RU2192014C1

RU2192014C1 - Kit for detection of antibodies to infectious bursal disease virus in poultry

Info

Publication number: RU2192014C1
Application number: RU2001103506A
Authority: RU
Inventors: А.В. Борисов; В.Н. Кузнецов; А.А. Гусев; В.В. Дрыгин; Н.С. Мудрак; Т.В. Оковытая
Original assignee: Федеральное государственное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных
Priority date: 2001-02-05
Filing date: 2001-02-05
Publication date: 2002-10-27

Abstract

FIELD: veterinary virology and biotechnology. SUBSTANCE: kit contains a purified and inactivated antigen of IBD virus immobilized upon a solid carrier, a dry positive hens' blood serum to IBD virus, a negative hens' blood serum and a dry antispecific immunoperoxidase conjugate against hens' immunoglobulins additionally containing a carboxyl- bearing cationite CB-4P-2. As unspecific components the kit contains a tris-buffer solution, a phosphate-citrate buffer, orthophenylen dyer or 2,2'-asino-di[3- ethyl]benzthiazolinsulfonic acid, twin-20 detergent and hydroperite. EFFECT: higher activity and specificity of the kit. 11 cl, 11 ex, 6 tbl

Description

Изобретение относится к области диагностики, ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к получению наборов для обнаружения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц в иммуноферментном анализе (ИФА), и может быть использовано при диагностике ИББ в научно-исследовательских учреждениях, региональных и областных ветеринарных лабораториях и при изготовлении указанных наборов на предприятиях биологической промышленности. The invention relates to the field of diagnostics, veterinary virology and biotechnology, in particular to the production of kits for detecting antibodies to the virus of infectious bursal disease (IBD) of birds in enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and can be used in the diagnosis of IBD in research institutions, regional and regional veterinary laboratories and in the manufacture of these kits at the enterprises of the biological industry.

ИББ птиц (болезнь Гамборо) - это вирусное высококонтагиозное заболевание, характеризующееся поражением фабрициевой сумки, почек, внутримышечными геморрагиями, диареей. В основном ИББ поражает В-лимфоциты фабрициевой сумки, вызывая атрофию ее лимфоидных фолликулов. Важными средствами борьбы против ИББ, причиняющей экономический ущерб за счет гибели 20-70% птиц при остром ее течении, снижения привесов и проявления вторичных инфекций на фоне иммунодепрессивного воздействия вируса на организм птиц, является своевременная диагностика заболевания и его вакцинопрофилактика. ИББ протекает остро, с характерной клиникой заболевания и субклинически. Широкое распространение имеет субклиническая форма. При острой форме болезни на первый план выступают клинические и патологоанатомические признаки, свойственные вторичным инфекциям, что создает затруднения при постановке диагноза. Диагноз на ИББ устанавливают на основании клинических, патолого-анатомических и эпизоотических данных, а также вирусологических и серологических исследований. Серологическая диагностика ИББ является наиболее распространенной, как в аспекте ретроспективного отслеживания возможных вспышек заболевания, так оценки эффективности его специфической профилактики. Для обнаружения вирусного антигена или специфических антител, свидетельствующих о контакте птиц с вирусом, используют различные серологические тесты, позволяющие выявлять комплексы антиген-антитело (иммунные комплексы). Такими тестами является: реакция диффузионной преципитации (РДП) и иммуноферментный анализ (ИФА). Иногда при диагностике ИББ применяют реакцию нейтрализации вируса (РН), реакцию иммунофлюоресценции (РИФ), латексной агглютинации и обратной пассивной гемагглютинации. IBD of birds (Gamboro disease) is a highly contagious viral disease characterized by damage to the factory bag, kidneys, intramuscular hemorrhages, diarrhea. Basically, IBD affects the B-lymphocytes of a factory bag, causing atrophy of its lymphoid follicles. An important means of the fight against IBD, which causes economic damage due to the death of 20-70% of birds during its acute course, reduction in weight gain and secondary infections against the background of the immunosuppressive effect of the virus on birds, is the timely diagnosis of the disease and its vaccination. IBD is acute, with a characteristic clinic of the disease and subclinical. Widespread has a subclinical form. In the acute form of the disease, clinical and pathological signs characteristic of secondary infections come to the fore, which creates difficulties in making a diagnosis. The diagnosis of IBD is based on clinical, pathological, anatomical and epizootic data, as well as virological and serological studies. Serological diagnosis of IBD is the most common, both in terms of retrospective monitoring of possible outbreaks of the disease, as well as evaluating the effectiveness of its specific prevention. To detect viral antigen or specific antibodies that indicate bird contact with the virus, various serological tests are used to detect antigen-antibody complexes (immune complexes). Such tests are: diffusion precipitation reaction (RDP) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Sometimes, in the diagnosis of IBD, a virus neutralization (RN) reaction, an immunofluorescence (RIF) reaction, latex agglutination, and reverse passive hemagglutination are used.

