RU2223312C2

RU2223312C2 - Biological object cultivating apparatus

Info

Publication number: RU2223312C2
Application number: RU2001124753/13A
Authority: RU
Inventors: Б.В. Соловьёв; Т.Б. Слепенко; А.Я. Самуйленко; Е.А. Рубан; В.И. Еремец
Original assignee: Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности
Priority date: 2001-09-11
Filing date: 2001-09-11
Publication date: 2004-02-10

Abstract

FIELD: biotechnology, in particular, apparatuses for cultivating of humans's or animal's cells and viruses in suspension and/or on microcarriers. SUBSTANCE: apparatus has case equipped with closure, process branch pipes and thermostatically controlling jacket, mixing device mounted inside casing, and bubbler located inside netted cylindrical vessel and adapted for aerating of nutrient medium therein. Netted vessel is arranged axially of case for rotation simultaneously with mixing device so as to isolate case volume including biological objects from nutrient medium aeration zone. Vertical plates of different height are positioned outside netted vessel and inside it for circulating of suspension and preventing vessel mesh openings from clogging. Apparatus may be used for preparing of vaccines and other biological preparations. EFFECT: increased yield of cells, viruses and cell synthesis products owing to improved hydrodynamic process and mass exchange process conditions in apparatus. 2 dwg

Description

Изобретение относится к биотехнологии, а конкретно к аппаратам для культивирования клеток и вирусов человека или животных в суспензии и/или на микроносителях, и может быть использовано при изготовлении вакцин и других биологических объектов. The invention relates to biotechnology, and in particular to apparatus for culturing human and animal cells and viruses in suspension and / or on microcarriers, and can be used in the manufacture of vaccines and other biological objects.

Известен аппарат [1], в котором аэрирование с целью насыщения культуральной питательной среды осуществляется путем подачи воздушно-газовой смеси над поверхностью среды. Однако для удовлетворения потребности растущих клеток в кислороде при достаточной их концентрации в таком аппарате необходимо активное перемешивание среды, в результате чего значительная часть клеток в суспензии может быть травмирована и погибает. В случае культивирования клеток на микроносителях активное перемешивание создает высокий гидродинамический сдвиг, превышающий силы адгезии клеток на микроносителях, в результате чего клетки отделяются от поверхности микроносителей ("сползают"), прекращают деление и гибнут. A known apparatus [1], in which aeration in order to saturate the culture medium is carried out by supplying an air-gas mixture above the surface of the medium. However, in order to satisfy the growing oxygen demand of the cells at a sufficient concentration in such an apparatus, active mixing of the medium is necessary, as a result of which a significant part of the cells in suspension can be injured and die. In the case of culturing cells on microcarriers, active mixing creates a high hydrodynamic shift exceeding the adhesion forces of cells on microcarriers, as a result of which the cells separate from the surface of the microcarriers (“slip”), stop dividing and die.

Известен также аппарат [2] для суспензионного культивирования клеток тканей или микроорганизмов, содержащий цилиндрическую емкость с крышкой и патрубками для подвода и отвода газа и устройство для аэрации и перемешивания среды. Устройство для аэрации и перемешивания содержит горизонтальное лопастное кольцо, укрепленное на вертикальном приводном валу, размещенное в верхней части емкости непосредственно под крышкой, и расположенную под ним кольцевую пластину с центральным отверстием для отвода газа, прикрепленную по периферии к стенке емкости с образованием кольцевой полости вокруг колеса для подвода и отвода газа. В кольцевой перегородке выполнены щелевые отверстия для прохода газа, расположенные равномерно по окружности под наклоном к горизонтальной плоскости. Патрубок для подвода газа установлен в крышке соосно лопастному колесу, а патрубок для отвода газа подключен к указанной кольцевой полости и размещен на краю крышки. Also known apparatus [2] for suspension cultivation of tissue cells or microorganisms, containing a cylindrical container with a lid and nozzles for supplying and discharging gas and a device for aeration and mixing of the medium. The device for aeration and mixing contains a horizontal impeller mounted on a vertical drive shaft, located in the upper part of the container directly under the cover, and an annular plate located under it with a central gas outlet, attached peripherally to the container wall with the formation of an annular cavity around the wheel for supply and removal of gas. Slit openings for gas passage are made in the annular partition, arranged uniformly around the circumference at an angle to the horizontal plane. A gas supply pipe is installed in the lid coaxially with the impeller, and a gas pipe is connected to the specified annular cavity and is placed on the edge of the cover.

