяцией мутантов, а поэтому они, вероятно, были аттенуированными.For a model of bacterial colonization of the pharynx, 2 × 10 ⁸ cells were intranasally inoculated to six C57BL / 6 mice and samples were taken after 48 hours. As in the case of the skin model, bacteria containing the inserted Tn917 transposon in the virulence gene were not isolated in mice inoculated with a mixed population of mutants, and therefore they were probably attenuated.

Для определения индекса конкурентоспособности (CI) были проведены дополнительные эксперименты на мутантах, идентифицированных посредством скрининга на STM. Отдельные мутанты были протестированы на модели инфицирования с поражением кожи смешанными инфекциями, вызываемыми штаммами дикого типа (Chiang S.L. & Mekalanos, J.J. Molecular Microbiology 1998; 27 (4):797-805). Как и в случае предварительного скрининга, группы из четырех мышей CD1 инокулировали равным количеством клеток дикого типа и мутантных клеток, общее число которых составляло 1х10⁸ клеток. Бактерии, выделенные через 48 часов, высевали на селективные среды, которые позволяют различать колонии дикого типа и мутантные колонии. Отношение мутантных бактерий к бактериям дикого типа, наблюдающееся в инокуляте, по сравнению с соответствующим отношением в выделенных бактериях представляет собой индекс конкурентоспособности (отношение бактерий-мутантов к бактериям дикого типа в инокуляте, деленное на отношение бактерий-мутантов к бактериям дикого типа, выделенных у животного-модели).To determine the competitiveness index (CI), additional experiments were performed on mutants identified by screening for STM. Individual mutants were tested on a model of infection with skin lesions by mixed infections caused by wild-type strains (Chiang SL & Mekalanos, JJ Molecular Microbiology 1998; 27 (4): 797-805). As in the case of preliminary screening, groups of four CD1 mice were inoculated with an equal number of wild-type cells and mutant cells, the total number of which was 1 × 10 ⁸ cells. Bacteria isolated after 48 hours were plated on selective media that distinguish between wild-type and mutant colonies. The ratio of mutant bacteria to wild-type bacteria observed in the inoculum, compared with the corresponding ratio in the isolated bacteria, is a competitiveness index (the ratio of mutant bacteria to wild-type bacteria in the inoculum divided by the ratio of mutant bacteria to wild-type bacteria isolated from the animal models).

Настоящее изобретение проиллюстрировано нижеследующими примерами.The present invention is illustrated by the following examples.

Пример 1Example 1

Был идентифицирован первый мутант и была клонирована нуклеотидная последовательность, непосредственно примыкающая к встроенному транспозону.The first mutant was identified and the nucleotide sequence directly adjacent to the inserted transposon was cloned.

Нуклеотидная последовательность была на 100% идентична на нуклеотидном уровне кодирующей последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID N0:l, с предполагаемой последовательностью белка, представленной как SEQ ID NO:2.The nucleotide sequence was 100% identical at the nucleotide level of the coding sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID N0: l, with the putative protein sequence represented as SEQ ID NO: 2.

Аминокислотная последовательность предсказанного белкового продукта была на 43% идентична предполагаемой последовательности нитроредуктазы NAD(P)H Н. influenzae (номер доступа: SW:Q57431).The amino acid sequence of the predicted protein product was 43% identical to the putative NAD (P) H N. influenzae nitroreductase sequence (accession number: SW: Q57431).

Если принять во внимание сходство предполагаемого гена нитроредуктазы NAD(P)H в S. pyogenes с геном нитроредуктазы NAD(P)H в Н. influenzae, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.Given the similarity between the putative NAD (P) H nitroreductase gene in S. pyogenes and the NAD (P) H nitroreductase gene in H. influenzae, we would expect that similar sequences in other streptococci and gram-positive bacteria may also be associated with virulence.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированный микроорганизм был аттенуирован с индексом конкурентоспособности (CI) 0,644.In the virulence attenuation test, it was shown that the mutated microorganism was attenuated with a competitiveness index (CI) of 0.644.

Пример 2Example 2

Был идентифицирован другой мутант и была клонирована нуклеотидная последовательность, непосредственно примыкающая к встроенному транспозону.Another mutant was identified, and a nucleotide sequence directly adjacent to the inserted transposon was cloned.