Сущность РДП состоит в том, что при взаимонаправленной диффузии антител и антигена в геле, имеющем определенную полимерную структуру, образуются иммунные комплексы, которые приводят к изменению оптической плотности по типу преципитата (1). Установлено, что в РДП преципитирующие антитела могут быть обнаружены в сыворотках крови через 5 дней после экспериментального заражения или вакцинации с последующим возрастанием их концентрации. Максимальная интенсивность реакции наблюдается к 21 дню и постепенно снижается. Эффект преципитации наблюдается еще до 20 недель. У цыплят, полученных от несушек, интенсивно реагирующих в РДП, преципитирующие антитела могут быть обнаружены до 5-6-дневного возраста (2). The essence of RDP is that upon the mutually directed diffusion of antibodies and antigen in a gel having a certain polymer structure, immune complexes are formed that lead to a change in optical density according to the type of precipitate (1). It was found that precipitating antibodies in RDP can be detected in blood serum 5 days after experimental infection or vaccination with a subsequent increase in their concentration. The maximum intensity of the reaction is observed by 21 days and gradually decreases. The precipitation effect is observed even up to 20 weeks. Precipitating antibodies can be detected in chickens obtained from laying hens intensively reacting in RDPs up to 5-6 days of age (2).

ИФА в 1000-1400 раз более чувствительна, чем РДП. ИФА позволяет выявлять антиген в различных тканях птиц и эмбрионов, тогда как РДП способна обнаружить антиген ИББ только в ткани фабрициевых сумок на 2-6 день после инфицирования, т.е. в период максимального накопления вируса. Данное обстоятельство практически исключает возможность использования РДП для оценки концентрации антигена в сырье для производства вакцин. ELISA is 1000-1400 times more sensitive than RDP. ELISA can detect antigen in various tissues of birds and embryos, while RDP is able to detect IBD antigen only in the fabric of factory bags 2-6 days after infection, i.e. during the period of maximum accumulation of the virus. This circumstance virtually eliminates the possibility of using RDP to assess the concentration of antigen in raw materials for vaccine production.