Недостатком этого аппарата является то, что формирование ассиметричного вихревого движения жидкости (потенциальный вихрь с осевым противотоком) в таком аппарате достигается при высоких скоростях движения газа (свыше 15-18 м/с) над поверхностью этой жидкости, т.е. связано с большими энергозатратами. При этом происходит захват капель жидкости с поверхности суспензии клеток с последующим выбросом их на стенку емкости. Клетки в каплях жидкости травмируются от удара о стенку аппарата, т.е. имеет место массовая гибель клеток. При снижении скорости движения газа до 6-8 м/с над поверхностью суспензии клеток наблюдается неустойчивое течение жидкости, т.е. периодическая смена режима ассиметричного вихревого движения жидкости на режим автоколебания жидкости, при котором возникает бегущая вдоль стенки емкости волна. Поверхность жидкости искривляется и представляет собой ассиметричный параболоид вращения. Вся жидкость в аппарате колеблется как единое целое, раскачивая весь аппарат, что неблагоприятно сказывается на процессе культивирования клеток. Кроме того, конструкция аппарата позволяет культивировать клетки при высоте заполнения емкости, равной или менее одного диаметра этой емкости. Если высота заполнения емкости суспензией клеток более одного диаметра этой емкости, то у дна ее образуется застойная зона. При культивировании клетки неизбежно оседают в эту зону и гибнут от недостатка кислорода. The disadvantage of this apparatus is that the formation of an asymmetric vortex fluid motion (a potential vortex with an axial countercurrent) in such an apparatus is achieved at high gas velocities (above 15-18 m / s) above the surface of this fluid, i.e. associated with high energy consumption. In this case, liquid droplets are captured from the surface of the cell suspension, followed by their ejection onto the wall of the container. Cells in liquid droplets are injured from hitting the apparatus wall, i.e. there is massive cell death. When the gas velocity decreases to 6-8 m / s above the surface of the cell suspension, an unstable fluid flow is observed, i.e. periodic change of the regime of asymmetric vortex motion of a liquid to the regime of self-oscillation of a liquid, in which a wave traveling along the wall of the tank appears. The surface of the liquid is curved and is an asymmetric paraboloid of revolution. All the fluid in the apparatus oscillates as a whole, swinging the entire apparatus, which adversely affects the process of cell cultivation. In addition, the design of the apparatus allows the cultivation of cells at a filling height of the container equal to or less than one diameter of the container. If the height of filling the container with a suspension of cells is more than one diameter of this container, then a stagnant zone forms at the bottom of it. During cultivation, cells inevitably settle in this zone and die from a lack of oxygen.

Ближайшим аналогом [3] заявляемого аппарата является биореактор для культивирования клеток на микроносителях, включающий корпус, снабженный крышкой, технологическими патрубками и теплообменной рубашкой, установленное в корпусе перемешивающее устройство и барботер, размещенный внутри сетчатой цилиндрической емкости для аэрации питательной среды в ней. Насыщение кислородом питательной среды культивирования производят через разделительные мембраны. The closest analogue [3] of the claimed apparatus is a bioreactor for culturing cells on microcarriers, including a housing equipped with a lid, process pipes and a heat transfer jacket, a mixing device installed in the housing and a bubbler placed inside a cylindrical mesh tank for aeration of the nutrient medium in it. Oxygen saturation of the culture medium is carried out through separation membranes.

