RU2220755C1 - Способ разделения смеси жирных кислот фракции c2-c6 методом газожидкостной хроматографии - Google Patents
Способ разделения смеси жирных кислот фракции c2-c6 методом газожидкостной хроматографии Download PDFInfo
- Publication number
- RU2220755C1 RU2220755C1 RU2002119447/15A RU2002119447A RU2220755C1 RU 2220755 C1 RU2220755 C1 RU 2220755C1 RU 2002119447/15 A RU2002119447/15 A RU 2002119447/15A RU 2002119447 A RU2002119447 A RU 2002119447A RU 2220755 C1 RU2220755 C1 RU 2220755C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- separation
- sample
- fraction
- column
- gas
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к химии и медицине, в частности к хроматографическому разделению веществ, и может быть использовано для анализа биологических субстратов и других объектов, содержащих смесь короткоцепочечных жирных кислот. Предложен способ разделения короткоцепочечных жирных кислот фракции C2-С6 методом ГЖХ на колонке с использованием неподвижной фазы из сополимера полиэтиленгликоля с терефталевой кислотой. Способ позволяет проводить выделение, разделение и определение короткоцепочечных жирных кислот с высокой точностью при уменьшении веса (или объема) пробы биологического образца. 3 з.п.ф-лы, 9 ил.
Description
Изобретение относится к области медицины и химии, в частности к хроматографическому разделению веществ, и может быть использовано для анализа биологических субстратов и других объектов, содержащих смесь короткоцепочечных жирных кислот.
К короткоцепочечным жирным кислотам (фракции С2-С6) относят уксусную, пропионовую, изомасляную, масляную, изовалериановую, валериановую и капроновую.
Известен способ разделения жирных кислот фракции С2-С6, включающий подготовку пробы путем гомогенизации в растворе NaOH, центрифугирование, упаривание, добавление Н2SO4, экстракцию смеси кислот серным эфиром в присутствии сернокислого натрия, введение экстракта в испаритель хроматографа и разделение на колонке из нержавеющей стали длиной 3 метра с внутренним диаметром 3 мм, заполненную 5%-ным полиэтиленгликолятадипинатом на хромосорбе, модифицированым 2% Н3РO4. (Тамм А. О. и др. Метаболиты кишечной микрофлоры в диагностике дисбиоза. В журнале "Антибиотики и медицинская биотехнология". Т. 32, 3, 1987, с. 191-195).
Известен способ, предусматривающий разделение смеси жирных кислот фракции С2-С6 методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ), включающий пробоподготовку образца биологического субстрата путем добавления Н2SO4 до рН 2-3, перегонки с паром, добавление NaOH до рН 9-10, упаривания пробы, добавления серного эфира и H2SO4 до рН 3, введения подготовленного образца в виде эфирного раствора в испаритель хроматографа и разделение на колонке из нержавеющей стали длиной 1,2 м, внутренним диаметром 3 мм, заполненную неподвижной фазой (15% Carbowax 20M, модифицированной терефталевой кислотой (1,5%) на Chromaton с диаметром зерна 0,16-0,20 мм). (Комплексная диагностика, лечение и профилактика дисбактериоза (дисбиоза) в клинике внутренних болезней. Методические рекомендации МЦ УДПРФ под редакцией проф. Минушкина О.Н., проф. Минаева В.Н., Москва, 1997, с. 16-17).
Недостатками известных способов является сложность пробоподготовки, недостаточная степень разделения смеси кислот на фракции, содержащие индивидуальные кислоты, приводящие к появлению систематических ошибок в оценке концентраций кислот, особенно изомерных кислот.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ разделения смеси жирных кислот фракции С2-С7 методом газожидкостной хроматографии, включающий обработку пробы биологического субстрата водой или водным раствором хлористоводородной кислоты, или последовательно водой и кислотой, введения надосадочной жидкости в испаритель хроматографа и разделения на кварцевой капиллярной колонке длиной 30±1 метр с внутренним диаметром 0,25±0,02 мм, при этом в качестве неподвижной фазы используют пленку сополимера полиэтиленгликоля с 2-нитротерефталевой кислотой при толщине пленки 0,25 мкм (патент RU 2145511, кл. В 01 D 15/08, 20.02.2000).
Чувствительность этого способа недостаточна при малых пробах биологических объектов (меньших чем 2,0 г), а также в случаях низкого содержания кислот в биологических образцах.
Задачей настоящего изобретения является создание газохроматографического способа разделения жирных кислот фракции С2-С6 из биологических субстратов. Технический результат, который может быть достигнут при осуществлении способа, - увеличение чувствительности при малых пробах биологических объектов (меньших чем 2,0 г), а также в случаях низкого содержания кислот в биологических образцах при обеспечении высокой степени разделения.