Нуклеотидная последовательность была на 98% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:3. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:4.The nucleotide sequence was 98% identical at the nucleotide level of the sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID NO: 3. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 4.

Аминокислотная последовательность была на 81% идентична предполагаемой последовательности фермента интегразы S. mutans (номер доступа: TREMBL: 069155).The amino acid sequence was 81% identical to the putative sequence of the S. mutans integrase enzyme (access number: TREMBL: 069155).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен предполагаемому гену интегразы S. mutans. Однако ранее было не известно о присутствии этого гена в S. pyogenes и о его роли в вирулентности.This suggests that the disrupted gene is at least partially identical to the putative integrase gene S. mutans. However, it was previously not known about the presence of this gene in S. pyogenes and its role in virulence.

Если принять во внимание сходство гена в S. pyogenes с предполагаемым геном интегразы S. mutans, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут также быть детерминантами вирулентности.If we take into account the similarity of the gene in S. pyogenes with the putative integrase gene of S. mutans, it should be expected that similar sequences in other streptococci and gram-positive bacteria can also be determinants of virulence.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированный микроорганизм был аттенуирован с индексом конкурентоспособности (CI) 0,229.In the virulence attenuation test, it was shown that the mutated microorganism was attenuated with a competitiveness index (CI) of 0.229.

Пример 3Example 3

Нуклеотидная последовательность была на 97% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:5. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:6.The nucleotide sequence was 97% identical at the nucleotide level of the sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID NO: 5. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 6.

Аминокислотная последовательность была на 37% идентична на аминокислотном уровне белку GlgP одноклеточной цианобактерии Synechocystis spp. (номер доступа: TREMBL:P73511).The amino acid sequence was 37% identical at the amino acid level to the GlgP protein of the unicellular cyanobacterium Synechocystis spp. (access number: TREMBL: P73511).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен гену glgP Synechocystis spp.This suggests that the disrupted gene is at least partially identical to the glgP gene of Synechocystis spp.

Если принять во внимание сходство гена в S. pyogenes с геном glgP Synechocystis spp., то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут также быть детерминантами вирулентности.If we take into account the similarity of the gene in S. pyogenes with the glgP gene of Synechocystis spp., It should be expected that similar sequences in other streptococci and gram-positive bacteria can also be determinants of virulence.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированный микроорганизм был аттенуирован с индексом конкурентоспособности (CI) 0,011.In the virulence attenuation test, it was shown that the mutated microorganism was attenuated with a competitiveness index (CI) of 0.011.

Пример 4Example 4

Нуклеотидная последовательность была на 97% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:7. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:8.The nucleotide sequence was 97% identical at the nucleotide level of the sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID NO: 7. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 8.

Аминокислотная последовательность была на 35% идентична на аминокислотном уровне белку ВrаВ В. subtilis (номер доступа: TREMBL: 035545).The amino acid sequence was 35% identical at the amino acid level to B. subtilis BraB protein (access number: TREMBL: 035545).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен гену bгаВ В. subtilis.This suggests that the destroyed gene is at least partially identical to the B. subtilis bgaB gene.

Если принять во внимание сходство гена braB в S. pyogenes с геном braB В. subtilis, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.If we take into account the similarity of the braB gene in S. pyogenes with the B. subtilis braB gene, then we should expect that similar sequences in other streptococci and gram-positive bacteria can also be associated with virulence.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированный микроорганизм был аттенуирован с индексом конкурентоспособности (CI) 0,88.The virulence attenuation test showed that a mutated microorganism was attenuated with a competitiveness index (CI) of 0.88.

Пример 5Example 5

Нуклеотидная последовательность была на 99% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:9. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:10.The nucleotide sequence was 99% identical at the nucleotide level of the sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID NO: 9. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 10.

Был также идентифицирован еще один аттенуированный мутант с нуклеотидной последовательностью, имеющей 98%-ную идентичность, на нуклеотидном уровне, с последовательностью в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:11. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:12.Another attenuated mutant was also identified with a nucleotide sequence having 98% identity at the nucleotide level, with a sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID NO: 11. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 12.

