RU2202797C2 - Kit for detecting antibodies to the agent of poultry respiratory mycoplasmosis - Google Patents
Kit for detecting antibodies to the agent of poultry respiratory mycoplasmosis Download PDFInfo
- Publication number
- RU2202797C2 RU2202797C2 RU2001105775A RU2001105775A RU2202797C2 RU 2202797 C2 RU2202797 C2 RU 2202797C2 RU 2001105775 A RU2001105775 A RU 2001105775A RU 2001105775 A RU2001105775 A RU 2001105775A RU 2202797 C2 RU2202797 C2 RU 2202797C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dry
- chickens
- blood serum
- serum
- kit according
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области диагностики, ветеринарной микробиологии и биотехнологии, в частности к получению наборов для обнаружения антител к возбудителю респираторного микоплазмоза птиц (РМП) в иммуноферментном анализе (ИФА), и может быть использовано при диагностике РМП в научно-исследовательских учреждениях, региональных и областных ветеринарных лабораториях и при изготовлении указанных наборов на предприятиях биологической промышленности. The invention relates to the field of diagnostics, veterinary microbiology and biotechnology, in particular to the production of kits for detecting antibodies to the causative agent of respiratory mycoplasmosis of birds (RMP) in enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and can be used in the diagnosis of RMP in research institutions, regional and regional veterinary laboratories and in the manufacture of these kits at the enterprises of the biological industry.
РМП (хроническая респираторная болезнь, болезнь воздухоносного мешка инфекционный синусит индеек) - хроническое инфекционное заболевание кур, индеек, фазанов, цесарок, характеризующееся поражением дыхания, истощением и потерей продуктивности. Возбудитель заболевания - Mycoplasma gallicepticum (MG), относящийся к плевропневмонийной группе микроорганизмов. Известны и другие патогенные и условно патогенные виды микоплазм, например, Mycoplasma meleagridis, которую часто удается выделить от индеек. Mycoplasma gallisepticum - полиморфный кокк величиной от 0,5 мкм до 1 мкм. Источником возбудителя является больная птица, а также вакцина, приготовленная из инфицированных эмбрионов. Летальность от 5 до 40% заболевшего поголовья птиц. RMP (chronic respiratory disease, air sac disease infectious sinusitis of turkeys) is a chronic infectious disease of chickens, turkeys, pheasants, guinea fowl, characterized by respiratory failure, exhaustion and loss of productivity. The causative agent of the disease is Mycoplasma gallicepticum (MG), which belongs to the pleuropneumonia group of microorganisms. Other pathogenic and conditionally pathogenic types of mycoplasmas are also known, for example, Mycoplasma meleagridis, which is often isolated from turkeys. Mycoplasma gallisepticum is a polymorphic coccus with a size of 0.5 μm to 1 μm. The source of the pathogen is a sick bird, as well as a vaccine prepared from infected embryos. Mortality from 5 to 40% of the diseased number of birds.
Диагноз на РМП устанавливают на основании эпизоотологических, клинических и патолого-анатомических данных с обязательными серологическими исследованиями патологического материала и постановкой биопробы. РМП необходимо дифференцировать от колисептицемии, аспергиллеза, инфекционного трахеита и бронхита, гиповитаминоза А, для чего обычно применяют культуральные или серологические методы. Для обнаружения возбудителя РМП или специфических антител к нему, свидетельствующих о контакте птиц с микроорганизмом, используют различные серологические тесты. Такими тестами являются: реакция подавления роста, реакция агглютинации (РА), реакция задержки гемагглютинации (РЗГА), метод прямой флюоресценции антител (МПФА), иммуноферментный анализ (ИФА) /1, 2, 3, 4, 5, 6, 7/. The diagnosis of RMP is established on the basis of epizootological, clinical and pathological anatomical data with mandatory serological studies of the pathological material and staging of the bioassay. RMP must be differentiated from colisepticemia, aspergillosis, infectious tracheitis and bronchitis, hypovitaminosis A, for which cultural or serological methods are usually used. To detect the causative agent of RMP or specific antibodies to it, indicating contact of birds with the microorganism, various serological tests are used. Such tests are: growth suppression reaction, agglutination reaction (RA), hemagglutination inhibition reaction (RHCA), direct antibody fluorescence method (MPFA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) / 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 /.
Большинство методов, позволяющих контролировать уровень антител к возбудителю РМП в сыворотках крови птиц, а также присутствие антигена в биологических материалах, основано на ИФА /1, 2, 4, 8, 9/. Для выявления антител к возбудителю РМП и определения их концентрации в сыворотках крови получил распространение непрямой вариант ИФА, в котором исследуемый образец взаимодействует с антигеном, иммобилизованном на планшете из оптически прозрачного полимера с 96 лунками. Далее антитела в составе иммунных комплексов реагируют с конъюгатом. Результаты анализа с высокой точностью фиксируют средствами спектрофотометрии. Для обнаружения и оценки титра антигена возбудителя РМП в биологических материалах широко применяют непрямой сэндвич-вариант ИФА, при осуществлении которого исследуемый антиген вначале улавливается специфическими антителами, иммобилизованными на планшете, а затем выявляется детекторными антителами, с которыми взаимодействует конъюгат. Результаты анализа фиксируют также с помощью спектрофотометра. Most methods that allow you to control the level of antibodies to the causative agent of RMP in the blood serum of birds, as well as the presence of antigen in biological materials, based on ELISA / 1, 2, 4, 8, 9 /. To detect antibodies to the causative agent of RMP and determine their concentration in blood serum, an indirect ELISA was used, in which the test sample interacts with an antigen immobilized on a 96-well optically transparent polymer plate. Then antibodies in the composition of the immune complexes react with the conjugate. The results of the analysis are recorded with high accuracy by spectrophotometry. To detect and evaluate the titer of the RMP pathogen antigen in biological materials, an indirect ELISA sandwich variant is widely used, during which the test antigen is first captured by specific antibodies immobilized on a tablet, and then detected by detection antibodies with which the conjugate interacts. The analysis results are also recorded using a spectrophotometer.
Достоинством ИФА являются высокая чувствительность и специфичность, возможность проведения масштабных исследований в полевых условиях, оперативность проведения анализов, небольшие объемы исследуемых проб и возможность автоматизации практически всех стадий выполнения реакции, включая регистрацию и обработку получаемых результатов /8, 9/. The advantages of ELISA are high sensitivity and specificity, the ability to conduct large-scale field studies, the speed of analysis, small volumes of test samples and the ability to automate almost all stages of the reaction, including recording and processing the results / 8, 9 /.
В настоящее время фирмы, специализирующиеся на производстве средств для молекулярно-биологической диагностики, выпускают специальные наборы для проведения ИФА с целью обнаружения сывороточных антител к вирусам и микробам, вызывающим различные заболевания кур, в том числе и РМП. Currently, firms specializing in the production of molecular biological diagnostics produce special kits for ELISA to detect serum antibodies to viruses and microbes that cause various diseases of chickens, including RMP.
