RU2039816C1

RU2039816C1 - Preparation for detaching contact-dependent cells from substrate

Info

Publication number: RU2039816C1
Application number: SU925065876A
Authority: RU
Inventors: В.В. Архипов; Т.А. Муранова; И.Г. Швыркова; А.И. Рыкунова
Original assignee: Филиал Института биоорганической химии им.М.М.Шемякина РАН
Priority date: 1992-08-05
Filing date: 1992-08-05
Publication date: 1995-07-20
Also published as: WO1994003586A1

Abstract

FIELD: biology; cytology. SUBSTANCE: plasminogen of mammals is useable as a preparation for detaching contact-dependent animal and human body cells from a substrate and disaggregating them in a cell culture. When used, plasminogen of mammals enables cells with intact cytoplasmic membranes to be cultured in large quantities. EFFECT: cell vitality close to 100% high speed of cell proliferation; high production output from limited quantity of raw materials. 1 tbl

Description

Изобретение относится к технике культивирования клеток млекопитающих. Изобретение может быть использовано в биологии, биотехнологии и медицине. The invention relates to techniques for the cultivation of mammalian cells. The invention can be used in biology, biotechnology and medicine.

Известно использование протеолитических ферментов и (или) хелатрующих агентов (ЭДТА) для отделения клеток от подложки с целью их дезагрегации. It is known to use proteolytic enzymes and (or) chelating agents (EDTA) to separate cells from a substrate in order to disaggregate them.

Недостатком этих препаратов является то, что они сильно повреждают клетки, особенно плазматическую мембрану, удаляя с ее поверхности важные компоненты или повреждая их. Согласно известным исследованиям обработка клеток при пересевах этими препаратами приводит к частичному разрушению клеточной мембраны, ядерной оболочки, деформации ядра, вакуолизации цитоплазмы и перераспределению гетерохроматина. The disadvantage of these drugs is that they severely damage cells, especially the plasma membrane, removing important components from its surface or damaging them. According to well-known studies, treatment of cells during passages with these drugs leads to partial destruction of the cell membrane, nuclear membrane, deformation of the nucleus, vacuolization of the cytoplasm and redistribution of heterochromatin.

Известно применение раствора трипсина в качестве препарата для дезагрегации клеток в культуре. It is known to use trypsin solution as a preparation for cell disaggregation in culture.

Сфера действия трипсина распространяется практически на все белки, с которыми он контактирует, в том числе на поверхностные белки клеточной мембраны. Это приводит к значительным структурным и функциональным изменениям в клетках, регистрируемым в течение суток после пересева клеток с использованием трипсина. Периодическое повторение этих повреждений в процессе дальнейшего пассирования клеток приводит либо к их дегенерации, либо к трансформации. Это исключает возможность использования таких клеток как для исследовательских целей, так и для практического применения (например, для введения в организм реципиента в составе искусственного органа, поскольку это может вызвать у пациента онкологическое заболевание). The scope of trypsin extends to almost all the proteins with which it is in contact, including the surface proteins of the cell membrane. This leads to significant structural and functional changes in the cells, recorded within a day after cell reseeding using trypsin. The periodic repetition of these injuries during the further passage of cells leads either to their degeneration or to transformation. This excludes the possibility of using such cells both for research purposes and for practical use (for example, for introducing a recipient into the body as part of an artificial organ, since this can cause cancer in a patient).

Целью изобретения является повышение жизнеспособности и сохранение нормальных функций культивируемых клеток в процессе их пассирования. The aim of the invention is to increase the viability and preservation of normal functions of cultured cells in the process of their passage.

Это достигается применением плазминогена млекопитающих для дезагрегации клеток в культуре (на примере плазминогена собаки, быка и человека). This is achieved by the use of mammalian plasminogen for cell disaggregation in culture (for example, plasminogen dog, bull and human).

Изобретение основано на впервые установленной способности плазминогена млекопитающих в концентрациях, близких к физиологическим, влиять на адгезионные взаимодействия между клеткой и подложкой, и между клетками. Плазминоген является предшественником специфического протеолитического фермента плазмина. Плазмин может образовываться в культуре из плазминогена вследствие активации последнего активаторами, экспрессируемыми культивируемыми клетками. The invention is based on the first established ability of mammalian plasminogen in concentrations close to physiological to influence the adhesive interactions between the cell and the substrate, and between cells. Plasminogen is the precursor of the specific proteolytic enzyme plasmin. Plasmin can be formed in culture from plasminogen due to activation of the latter by activators expressed by cultured cells.

