RU2220200C1

RU2220200C1 - Method for preparing testicle cell primary culture enriched with leidig's cells

Info

Publication number: RU2220200C1
Application number: RU2002112799/13A
Authority: RU
Inventors: Г.Н. Огудина; Е.И. Зарайский; А.А. Артюхин; А.И. Романов; Д.Ю. Будаков
Original assignee: Зарайский Евгений Ильич
Priority date: 2002-05-16
Filing date: 2002-05-16
Publication date: 2003-12-27

Abstract

FIELD: biology, cytology. SUBSTANCE: method involves using 0.1-0.2% collagenase solution containing 0.01-1% of DNase. Cells are cultured in DMEM medium containing 20% of calf embryo serum. Method provides preparing the monolayer of testicle primary cells enriched with Leidig's cells with viability 97-99%. EFFECT: improved preparing method. 1 tbl, 1 ex

Description

Изобретение относится к цитологии. The invention relates to cytology.

Цель изобретения - получение первичной культуры клеток семенника, обогащенной клетками Лейдига с помощью дезагрегации ткани непротеолитическими ферментами. The purpose of the invention is to obtain a primary culture of testis cells enriched in Leydig cells using tissue disaggregation with non-proteolytic enzymes.

Известен способ получения тканевой культуры семенника свиньи с использованием семенников взрослых животных ("Методика получения культуры клеток свиньи". Методические рекомендации. М., 1987). Однако в связи с тем, что в отличие от пре- и неонатальных семенников, в которых содержится до 50% клеток Лейдига, в семенниках взрослых животных их содержание не превышает 5-10% клеток Лейдига, данный способ низкоэффективен. A known method of obtaining tissue culture of the testis of a pig using the testes of adult animals ("Method for obtaining a culture of pig cells". Methodological recommendations. M., 1987). However, due to the fact that, unlike pre- and neonatal testes, which contain up to 50% of Leydig cells, in the testes of adult animals their content does not exceed 5-10% of Leydig cells, this method is ineffective.

Известен способ получения культуры клеток Лейдига с использованием дезагрегирующей смеси, содержащей протеолитические ферменты (Дендеберов Е.С. "Культуральная аллотрансплантация неонатальных эндокриноцитов семенников". Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата мед. наук. М., 1993). Однако выход живых клеток при таком методе не превышает 50-60%. A known method of obtaining a Leydig cell culture using a disaggregating mixture containing proteolytic enzymes (Dendeberov ES "Cultural allotransplantation of neonatal endocrinocytes of the testes." Abstract of the dissertation for the degree of candidate of medical science. M., 1993). However, the yield of living cells with this method does not exceed 50-60%.

Известен способ получения культуры эмбриональных клеток Лейдига, наиболее близкий к предложенному и взятый нами за прототип (Басмаджян М.Е., Геворкян В.И., Кирпатовский И.Д. и др. "Способ получения культуры эмбриональных клеток Лейдига", Авторское свидетельство SU 1317305). Способ осуществляли, диссоциируя ткань с помощью дезагрегирующей смеси, содержащей 0,2% раствора коллалитина с добавлением 23 мг раствора Версена на 100 мл смеси. Полученные клетки культивировали в ростовой среде, состоящей из равных объемов среды 199 и гидролизата лактальбумина с добавлением 20% сыворотки крупного рогатого скота. Однако в связи с этическими проблемами, связанными с использованием эмбриональных тканей человека, а также с опасностью заражения культур человеческими вирусами, в первую очередь вирусных гепатитов и СПИДа, данный способ имеет ограниченные возможности применения. A known method of obtaining a culture of Leydig embryonic cells, closest to the proposed and taken as a prototype (Basmadzhyan M.E., Gevorkyan V.I., Kirpatovsky I.D. et al. "Method for producing a culture of Leydig embryonic cells", Copyright certificate SU 1317305). The method was carried out by dissociating the tissue using a disaggregating mixture containing 0.2% collalitin solution with the addition of 23 mg Versen solution per 100 ml of the mixture. The obtained cells were cultured in a growth medium consisting of equal volumes of 199 medium and a lactalbumin hydrolyzate with the addition of 20% cattle serum. However, due to the ethical problems associated with the use of human embryonic tissues, as well as the risk of infection of cultures with human viruses, primarily viral hepatitis and AIDS, this method has limited application possibilities.

Задачей изобретения является разработка способа получения первичной культуры клеток семенника, обогащенной клетками Лейдига, обладающей высокой жизнеспособностью. The objective of the invention is to develop a method for obtaining a primary culture of testis cells enriched in Leydig cells with high viability.