Известен набор для определения антител к возбудителю РМП в крови, сыворотке крови или яичном желтке (полуколичественный метод) в ИФА. Антиген возбудителя РМП нанесен отдельно на пластиковую гребенку. Реакция протекает внутри ячеек проявляющих пластин. В состав набора включены 3 карточки гребенки "Immunocomb", 3 проявляющие пластины, 3 листка бумаги для образцов с предварительно нанесенными дисками, 4 ланцета для взятия проб крови, 1 пинцет, 1 калибровочная цветовая шкала "CombScale", 1 пробирка с сывороткой для положительного контроля, 1 пробирка с сывороткой для отрицательного контроля, график "CombScore". Набор используется для оценки эффективности вакцинации, определения наиболее приемлемых сроков вакцинации и периодического серологического анализа стад с целью быстрой и эффективной диагностики заболеваний /10/. A known kit for determining antibodies to the causative agent of RMP in the blood, blood serum or egg yolk (semi-quantitative method) in ELISA. The antigen of the pathogen RMP is applied separately to a plastic comb. The reaction proceeds inside the cells of the developing plates. The kit includes 3 Immunocomb comb cards, 3 developing plates, 3 pieces of paper for samples with pre-applied discs, 4 lancets for taking blood samples, 1 tweezers, 1 calibration color scale "CombScale", 1 tube with serum for positive control , 1 tube with serum for negative control, graph "CombScore". The kit is used to assess the effectiveness of vaccination, determine the most appropriate timing of vaccination and periodic serological analysis of herds with the aim of quick and effective diagnosis of diseases / 10 /.
Известен набор для определения антител к возбудителю РМП в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген возбудителя РМП, иммобилизованный на твердом носителе, отрицательную сыворотку крови, положительную сыворотку крови к MG, антикуриный пероксидазный конъюгат, раствор для разведения и промывки сывороток и конъюгата, окрашивающий раствор 2,2'-азино-ди[3-этил] бензтиазолинсульфоновой кислоты (АБТС) и раствор, останавливающий окраску реакции - 5% SDS. Измерение оптической плотности проводят с использованием фильтра 405-410 нм. С помощью данного набора исследуют полевые сыворотки на наличие антител к возбудителю РМП и проводят количественную оценку титра антител /11/. A known kit for determining antibodies to the pathogen of RMP in ELISA, containing a purified and inactivated antigen of the pathogen of RMP immobilized on a solid carrier, negative blood serum, positive blood serum to MG, anti-chicken peroxidase conjugate, a solution for dilution and washing of serum and conjugate,
Известен набор для определения антител к возбудителю РМП в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген возбудителя РМП, иммобилизованный на твердом носителе, положительную сыворотку крови кур к возбудителю РМП, отрицательную сыворотку крови кур, щелочной фосфатазный конъюгат овечьих антител к куриным IgG, буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов (фосфатный буфер с белковыми стабилизаторами), субстратный буфер (диэтаноламиновый буфер с энзимфакторами), таблетки pNPP, останавливающий раствор. С помощью данного набора можно измерять уровень антител к возбудителю РМП в сыворотках крови кур /12/. A known kit for determining antibodies to the pathogen of RMP in ELISA, containing a purified and inactivated antigen of the pathogen of RMP immobilized on a solid carrier, positive blood serum of chickens to the pathogen of RMP, negative blood serum of chickens, alkaline phosphatase conjugate of sheep antibodies to chicken IgG, a buffer solution for breeding and washing of immunospecific components (phosphate buffer with protein stabilizers), substrate buffer (diethanolamine buffer with enzyme factors), pNPP tablets, stopping the solution. Using this kit, you can measure the level of antibodies to the causative agent of RMP in the blood serum of chickens / 12 /.
Известен набор для определения антител к возбудителю РМП в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген возбудителя РМП, иммобилизованный на твердом носителе, положительную сыворотку крови кур к возбудителю РМП, отрицательную сыворотку крови кур, препарат козьих антител к куриным IgG, конъюгированных с пероксидазой хрена, с гентамицином, буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов, буферный раствор для разведения концентрата субстрата ТМВ, останавливающий раствор. Данный набор позволяет измерять уровень антител к возбудителю РМП в сыворотках крови кур /13/. A known kit for determining antibodies to the pathogen of RMP in ELISA, containing a purified and inactivated antigen of the pathogen of RMP immobilized on a solid carrier, positive blood serum of chickens to the pathogen of RMP, negative blood serum of chickens, the preparation of goat antibodies to chicken IgG conjugated with horseradish peroxidase, s gentamicin, a buffer solution for dilution and washing of immunospecific components, a buffer solution for dilution of TMB substrate concentrate, stopping the solution. This kit allows you to measure the level of antibodies to the causative agent of RMP in the blood serum of chickens / 13 /.
Общим недостатком указанных наборов является то, что они импортные, что определяет высокую себестоимость соответствующих исследований. A common drawback of these sets is that they are imported, which determines the high cost of relevant studies.
Известен набор для определения антител к возбудителю РМП в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген возбудителя РМП, иммобилизованный на твердом носителе, положительную сыворотку крови кур к возбудителю РМП, отрицательную сыворотку крови кур, лиофильно высушенный антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов, субстратный буфер, детергент твин-20, краситель, 5-аминосалициловую кислоту, гидроперит (14). A known kit for determining antibodies to the pathogen of RMP in ELISA, containing purified and inactivated antigen of the pathogen of RMP immobilized on a solid carrier, positive blood serum of chickens to the pathogen of RMP, negative blood serum of chickens, freeze-dried antispecies immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins, buffer solution for dilution and washing of immunospecific components, substrate buffer, tween-20 detergent, dye, 5-aminosalicylic acid, hydroperite (14).
Недостатки данного набора состоят в его низкой активности и специфичности, а также высокой себестоимости изготовления. The disadvantages of this kit are its low activity and specificity, as well as the high cost of manufacturing.
Известен также карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2, который является органическим ионообменным веществом слабокислотного типа в натриевой форме. Известно его применение для селективного удаления небольших количеств двухвалентных катионов из смесей с большими концентрациями одновалентных катионов, для очистки катионного обмена (15). Also known is a carboxyl-containing cation exchanger KB-4P-2, which is an organic ion-exchange substance of a weakly acid type in sodium form. It is known for its use for the selective removal of small amounts of divalent cations from mixtures with high concentrations of monovalent cations, for the purification of cation exchange (15).
Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является набор для определения антител к возбудителю РМП в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген возбудителя РМП, иммобилизованный на твердом носителе, сухую положительную сыворотку крови кур к возбудителю РМП, сухую отрицательную сыворотку крови кур и сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов, субстратный буфер, краситель, детергент и гидроперит (16). The closest to the invention according to the set of essential features is a kit for determining antibodies to the pathogen of RMP in ELISA, containing a purified and inactivated antigen of the pathogen of RMP immobilized on a solid carrier, dry positive blood serum of chickens to the pathogen of RMP, dry negative blood serum of chickens and dry antiviral immunoperoxidase anti-chicken immunoglobulin conjugate, buffer solution for dilution and washing of immunospecific components, substrate buffer, dye, de ergent gidroperit and (16).