Предсказанный белок первого мутанта был на 53% идентичен на аминокислотном уровне белку AdcR S. pneumoniae (номер доступа: TREMBL: 033703). Предсказанный белок второго мутанта был на 79% идентичен на аминокислотном уровне белку AdcC S. pneumoniae (номер доступа: TREMBL: 087862).The predicted protein of the first mutant was 53% identical at the amino acid level to the S. pneumoniae AdcR protein (access number: TREMBL: 033703). The predicted protein of the second mutant was 79% identical at the amino acid level to the S. pneumoniae AdcC protein (access number: TREMBL: 087862).

Это свидетельствует о том, что разрушенные гены, по крайней мере, частично идентичны генам adcR и adcC S. pneumoniae. Гены adcR и adcC являются частью оперона adc (включающего adcR, adcC adcB и adcA) в S. pneumoniae. Поэтому аттенуация мутантов adcR и adcC S. pyogenes могла быть обусловлена отсутствием экспрессии генов adcR и adcC, или предсказанных и нижерасположенных генов (гомологов adcB и adcA). Ранее не считалось, что эти гены играют какую-либо роль в вирулентности S. pyogenes.This suggests that the disrupted genes are at least partially identical to the S. pneumoniae adcR and adcC genes. The adcR and adcC genes are part of the adc operon (including adcR, adcC adcB and adcA) in S. pneumoniae. Therefore, the attenuation of S. pyogenes adcR and adcC mutants could be due to the lack of expression of the adcR and adcC genes, or the predicted and downstream genes (adcB and adcA homologs). These genes were not previously thought to play any role in the virulence of S. pyogenes.

Если принять во внимание сходство гена в S. pyogenes с генами adcR и adcC S. pneumoniae, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.If we take into account the similarity of the gene in S. pyogenes with the adcR and adcC genes of S. pneumoniae, then it is expected that similar sequences in other streptococci and gram-positive bacteria can also be associated with virulence.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированные микроорганизмы были аттенуированы с индексом конкурентоспособности (CI) 0,548 (adcR) и 0,028 {adcC}.In the virulence attenuation test, it was shown that mutated microorganisms were attenuated with a competitiveness index (CI) of 0.548 (adcR) and 0.028 {adcC}.

Пример 6Example 6

Нуклеотидная последовательность была на 99% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:13. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:14.The nucleotide sequence was 99% identical at the nucleotide level of the sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID NO: 13. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 14.

Аминокислотная последовательность была на 39% идентична на аминокислотном уровне гомологу белка ДНК-репарации radC (orfB) В. subtilis (номер доступа: SK: Q02170).The amino acid sequence was 39% identical at the amino acid level to the B. subtilis radC (orfB) DNA repair protein homolog (accession number: SK: Q02170).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен гену orfB В. subtilis.This suggests that the disrupted gene is at least partially identical to the B. subtilis orfB gene.

Если принять во внимание сходство гена orfB S. pyogenes с геном В. subtilis, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.If we take into account the similarity of the orfB gene of S. pyogenes with the B. subtilis gene, then we should expect that similar sequences in other streptococci and gram-positive bacteria can also be associated with virulence.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированный микроорганизм был аттенуирован с индексом конкурентоспособности (CI) 0,766.In the virulence attenuation test, it was shown that the mutated microorganism was attenuated with a competitiveness index (CI) of 0.766.

Пример 7Example 7

Нуклеотидная последовательность была на 98% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:15. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:16.The nucleotide sequence was 98% identical at the nucleotide level of the sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID NO: 15. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 16.

Аминокислотная последовательность была на 54% идентична на аминокислотном уровне белку-переносчику карбоксил-биотина (ВССР) в S. mutans (номер доступа: SW: P29337).The amino acid sequence was 54% identical at the amino acid level to the carboxyl-biotin transporter protein (BSSR) in S. mutans (accession number: SW: P29337).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен гену, кодирующему ВССР S. mutans. O присутствии этого гена в S. pyogenes и о его роли в вирулентности ранее не было известно.This suggests that the destroyed gene is at least partially identical to the gene encoding the BSSR S. mutans. The presence of this gene in S. pyogenes and its role in virulence were not previously known.

Если принять во внимание сходство транслированного гена S. pyogenes с ВССР S. mutans, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.If we take into account the similarity of the translated S. pyogenes gene with the BSSR S. mutans, then we should expect that similar sequences in other streptococci and gram-positive bacteria can also be associated with virulence.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированные микроорганизмы были аттенуированы с индексом конкурентоспособности (CI) 0,044.The virulence attenuation test showed that mutated microorganisms were attenuated with a competitiveness index (CI) of 0.044.