Большинство методов, позволяющих контролировать уровень антител к вирусу ИББ в сыворотках крови кур, а также присутствие вируса или его антигена в биологических материалах, основано на ИФА. Для выявления антител к вирусу ИББ и определения их концентрации в сыворотках крови получил распространение непрямой вариант ИФА, в котором исследуемый образец взаимодействует с антигеном, иммобилизованным на планшете из оптически прозрачного полимера с 96 лунками. Далее антитела в составе иммунных комплексов реагируют с конъюгатом. Результаты анализа с высокой точностью фиксируют средствами спектрофотометрии. Для обнаружения и оценки титра антигена вируса ИББ в биологических материалах широко применяют непрямой сэндвич-вариант ИФА, при осуществлении которого исследуемый антиген вначале улавливается специфическими антителами, иммобилизованными на планшете, а затем выявляется детекторными антителами, с которыми взаимодействует конъюгат. Результаты анализа фиксируют также с помощью спектрофотометра. Most methods that allow you to control the level of antibodies to the IBD virus in chicken blood serum, as well as the presence of the virus or its antigen in biological materials, are based on ELISA. To detect antibodies to the IBD virus and determine their concentration in blood serum, an indirect ELISA was used, in which the test sample interacts with an antigen immobilized on a 96-well optically transparent polymer plate. Then antibodies in the composition of the immune complexes react with the conjugate. The results of the analysis are recorded with high accuracy by spectrophotometry. To detect and evaluate the titer of the IBD virus antigen in biological materials, an indirect ELISA sandwich variant is widely used, during which the test antigen is first captured by specific antibodies immobilized on a plate, and then detected by detection antibodies with which the conjugate interacts. The analysis results are also recorded using a spectrophotometer.

Достоинством ИФА являются высокая чувствительность и специфичность, возможность проведения масштабных исследований в полевых условиях, оперативность проведения анализов, небольшие объемы исследуемых проб и возможность автоматизации практически всех стадий выполнения реакции, включая регистрацию и обработку получаемых результатов (3). The advantages of ELISA are high sensitivity and specificity, the possibility of large-scale field studies, the speed of analysis, small volumes of test samples and the ability to automate almost all stages of the reaction, including recording and processing the results obtained (3).

В настоящее время фирмы, специализирующиеся на производстве средств для молекулярно-биологической диагностики, выпускают специальные наборы для проведения ИФА с целью обнаружения сывороточных антител к вирусам, вызывающим различные заболевания кур, в том числе и ИББ. Currently, companies specializing in the production of molecular biological diagnostics produce special kits for ELISA to detect serum antibodies to viruses that cause various diseases of chickens, including IBD.

Известен набор для определения антител к вирусам ИББ, НБ и ИБК у птиц в крови, сыворотке крови или яичном желтке (полуколичественный метод) в ИФА. Антигены вирусов ИББ, НБ и ИБК нанесены отдельно на пластиковую гребенку. Реакция протекает внутри ячеек проявляющих пластин. В состав набора включены 3 карточки гребенки "Immunocomb", 3 проявляющие пластины, 3 листка бумаги для образцов с предварительно нанесенными дисками, 4 ланцета для взятия проб крови, 1 пинцет, 1 калибровочная цветовая шкала "CombScale", 1 пробирка с сывороткой для положительного контроля, 1 пробирка с сывороткой для отрицательного контроля, график "CombScore". Набор используется для оценки эффективности вакцинации, определения наиболее приемлемых сроков вакцинации и периодического серологического анализа стад с целью быстрой и эффективной диагностики заболеваний (4). A known kit for determining antibodies to viruses IBD, NB and IBC in birds in the blood, blood serum or egg yolk (semi-quantitative method) in ELISA. The antigens of the viruses IBC, NB and IBC are applied separately to a plastic comb. The reaction proceeds inside the cells of the developing plates. The kit includes 3 Immunocomb comb cards, 3 developing plates, 3 pieces of paper for samples with pre-applied discs, 4 lancets for taking blood samples, 1 tweezers, 1 calibration color scale "CombScale", 1 tube with serum for positive control , 1 tube with serum for negative control, graph "CombScore". The kit is used to assess the effectiveness of vaccination, determine the most appropriate timing of vaccination and periodic serological analysis of herds in order to quickly and efficiently diagnose diseases (4).