Недостатки набора - прототипа состоят в его низкой активности и специфичности, а также высокой себестоимости изготовления. Это объясняется тем, что в наборе-прототипе используются лиофилизованные биокомпоненты, сложность получения которых заключается в том, что для лиофилизации необходимо использовать оптимальные объемы нативного материала (минимум 0,5 см3), иначе невозможно получить оптимальную форму лиофилизованной "таблетки". Даже используя для лиофилизации такие минимальные объемы, существует опасность размораживания материала при загрузке и потери активности при высушивании, особенно конъюгата и специфической сыворотки. Процесс лиофилизации с предварительным замораживанием продолжается около 3 суток. Кроме того, при регидратации и разведении конъюгата до рабочего состояния, после использования излишки ценных биокомпонентов подвергают утилизации, так как они не подлежат хранению.The disadvantages of the prototype kit are its low activity and specificity, as well as the high cost of manufacturing. This is because the prototype kit uses lyophilized biocomponents, the difficulty of obtaining which is that for lyophilization it is necessary to use the optimal volumes of native material (minimum 0.5 cm 3 ), otherwise it is impossible to obtain the optimal form of the lyophilized “tablet”. Even using such minimal volumes for lyophilization, there is a danger of thawing of the material during loading and loss of activity during drying, especially the conjugate and specific serum. The freeze-drying process with preliminary freezing lasts about 3 days. In addition, during rehydration and dilution of the conjugate to a working state, after use, surpluses of valuable biocomponents are recycled, since they are not subject to storage.
В задачу создания настоящего изобретения входила разработка набора для определения антител к возбудителю РМП в ИФА, обладающего более высокой активностью и специфичностью и низкой себестоимостью изготовления. The task of creating the present invention was the development of a kit for the determination of antibodies to the causative agent of RMP in ELISA, which has higher activity and specificity and low manufacturing cost.
Технический результат от использования изобретения заключается в повышении активности и специфичности набора и снижении себестоимости его изготовления. The technical result from the use of the invention is to increase the activity and specificity of the kit and reduce the cost of its manufacture.
Указанный технический результат достигнут созданием изобретения, охарактеризованного следующей совокупностью признаков. The specified technical result is achieved by the creation of the invention, characterized by the following set of features.
1. Набор для определения антител к возбудителю РМП в ИФА. 1. A kit for determining antibodies to the causative agent of RMP in ELISA.
1.1. Очищенный инактивированный антиген возбудителя РМП, иммобилизованный на твердом носителе. 1.1. Purified inactivated RMP pathogen antigen immobilized on a solid support.
1.2. Сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 1.2. Dry positive blood serum of chickens to the pathogen RMP, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.
1.2.1. Сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Положительная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
1.2.2. Сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП, полученная контактным обезвоживанием.1.2.1. Dry positive blood serum of chickens to the pathogen RMP and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Positive serum - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
1.2.2. Dry positive blood serum of chickens to the pathogen RMP obtained by contact dehydration.
1.3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 1.3. Dry negative blood serum of chickens, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.
1.3.1. Сухая отрицательная сыворотка крови кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Отрицательная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
1.3.2. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, полученная контактным обезвоживанием.1.3.1. Dry negative blood serum of chickens and carboxyl-containing cation exchanger KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Negative Serum - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
1.3.2. Dry negative blood serum of chickens obtained by contact dehydration.
1.4. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащий карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 1.4. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.
1.4.1. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Антивидовой иммунопероксидазный конъюгат - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
1.4.2. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.1.4.1. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins and carboxyl-containing cation exchanger KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Anti-Immunoperoxidase Conjugate - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
1.4.2. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins obtained by contact dehydration.
1.5. Буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов. 1.5. Buffer solution for dilution and washing of immunospecific components.
1.5.1. В качестве буферного раствора для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор. 1.5.1. As a buffer solution for dilution and washing of immunospecific components, the kit contains a Tris buffer solution.
1.6. Субстратный буфер. 1.6. Substrate buffer.
1.6.1. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер. 1.6.1. As a substrate buffer, the kit contains a phosphate-citrate buffer.
1.7. Детергент. 1.7. Detergent.
1.7.1. Из детергентов набор содержит твин-20. 1.7.1. Of the detergents, the kit contains tween-20.
1.8. Краситель. 1.8. Dye.
1.8.1. Из красителей набор содержит ортофенилендиамин (ОФД). 1.8.1. Of the dyes, the kit contains orthophenylenediamine (CRF).
1.8.2. Из красителей набор содержит АБТС. 1.8.2. Of the dyes, the kit contains ABTS.
1.9. Гидроперит. 1.9. Hydroperite.
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана. The present invention includes the following set of essential features that provide a technical result in all cases for which legal protection is sought.
1. Набор для определения антител к возбудителю РМП в ИФА. 1. A kit for determining antibodies to the causative agent of RMP in ELISA.
1.1. Очищенный и инактивированный антиген возбудителя РМП, иммобилизованный на твердом носителе. 1.1. Purified and inactivated antigen of RMP pathogen immobilized on a solid carrier.
1.2. Сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 1.2. Dry positive blood serum of chickens to the pathogen RMP, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.
1.3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 1.3. Dry negative blood serum of chickens, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.
1.4. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащий карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 1.4. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.
1.5. Буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов. 1.5. Buffer solution for dilution and washing of immunospecific components.
1.6. Субстратный буфер. 1.6. Substrate buffer.
1.7. Детергент. 1.7. Detergent.
1.8. Краситель. 1.8. Dye.
1.9. Гидроперит. 1.9. Hydroperite.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования. The present invention is also characterized by other features expressing specific forms of its implementation or special conditions of use.
1. Сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Положительная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
2. Сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП, полученная контактным обезвоживанием.1. Dry positive blood serum of chickens to the pathogen RMP and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Positive serum - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
2. Dry positive blood serum of chickens to the pathogen RMP obtained by contact dehydration.
3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Отрицательная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
4. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, полученная контактным обезвоживанием.3. Dry negative blood serum of chickens and carboxyl-containing cation exchanger KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Negative Serum - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
4. Dry negative serum of chickens obtained by contact dehydration.
5. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Конъюгат - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
6. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.5. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Conjugate - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
6. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins obtained by contact dehydration.
7. В качестве буферного раствора для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор. 7. As a buffer solution for dilution and washing of immunospecific components, the kit contains a Tris buffer solution.
8. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер. 8. The kit contains a phosphate citrate buffer as a substrate buffer.
9. Из детергентов набор содержит твин-20. 9. Of the detergents, the kit contains tween-20.
10. Из красителей набор содержит ОФД. 10. Of the dyes, the kit contains OFD.