Недостатком такого аппарата для культивирования является быстрое оседание клеток (в том числе и на микроносителях) на поверхности мембраны (сетки) и закупоривание пор (ячеек) мембраны (сетки), что не позволяет в дальнейшем эффективно поддерживать необходимую концентрацию растворенного кислорода в культуральной питательной среде и соответственно размножение клеток и вирусов. The disadvantage of this apparatus for cultivation is the rapid sedimentation of cells (including on microcarriers) on the surface of the membrane (mesh) and clogging of the pores (cells) of the membrane (mesh), which does not allow further effective maintenance of the required concentration of dissolved oxygen in the culture medium respectively, the reproduction of cells and viruses.

Технический результат предлагаемого аппарата для культивирования биологических объектов заключается в увеличении выхода клеток, вирусов и продуктов клеточного синтеза, а также в обеспечении наиболее приемлемых гидродинамических условий процесса, исключающих формирование зон застоя и оседания клеток и/или микроносителей с клетками, в обеспечении благоприятных условий массообмена в аппарате, исключающих ограничение использования аппарата как по объему заполнения емкости, так и по степени чувствительности клеток к насыщению среды кислородом и травмированию. The technical result of the proposed apparatus for the cultivation of biological objects is to increase the yield of cells, viruses and cell synthesis products, as well as to ensure the most acceptable hydrodynamic process conditions, excluding the formation of stagnation and sedimentation zones of cells and / or microcarriers with cells, in ensuring favorable conditions for mass transfer in apparatus, eliminating the limitation of the use of the apparatus both in terms of capacity filling and in the degree of sensitivity of cells to saturation of the medium by origital and injuries.

Этот результат достигается тем, что в заявляемом аппарате для культивирования биологических объектов, содержащем корпус, снабженный крышкой, технологическими патрубками и термостатирующей рубашкой, установленное в корпусе перемешивающее устройство и барботер, размещенный внутри сетчатой цилиндрической емкости для аэрации питательной среды в ней, указанная емкость установлена по оси корпуса с возможностью вращения одновременно с валом перемешивающего устройства и служит для отделения объема корпуса с биологическими объектами от объема аэрации питательной среды, при этом снаружи емкости с зазорами и внутри нее укреплены вертикальные пластины разной высоты для циркуляции суспензии и предотвращения забивания отверстий сетки емкости биологическими объектами. This result is achieved by the fact that in the inventive apparatus for the cultivation of biological objects, comprising a housing provided with a lid, technological nozzles and a thermostatic jacket, a mixing device installed in the housing and a bubbler placed inside a cylindrical mesh tank for aeration of the nutrient medium in it, the specified tank is installed on the axis of the housing with the possibility of rotation simultaneously with the shaft of the mixing device and serves to separate the volume of the housing with biological objects from aeration of the nutrient medium, while outside the container with gaps and inside it, vertical plates of different heights are strengthened to circulate the suspension and prevent clogging of the mesh openings of the container with biological objects.

Изобретение поясняется чертежами, на которых на фиг.1 схематично изображен продольный разрез аппарата; на фиг.2 - разрез по сечению А-А. The invention is illustrated by drawings, in which figure 1 schematically shows a longitudinal section of the apparatus; figure 2 is a sectional view taken along section AA.