Известен набор для определения антител к вирусу ИББ птиц в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса ИББ, отрицательную сыворотку крови, антикуриный пероксидазный конъюгат, раствор для разведения и промывки сывороток и конъюгата, окрашивающий раствор 2,2'-азино-ди [3-этил] бензтиазолинсульфоновой кислоты (АБТС) и раствор, останавливающий окраску реакции - 5% SDS. Измерение оптической плотности проводят с использованием фильтра 405-410 нм. С помощью данного набора исследуют полевые сыворотки на наличие антител к вирусу ИББ и проводят количественную оценку титра антител (5). A known kit for determining antibodies to the IBD virus of birds in ELISA, containing purified and inactivated antigen of the IBD virus, negative blood serum, anti-chicken peroxidase conjugate, a solution for diluting and washing sera and conjugate, staining solution of 2,2'-azino di [3- ethyl] benzthiazoline sulfonic acid (ABTS) and a solution that stops the color of the reaction - 5% SDS. The measurement of optical density is carried out using a filter of 405-410 nm. Using this kit, field sera are examined for the presence of antibodies to the IBD virus and a titer of antibodies is quantified (5).

Известен набор для определения антител к вирусу ИББ птиц в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса ИББ, иммобилизованный на твердом носителе, положительную сыворотку крови кур к вирусу ИББ, отрицательную сыворотку крови кур к вирусу ИББ, щелочной фосфатазный конъюгат овечьих антител к куриным IgG, буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов (фосфатный буфер с белковыми стабилизаторами), субстратный буфер (диэтаноламиновый буфер с энзим-факторами), таблетки pNPP, останавливающий раствор. С помощью данного набора можно измерять уровень антител к вирусу ИББ в сыворотках крови кур (6). A known kit for determining antibodies to IBD virus in ELISA, containing purified and inactivated IBD virus antigen immobilized on a solid carrier, positive chicken blood serum to IBD virus, negative chicken blood serum to IBD virus, alkaline phosphatase conjugate of sheep’s antibodies to chicken IgG, buffer solution for dilution and washing of immunospecific components (phosphate buffer with protein stabilizers), substrate buffer (diethanolamine buffer with enzyme factors), pNPP tablets, stopping solution. Using this kit, one can measure the level of antibodies to the IBD virus in chicken blood serum (6).

Известен набор для определения антител к вирусу ИББ птиц в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса ИББ, иммобилизованный на твердом носителе, положительную сыворотку крови кур к вирусу ИББ, отрицательную сыворотку крови кур к вирусу ИББ, препарат козьих антител к куриным IgG, конъюгированных с пероксидазой хрена, с гентамицином, буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов, буферный раствор для разведения концентрата субстрата ТМВ, останавливающий раствор. A known kit for determining antibodies to the IBD virus of birds in ELISA, containing purified and inactivated antigen of the IBD virus, immobilized on a solid carrier, positive blood serum of chickens to the IBD virus, negative blood serum of chickens to the IBD virus, the preparation of goat antibodies to chicken IgG conjugated to horseradish peroxidase, with gentamicin, a buffer solution for dilution and washing of immunospecific components, a buffer solution for dilution of TMB substrate concentrate, stopping the solution.

Данный набор позволяет измерять уровень антител к вирусу ИББ в сыворотках крови кур (7). This kit allows you to measure the level of antibodies to the IBD virus in chicken serum (7).

Общим недостатком указанных наборов является то, что они импортные, что определяет высокую себестоимость соответствующих исследований. A common drawback of these sets is that they are imported, which determines the high cost of relevant studies.

Известен набор для определения антител к вирусу ИББ птиц в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса ИББ, иммобилизованный на твердом носителе, положительную сыворотку крови кур к вирусу ИББ, отрицательную сыворотку крови кур к вирусу ИББ, лиофильно высушенный антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов, субстратный буфер, детергент твин-20, краситель, 5-аминосалициловую кислоту, гидроперит (8). Недостатки данного набора состоят в его низкой активности и специфичности, а также высокой себестоимости изготовления. A known kit for determining antibodies to the IBD virus of birds in ELISA, containing purified and inactivated IBD virus antigen immobilized on a solid carrier, positive chicken blood serum to the IBD virus, negative chicken blood serum to the IBD virus, freeze-dried anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins, buffer solution for dilution and washing of immunospecific components, substrate buffer, tween-20 detergent, dye, 5-aminosalicylic acid, hydroperite (8). The disadvantages of this kit are its low activity and specificity, as well as the high cost of manufacturing.