11. Из красителей набор содержит АБТС. 11. Of the dyes, the kit contains ABTS.
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый набор и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются следующие. The features of the invention characterizing the proposed set and coinciding with the signs of the prototype, including the generic concept, reflecting the purpose, are the following.
1. Набор для определения антител к возбудителю РМП в ИФА. 1. A kit for determining antibodies to the causative agent of RMP in ELISA.
1.1. Очищенный инактивированный антиген возбудителя РМП, иммобилизованный на твердом носителе. 1.1. Purified inactivated RMP pathogen antigen immobilized on a solid support.
1.2. Сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП. 1.2. Dry positive blood serum of chickens to the causative agent of RMP.
1.3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур. 1.3. Dry negative blood serum of chickens.
1.4. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур. 1.4. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins.
1.5. Буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов. 1.5. Buffer solution for dilution and washing of immunospecific components.
1.6. Субстратный буфер. 1.6. Substrate buffer.
1.7. Детергент. 1.7. Detergent.
1.8. Краситель. 1.8. Dye.
1.8. Гидроперит. 1.8. Hydroperite.
По сравнению с набором-прототипом существенными отличительными признаками предлагаемого набора являются следующие. Compared with the prototype kit, the salient features of the proposed kit are as follows.
1. Сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 1. Dry positive blood serum of chickens to the pathogen RMP, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.
2. Сухая отрицательная сыворотка кур, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 2. Dry negative chicken serum, optionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.
3. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащий карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 3. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования. The present invention is also characterized by other distinctive features expressing specific forms of execution or special conditions for its use.
1. Сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Положительная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
2. Сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП, полученная контактным обезвоживанием.1. Dry positive blood serum of chickens to the pathogen RMP and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Positive serum - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
2. Dry positive blood serum of chickens to the pathogen RMP obtained by contact dehydration.
3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Отрицательная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
4. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, полученная контактным обезвоживанием.3. Dry negative blood serum of chickens and carboxyl-containing cation exchanger KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Negative Serum - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
4. Dry negative serum of chickens obtained by contact dehydration.
5. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Антивидовой иммунопероксидазный конъюгат - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
6. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулиьюв кур, полученный контактным обезвоживанием.5. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Anti-Immunoperoxidase Conjugate - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
6. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulin obtained by contact dehydration.
7. В качестве буферного раствора для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор. 7. As a buffer solution for dilution and washing of immunospecific components, the kit contains a Tris buffer solution.
8. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер. 8. The kit contains a phosphate citrate buffer as a substrate buffer.
9. Из детергентов набор содержит твин-20. 9. Of the detergents, the kit contains tween-20.
10. Из красителей набор содержит ОФД. 10. Of the dyes, the kit contains OFD.
11. Из красителей набор содержит АБТС. 11. Of the dyes, the kit contains ABTS.
Предлагаемый набор обладает более высокой активностью и специфичностью и низкой себестоимостью изготовления. The proposed set has a higher activity and specificity and low manufacturing cost.
Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого набора, изложенных в независимом пункте формулы изобретения. The analysis of the prior art by the applicant, including a search by patent and scientific and technical sources of information, and the identification of sources containing information about analogues of the invention, allowed to establish that the applicant did not find sources characterized by signs that are identical (identical) to all the essential features of the invention. The determination from the list of identified analogues of the prototype, as the closest in the totality of features, made it possible to establish the set of essential distinguishing features of the proposed set with respect to the technical result perceived by the applicant, set forth in the independent claim.
Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна". Therefore, the claimed invention meets the condition of patentability "novelty."
Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. В результате поиска установлено следующее. To verify the conformity of the proposed solution to the patentability condition "inventive step", an additional search was carried out for known solutions to identify features included in the distinctive part of the independent claim. The search resulted in the following.
Известно использование карбоксилсодержащего катионита КБ-4П-2 для селективного удаления небольших количеств двухвалентных катионов из смесей с большими концентрациями одновалентных катионов, а также для очистки стрептомицина и других реакций катионного обмена (13). Для высушивания микроколичеств иммуноспецифических компонентов предлагаемого набора авторами использован впервые карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2, при этом авторами обнаружено новое, ранее неизвестное, свойство катионита КБ-4П-2 не изменять нативные характеристики иммуноспецифических компонентов при обезвоживании и одновременно повышать их специфичность и активность. It is known to use carboxyl-containing cation exchanger KB-4P-2 for the selective removal of small amounts of divalent cations from mixtures with high concentrations of monovalent cations, as well as for the purification of streptomycin and other cation exchange reactions (13). The authors used the carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 for the first time to dry micro-quantities of the immunospecific components of the proposed kit, while the authors discovered a new, previously unknown property of the cation exchange resin KB-4P-2 not to change the native characteristics of the immunospecific components during dehydration and at the same time increase their specificity and activity.
Результаты поиска показывают, что предлагаемое изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены аналогичные решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата. Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень". The search results show that the invention does not follow explicitly from the prior art set forth in the corresponding section of the description (similar solutions have not been identified that have features that match the distinguishing features of the invention), and the effect of the essential features of the invention not identified transformations to achieve a technical result. Therefore, the present invention meets the condition of patentability "inventive step".
Сущность изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения. The invention is illustrated by examples of its execution, which do not limit the scope of the invention.
Пример 1. Example 1
Набор для определения антител к возбудителю РМП в ИФА содержит следующие компоненты: очищенный и инактивированный антиген возбудителя РМП, штамм "S6", нанесенный на пластиковый планшет (два планшета), дополнительно содержащие карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 сухую положительную сыворотку крови кур к возбудителю РМП (одна ампула), сухую отрицательную сыворотку крови кур (одна ампула) и сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур (одна ампула), а также набор солей для приготовления трис-буферного раствора, используемого для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов и содержащего трис(оксиметил)аминометан в количестве 0,97 г, трис(оксиметил)аминометан гидрохлорид в количестве 6,61 г, хлористый натрий в количестве 11,7 г (три флакона), набор солей для приготовления субстратного буфера, содержащего натрий фосфорнокислый двузамещенный в количестве 5,37 г и лимонную кислоту в количестве 1,57 г (фосфатно-цитратный буфер - два флакона), ОФД (одна таблетка) или АБТС (одна таблетка), детергент твин-20 (один флакон), гидроперит (одна таблетка). The kit for determining antibodies to the pathogen of RMP in ELISA contains the following components: purified and inactivated antigen of the pathogen of RMP, strain "S6", deposited on a plastic tablet (two tablets), additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 dry positive blood serum of hens to the pathogen RMP (one ampoule), dry negative blood serum of chickens (one ampoule) and dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins (one ampoule), as well as a set of salts for the preparation of Tris buffer solution, used for dilution and washing of immunospecific components and containing tris (oxymethyl) aminomethane in an amount of 0.97 g, tris (oxymethyl) aminomethane hydrochloride in an amount of 6.61 g, sodium chloride in an amount of 11.7 g (three bottles), a set of salts for preparation of a substrate buffer containing sodium phosphate disubstituted in an amount of 5.37 g and citric acid in an amount of 1.57 g (phosphate-citrate buffer - two bottles), OFD (one tablet) or ABTS (one tablet), tween-20 detergent ( one bottle), hydroperite (one tablet).