Анализ патентной у научно-технической литературы показал, что неизвестно какое-либо использование плазминогена млекопитающих (также и плазмина) для дезагрегации клеток, в том числе и в культуре. Поэтому можно сделать вывод, что предлагаемое техническое решение может быть квалифицировано как применение известного вещества по новому назначению. An analysis of the patent in scientific and technical literature showed that it is not known any use of mammalian plasminogen (also plasmin) for cell disaggregation, including in culture. Therefore, we can conclude that the proposed technical solution can be qualified as the use of a known substance for a new purpose.

Предлагаемый препарат обеспечивает следующие преимущества по сравнению с результатами, получаемыми при использовании протеолитических ферментов трипсина и коллагеназы для дезагрегации клеток:
увеличение процента жизнеспособных клеток;
увеличение скорости их распластывания;
увеличение пролиферативного периода жизни клеток в культуре.The proposed drug provides the following advantages compared with the results obtained using proteolytic enzymes trypsin and collagenase for cell disaggregation:
increase in the percentage of viable cells;
an increase in the speed of their spreading;
an increase in the proliferative period of cell life in culture.

Указанные преимущества подтверждаются данными, приведенными в таблице. The indicated advantages are confirmed by the data given in the table.

Ниже приведены примеры конкретного выполнения. Во всех примерах использовали плазминоген, выделенный из сыворотки крови соответствующих млекопитающих по известному методу. Плазминоген представлял собой электрофоретически чистый препарат. Белок идентифицировали определением N-концевой аминокислотной последовательности автоматическим методом Эдмана. The following are examples of specific implementation. In all examples, plasminogen isolated from the blood serum of the respective mammals was used according to a known method. Plasminogen was an electrophoretically pure preparation. The protein was identified by the determination of the N-terminal amino acid sequence by the automatic Edman method.

П р и м е р 1. Клетки ВНК-21 выращивали до образования монослоя в пластиковых флаконах (50 мл, фирма "Greiner") в среде DMEM (фирма "Sigma"), содержащей 10% бычьей сыворотки (Минский завод). В опытных культурах отделение клеток проводили при помощи плазминогена собаки, в контрольных культурах при помощи коммерческого 0,25%-ного раствора трипсина. В опытные культуры после удаления из флаконов старой среды вносили по 6 мл свежей среды DMEM без сыворотки, затем добавляли по 0,3 мл раствора плазминогена (1 мг/мл) в солевом буфере. Далее культуры инкубировали в термостате (СО₂-инкубатор) при 37^оС в течение 4,5 ч. После этого флаконы встряхивали, что приводило к откреплению монослоя клеток. Содержимое флакона пипетировали до образования суспензии единичных клеток. Проба трипановым синим показала, что 98% клеток являются жизнеспособными. 1 мл клеточной суспензии переносили в новый флакон, содержащий 6,2 мл среды DMEM и 0,8 мл бычьей сыворотки, помещали в термостат при 37^оС для дальнейшего культивирования. Время распластывания клеток составляло 70 мин.EXAMPLE 1. VNK-21 cells were grown to form a monolayer in plastic bottles (50 ml, Greiner company) in DMEM medium (Sigma company) containing 10% bovine serum (Minsk Plant). In experimental cultures, cell separation was performed using dog plasminogen, in control cultures using commercial 0.25% trypsin solution. After removal of old medium from vials, 6 ml of fresh DMEM medium without serum were added to the experimental cultures, then 0.3 ml of a plasminogen solution (1 mg / ml) in saline buffer was added. Next the cultures were incubated in an incubator (CO ₂ incubator) at 37 ^{° C} for 4.5 hours. The vials were shaken, leading to detachment of the monolayer cells. The contents of the vial were pipetted to a single cell suspension. A trypan blue test showed that 98% of the cells are viable. 1 ml cell suspension was transferred to a new vial containing 6.2 ml of DMEM medium and 0.8 ml of bovine serum was placed in a thermostat at ³⁷ ° C for further cultivation. Cell spreading time was 70 min.