Способ осуществляли следующим образом. The method was carried out as follows.

Семенники извлекали у пре- или неонатальных плодов животных в стерильных условиях и помещали во флакон, содержащий 20 мл среды RPMI 1640 с добавлением антибиотиков (пенициллина, стрептомицина, канамицина и фунгизона). После пятиминутной отмывки семенники переносили в следующий флакон с аналогичным содержимым. Процедуру повторяли три раза. The testes were removed from pre- or neonatal animal fetuses under sterile conditions and placed in a vial containing 20 ml of RPMI 1640 medium supplemented with antibiotics (penicillin, streptomycin, kanamycin and fungicone). After a five-minute wash, the testes were transferred to the next vial with the same contents. The procedure was repeated three times.

Затем семенники переносили в стерильную чашку Петри, содержащую 10 мл среды RPMI 1640 с добавлением антибиотиков (пенициллина, стрептомицина, канамицина и фунгизона). Then the testes were transferred to a sterile Petri dish containing 10 ml of RPMI 1640 medium supplemented with antibiotics (penicillin, streptomycin, kanamycin and fungicone).

После удаления соединительной наружной оболочки и придатков содержимое белочной оболочки выдавливали пинцетом, расстригали на куски, размером 1-3 мм и с помощью пипетки переносили во флакон, содержащий 10 мл дезагрегирующей смеси, состоящей из среды DMEM с 0,1-2% раствора коллагеназы и 0,01-1% ДНК-азы. При понижении концентрации коллагеназы ниже 0,1% и концентрации ДНК-азы ниже 0,01% снижался выход клеток из ткани. При повышении концентрации коллагеназы выше 2% и ДНК-азы выше 1% понижалась жизнеспособность клеток. Флакон помещали в СО₂ инкубатор при температуре 37^oС и содержании СО₂, равном 6%. Культуру инкубировали 30-60 минут, мягко покачивая каждые 5 минут. Каждые 10 минут производили отбор выходящих клеток и перевод их в культуру. Из каждой порции отбирали аликвоту и проводили контроль количества и жизнеспособности клеток в камере Горяева с окраской трипановым синим или акридиновым желтым. Как только жизнеспособность клеток понижалась до 95-97%, процедуру прекращали. Суспензию клеток фильтровали через капроновый фильтр и отмывали от ферментов двукратным центрифугированием в стерильных полипропиленовых пробирках, содержащих 50 мл среды RPMI 1640 с добавлением антибиотиков (пенициллина, стрептомицина, канамицина и фунгизона) и 5% эмбриональной сыворотки теленка. Цетрифугирование проводили в рефрижераторной центрифуге при 800-900 об/мин, в течение 10 мин.After removal of the connective external membrane and appendages, the contents of the protein membrane were squeezed out with tweezers, cut to pieces 1-3 mm in size and pipetted into a vial containing 10 ml of a disaggregating mixture consisting of DMEM medium with a 0.1-2% collagenase solution and 0.01-1% DNAase. With a decrease in the concentration of collagenase below 0.1% and a concentration of DNAase below 0.01%, the yield of cells from the tissue decreased. With an increase in collagenase concentration above 2% and DNAase above 1%, cell viability decreased. The vial was placed in a CO ₂ incubator at a temperature of 37 ^{° C.} and a CO ₂ content of 6%. The culture was incubated for 30-60 minutes, gently shaking every 5 minutes. Every 10 minutes, outgoing cells were selected and transferred to culture. An aliquot was taken from each portion and the number and viability of cells in the Goryaev chamber were monitored with trypan blue or acridine yellow. As soon as cell viability was reduced to 95-97%, the procedure was stopped. The cell suspension was filtered through a nylon filter and washed from the enzymes by double centrifugation in sterile polypropylene tubes containing 50 ml of RPMI 1640 medium supplemented with antibiotics (penicillin, streptomycin, kanamycin and fungicone) and 5% calf fetal serum. Centrifugation was carried out in a refrigerated centrifuge at 800-900 rpm for 10 minutes

Осадок ресуспендировали в 5 мл среды DMEM, содержащей глютамин и 20% эмбриональной сыворотки теленка. Жизнеспособность и количество клеток подсчитывали в камере Горяева. Если жизнеспособность клеток была ниже 95%, то такие культуры не использовали. Клетки рассевали на пластиковые флаконы в концентрации 200-800 тыс. клеток на 1 мл и культивировали в СО₂ инкубаторе при температуре 37^oС и содержании СО₂, равном 6%. Наличие клеток Лейдига определяли окрашиванием культур судановыми красителями.The pellet was resuspended in 5 ml of DMEM medium containing glutamine and 20% fetal calf serum. Viability and cell number were counted in a Goryaev’s chamber. If cell viability was below 95%, then such cultures were not used. The cells were scattered on plastic bottles at a concentration of 200-800 thousand cells per 1 ml and cultured in a CO ₂ incubator at a temperature of 37 ^° C and a CO ₂ content of 6%. The presence of Leydig cells was determined by staining the cultures with Sudan dyes.