Пример 2. Example 2
Для изготовления антигена возбудителя РМП используют производственный штамм "S6" MG. Расплодкой штамма засевают колбы с микоплазма-бульоном, содержащим 15% лошадиной сыворотки. Культивирование проводят на установке УВМТ-2-250 при температуре 37,0±0,5oС и перемешивании 120 об/мин. При достижении бульонной культурой оптической плотности на длине волны 650 нм 0,65 оптических единиц ферментацию останавливают. Чистоту роста определяют путем высева проб культуральной среды на микоплазма-агар, МПА, МПБ, среду Сабуро. На микоплазма-агаре через 24-48 ч должны формироваться характерные для микоплазм колонии с врастающим в толщу агара центром и прозрачной периферией, напоминающие яичницу "глазунью". После прекращения термостатирования в культуральную среду вносят аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ) в концентрации 0,3%. Инактивацию проводят при температуре 20-25oС и перемешивании в течении 24 ч. Затем культуральную жидкость центрифугируют при 22000 g в течение 35 мин. Надосадок декантируют, осадок ресуспендируют фосфатно-буферным раствором (ФБР) с рН 7,2. Отмывку повторяют. Осадок ресуспендируют в ФБР до 1/100 исходного объема и спектрофотометрически определяют концентрацию белка в материале. Материал обрабатывают додецил-сульфатом натрия (ДСН) (1 мг детергента на 1 мг белка) в течение 1 ч при 37,0±0,5oС. Затем проводят диализ антигена в течение 48 ч при 4,0±0,5oС против ФБР с добавлением этилендиаминтетроацетата (ЭДТА) в концентрации 0,01%. ФБР устанавливают концентрацию белка 1 мг/мл.For the manufacture of the antigen of the pathogen RMP using the production strain "S6" MG. The seed strain is seeded with flasks containing mycoplasma broth containing 15% horse serum. Cultivation is carried out on the installation of UVMT-2-250 at a temperature of 37.0 ± 0.5 o With stirring 120 rpm When the broth culture reaches an optical density at a wavelength of 650 nm of 0.65 optical units, fermentation is stopped. The purity of growth is determined by seeding samples of the culture medium on mycoplasma agar, MPA, MPB, Saburo medium. On mycoplasma agar after 24-48 hours, colonies characteristic of mycoplasmas with the center growing in the thickness of the agar and transparent periphery, resembling fried eggs, should form. After termination of thermostating, aminoethylethyleneimine (AEEI) is added to the culture medium at a concentration of 0.3%. Inactivation is carried out at a temperature of 20-25 o C and stirring for 24 hours. Then, the culture fluid is centrifuged at 22000 g for 35 minutes. The supernatant is decanted, the precipitate is resuspended in phosphate-buffered saline (PBS) with a pH of 7.2. The washing is repeated. The precipitate was resuspended in the FBI to 1/100 of the original volume and the protein concentration in the material was determined spectrophotometrically. The material is treated with sodium dodecyl sulfate (SDS) (1 mg of detergent per 1 mg of protein) for 1 h at 37.0 ± 0.5 o C. Then the antigen is dialyzed for 48 hours at 4.0 ± 0.5 o C against the FBI with the addition of ethylene diamine tetroacetate (EDTA) at a concentration of 0.01%. The FBI set the protein concentration to 1 mg / ml.
Активность и специфичность полученного антигена определяют в непрямом варианте ИФА. Для этого антиген иммобилизуют на планшет в различных концентрациях (разведения от 1:50 до 1:300) и исследуют в непрямом варианте ИФА. Определяют ту концентрацию (разведение), при которой специфичная к возбудителю РМП гипериммунная сыворотка кур демонстрирует титр не менее чем 1:9000. Исключают неспецифические реакции. Исследуемый антиген не должен специфически реагировать с сыворотками, имеющими антитела к вирусам: бронхита, ньюкаслской болезни, адено-, рео-, а также к бактериальным антигенам: сальмонеллеза и пастереллеза. The activity and specificity of the obtained antigen is determined in an indirect ELISA. For this, the antigen is immobilized on a tablet in various concentrations (dilutions from 1:50 to 1: 300) and examined in an indirect ELISA. The concentration (dilution) is determined at which the hyperimmune chicken serum specific to the pathogen of RMP shows a titer of at least 1: 9000. Exclude non-specific reactions. The studied antigen should not specifically react with sera having antibodies to viruses: bronchitis, Newcastle disease, adeno-, reo-, and also to bacterial antigens: salmonellosis and pasteurellosis.
Прошедший необходимые тесты очищенный и инактивированный препарат антигена возбудителя РМП используют для иммобилизации на планшеты. Количество антигена, необходимое для изготовления партии наборов, размораживают и готовят рабочее разведение в буфере для разведения антигена. После инкубации в течение 18 ч при 4oС или 2 ч при 37oС раствор антигена удаляют, планшеты промывают буфером и вносят по 0,1 мл блокирующего раствора. Инкубируют 1 ч при комнатной температуре и промывают 3 раза буфером. Планшеты высушивают на воздухе и упаковывают в полиэтиленовые пакеты поштучно.Having passed the necessary tests, the purified and inactivated preparation of the RMP pathogen antigen is used for immobilization on tablets. The amount of antigen needed to make a batch of sets is thawed and a working dilution is prepared in the buffer for dilution of the antigen. After incubation for 18 hours at 4 ° C or 2 hours at 37 ° C, the antigen solution is removed, the plates are washed with buffer and 0.1 ml of blocking solution is added. Incubated for 1 h at room temperature and washed 3 times with buffer. The tablets are air dried and packaged in plastic bags individually.