Известен также карбоксилсодержащий катионит КБ-4-П2, который является органическим ионообменным веществом слабокислотного типа в натриевой форме. Известно его применение для селективного удаления небольших количеств двухвалентных катионов из смесей с большими концентрациями одновалентных катионов, для очистки катионного обмена (9). Also known is a carboxyl-containing cation exchanger KB-4-P2, which is an organic ion-exchange substance of a weakly acid type in sodium form. Its use is known for the selective removal of small amounts of divalent cations from mixtures with high concentrations of monovalent cations, for the purification of cation exchange (9).

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является набор для определения антител к вирусу ИББ птиц в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса ИББ кур, иммобилизованный на твердом носителе, сухие положительную сыворотку крови кур к вирусу ИББ, отрицательную сыворотку крови кур к вирусу ИББ и антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащие 5% сахарозы или желатозы, или лактозы, буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов, субстратный буфер, краситель, детергент и гидроперит (10, 11). The closest to the invention according to the set of essential features is a kit for determining antibodies to the IBD virus of birds in ELISA, containing a purified and inactivated antigen of the IBD virus of chickens immobilized on a solid carrier, dried positive chicken blood serum to the IBD virus, negative chicken serum to the IBD virus and anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins, additionally containing 5% sucrose or gelatose, or lactose, a buffer solution for dilution and washing specific components, substrate buffer, dye, detergent and hydroperite (10, 11).

Недостатки набора - прототипа состоят в его низкой активности и специфичности, а также высокой себестоимости изготовления. Это объясняется тем, что в наборе-прототипе используются лиофилизированные биокомпоненты, сложность получения которых заключается в том, что для лиофилизации необходимо использовать оптимальные объемы нативного материала (минимум 0,5 см³), иначе невозможно получить нормальную таблетку. Даже используя для лиофилизации такие минимальные объемы, существует опасность размораживания материала при загрузке и потери активности при высушивании, особенно конъюгата и специфической сыворотки. Процесс лиофилизации с предварительным замораживанием продолжается около 3 суток. Кроме того, при регидратации таблеток и разведении конъюгата до рабочего состояния после использования излишки ценных биокомпонентов подвергают утилизации, так как они не подлежат хранению.The disadvantages of the prototype kit are its low activity and specificity, as well as the high cost of manufacturing. This is because the prototype kit uses lyophilized biocomponents, the difficulty of obtaining which is that for lyophilization it is necessary to use the optimal volumes of native material (at least 0.5 cm ³ ), otherwise it is impossible to get a normal tablet. Even using such minimal volumes for lyophilization, there is a danger of thawing of the material during loading and loss of activity during drying, especially the conjugate and specific serum. The freeze-drying process with preliminary freezing lasts about 3 days. In addition, during rehydration of the tablets and dilution of the conjugate to a working state after use, excess valuable biocomponents are disposed of, since they are not subject to storage.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка набора для определения антител к вирусу ИББ птиц в ИФА, обладающего более высокой активностью и специфичностью и низкой себестоимостью изготовления. The task of creating the present invention was the development of a kit for determining antibodies to the IBD virus in ELISA, with higher activity and specificity and low cost of manufacture.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении активности и специфичности набора и снижении себестоимости его изготовления. The technical result from the use of the invention is to increase the activity and specificity of the kit and reduce the cost of its manufacture.

Указанный технический результат достигнут созданием изобретения, охарактеризованного следующей совокупностью признаков:
1. Набор для определения антител к вирусу ИББ птиц в ИФА.The specified technical result is achieved by the creation of the invention, characterized by the following set of features:
1. A kit for determining antibodies to the IBD virus of birds in ELISA.