Пример 8Example 8

Была идентифицирована серия мутантов, имеющих последовательности, сходные с последовательностями генов, ответственных за нитратное брожение. Нуклеотидные последовательности восьми мутантов были на 100% идентичны последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:17. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:18.A series of mutants has been identified that have sequences similar to those of the genes responsible for nitrate fermentation. The nucleotide sequences of the eight mutants were 100% identical to the sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID NO: 17. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 18.

Предсказанный белок гена S. pyogenes был на 58% идентичен на аминокислотном уровне белку citF, альфа-цепи цитратлиазы, Е. coil (номер доступа SW: P75726).The predicted protein of the S. pyogenes gene was 58% identical at the amino acid level to the protein citF, alpha chain of citrate lyase, E. coil (access number SW: P75726).

Нуклеотидная последовательность трех других мутантов была на 99% идентична другой последовательности в геноме S. pyogenes. Эта нуклеотидная последовательность представлена как SEQ ID NO:19, а предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:20.The nucleotide sequence of the three other mutants was 99% identical to the other sequence in the S. pyogenes genome. This nucleotide sequence is represented as SEQ ID NO: 19, and the predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 20.

Указанные аминокислотные последовательности были на 55% идентичны на аминокислотном уровне белку citE, бета-цепи цитратлиазы, Е. coli (номер доступа SW: P77770).The indicated amino acid sequences were 55% identical at the amino acid level to the protein citE, beta chain of citrate lyase, E. coli (accession number SW: P77770).

Нуклеотидные последовательности двух других мутантов были на 99% идентичны нуклеотидной последовательности S. pyoqenes, идентифицированной здесь как SEQ ID NO:21. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:22.The nucleotide sequences of the other two mutants were 99% identical to the nucleotide sequence of S. pyoqenes, identified here as SEQ ID NO: 21. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 22.

Аминокислотная последовательность была на 46% идентична на аминокислотном уровне белку CitD, белку-переносчику цитратлиазацила (гамма-цепи цитратлиазы) в Е. coli (номер доступа SW: P77618).The amino acid sequence was 46% identical at the amino acid level to the CitD protein, a carrier protein of citratliazacyl (gamma chain citrate lyase) in E. coli (accession number SW: P77618).

Были идентифицированы два других мутанта с нуклеотидными последовательностями, имеющими 99%-ную идентичность с нуклеотидной последовательностью S. pyoqenes, идентифицированной здесь как SEQ ID NO:23. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:24.Two other mutants with nucleotide sequences having a 99% identity with the nucleotide sequence of S. pyoqenes identified here as SEQ ID NO: 23 were identified. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 24.

Аминокислотные последовательности были на 34% идентичны на аминокислотном уровне белку CitC, цитрат (рrо-3s)-лиазе (лигазе), Е. coli (номер доступа SW: P77390).Amino acid sequences were 34% identical at the amino acid level to the CitC protein, citrate (p-3s) lyase (ligase), E. coli (accession number SW: P77390).

Был идентифицирован другой мутант с нуклеотидной последовательностью, имеющей 99%-ную идентичность с нуклеотидной последовательностью S. pyoqenes, идентифицированной здесь как SEQ ID NO:25. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:26.Another mutant with a nucleotide sequence having a 99% identity with the nucleotide sequence of S. pyoqenes identified here as SEQ ID NO: 25 was identified. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 26.

Аминокислотная последовательность была на 37% идентична на аминокислотном уровне белку CitX E. coil (номер доступа SW: P77563).The amino acid sequence was 37% identical at the amino acid level to the CitX E. coil protein (accession number SW: P77563).

Были идентифицированы еще три мутанта с нуклеотидными последовательностями, имеющими 100%-ную идентичность с нуклеотидной последовательностью S. pyogenes, идентифицированной здесь как SEQ ID NO:27. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO: 2 8.Three more mutants were identified with nucleotide sequences having 100% identity with the nucleotide sequence of S. pyogenes, identified here as SEQ ID NO: 27. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 2 8.