Пример 3. Для получения положительной сыворотки в качестве доноров используют безлейкозных цыплят в возрасте 21-42 дня. Для гипериммунизации используют антиген возбудителя РМП, полученный так, как описано в примере 2. Цыплятам внутримышечно в дозе 0,5 мл вводят суспензию очищенного и инактивированного антигена из производственного штамма "S6" с неполным адъювантом Фрейнда. Двукратно с интервалом в 10 суток птицу подвергают гипериммунизации. Спустя 10 суток после последней инъекции проводят пробное взятие крови для определения активности гипериммунной сыворотки. В случае высокой активности сыворотки цыплят тотально обескровливают с соблюдением правил асептики и антисептики в увлажненные физиологическим раствором пробирки. Если активность сывороток невысокого уровня, проводят дополнительную иммунизацию свежеприготовленным антигеном с адъювантом, а спустя 10 суток доноров тотально обескровливают. Индивидуальные пробы крови выдерживают сначала при +37oС в течение 30-60 мин, а затем при +4oС в течение суток. Отстоявшуюся сыворотку отсасывают в стерильные пробирки, не допуская попадания эритроцитов и других форменных элементов крови, инактивируют при +57oС в течение 30 мин, консервируют хинозолом в соотношении 1:1000. Полученную сыворотку смешивают с карбоксилсодержащим катионитом КБ-4П-2 в соотношении, мас.%, 2:98-15:85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию.Example 3. To obtain positive serum as donors use leukemic chickens at the age of 21-42 days. For hyperimmunization, the RMP pathogen antigen obtained as described in Example 2 is used. Intramuscularly at a dose of 0.5 ml, chickens are given a suspension of purified and inactivated antigen from production strain "S6" with incomplete Freund's adjuvant. Twice with an interval of 10 days, the bird is subjected to hyperimmunization. 10 days after the last injection, a test blood sample is taken to determine the activity of hyperimmune serum. In case of high activity, the chickens serum is totally bled according to the rules of asepsis and antiseptics in test tubes moistened with saline. If the activity of serums is not high, additional immunization is carried out with a freshly prepared antigen with an adjuvant, and after 10 days the donors are totally bled. Individual blood samples can withstand first at +37 o C for 30-60 minutes, and then at +4 o C for a day. The settled serum is aspirated into sterile tubes, preventing the ingress of red blood cells and other formed blood elements, inactivated at +57 ° C for 30 minutes, and preserved with quinosol in a ratio of 1: 1000. The resulting serum is mixed with carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 in the ratio, wt.%, 2: 98-15: 85 (these ratios are optimal) and subjected to contact dehydration.
Пример 4. Example 4
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к возбудителю РМП, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Положительная сыворотка - 2,0
Катионит КБ-4П-2 - 98,0
Результаты испытаний представлены в табл. 1.Comparative tests were performed in ELISA of dry positive blood serum of chickens to the pathogen RMP, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 and obtained by contact dehydration, while the content of ingredients in this mixture is, wt.%:
Positive serum - 2.0
Cation exchange resin KB-4P-2 - 98.0
The test results are presented in table. 1.
Представленные в табл. 1 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП превосходит по активности и специфичности таковую прототипа, полученную методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев. Presented in the table. 1 data indicate that obtained by contact dehydration dry positive blood serum of chickens to the pathogen RMP exceeds the activity and specificity of that of the prototype obtained by freeze drying, and is stored without decrease in activity for 12 months.
Пример 5. Example 5
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к возбудителю РМП, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Положительная сыворотка - 7,0
Катионит КБ-4П-2 - 93,0
Результаты испытаний представлены в табл. 2.Comparative tests were performed in ELISA of dry positive blood serum of chickens to the pathogen RMP, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 and obtained by contact dehydration, while the content of ingredients in this mixture is, wt.%:
Positive serum - 7.0
Cation exchange resin KB-4P-2 - 93.0
The test results are presented in table. 2.
Представленные в табл. 2 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП превосходит по активности и специфичности таковую прототипа, полученного методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев. Presented in the table. 2 data indicate that obtained by contact dehydration dry positive blood serum of chickens to the pathogen RMP exceeds the activity and specificity of that of the prototype obtained by freeze drying, and is stored without decrease in activity for 12 months.
Пример 6. Example 6
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к возбудителю РМП, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет мас.%:
Положительная сыворотка - 15,0
Катионит КБ-4П-2 - 85,0
Результаты испытаний представлены в табл. 3.Comparative tests were performed in ELISA of dry positive blood serum of chickens to the pathogen RMP, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 and obtained by contact dehydration, while the content of ingredients in this mixture is wt.%:
Positive serum - 15.0
Cation exchange resin KB-4P-2 - 85.0
The test results are presented in table. 3.
Представленные в табл. 3 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП превосходит по активности и специфичности таковую прототипа, полученную методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев. Presented in the table. 3 data indicate that obtained by contact dehydration dry positive blood serum of chickens to the pathogen RMP exceeds the activity and specificity of that of the prototype obtained by freeze drying, and is stored without decrease in activity for 12 months.
Пример 7. Example 7
Используемую в качестве компонента набора отрицательную сыворотку крови кур получают от здоровой безлейкозной птицы. К полученной сыворотке добавляют карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 в соотношении, мас.%, 2:98-15:85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию. The negative blood serum of chickens used as a component of the kit is obtained from a healthy non-leukemic bird. To the resulting serum add carboxyl-containing cation exchanger KB-4P-2 in the ratio, wt.%, 2: 98-15: 85 (these ratios are optimal) and subjected to contact dehydration.
Пример 8. Example 8
В предлагаемом наборе используют антивидовые коммерческие конъюгаты, выпускаемые НИИЭМ имени Н.Ф. Гамалея, представляющие собой глобулиновую фракцию, выделенную из антисыворотки, полученной иммунизацией кур и меченую пероксидазой хрена. К конъюгату добавляют карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 в соотношении, мас.%, 2:98-15:85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию. The proposed kit uses anti-species commercial conjugates manufactured by NIEM named after N.F. Gamalea, representing a globulin fraction isolated from antiserum obtained by immunization of chickens and labeled with horseradish peroxidase. To the conjugate add carboxyl-containing cation exchanger KB-4P-2 in the ratio, wt.%, 2: 98-15: 85 (these ratios are optimal) and subjected to contact dehydration.
Пример 9. Example 9
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученный контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Конъюгат - 2,0
Катионит КБ-4П-2 - 98,0
Результаты испытаний представлены в табл. 4.Comparative tests were carried out in ELISA of a dry antiviral immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 and obtained by contact dehydration, while the content of ingredients in this mixture is, wt.%:
Conjugate - 2.0
Cation exchange resin KB-4P-2 - 98.0
The test results are presented in table. 4.
Представленные в табл. 4 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат превосходит по активности и специфичности таковой прототипа, полученный методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев. Presented in the table. 4 data indicate that the dry antiviral immunoperoxidase conjugate obtained by contact dehydration is superior in activity and specificity to that of the prototype obtained by freeze drying and is stored for 12 months without loss of activity.
Пример 10. Example 10
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученного контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Конъюгат - 7,0
Катионит КБ-4П-2 - 93,0
Результаты испытаний представлены в табл. 5.Comparative tests were performed in ELISA of a dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 and obtained by contact dehydration, while the content of ingredients in this mixture is, wt.%:
Conjugate - 7.0
Cation exchange resin KB-4P-2 - 93.0
The test results are presented in table. 5.
Представленные в табл. 5 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат превосходит по активности и специфичности таковой прототипа, полученный методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев. Presented in the table. 5 data indicate that the dry antiviral immunoperoxidase conjugate obtained by contact dehydration is superior in activity and specificity to that of the prototype obtained by lyophilic drying and is stored without a decrease in activity for 12 months.