Поставленная задача решается разделением смеси жирных кислот фракции С2-С6 методом газожидкостной хроматографии, включающим обработку пробы биологического субстрата водой или водным раствором реагента, введение надосадочной жидкости в испаритель хроматографа и разделение на кварцевой капиллярной колонке длиной 32-40 метров с внутренним диаметром 0,28-0,35 мм с использованием в качестве неподвижной фазы пленки сополимера полиэтиленгликоля с терефталевой кислотой. При этом используют пленку толщиной 0,26-0,35 мкм и температуру термостата поддерживают равной 145-155oС.
Определение содержания индивидуальных кислот в смеси осуществляются как путем расчета площадей хроматографических пиков методом "треугольника", так и методом компьютерной обработки хроматограмм.
Использование терефталевой кислоты для получения пленки сополимера с полиэтиленгликолем приводит к удешевлению стоимости колонок и проведению исследований (особенно в массовом масштабе) при сохранении хорошего разделения смесей, содержащих кислоты. В многолетней практике применения ГЖХ никто не использовал терефталевую кислоту для разделения и определения жидких смесей, содержащих короткоцепочечные жирные кислоты.
Увеличение длины колонки приводит к улучшению разделения кислот (коэффициент разделения R=1,9). Увеличение диаметра колонки позволяет нанести большую толщину фазы пленки (0,26-0,35 мкм), что приводит к увеличению чувствительности способа.
Это в свою очередь при введении большего количества исследуемого образца (0,9-1 мкл) позволяет определять кислоты в более низких концентрациях ("следовых"), находящихся в образце биоматериала (биоптаты слизистой оболочки толстой кишки, стерильная спинно-мозговая жидкость, вагинальные смывы).
Увеличение длины и диаметра колонки позволяет нанести большую толщину фазы пленки, что приводит к увеличению чувствительности способа и позволяет снизить вес исследуемого образца. В предлагаемом способе используют пробы вещества весом от 0,05 до 1,8 г (или 0,1-1,8 мл).
Уменьшение веса исследуемого образца до 0,05-0,1 г позволяет избежать многократных заборов материала (что важно особенно при инвазивных методах исследования (фиброскопия, спинномозговая пункция и т.д.), у тяжелых больных и детей и, кроме того, приводит к уменьшению расхода реактивов при пробоподготовке.
Обработку пробы образца проводят водой или раствором хлористоводородной кислоты (НСl) или последовательно водой и кислотой.
В частности, уменьшение объема пробы для анализа влечет за собой уменьшение объема НСl, что при сохранении хорошего разделения кислот обеспечивает "долговременность" использования неподвижной фазы.
При длинной колонке повышение температуры до 145-155oС способствует сокращению времени анализа до 8 минут при сохранении хорошего разделения кислот на фракции, включая их изомеры.
На фиг.1 представлена хроматограмма разделения кислот С2-С6 из стандартной смеси.
На фиг. 2-9 представлены хроматограммы разделения смесей кислот фракции С2-С6 из образцов: биоптата слизистой оболочки толстой кишки, интраоперационного образца аденокарциномы толстой кишки, фекалий, спинно-мозговой жидкости, вагинального смыва, слюны, асцитической жидкости, образца фекалий (без обработки пробы НСl).
Ниже приведены примеры разделения смеси жирных кислот фракции С2-С6 (с целью определения их содержания в различных биологических объектах), подтверждающие возможность осуществления способа, который не ограничивается ими.
Пример 1.
К пробе препарата (образца биоптата слизистой оболочки толстой кишки) весом 0,07 г приливают 0,5 мл дистиллированной воды и 0,1 мл стандартного раствора (для количественного определения содержания летучих жирных кислот), гомогенизируют, растирая в ступке, добавляют 0,1 мл 1 N НСl, центрифугируют при 4500 об/мин в течение 10 мин. Микрошприцем вводят пробу надосадочной жидкости в испаритель хроматографа с детектором ионизации в пламени, снабженном кварцевой капиллярной колонкой длиной 38 м с внутренним диаметром 0,33 мм, колонка в качестве неподвижной фазы содержит сополимер полиэтиленгликоля с терефталевой кислотой в виде пленки толщиной 0,34 мкм.
Режим работы хроматографа: изотермический с температурой термостата 155oС, температурой испарителя и детектора 230oС. Газ-носитель - азот с давлением на входе на входе в колонку 1,8 ати. Расход газа-носителя 2,0 мл/мин, воздуха 300 мл/мин. Соотношение потоков газа-носителя на сброс и в колонку 50: 1. Время хроматографирования около 8 мин. Результат разделения представлен на фиг. 2.