В контрольные культуры после удаления старой среды вносили по 6 мл предварительно нагретого до 37^оС, 0,25%-ного раствора трипсина и инкубировали 2 мин. Затем раствор трипсина сливали, клетки инубировали при 37^оС в течение нескольких минут до открепления монослоя клеток после встряхивания. Во флаконы вносили по 8 мл среды DMEM, содержащей 10% бычьей сыворотки. Содержимое флаконов пипетировали до получения суспензии единичных клеток. Проба трипановым синим показала, что 84% клеток являются жизнеспособными. Далее по 1 мл клеточной суспензии вносили во флаконы, содержащие по 7 мл среды DMEM с 10% бычьей сыворотки для дальнейшего культивирования. Время распластывания клеток составляло 150 мин.After removing the old medium, 6 ml of 0.25% trypsin solution preheated to 37 ^° C were added to the control cultures and incubated for 2 min. Then trypsin solution was decanted, the cells inubirovali at ³⁷ ° C for several minutes to detach the cells monolayer after shaking. 8 ml DMEM medium containing 10% bovine serum was added to the vials. The contents of the vials were pipetted to obtain a suspension of single cells. A trypan blue test showed that 84% of the cells are viable. Then, 1 ml of the cell suspension was introduced into vials containing 7 ml of DMEM medium with 10% bovine serum for further cultivation. Cell spreading time was 150 min.

В случае использования плазминогена собаки клетки ВНК-21 прошли 19 пассажей и сохранили при этом типичную морфологию, соответствующую исходной культуре. Для наблюдения за морфологией клеток использовали световой микроскоп. Не зарегистрированы изменения скорости распластывания клеток и времени образования слитого монослоя (то есть скорости роста) на протяжении всех пересевов. In the case of using the plasminogen of the dog, BHK-21 cells went through 19 passages and retained the typical morphology corresponding to the initial culture. A light microscope was used to monitor cell morphology. No changes in the rate of spreading of the cells and the time of formation of the fused monolayer (i.e., growth rate) during all transfers were recorded.

При использовании при пересевах клеток трипсина после 10 пассажа клетки не образовывали слитого монослоя и после 12 пересева дегенерировали. When using trypsin during transplantation of cells after passage 10, the cells did not form a fused monolayer and degenerated after 12 reseeding.

П р и м е р 2. Эндотелиальные клетки аорты собаки (2 пассаж) культивировали в двух пластиковых флаконах (50 мл, фирма "Greiner") в среде DMEM (фирма "Sigma"), содержащей 20% эмбриональной сыворотки коровы, с добавкой инсулина и гепарина. После удаления старой среды в опытный флакон вносили 4 мл среды DMEM без сыворотки и добавляли 0,5 мл раствора плазминогена собаки (1 мг/мл) в солевом буфере. Клетки инкубировали 5 ч при 37^оС. После этого флаконы встряхивали и отделившийся монослой пипетировали для получения суспензии единичных клеток. Проба трипановым синим показала, что жизнеспособными являются 94% клеток. Для дальнейшего культивирования 2 мл клеточной суспензии переносили во флакон с 4 мл среды DMEM и 1,5 мл эмбриональной сыворотки коровы. Время распластывания клеток составляло 5 ч.Example 2. Dog aortic endothelial cells (passage 2) were cultured in two plastic bottles (50 ml, Greiner) in DMEM (Sigma) containing 20% fetal bovine serum with insulin supplementation and heparin. After removing the old medium, 4 ml of serum-free DMEM medium was added to the test vial and 0.5 ml of the dog plasminogen solution (1 mg / ml) in saline buffer was added. Cells were incubated for 5 hours at 37 ^C. Thereafter, the vials were shaken and separated the monolayer pipetted to obtain a single cell suspension. A trypan blue test showed that 94% of the cells were viable. For further cultivation, 2 ml of the cell suspension was transferred into a vial with 4 ml of DMEM medium and 1.5 ml of fetal bovine serum. Cell spreading time was 5 hours.

В контрольном флаконе отделение эндотелиальных клеток от подложки при пересевах проводили трипсином по методике, описанной в примере 1. После отделения монослоя клетки суспендировали в 4 мл среды DMEM, содержащей 20% эмбриональной сыворотки коровы. Проба трипановым синим показала, что 74% клеток являются жизнеспособными. Для дальнейшего культивирования 1,8 мл клеточной суспензии помещали во флакон, содержащий 5,7 мл среды DMEM с 20% эмбриональной сыворотки коровы. (Как и в случае использования плазминогена при пересевах конечный объем культуральной среды равен 7,5 мл при содержании в ней 20% сыворотки). Затем клетки помещали в термостат при 37^оС для дальнейшего культивирования. Время распластывания клеток составляло 14 ч.In a control vial, endothelial cells from the substrate were separated by transplantation using trypsin as described in Example 1. After separation of the monolayer, the cells were suspended in 4 ml of DMEM medium containing 20% fetal bovine serum. A trypan blue test showed that 74% of the cells are viable. For further cultivation, 1.8 ml of the cell suspension was placed in a vial containing 5.7 ml of DMEM medium with 20% fetal bovine serum. (As in the case of using plasminogen during transfers, the final volume of the culture medium is 7.5 ml with a content of 20% serum in it). Then the cells were placed in a thermostat at 37 ^about With for further cultivation. Cell spreading time was 14 hours.