Пример 11. Example 11
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученного контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет. мас.%:
Конъюгат - 15,0
Катионит КБ-4П-2 - 85,0
Результаты испытаний представлены в табл. 6.Comparative tests were performed in ELISA of a dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 and obtained by contact dehydration, while the content of ingredients in this mixture is. wt.%:
Conjugate - 15.0
Cation exchange resin KB-4P-2 - 85.0
The test results are presented in table. 6.
Представленные в табл. 6 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат превосходит по активности и специфичности таковой прототипа, полученный методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев. Presented in the table. 6 data indicate that the dry antiviral immunoperoxidase conjugate obtained by contact dehydration is superior in activity and specificity to that of the prototype obtained by freeze drying and is stored for 12 months without loss of activity.
Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- набор для определения антител к возбудителю РМП в ИФА, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной микробиологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- набор для определения антител к возбудителю РМП в ИФА, приготовленный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой активностью и специфичностью, а также низкой себестоимостью изготовления.Thus, the above information indicates the fulfillment when using the invention of the following set of conditions:
- a kit for determining antibodies to the causative agent of RMP in ELISA, embodying the invention, is intended for use in agriculture, namely in veterinary microbiology and biotechnology;
- for the proposed invention in the form described in the independent claim, the possibility of its implementation using the means and methods described in the application or known prior to the priority date has been confirmed;
- a kit for determining antibodies to the causative agent of RMP in ELISA, prepared in accordance with the invention, has high activity and specificity, as well as low cost of manufacture.
Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость". Therefore, the present invention meets the condition of patentability "industrial applicability".
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ,
принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на "Набор для определения антител к возбудителю респираторного микоплазмоза птиц"
1. Avakian A.P., Kleven S.H., Glisson R. Evaluation of the specificity and sensitivity of two commercial enzime-linked immunosorbent assay kits, the serum plate agglutination test, and the hemagglutination-inhibition teat for antibodies formed in response to Mycoplasma gallisepticum. Avian. Dis., 1988, V. 32, pp. 262-272.SOURCES OF INFORMATION,
taken into account when drawing up the description of the invention to the application for the grant of a patent of the Russian Federation on "Kit for the determination of antibodies to the causative agent of respiratory mycoplasmosis of birds
1. Avakian AP, Kleven SH, Glisson R. Evaluation of the specificity and sensitivity of two commercial enzime-linked immunosorbent assay kits, the serum plate agglutination test, and the hemagglutination-inhibition teat for antibodies formed in response to Mycoplasma gallisepticum. Avian Dis., 1988, V. 32, pp. 262-272.
2. Ansari A. A. , Taylor R.F., Chang T.S. Application of enzyme-linked immunosorbent assay for detecting antibody to Mycoplasma gallisepticum infection in poultry. Avian Dis., V. 27, pp. 21-35
3. Clide W.A. Growth inhibition testes. In: Methods in Mycoplasmology, vol. 1, Mycoplasma characterization. S. Razin, Tully I,G., eds. Academic Press, NY, 1983, pp. 405-410.2. Ansari AA, Taylor RF, Chang TS Application of enzyme-linked immunosorbent assay for detecting antibody to Mycoplasma gallisepticum infection in poultry. Avian Dis., V. 27, pp. 21-35
3. Clide WA Growth inhibition testes. In: Methods in Mycoplasmology, vol. 1, Mycoplasma characterization. S. Razin, Tully I, G., Eds. Academic Press, NY, 1983, pp. 405-410.
4. Kempt I. , Gesbert F., Guittet M. e.a. Evaluation of two commercial enzime-linked immunosorbent assay kits for the detection of Mycoplasma gallisepticum antibodies. Avian Pathol., 1994, V. 23, pp. 329-338. 4. Kempt I., Gesbert F., Guittet M. e.a. Evaluation of two commercial enzime-linked immunosorbent assay kits for the detection of Mycoplasma gallisepticum antibodies. Avian Pathol., 1994, V. 23, pp. 329-338.
5. Kleven S. H. , Morrow C.I., Whithear K.G. Comparison of Mycoplasma gallisepticum strains by hemagglutination-inhibition and restriction endonuclease analysis. Avian Dis., 1988. V. 32, pp. 731-741. 5. Kleven S. H., Morrow C.I., Whithear K.G. Comparison of Mycoplasma gallisepticum strains by hemagglutination-inhibition and restriction endonuclease analysis. Avian Dis., 1988. V. 32, pp. 731-741.
6. Nougayrede P. , Toquin D., Andrae B. e.a. Depistage serologique des mycoplasmoses aviares: agglutination rapide surlame, inhibition de I'hemagglutination, inhibition metabolique, techniques appliques au dianostic des infections a Mycoplasma gallisepticum. Avian Pathol., 1984, V. 13, pp. 753-768. 6. Nougayrede P., Toquin D., Andrae B. e.a. Depistage serologique des mycoplasmoses aviares: agglutination rapide surlame, inhibition de I'hemagglutination, inhibition metabolique, techniques appliques au dianostic des infections a Mycoplasma gallisepticum. Avian Pathol., 1984, V. 13, pp. 753-768.
7. Пат. США 4908305; G 01 N 33/53, 33/577, 13.03.90 г. 7. Pat. US 4,908,305; G 01 N 33/53, 33/577, 03/13/90
8. Егоров А. М., Осипов А.П. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высшая школа, 1991, с. 77-100. 8. Egorov A.M., Osipov A.P. and other Theory and practice of enzyme immunoassay. M .: Higher school, 1991, p. 77-100.
9. Сеймур П.Х. Иммуноферментный анализ антител // Иммуноферментный анализ. М.: Мир, 1988, с. 193-205. 9. Seymour P.Kh. Enzyme-linked immunosorbent assay of antibodies // Enzyme-linked immunosorbent assay. M .: Mir, 1988, p. 193-205.
10. Mycoplasma gallisepticum - synoviae antibody test kit. Instruction manual. Biogal Galed Labs. Kibbutz Galed 19240 Israel. 10. Mycoplasma gallisepticum - synoviae antibody test kit. Instruction manual. Biogal Galed Labs. Kibbutz Galed 19240 Israel.
11. Mycoplasma gallisepticum antibody test kit. Instruction. Catalog 54-85-01/KPL (Kirkegaard and Perry Laboratories), US, @ Cessna Court Gaithersburg Maryland 20879, 8006383167. 11. Mycoplasma gallisepticum antibody test kit. Instruction. Catalog 54-85-01 / KPL (Kirkegaard and Perry Laboratories), US, @ Cessna Court Gaithersburg Maryland 20879, 8006383167.
12. Mycoplasma gallisepticum antibody test kit. Instruction. Catalog Code CK 113. BioChek C.V. Weth, Venteweg. 143.2805 J N Gonda, Holland. 12. Mycoplasma gallisepticum antibody test kit. Instruction. Catalog Code CK 113. BioChek C.V. Weth, Venteweg. 143.2805 J N Gonda, Holland.