Пример 2.
К пробе препарата (интраоперационный образец аденокарциномы толстой кишки ) весом 0,15 г приливают 0,5 мл дистиллированной воды и 0,1 мл стандартного раствора, гомогенизируют, растирая в ступке, добавляют 0,1 мл 1 N НСl, центрифугируют при 4500 об/мин в течение 10 мин. Микрошприцем вводят пробы надосадочной жидкости в испаритель хроматографа.
Хроматографическое разделение проводят, как описано в примере 1, за исключением того, что разделение проводят на колонке длиной 37 м с внутренним диаметром 0,31 мм с неподвижной фазой в виде пленки толщиной 0,32 мкм при температуре термостата 150oС. Время хроматографирования 8 мин. Результат разделения представлен на фиг.3.
Пример 3.
К пробе препарата (образец фекалий) весом 1,2 г приливают 2 мл дистиллированной воды и 1 мл стандартного раствора, перемешивают путем встряхивания в течение 10 минут, добавляют 0,5 мл 1 N НСl, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 10 мин. Хроматографическое разделение проводят, как описано в примере 1, за исключением того, что используют колонку длиной 32 м с внутренним диаметром 0,29 мм с неподвижной фазой в виде пленки толщиной 0,28 мкм при температуре термостата 145oС. Время хроматографирования 8 мин.
Результат разделения представлен на фиг.4
Пример 4.
Пример 4.
Образец жидкого биологического субстрата (спинно-мозговая жидкость) 0,5 мл помещают в пробирку для центрифуги, приливают к содержимому 0,1 мл 6 N HCl и 0,1 мл стандартного раствора. Скоагулированные белки отделяют центрифугированием 4000 об/мин в течение 10 мин.
Хроматографическое разделение проводят, как описано в примере 1, за исключением того, что разделение проводят на колонке длиной 36 м с внутренним диаметром 0,32 мм с неподвижной фазой в виде пленки толщиной 0,33 мкм при температуре термостата 150oС. Время хроматографирования 8 мин.
Результаты разделения приведены на фиг. 5.
Примеры 5-7.
Образец жидкого биологического субстрата (вагинальный смыв, или слюна, или асцитическая жидкость) 1 мл помещают в пробирку для центрифуги, приливают к содержимому 0,2 мл 1 N HCl и 0,9 мл стандартного раствора. Скоагулированные белки отделяют центрифугированием 4000 об/мин в течение 10 мин. Хроматографическое разделение проводят, как описано в примере 1, за исключением того, что разделение проводят на колонке длиной 34 м с внутренним диаметром 0,29 мм с неподвижной фазой в виде пленки толщиной 0,31 мкм при температуре термостата 150oС. Время хроматографирования 8 мин.
Результаты разделения приведены на фиг. 6-8.
Пример 8 (без обработки биосубстрата хлористоводородной кислотой).
К пробе препарата (образец фекалий) весом 0,5 г приливают 1 мл дистиллированной воды и 1 мл стандартного раствора, перемешивают путем встряхивания в течение 10 минут, центрифугируют при 6000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость вводят в испаритель хроматографа и ведут разделение при тех же условиях хроматографирования, как в примере 3.
Результаты разделения приведены на фиг. 9.
Кислоты на хроматограммах представлены в виде четких пиков, пригодных для точного расчета их содержания в анализируемых образцах. Для сравнения на фиг 1. представлена хроматограмма разделения кислот С2-С6 из стандартной смеси.
Достоверность способа подтверждена в контрольных опытах на модельных смесях кислот. Ошибка не превышала 2-4%. Чувствительность методики 96±2%. Воспроизводимость результатов 98±2%.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет достигнуть увеличения чувствительности при малых пробах биологических объектов (меньших чем 2,0 г), а также в случаях низкого содержания кислот в биологических образцах при обеспечении высокой степени разделения. Кроме того, обеспечивается удешевление способа разделения смеси жирных кислот фракции С2-С6 (за счет использования неподвижной фазы сополимера полиэтиленгликоля с терефталевой кислотой).
Claims (4)
1. Способ разделения смеси жирных кислот фракции С2-С6 методом газожидкостной хроматографии, включающий обработку пробы биологического субстрата, введение образца пробы в испаритель хроматографа и разделение на колонке с неподвижной фазой, отличающийся тем, что в качестве неподвижной фазы используют сополимер полиэтиленгликоля с терефталевой кислотой.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сополимер полиэтиленгликоля с терефталевой кислотой используют в виде пленки толщиной 0,26-0,35 мкм.