1.1. Очищенный и инактивированный антиген вируса ИББ кур, иммобилизованный на твердом носителе. 1.1. Purified and inactivated IBD virus antigen of chickens immobilized on a solid carrier.

1.2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ дополнительно содержит карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 1.2. Dry positive blood serum of chickens to the IBD virus additionally contains a carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.

1.2.1. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Положительная сыворотка - 2 - 15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
1.2.2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ, полученная контактным обезвоживанием.1.2.1. Dry positive blood serum of chickens to the IBD virus and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Positive serum - 2 - 15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
1.2.2. Dry positive blood serum of chickens to the IBD virus obtained by contact dehydration.

1.3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур дополнительно содержит карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 1.3. Dry negative blood serum of chickens additionally contains carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.

1.3.1. Сухая отрицательная сыворотка крови кур к вирусу ИББ и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Отрицательная сыворотка - 2 - 15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
1.3.2. Сухая отрицательная сыворотка крови кур к вирусу ИББ, полученная контактным обезвоживанием.1.3.1. Dry negative blood serum of chickens to the IBD virus and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Negative Serum - 2 - 15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
1.3.2. Dry negative blood serum of chickens to the IBD virus obtained by contact dehydration.

1.4. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур дополнительно содержит карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 1.4. The dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins further comprises a carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.

1.4.1. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Антивидовой иммунопероксидазный конъюгат - 2 - 15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
1.4.2. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.1.4.1. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins and carboxyl-containing cation exchanger KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Anti-Immunoperoxidase Conjugate - 2 - 15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
1.4.2. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins obtained by contact dehydration.

1.5. Буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов. 1.5. Buffer solution for dilution and washing of immunospecific components.

1.5.1. В качестве буферного раствора для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор. 1.5.1. As a buffer solution for dilution and washing of immunospecific components, the kit contains a Tris buffer solution.

1.6. Субстратный буфер. 1.6. Substrate buffer.

1.6.1. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер. 1.6.1. As a substrate buffer, the kit contains a phosphate-citrate buffer.

1.7. Детергент. 1.7. Detergent.

1.7.1. Из детергентов набор содержит твин-20. 1.7.1. Of the detergents, the kit contains tween-20.

1.8. Краситель. 1.8. Dye.

1.8.1. Из красителей набор содержит ортофенилендиамин (ОФД). 1.8.1. Of the dyes, the kit contains orthophenylenediamine (CRF).

1.8.2. Из красителей набор содержит АБТС. 1.8.2. Of the dyes, the kit contains ABTS.

1.9. Гидроперит. 1.9. Hydroperite.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1. Набор для определения антител к вирусу ИББ птиц в ИФА.The present invention includes the following set of essential features that provide a technical result in all cases for which legal protection is sought:
1. A kit for determining antibodies to the IBD virus of birds in ELISA.

1.6. Субстратный буфер. 1.6. Substrate buffer.

1.7. Детергент. 1.7. Detergent.

1.8. Краситель. 1.8. Dye.

1.9. Гидроперит. 1.9. Hydroperite.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования:
1. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Положительная сыворотка - 2 - 15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ, полученная контактным обезвоживанием.The present invention is also characterized by other features expressing specific forms of its implementation or special conditions of use:
1. Dry positive blood serum of chickens to the IBD virus and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Positive serum - 2 - 15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
2. Dry positive blood serum of chickens to the IBD virus obtained by contact dehydration.

3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Отрицательная сыворотка - 2 - 15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
4. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, полученная контактным обезвоживанием.3. Dry negative blood serum of chickens and carboxyl-containing cation exchanger KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Negative Serum - 2 - 15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
4. Dry negative serum of chickens obtained by contact dehydration.

5. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Конъюгат - 2 - 15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
6. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.5. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Conjugate - 2 - 15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
6. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins obtained by contact dehydration.