Аппарат состоит из корпуса 1 из нержавеющей стали с днищем и термостатирующей рубашкой 2, охлаждаемой водой и нагреваемой паром, которые подают через патрубки 3 и 4 и сливают через патрубок 5 крышки 6, на которой смонтированы патрубки для загрузки 7 и выгрузки компонентов питательной среды и культуральной жидкости 8, пробоотборника 9, патрубков для ввода датчиков температуры 10, порциального давления растворенного в среде кислорода (рО₂) 11, рН 12, окислительно-восстановительного потенциала (еН) 13, смонтированного на крышке и установленного в корпусе перемешивающего устройства с магнитным приводом 14 и барбатером для аэрации культуральной жидкости 15, размещенном внутри сетчатой цилиндрической емкости 16, установленной по оси корпуса с возможностью вращения одновременно с валом перемешивающего устройства, прикрепленной плотно без зазора в своей нижней части к валу втулкой с болтом 17, которая отделяет объем корпуса с культуральной средой от объема аэрации питательной среды, снаружи и внутри сетчатой цилиндрической емкости укреплены вертикальные пластины разной высоты 18, 19 на всю длину и ³/₄ длины цилиндра, угол наклона и величину зазора между пластинами и сеткой регулируют за счет крепления болт-гайками 20 (фиг.2) для обеспечения циркуляции суспензии и предотвращения забивания отверстий сетки биологическим материалом (микроносители, компоненты питательной среды, клетки).The apparatus consists of a stainless steel case 1 with a bottom and a thermostatic jacket 2, cooled by water and heated by steam, which are fed through nozzles 3 and 4 and drained through the nozzle 5 of the cover 6, on which the nozzles are mounted for loading 7 and unloading the components of the nutrient medium and culture fluid 8, the sampler 9, the pipes for input temperature sensors 10, pressure portsialnogo dissolved in oxygen (pO ₂₎ 11 12 pH, redox potential (eh) 13 mounted on the lid and mounted in the armature a whisker of a stirring device with a magnetic drive 14 and a barbator for aeration of the culture fluid 15, located inside the cylindrical mesh tank 16, mounted along the axis of the housing with the possibility of rotation simultaneously with the shaft of the stirring device, attached tightly without a gap in its lower part to the shaft by a sleeve with a bolt 17, which separates the volume of the housing with the culture medium from the volume of aeration of the nutrient medium, vertical plates of different heights 18, 19 are strengthened on the outside and inside the mesh cylindrical tank the length and ^3/4 _{of the} length of the cylinder, the angle of inclination and the gap between the plates and the grid are controlled by fastening with bolt-nuts 20 (figure 2) to ensure circulation of the suspension and prevent clogging of the mesh holes with biological material (microcarriers, nutrient components, cells) .

Аппарат работает следующим образом. The device operates as follows.

Для проведения культивирования биологических объектов (например, клеток животных) в суспензии и на микроносителях с корпуса 1 аппарата снимают крышку 6 и на вал перемешивающего устройства 14 устанавливают механический пеногаситель (на схеме не показан) и сетчатую цилиндрическую емкость 16 с размерами ячеек 25-50 мкм для культивирования клеток в суспензии, или 130-180 мкм для культивирования на микроносителях, или другими размерами в зависимости от вида биологических объектов с наружными 18 и внутренними вертикальными пластинами 19 на всю длину и ³/₄ длины сетчатой цилиндрической емкости, в которую вводят барботер 15.To carry out the cultivation of biological objects (for example, animal cells) in suspension and on microcarriers, the lid 6 is removed from the apparatus body 1 and a mechanical defoamer (not shown in the diagram) and a cylindrical mesh container 16 with mesh sizes 25-50 μm are installed on the shaft of the mixing device 14 for culturing cells in suspension, or 130-180 microns for cultivation on microcarriers, or other sizes depending on the type of biological objects with external 18 and internal vertical plates 19 for the entire length and ³ / _{4 the} length of the mesh cylindrical container into which the bubbler 15 is introduced.

Сетчатую цилиндрическую емкость 16 в нижней части плотно без зазора крепят к валу перемешивающего устройства 14 посредством втулки с болтом 17. Перед установкой сетчатой цилиндрической емкости на вал перемешивающего устройства регулируют угол наклона и угол зазора внешних пластин 18 между пластинами и сеткой за счет крепления болт-гайкой 20. The mesh cylindrical container 16 in the lower part is tightly attached to the shaft of the mixing device 14 without a gap by means of a sleeve with a bolt 17. Before installing the mesh cylindrical container on the shaft of the mixing device, the angle of inclination and the clearance angle of the outer plates 18 between the plates and the mesh are adjusted by fixing with a bolt-nut 20.