3. Способ по любому из пп.1-2, отличающийся тем, что разделение проводят на кварцевой капиллярной колонке длиной 32-40 м, внутренним диаметром 0,28-0,35 мм.
4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что при разделении на колонке температуру поддерживают равной 145-155°С.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2002119447/15A RU2220755C1 (ru) | 2002-07-23 | 2002-07-23 | Способ разделения смеси жирных кислот фракции c2-c6 методом газожидкостной хроматографии |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2002119447/15A RU2220755C1 (ru) | 2002-07-23 | 2002-07-23 | Способ разделения смеси жирных кислот фракции c2-c6 методом газожидкостной хроматографии |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2220755C1 true RU2220755C1 (ru) | 2004-01-10 |
RU2002119447A RU2002119447A (ru) | 2004-02-27 |
Family
ID=32091375
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2002119447/15A RU2220755C1 (ru) | 2002-07-23 | 2002-07-23 | Способ разделения смеси жирных кислот фракции c2-c6 методом газожидкостной хроматографии |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2220755C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2473902C1 (ru) * | 2011-05-20 | 2013-01-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России) | Газохроматографический способ оценки дисбиотических состояний ротоглотки у детей |
-
2002
- 2002-07-23 RU RU2002119447/15A patent/RU2220755C1/ru not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2473902C1 (ru) * | 2011-05-20 | 2013-01-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России) | Газохроматографический способ оценки дисбиотических состояний ротоглотки у детей |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2002119447A (ru) | 2004-02-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Lord et al. | Microextraction of drugs | |
Elmongy et al. | Saliva as an alternative specimen to plasma for drug bioanalysis: A review | |
Zlatkis et al. | The role of organic volatile profiles in clinical diagnosis. | |
Nikolin et al. | High perfomance liquid chromatography in pharmaceutical analyses | |
MAuNsELL et al. | Routine isotope-dilution liquid chromatography–tandem mass spectrometry assay for simultaneous measurement of the 25-hydroxy metabolites of vitamins D2 and D3 | |
Mills et al. | Headspace solid-phase microextraction procedures for gas chromatographic analysis of biological fluids and materials | |
Miwa et al. | High-performance liquid chromatographic analysis of serum long-chain fatty acids by direct derivatization method | |
Woollard et al. | The analysis of pantothenic acid in milk and infant formulas by HPLC | |
Teerlink | Determination of the endogenous nitric oxide synthase inhibitor asymmetric dimethylarginine in biological samples by HPLC | |
ES2232819T3 (es) | Metodo de examen clinico basado en las estructuras de oligosacaridos unidos a inmunoglobina g. | |
Ponce-Rodríguez et al. | On-line in-tube solid phase microextraction coupled to capillary liquid chromatography-diode array detection for the analysis of caffeine and its metabolites in small amounts of biological samples | |
Iadarola et al. | Recent applications of CE‐and HPLC‐MS in the analysis of human fluids | |
Viktora et al. | New automated fluorometric methods for estimation of small amounts of adrenaline and noradrenaline | |
Wang et al. | Integration of phase separation with ultrasound-assisted salt-induced liquid–liquid microextraction for analyzing the fluoroquinones in human body fluids by liquid chromatography | |
Spichiger et al. | Determination of menthol in plasma and urine of rats and humans by headspace solid phase microextraction and gas chromatography–mass spectrometry | |
JP7019372B2 (ja) | ビタミンd代謝物の選択的測定法 | |
Grunbaum et al. | Studies in histochemistry. XLV. Determination of hydroxyproline in microgram amounts of tissue | |
Maruyama et al. | Analysis of conjugated bile acids in bile by high-pressure liquid chromatography | |
RU2220755C1 (ru) | Способ разделения смеси жирных кислот фракции c2-c6 методом газожидкостной хроматографии | |
Mechanic et al. | A rapid quantitative estimation of tyrosine and phenylalanine by ion-exchange chromatography | |
Tagawa et al. | Simultaneous determination of estriol and estriol 3-sulfate in serum by column-switching semi-micro high-performance liquid chromatography with ultraviolet and electrochemical detection | |
RU2145511C1 (ru) | Способ разделения смеси жирных кислот фракции c2 - c7 методом газожидкостной хроматографии | |
Mehta | Therapeutic monitoring of free (unbound) drug levels: analytical aspects | |
Huggett et al. | Rapid micro-method for the measurement of paracetamol in blood plasma or serum using gas-liquid chromatography with flame-ionisation detection | |
Schöneshöfer et al. | Automated liquid chromatographic determination of the 20-dihydro isomers of cortisol and cortisone in human urine |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20080724 |
|
NF4A | Reinstatement of patent |
Effective date: 20100627 |
|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20100724 |