Аминокислотные последовательности были на 59% идентичны на аминокислотном уровне белку OadA, субъединицы альфа оксалоацетат-декарбоксилазы К. pneumoniae (номер доступа SW: Р13187).Amino acid sequences were 59% identical at the amino acid level to the OadA protein, subunit of K. pneumoniae alpha oxaloacetate decarboxylase (accession number SW: P13187).

Все предсказанные белковые последовательности вышеуказанных мутантов имели различные степени идентичности генным продуктам E. coli или К. pneumoniae, необходимым для нитратного брожения.All of the predicted protein sequences of the above mutants had varying degrees of identity with the E. coli or K. pneumoniae gene products needed for nitrate fermentation.

Это свидетельствует о том, что разрушенные гены, по крайней мере, частично идентичны генам citF, E, D, С, Х и oadA E. coli и К. pneumoniae. Гены, участствующие в цитратном брожении, локализованы в одном локусе на хромосоме в E. coli и К. pneumoniae. Поэтому аттенуация мутантов S. pyogenes могла быть обусловлена отсутствием экспрессии генов citFEDCX и oadA или нижерасположенных генов. Ранее этим генам не приписывали какой-либо роли в вирулентности.This suggests that the destroyed genes are at least partially identical to the citF, E, D, C, X and oadA genes of E. coli and K. pneumoniae. Genes involved in citrate fermentation are localized at the same locus on the chromosome in E. coli and K. pneumoniae. Therefore, the attenuation of S. pyogenes mutants could be due to the lack of expression of the citFEDCX and oadA genes or downstream genes. Previously, these genes were not assigned any role in virulence.

Если принять во внимание сходство гена в S. pyogenes с генами, присутствующими в E. coli или К. pneumoniae, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.If we take into account the similarity of the gene in S. pyogenes with the genes present in E. coli or K. pneumoniae, it should be expected that similar sequences in other streptococci and gram-positive bacteria can also be associated with virulence.

Мутанты для каждого из citF, Е, D, Х и oadA были протестированы на аттенуацию вирулентности. Было показано, что мутированные микроорганизмы были аттенуированы с индексом конкурентоспособности (CI) 0,122 (citF), 0,064 (citE), 0,078 (citD), 0,025 (citX) и 0,251 (oadA).Mutants for each of citF, E, D, X, and oadA were tested for attenuation of virulence. It was shown that mutated microorganisms were attenuated with a competitiveness index (CI) of 0.122 (citF), 0.064 (citE), 0.078 (citD), 0.025 (citX) and 0.251 (oadA).

Пример 9Example 9

Нуклеотидная последовательность была на 98% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, идентифицированной здесь как в SEQ ID NO:29. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID N0:30.The nucleotide sequence was 98% identical at the nucleotide level of the sequence in the S. pyogenes genome, identified here as in SEQ ID NO: 29. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID N0: 30.

Аминокислотная последовательность была на 27% идентична на аминокислотном уровне белку femB S. aureas (номер доступа: TREMBL: Q9X9D7).The amino acid sequence was 27% identical at the amino acid level to the femB protein S. aureas (accession number: TREMBL: Q9X9D7).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен гену femB S. aureas. Однако ранее не было известно о присутствии этого гена в S. pyogenes и о его роли в вирулентности.This suggests that the disrupted gene is at least partially identical to the femB gene of S. aureas. However, it was previously not known about the presence of this gene in S. pyogenes and its role in virulence.

Если принять во внимание сходство гена S. pyogenes с геном femB S. aureas, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.If we take into account the similarity of the S. pyogenes gene with the femB gene of S. aureas, it should be expected that similar sequences in other streptococci and gram-positive bacteria can also be associated with virulence.

Пример 10Example 10

Нуклеотидная последовательность была в значительной степени идентична последовательности в геноме S. pyoqenes, представленной как SEQ ID NO:31. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:32.The nucleotide sequence was substantially identical to the sequence in the S. pyoqenes genome represented as SEQ ID NO: 31. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 32.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированный микроорганизм был аттенуирован с индексом конкурентоспособности (CI) 0,160.In the virulence attenuation test, it was shown that the mutated microorganism was attenuated with a competitiveness index (CI) of 0.160.

Пример 11Example 11

Нуклеотидная последовательность была на 100% идентична последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:33. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:34.The nucleotide sequence was 100% identical to the sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID NO: 33. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 34.