Пример. В качестве источника получения клеток Лейдига семенников использовали неонатальную ткань семенника однодневного поросенка. Дезагрегацию предварительно измельченной ткани проводили смесью, содержащей среду DMEM с 2% раствором коллагеназы и 0,1% ДНК-азы. Example. The neonatal tissue of the one-day-old piglet testis was used as a source of testicular Leydig cells. Pre-crushed tissue was disaggregated using a mixture containing DMEM medium with a 2% collagenase solution and 0.1% DNAase.

Рассев клеток проводили при посевной дозе 500 тыс. клеток на 1 мл в среде DMEM с глютамином, содержащей 20% эмбриональной телячьей сыворотки по 3,5 мл во флакон и культивировали при 37^oС в атмосфере 6% СО₂. Через 6-8 часов клетки прикреплялись к пластику, а через 10-16 часов распластывались и начинали расти.Cells were seeded at a seeding dose of 500 thousand cells per 1 ml in glutamine-containing DMEM medium containing 20% fetal calf serum, 3.5 ml each in a vial and cultured at 37 ^° C in an atmosphere of 6% CO ₂ . After 6-8 hours, the cells attached to the plastic, and after 10-16 hours they spread and began to grow.

Монослой образовывался через 36-48 часов. К этому времени он состоял в основном из клеток полигонального типа, богатых мелкозернистым материалом и вакуольными включениями, положительно окрашивающимися судановыми красителями. A monolayer was formed after 36-48 hours. By this time, it consisted mainly of polygonal cells, rich in fine-grained material and vacuole inclusions, positively stained with Sudan dyes.

Жизнеспособность клеток в культуре составляла 97-99%. Зависимость жизнеспособности и выхода клеток семенника от способа дезагрегации и культуральных сред представлена в таблице. Из таблицы видно, что применение в качестве дезагрегирующего агента коллагеназы в концентрации 0,1-2% и ДНК-азы в концентрации 0,01-0,1% позволяет добиться наибольшей жизнеспособности клеток, но наибольший выход при этом получали в варианте с 2% коллагеназы, 0,1% ДНК-азы, отмывкой в RPMI-1640 с 5% эмбриональной сыворотки теленка и культивировании в среде DMEM с 20% эмбриональной сыворотки теленка. Использование других концентраций дезагрегирующего агента, уменьшение концентрации сыворотки в отмывочной среде и использование для культивированния других сред, в том числе и среды, предложенной в прототипе, приводило к понижению жизнеспособности и/или к уменьшению выхода клеток. Cell viability in the culture was 97-99%. The dependence of the viability and yield of testis cells on the method of disaggregation and culture media is presented in the table. The table shows that the use of collagenase as a disaggregating agent at a concentration of 0.1-2% and DNAase at a concentration of 0.01-0.1% allows to achieve the highest cell viability, but the highest yield was obtained in the variant with 2% collagenase, 0.1% DNAase, washing in RPMI-1640 with 5% fetal calf serum and culturing in DMEM medium with 20% fetal calf serum. The use of other concentrations of the disaggregating agent, a decrease in the concentration of serum in the washing medium, and the use of other media for culturing, including the medium proposed in the prototype, led to a decrease in viability and / or to a decrease in cell yield.

Claims

A method of obtaining a primary culture of testis cells enriched in Leydig cells by grinding testis tissue, disaggregating it in a solution containing enzymes dissociating tissue, and culturing in a medium containing serum, characterized in that 0.1-2% is used as a disaggregating liquid a collagenase solution containing 0.01-1% DNA, washing from enzymes is carried out in RPMI 1640 medium containing 5% fetal calf serum, the cells are selected and transferred to the culture medium for the entire duration of the disaggregation tion, cultivation is carried out in DMEM medium containing 20% fetal calf serum, which allows to obtain a testis cell culture enriched with Leydig cells with a viability of 97-99%.