7. В качестве буферного раствора для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор. 7. As a buffer solution for dilution and washing of immunospecific components, the kit contains a Tris buffer solution.

8. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер. 8. The kit contains a phosphate citrate buffer as a substrate buffer.

9. Из детергентов набор содержит твин-20. 9. Of the detergents, the kit contains tween-20.

10. Из красителей набор содержит ОФД. 10. Of the dyes, the kit contains OFD.

11. Из красителей набор содержит АБТС. 11. Of the dyes, the kit contains ABTS.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый набор и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1. Набор для определения антител к вирусу ИББ птиц в ИФА.The signs of the invention, characterizing the proposed set and coinciding with the signs of the prototype, including the generic concept, reflecting the purpose, are:
1. A kit for determining antibodies to the IBD virus of birds in ELISA.

2. Очищенный и инактивированный антиген ИББ кур, иммобилизованный на твердом носителе. 2. Purified and inactivated IBD chicken antigen, immobilized on a solid carrier.

3. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ кур. 3. Dry positive blood serum of chickens to the IBD virus of chickens.

4. Сухая отрицательная сыворотка крови кур. 4. Dry negative blood serum of chickens.

5. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур. 5. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins.

6. Буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов. 6. Buffer solution for dilution and washing of immunospecific components.

7. Субстратный буфер. 7. The substrate buffer.

8. Детергент. 8. Detergent.

9. Краситель. 9. Dye.

10. Гидроперит. 10. Hydroperite.

По сравнению с набором-прототипом существенными отличительными признаками предлагаемого набора являются:
1. Сухая положительная сыворотка крови кур дополнительно содержит карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.Compared with the prototype kit, the salient features of the proposed kit are:
1. Dry positive blood serum of chickens additionally contains carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.

2. Сухая отрицательная сыворотка кур дополнительно содержит карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 2. Dry negative chicken serum additionally contains a carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.

3. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур дополнительно содержит карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 3. The dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins further comprises a KB-4P-2 carboxyl-containing cation exchanger.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования:
1. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Положительная сыворотка - 2 - 15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ, полученная контактным обезвоживанием.The present invention is also characterized by other distinctive features expressing specific forms of its implementation or special conditions of use:
1. Dry positive blood serum of chickens to the IBD virus and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Positive serum - 2 - 15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
2. Dry positive blood serum of chickens to the IBD virus obtained by contact dehydration.

3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур к вирусу ИББ и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Отрицательная сыворотка - 2 - 15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
4. Сухая отрицательная сыворотка крови кур к вирусу ИББ, полученная контактным обезвоживанием.3. Dry negative blood serum of chickens to the IBD virus and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Negative Serum - 2 - 15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
4. Dry negative blood serum of chickens to the IBD virus obtained by contact dehydration.

5. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Антивидовой иммунопероксидазный конъюгат - 2 - 15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
6. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.5. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Anti-Immunoperoxidase Conjugate - 2 - 15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
6. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins obtained by contact dehydration.

Предлагаемый набор обладает более высокой активностью и специфичностью и низкой себестоимостью изготовления. The proposed set has a higher activity and specificity and low manufacturing cost.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволили установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого набора, изложенных в независимом пункте формулы изобретения. The analysis of the prior art by the applicant, including a search by patent and scientific and technical sources of information, and the identification of sources containing information about analogues of the invention, it was established that the applicant did not find sources characterized by signs that are identical (identical) to all the essential features of the invention. The definition from the list of identified analogues of the prototype, as the closest in the totality of features, made it possible to establish a set of essential distinguishing features of the proposed set with respect to the technical result perceived by the applicant as set forth in the independent claim.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна". Therefore, the claimed invention meets the condition of patentability "novelty."

Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. В результате поиска установлено следующее. To verify the conformity of the proposed solution to the patentability condition "inventive step", an additional search for known solutions was carried out to identify features included in the distinctive part of the independent claim. The search resulted in the following.