Пример 12Example 12

Нуклеотидная последовательность была на 98% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:35. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:36.The nucleotide sequence was 98% identical at the nucleotide level of the sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID NO: 35. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 36.

Аминокислотная последовательность была на 46% идентична на аминокислотном уровне ATP-связывающему белку транспорта субтилина в Bacillus subtilis (номер доступа: SW:P33116).The amino acid sequence was 46% identical at the amino acid level to the ATP-binding subtilin transport protein in Bacillus subtilis (access number: SW: P33116).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен гену braB В. subtilis.This suggests that the disrupted gene is at least partially identical to the B. subtilis braB gene.

Если принять во внимание сходство гена в S. pyogenes с указанным геном В. subtilis, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.If we take into account the similarity of the gene in S. pyogenes with the indicated B. subtilis gene, then we should expect that similar sequences in other streptococci and gram-positive bacteria can also be associated with virulence.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированный микроорганизм был аттенуирован с индексом конкурентоспособности (CI) 0,128.In the virulence attenuation test, it was shown that the mutated microorganism was attenuated with a competitiveness index (CI) of 0.128.

Пример 13Example 13

Был идентифицирован другой мутант и сразу после инсерции транспозона была клонирована нуклеотидная последовательность.Another mutant was identified, and immediately after insertion of the transposon, the nucleotide sequence was cloned.

Указанная нуклеотидная последовательность была на 98% идентична последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:37. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:38.The specified nucleotide sequence was 98% identical to the sequence in the genome of S. pyogenes, presented as SEQ ID NO: 37. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 38.

Пример 14Example 14

Нуклеотидная последовательность была на 98% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:37. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:40.The nucleotide sequence was 98% identical at the nucleotide level of the sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID NO: 37. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 40.

Аминокислотная последовательность была на 29% идентична на аминокислотном уровне гипотетическому 36,9 кДа-белку Е. coli (номер доступа: SW: P33019).The amino acid sequence was 29% identical at the amino acid level to the hypothetical 36.9 kDa protein of E. coli (accession number: SW: P33019).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен указанному гену Е. coli. Другие аналогичные последовательности могут быть ассоциированы с вирулентностью.This suggests that the destroyed gene is at least partially identical to the indicated E. coli gene. Other similar sequences may be associated with virulence.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированный микроорганизм был аттенуирован с индексом конкурентоспособности (CI) 0,747.In the virulence attenuation test, it was shown that the mutated microorganism was attenuated with a competitiveness index (CI) of 0.747.

Пример 15Example 15

Нуклеотидная последовательность была на 99% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:41. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:42.The nucleotide sequence was 99% identical at the nucleotide level of the sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID NO: 41. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 42.

Аминокислотная последовательность была на 29% идентична на аминокислотном уровне гипотетическому 89 кДа-белку A. fulgidus (номер доступа: TREMBL: 028425).The amino acid sequence was 29% identical at the amino acid level to the hypothetical 89 kDa protein of A. fulgidus (access number: TREMBL: 028425).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен указанному гену E.coli. Другие аналогичные последовательности могут быть ассоциированы с вирулентностью.This indicates that the disrupted gene is at least partially identical to the indicated E. coli gene. Other similar sequences may be associated with virulence.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированный микроорганизм был аттенуирован с индексом конкурентоспособности (CI) 0,588.In the virulence attenuation test, it was shown that the mutated microorganism was attenuated with a competitiveness index (CI) of 0.588.

Пример 16Example 16

Нуклеотидная последовательность была на 99% идентична последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:43. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:44.The nucleotide sequence was 99% identical to the sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID NO: 43. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 44.

Пример 17Example 17

Нуклеотидная последовательность была на 98% идентична последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:45. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:46.The nucleotide sequence was 98% identical to the sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID NO: 45. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 46.

Пример 18Example 18

Нуклеотидная последовательность была на 97% идентична последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:47. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:48.The nucleotide sequence was 97% identical to the sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID NO: 47. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 48.

Пример 19Example 19

Нуклеотидная последовательность была на 98% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:49. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:50.The nucleotide sequence was 98% identical at the nucleotide level of the sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID NO: 49. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 50.