После окончания монтажа одевают крышку, заполняют аппарат питательной средой и производят засев через штуцер 7, подсоединяют датчики параметров и двигатель привода перемешивающего устройства 14 к пульту автоматического управления (на схеме не показан), подключают к барботеру 15 сжатый воздух или смесь газов и устанавливают расход газа на аэрацию в зависимости от требуемого значения рО₂, включают мешалку и проводят культивирование.After the installation is completed, they put on a lid, fill the apparatus with nutrient medium and inoculate through nozzle 7, connect the parameter sensors and the drive motor of the mixing device 14 to the automatic control panel (not shown in the diagram), connect compressed air or a mixture of gases to the bubbler 15, and set the gas flow rate for aeration, depending on the desired pO ₂ value, the mixer is turned on and cultivation is carried out.

Для взятия проб на биологический анализ в процессе культивирования используют пробоотборник 9. По завершении культивирования проводят слив культуральной жидкости через патрубок 8 для дальнейшей обработки. To take samples for biological analysis during the cultivation process, a sampler 9 is used. At the end of the cultivation, the culture fluid is drained through pipe 8 for further processing.

Конструкция предлагаемой системы аэрации и перемешивания в процессе культивирования клеток и вирусов или других биологических объектов позволяет реализовать нестационарный процесс перемешивания среды, обеспечивающий приближенные к оптимальным гидродинамические условия, условия массообмена, что обеспечивает уменьшение продолжительности производственного процесса и производства биологических препаратов, повышает производительность процесса, снижает себестоимость продукта. Предлагаемый аппарат для культивирования биологических объектов обеспечивает максимальный выход клеточной массы как в суспензии, так и на микроносителях, соответственно максимальное накопление клеточных метаболитов, продуктов клеточного синтеза (вирусного материала, биологически активных веществ, моно- или поликлональных антител) и т.д. Эффект достигается, во-первых, за счет возможности обеспечить оптимальную концентрацию растворенного кислорода на любом этапе культивирования, во-вторых, в результате создания благоприятных условий перемешивания культуральной среды, при которых исключается или минимизируется травмирование клеток в суспензии и на микроносителях, соответственно гибель клеток в суспензии или отделение клеток с поверхности микроносителей и последующая гибель клеток. The design of the proposed aeration and mixing system during the cultivation of cells and viruses or other biological objects makes it possible to implement an unsteady process of mixing the medium, which provides hydrodynamic conditions and mass transfer conditions that are close to optimal, which reduces the duration of the production process and the production of biological preparations, increases the productivity of the process, and reduces the cost product. The proposed apparatus for the cultivation of biological objects provides the maximum yield of cell mass both in suspension and on microcarriers, respectively, the maximum accumulation of cellular metabolites, cell synthesis products (viral material, biologically active substances, mono- or polyclonal antibodies), etc. The effect is achieved, firstly, due to the ability to provide the optimal concentration of dissolved oxygen at any stage of cultivation, and secondly, as a result of creating favorable conditions for mixing the culture medium, in which injury to cells in suspension and microcarriers is eliminated or minimized, respectively, cell death in suspension or separation of cells from the surface of microcarriers and subsequent cell death.

При использовании предлагаемого аппарата для культивирования биологических объектов эффективность культивирования повышается. When using the proposed apparatus for the cultivation of biological objects, the efficiency of cultivation increases.