П р и м е р 3. Для открепления клеток ВНК-21 от подложки и их дезагрегации использовали плазминоген из сыворотки крови быка. Концентрация плазминогена в исходном растворе была равна 4 мг/мл, а не 1 мг/мл, как в случае использования плазминогена из сыворотки крови собаки, что обусловлено более низкой антиадгезионной активностью плазминогена быка. Все остальные условия соответствуют условиям, описанным в примере 1. Время распластывания открепленных клеток при повторном культивировании составляло 70 мин. Example 3. For detachment of BHK-21 cells from the substrate and their disaggregation, plasminogen from bovine serum was used. The concentration of plasminogen in the initial solution was 4 mg / ml, and not 1 mg / ml, as in the case of using plasminogen from dog blood serum, which is due to the lower release activity of the bovine plasminogen. All other conditions correspond to the conditions described in example 1. The spreading time of the detached cells during re-cultivation was 70 minutes

П р и м е р 4. Для открепления клеток ВНК-21 от подложки и получения их суспензии использовали плазминоген из сыворотки крови человека. Концентрация плазминогена в исходном растворе была равна 8 мг/мл. Все остальные условия соответствуют условиям, описанным в примере 1. После получения клеточной суспензии проба трипановым синим показала, что 97% клеток являются жизнеспособными. Время распластывания открепленных клеток при повторном культивировании составляло 80 мин. Example 4. For detachment of BHK-21 cells from the substrate and preparation of their suspension, plasminogen from human blood serum was used. The plasminogen concentration in the initial solution was 8 mg / ml. All other conditions correspond to the conditions described in example 1. After receiving the cell suspension, the trypan blue sample showed that 97% of the cells are viable. The spreading time of detached cells upon repeated cultivation was 80 minutes.

Использование плазминогена в сравнении с трипсином обеспечивает следующие преимущества:
возможность получения урожая клеток с интактными цитоплазматическими мембранами, о чем свидетельствует высокая скорость распластывания клеток, а также близкое к 100% количество жизнеспособных клеток после пересева;
увеличение пролиферативного периода жизни клеток, что делает возможным получение их в необходимом количестве из ограниченного источника. Это преимущество может быть использовано в биотехнологии для получения максимального урожая клеток из тканей экзотических животных с целью получения вакцин, а также в медицине для создания искусственных органов, включающих аутологичные клетки реципиента; снижение вероятности трансформации клеток при наращивании их биомассы с целью последующего введения их в том или ином виде в организм человека, например при обращивании аутогенными эндотелиальными клетками протезов сердечно-сосудистой системы. На примере клеток ВНК-21 показано, что при использовании трипсина заметная морфологическая трансформация клеток наблюдается уже к 10 пересеву, а при использовании плазминогена не наблюдается и после 19 пересевов.The use of plasminogen in comparison with trypsin provides the following advantages:
the possibility of obtaining a crop of cells with intact cytoplasmic membranes, as evidenced by the high speed of cell spreading, as well as close to 100% number of viable cells after reseeding;
an increase in the proliferative period of cell life, which makes it possible to obtain them in the required quantity from a limited source. This advantage can be used in biotechnology to obtain the maximum yield of cells from the tissues of exotic animals in order to obtain vaccines, as well as in medicine to create artificial organs, including autologous recipient cells; reducing the likelihood of transformation of cells during the growth of their biomass for the purpose of their subsequent introduction in one form or another into the human body, for example, when autogenous endothelial cells are treated with prostheses of the cardiovascular system. By the example of BHK-21 cells, it was shown that when using trypsin, a noticeable morphological transformation of cells is already observed by 10 passages, and when using plasminogen, it is not observed even after 19 passages.

Claims

The use of mammalian plasminogen as a drug for detaching contact-dependent cells from the substrate and disaggregating them in culture.