Аминокислотная последовательность была на 47% идентична на аминокислотном уровне белку ciaH в S. pneumoniae (номер доступа: SW: Q54955).The amino acid sequence was 47% identical at the amino acid level to the ciaH protein in S. pneumoniae (access number: SW: Q54955).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен гену ciaH S. pneumoniae.This suggests that the disrupted gene is at least partially identical to the ciaH gene of S. pneumoniae.

Если принять во внимание сходство гена ciaH S. pyogenes с геном ciaH S. pneumoniae, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.If we take into account the similarity of the ciaH gene of S. pyogenes with the ciaH gene of S. pneumoniae, we should expect that similar sequences in other streptococci and gram-positive bacteria can also be associated with virulence.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированный микроорганизм был аттенуирован с индексом конкурентоспособности (CI) 0,205.In the virulence attenuation test, it was shown that the mutated microorganism was attenuated with a competitiveness index (CI) of 0.205.

Пример 20Example 20

Нуклеотидная последовательность была на 98% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:51. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:52.The nucleotide sequence was 98% identical at the nucleotide level of the sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID NO: 51. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 52.

Аминокислотная последовательность была на 39% идентична на аминокислотном уровне белку-гомологу mucA S. рnеumоniае (номер доступа: TREMBL: Q9ZBB1).The amino acid sequence was 39% identical at the amino acid level to the mucA S. homologous protein proteinum access number: TREMBL: Q9ZBB1).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен гену muсА S. pneumoniae.This suggests that the disrupted gene is at least partially identical to the S. pneumoniae mucA gene.

Если принять во внимание сходство гена S. pyogenes с геном mucA S. pneumoniae, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.If we take into account the similarity of the S. pyogenes gene with the S. pneumoniae mucA gene, then we should expect that similar sequences in other streptococci and gram-positive bacteria can also be associated with virulence.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированный микроорганизм был аттенуирован с индексом конкурентоспособности (CI) 0,547.The virulence attenuation test showed that the mutated microorganism was attenuated with a competitiveness index (CI) of 0.547.

Пример 21Example 21

Нуклеотидная последовательность была на 98% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:53. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:54.The nucleotide sequence was 98% identical at the nucleotide level of the sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID NO: 53. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 54.

Аминокислотная последовательность была на 69% идентична на аминокислотном уровне белку gidA В. subtilis (номер доступа: SW: P39815).The amino acid sequence was 69% identical at the amino acid level to the B. subtilis gidA protein (accession number: SW: P39815).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен указанному гену В. subtilis.This suggests that the destroyed gene is at least partially identical to the indicated B. subtilis gene.

Если принять во внимание сходство гена в S. pyogenes с геном gidA В. subtilis, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.If we take into account the similarity of the gene in S. pyogenes with the B. subtilis gidA gene, then we should expect that similar sequences in other streptococci and gram-positive bacteria can also be associated with virulence.

В тесте на аттенуацию вирулентности было показано, что мутированный микроорганизм был аттенуирован с индексом конкурентоспособности (CI) 0,444.The virulence attenuation test showed that a mutated microorganism was attenuated with a competitiveness index (CI) of 0.444.

Пример 22Example 22

Нуклеотидная последовательность была на 98% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:55. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:56.The nucleotide sequence was 98% identical at the nucleotide level of the sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID NO: 55. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 56.

Аминокислотная последовательность была на 74% идентична на аминокислотном уровне белку dltA S. mutans (номер доступа: SW: Q53526).The amino acid sequence was 74% identical at the amino acid level to the S. mutans dltA protein (accession number: SW: Q53526).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен гену dltA S. mutans.This suggests that the disrupted gene is at least partially identical to the S. mutans dltA gene.

Если принять во внимание сходство гена S. pyogenes с геном dltA В. mutans, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.If we take into account the similarity of the S. pyogenes gene with the B. mutans dltA gene, then we should expect that similar sequences in other streptococci and gram-positive bacteria can also be associated with virulence.

Пример 23Example 23

Нуклеотидная последовательность была на 99% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:57. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:58.The nucleotide sequence was 99% identical at the nucleotide level of the sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID NO: 57. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 58.

Аминокислотная последовательность была на 41% идентична на аминокислотном уровне белку hmgA A. fulgidus (номер доступа: SW: 028538).The amino acid sequence was 41% identical at the amino acid level to the A. fulgidus hmgA protein (access number: SW: 028538).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен указанному гену А. fulgidus.This suggests that the destroyed gene is at least partially identical to the indicated A. fulgidus gene.