Предлагаемый аппарат использовали при отработке технологии вакцины против болезни Марека на основе культивирования клеток перепелиных эмбрионов на микроносителях. За один технологический цикл в аппарате объемом 0,025 м³ можно получить до 1,8 млн доз вакцины, что в несколько раз выше по сравнению с использованием других аппаратов. Предлагаемый аппарат для культивирования биологических объектов позволяет обеспечить оптимальное насыщение культуральной питательной среды растворенным кислородом, массообмен необходимой интенсивности, приемлемые для клеток в суспензии или на микроносителях условия перемешивания, максимально исключающие травмирование клеток, что, в свою очередь, позволяет культивировать первичные клетки тканей или органов, клетки перевиваемых линий, гибридные и гибридомные клетки, чувствительные к механическому повреждению и имеющие различную потребность в кислороде, получать более высокие концентрации любых типов клеток. Аппарат легко масштабируется от 0,005 до 0,25 м³, причем в большем масштабе соотношение объема среды культивирования клеток и изолированного объема аэрирования питательной среды более эффективно. Заявляемый аппарат может широко использоваться в биологической, медицинской и пищевой промышленности.The proposed apparatus was used to develop a technology for vaccines against Marek’s disease based on the cultivation of quail embryo cells on microcarriers. Up to 1.8 million doses of vaccine can be obtained in one technological cycle in a device with a volume of 0.025 m ³ , which is several times higher compared to using other devices. The proposed apparatus for the cultivation of biological objects makes it possible to ensure optimal saturation of the culture medium with dissolved oxygen, mass transfer of the required intensity, mixing conditions acceptable for cells in suspension or on microcarriers, which exclude cell injury to the maximum, which, in turn, allows the cultivation of primary cells of tissues or organs, cells of transplantable lines, hybrid and hybridoma cells, sensitive to mechanical damage and having different detachment in oxygen, receive higher concentrations of any type of cell. The apparatus easily scales from 0.005 to 0.25 m ³ , and on a larger scale, the ratio of the volume of the cell culture medium to the isolated volume of aeration of the nutrient medium is more efficient. The inventive apparatus can be widely used in the biological, medical and food industries.

Источники информации
1. Биотехнология клеток животных. /Под ред. Р.Е.Спиера и Дж.Гриффитса. - М.: ВО "Агропромиздат", 1989, стр.294. Л.Л.Ван Везель. Системы выращивания в монослое: гомогенные процессы в единичном оборудовании.Sources of information
1. Biotechnology of animal cells. / Ed. R.E.Spiera and J. Griffiths. - M .: IN "Agropromizdat", 1989, p. 294. L.L. Van Wesel. Monolayer growing systems: homogeneous processes in a single equipment.

2. Аппарат для суспензионного культивирования клеток тканей или микроорганизмов WO 92/05245 А1, С 12 М 1/04, 02.04.1992. 2. Apparatus for suspension cultivation of tissue cells or microorganisms WO 92/05245 A1, C 12 M 1/04, 04/02/1992.

3. Биореактор для культивирования клеток на микроносителях. Максимов М. Г. , Попов Ю.А., Хохлов А.М., Швяков А.А., Шишков М.И. Патент RU 2050415 C1, 6 C 12 М 3/00 от 20.12.1995 - прототип. 3. Bioreactor for culturing cells on microcarriers. Maksimov M.G., Popov Yu.A., Khokhlov A.M., Shvyakov A.A., Shishkov M.I. Patent RU 2050415 C1, 6 C 12 M 3/00 dated 12/20/1995 - prototype.

Claims

An apparatus for cultivating biological objects, comprising a housing provided with a lid, process pipes and a thermostatic jacket, a mixing device installed in the housing and a bubbler located inside the cylindrical mesh tank for aeration of the nutrient medium in it, characterized in that the mesh cylindrical tank is installed along the housing axis with the possibility of rotation simultaneously with the shaft of the mixing device and serves to separate the volume of the body with biological objects from the volume of aeration itatelnoy medium, the outside of the vessel with gaps and fastened inside the vertical plates of different heights for the circulation of the suspension and to prevent clogging of the mesh openings capacitance biological objects.