13. IDEXX's instruction for an enzyme immunoassay for the detection of antibody in chicken serum. IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, USA, 1996, 30 р. 13. IDEXX's instruction for an enzyme immunoassay for the detection of antibody in chicken serum. IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, USA, 1996, 30 p.
14. Временное наставление по применению набора для выявления антител к возбудителю респираторного микоплазмоза птиц иммуноферментным методом. Утверждено Департаментом ветеринарии МСХП РФ 13.02.01 г. 14. Temporary guidance on the use of the kit to detect antibodies to the causative agent of respiratory mycoplasmosis in birds by the enzyme immunoassay. Approved by the Veterinary Department of the Ministry of Agriculture of the Russian Federation on February 13, 01
15. Краткая химическая энциклопедия. М.: Сов. энциклопедия, 1963, т.2, с. 299-306. 15. Brief chemical encyclopedia. M .: Sov. Encyclopedia, 1963, v. 2, p. 299-306.
16. Патент Японии JP 7236498, C 12 Q 1/68, 12.09.1995 г. (прототип). 16. Japan patent JP 7236498, C 12
Claims (9)
Положительная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
3. Набор по п.1, отличающийся тем, что он содержит сухую положительную сыворотку крови кур к возбудителю инфекции, полученную контактным обезвоживанием.2. The kit according to claim 1, characterized in that the dry positive serum to the pathogen and the carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Positive serum - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
3. The kit according to claim 1, characterized in that it contains dry positive blood serum of chickens to the causative agent of infection obtained by contact dehydration.
Отрицательная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
5. Набор по п.1, отличающийся тем, что он содержит сухую отрицательную сыворотку крови кур, полученную контактным обезвоживанием.4. The kit according to p. 1, characterized in that the dry negative blood serum of chickens and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Negative Serum - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
5. The kit according to claim 1, characterized in that it contains dry negative blood serum of chickens obtained by contact dehydration.
Конъюгат - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
7. Набор по п,1, отличающийся тем, что он содержит сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.6. The kit according to claim 1, characterized in that the dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins and carboxy-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Conjugate - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
7. The kit according to claim 1, characterized in that it contains a dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins obtained by contact dehydration.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001105775A RU2202797C2 (en) | 2001-03-02 | 2001-03-02 | Kit for detecting antibodies to the agent of poultry respiratory mycoplasmosis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001105775A RU2202797C2 (en) | 2001-03-02 | 2001-03-02 | Kit for detecting antibodies to the agent of poultry respiratory mycoplasmosis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2202797C2 true RU2202797C2 (en) | 2003-04-20 |
| RU2001105775A RU2001105775A (en) | 2003-06-20 |
Family
ID=20246715
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001105775A RU2202797C2 (en) | 2001-03-02 | 2001-03-02 | Kit for detecting antibodies to the agent of poultry respiratory mycoplasmosis |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2202797C2 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109956895A (en) * | 2019-03-14 | 2019-07-02 | 深圳市易瑞生物技术股份有限公司 | A kind of procymidone haptens and its synthetic method and application |
| CN115327100A (en) * | 2022-08-12 | 2022-11-11 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | Mycoplasma bovis plate agglutination antigen and preparation method and application thereof |
| CN117491657A (en) * | 2023-11-03 | 2024-02-02 | 中国兽医药品监察所 | Mycoplasma gallisepticum positive serum and negative serum standard substance and preparation method thereof |
-
2001
- 2001-03-02 RU RU2001105775A patent/RU2202797C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ЛУРЬЕ А.А. Хроматографические материалы (справочник). - М.: Химия, 1978, с.101-106. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109956895A (en) * | 2019-03-14 | 2019-07-02 | 深圳市易瑞生物技术股份有限公司 | A kind of procymidone haptens and its synthetic method and application |
| CN115327100A (en) * | 2022-08-12 | 2022-11-11 | 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 | Mycoplasma bovis plate agglutination antigen and preparation method and application thereof |
| CN117491657A (en) * | 2023-11-03 | 2024-02-02 | 中国兽医药品监察所 | Mycoplasma gallisepticum positive serum and negative serum standard substance and preparation method thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dasch et al. | Sensitive microplate enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies against the scrub typhus rickettsia, Rickettsia tsutsugamushi | |
| US20060246429A1 (en) | Dot-elisa for the detection of animal viruses | |
| TWI611188B (en) | Improved diagnostic test for csfv antibodies | |
| DK2609428T3 (en) | STRENGTH TEST FOR VACCINE FORMULATIONS | |
| CN108918869B (en) | Application of fiber2 protein and recombinant protein thereof in detecting serum type 4 avian adenovirus antibody | |
| Benčina et al. | Transfer of maternal immunoglobulins and antibodies to Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae to the allantoic and amniotic fluid of chicken embryos | |
| RU2202797C2 (en) | Kit for detecting antibodies to the agent of poultry respiratory mycoplasmosis | |
| Adair et al. | Development of a microtitre fluorescent antibody test for serological detection of adenovirus infection in birds | |
| Adair et al. | Serological studies with reoviruses in chickens, turkeys and ducks | |
| Rivetz et al. | Evaluation of a novel rapid kit for the visual detection of Newcastle disease virus antibodies | |
| JP2002525605A (en) | Salmonella antigen formulation and kit for detecting Salmonella antibodies | |
| CN104628834B (en) | A kind of tuberculosis infection T cell immunodetection antigen and application thereof | |
| Rhoades | A hemagglutination-inhibition test for Mycoplasma meleagridis antibodies | |
| Zaghawa et al. | Antiserum Raised in Pigs against Canine Distemper Virus and its Utility in Diagnostic Procedures for Morbillivirus Infections (Canine Distemper, Phocine Distemper, Rinderpest) 1 | |
| RU2192014C1 (en) | Kit for detection of antibodies to infectious bursal disease virus in poultry | |
| RU2199126C2 (en) | Kit for detecting antibodies to encephalomyelitis virus in poultry | |
| RU2189042C1 (en) | Kit for detecting antibodies to infectious bronchitis virus in hens | |
| Lyerla et al. | Physicochemical and serological characteristics of respiratory virus fluorescein-isothiocyanate conjugates for fluorescent-antibody diagnosis | |
| Hamdy et al. | Complement fixation reaction for the diagnosis of type II avian (Marek's) leukosis | |
| Cardoso et al. | Validation of an immunohistochemistry assay to detect turkey coronavirus: a rapid and simple screening tool for limited resource settings | |
| RU2323743C2 (en) | Method of determination of specific antibodies to virus of goose enteritis | |
| US20130115639A1 (en) | Method for detecting a salmonella infection | |
| RU2684417C1 (en) | Method of determining specific antibodies to type i ducklings hepatitis virus | |
| Bibi et al. | Seroprevalence of Mycoplasma gallisepticum in non Vaccinated broiler flocks in Abbottabad Khyberpakhtunkhwa, Pakistan | |
| RU2167673C1 (en) | Set for determining antibodies to egg yield drop syndrome-76 hen virus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070303 |