Если принять во внимание сходство гена S. pyogenes с геном hmgA A. fulgidus, то следует ожидать, что аналогичные последовательности в других стрептококках и грамположительных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.If we take into account the similarity of the S. pyogenes gene with the hmgA gene of A. fulgidus, we should expect that similar sequences in other streptococci and gram-positive bacteria can also be associated with virulence.

Пример 24Example 24

Нуклеотидная последовательность была на 99% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:59. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:60.The nucleotide sequence was 99% identical at the nucleotide level of the sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID NO: 59. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 60.

Аминокислотная последовательность была на 34% идентична на аминокислотном уровне предполагаемому белку JAG в Т. maritima (номер доступа: TREMBL: Q9X1H1).The amino acid sequence was 34% identical at the amino acid level to the putative JAG protein in T. maritima (access number: TREMBL: Q9X1H1).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен указанному гену Т. maritima. Другие аналогичные последовательности в других грамотрицательных бактериях могут быть ассоциированы с вирулентностью.This suggests that the destroyed gene is at least partially identical to the indicated T. maritima gene. Other similar sequences in other gram-negative bacteria may be associated with virulence.

Пример 25Example 25

Нуклеотидная последовательность была на 99% идентична на нуклеотидном уровне последовательности в геноме S. pyogenes, представленной как SEQ ID NO:61. Предсказанная аминокислотная последовательность представлена как SEQ ID NO:62.The nucleotide sequence was 99% identical at the nucleotide level of the sequence in the S. pyogenes genome represented as SEQ ID NO: 61. The predicted amino acid sequence is presented as SEQ ID NO: 62.

Аминокислотная последовательность была на 49% идентична на аминокислотном уровне гипотетическому 49,4 кДа-белку в S. suis (номер доступа: TREMBL: Q9X4U3).The amino acid sequence was 49% identical at the amino acid level to the hypothetical 49.4 kDa protein in S. suis (access number: TREMBL: Q9X4U3).

Это свидетельствует о том, что разрушенный ген, по крайней мере, частично идентичен указанному гену S. suis. Аналогичные последовательности в других грамотрицательных бактериях могут быть также ассоциированы с вирулентностью.This suggests that the disrupted gene is at least partially identical to the indicated S. suis gene. Similar sequences in other gram-negative bacteria may also be associated with virulence.

Список последовательностей приведен в конце описания.A list of sequences is provided at the end of the description.

Claims

1. The peptide used to treat or prevent a condition associated with infection with streptococcus or a Gram-positive bacterium, encoded by an operon comprising any of the nucleotide sequences identified as SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, S.pyogenes 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59 and 61 , or a related molecule having at least 80% similarity or identity at the peptide or nucleotide level, or a functional fragment thereof.

2. The peptide according to claim 1, characterized in that the similarity or sequence identity is at least 90%.

3. The peptide according to claim 1, containing the amino acid sequence identified as SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, or 62.

4. The peptide according to claim 1, characterized in that the condition is pneumonia.

5. The peptide according to any one of claims 1 to 4, used in veterinary medicine.

6. The peptide according to any one of claims 1 to 3, used in a screening assay to identify an antimicrobial drug.

7. The polynucleotide used to treat or prevent a condition associated with infection with streptococcus or gram-positive bacterium, encoding a peptide according to any one of claims 1 to 3.

8. The polynucleotide according to claim 7, embedded in the host cell.

9. The polynucleotide according to claim 7, used for the manufacture of a medicament for treating or preventing a condition associated with infection with streptococcus or gram-positive bacterium.

10. The polynucleotide according to claim 9, characterized in that the condition is pneumonia.

11. The polynucleotide according to any one of claims 9 to 10, used in veterinary medicine.

12. The polynucleotide of claim 7, used in a screening assay to identify an antimicrobial drug.

13. A vaccine used to treat or prevent a condition associated with infection with streptococcus or a gram-positive bacterium, comprising an effective amount of a compound selected from the group consisting of (a) a peptide according to any one of claims 1 to 3, (b) a polynucleotide according to any one of claims 7-8, and a suitable carrier or adjuvant.

14. The antibody obtained using the peptide according to any one of claims 1 to 3, which binds to the peptide according to any one of claims 1 to 3.