Известно использование карбоксилсодержащего катионита КБ-4П-2 для селективного удаления небольших количеств двухвалентных катионов из смесей с большими концентрациями одновалентных катионов, а также для очистки стрептомицина и других реакций катионного обмена (9). Для высушивания микроколичеств иммуноспецифических компонентов предлагаемого набора авторами использован впервые карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2, при этом авторами обнаружено новое, ранее неизвестное, свойство катионита КБ-4П-2 не изменять нативные характеристики иммуноспецифических компонентов при обезвоживании и одновременно повышать их специфичность и активность. It is known to use carboxyl-containing cation exchanger KB-4P-2 for the selective removal of small amounts of divalent cations from mixtures with high concentrations of monovalent cations, as well as for the purification of streptomycin and other cation exchange reactions (9). The authors used the carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 for the first time to dry micro-quantities of the immunospecific components of the proposed kit, while the authors discovered a new, previously unknown property of the cation exchange resin KB-4P-2 not to change the native characteristics of the immunospecific components during dehydration and at the same time increase their specificity and activity.

Результаты поиска показывают, что предлагаемое изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены аналогичные решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата. Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень". The search results show that the proposed invention does not follow explicitly from the prior art set forth in the corresponding section of the description (similar solutions have not been identified that have features matching the distinctive features of the proposed invention), and the effect of the essential features of the proposed invention is not revealed transformations to achieve a technical result. Therefore, the present invention meets the condition of patentability "inventive step".

Сущность изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения. The invention is illustrated by examples of its execution, which do not limit the scope of the invention.

Пример 1. Example 1

Набор для определения антител к вирусу ИББ птиц в ИФА содержит следующие компоненты: очищенный и инактивированный антиген вируса ИББ кур, штамм "БГ", нанесенный на пластиковый планшет (два планшета), дополнительно содержащие карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 сухие положительную сыворотку крови кур к вирусу ИББ (одна ампула), отрицательную сыворотку крови кур (одна ампула) и антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобинов кур (одна ампула), а также набор солей для приготовления трис-буферного раствора, используемого для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов и содержащего трис (оксиметил) аминометан в количестве 0,97 г, трис (оксиметил) аминометан гидрохлорид в количестве 6,61 г, хлористый натрий в количестве 11,7 г (три флакона), набор солей для приготовления субстратного буфера, содержащего натрий фосфорнокислый двузамещенный в количестве 5,37 г и лимонную кислоту в количестве 1,57 г (фосфатно-цитратный буфер - два флакона), ОФД (одна таблетка) или АБТС (одна таблетка), детергент твин-20 (один флакон), гидроперит (одна таблетка). The kit for determining antibodies to the IBD virus of birds in ELISA contains the following components: purified and inactivated antigen of the IBD virus of chickens, strain "BG", applied to a plastic tablet (two tablets), optionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 dry positive blood serum of hens to the IBD virus (one ampoule), negative blood serum of chickens (one ampoule) and anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobins (one ampoule), as well as a set of salts for the preparation of Tris-buffer solution used for dilution and washing of immunospecific components and containing tris (oxymethyl) aminomethane in an amount of 0.97 g, tris (oxymethyl) aminomethane hydrochloride in an amount of 6.61 g, sodium chloride in an amount of 11.7 g (three bottles), a set of salts for the preparation of substrate a buffer containing sodium phosphate disubstituted in an amount of 5.37 g and citric acid in an amount of 1.57 g (phosphate-citrate buffer - two bottles), OFD (one tablet) or ABTS (one tablet), tween-20 detergent (one bottle ), hydroperite (one tablet).

Пример 2. Example 2

Для изготовления антигена вируса ИББ используют производственный штамм "БГ". Вирус культивируют на 9-11-дневных SPF-эмбрионах кур при 37^oС и влажности 60%. Первый пассаж является матровой расплодкой, которую используют для получения необходимого количества вируссодержащего сырья. Вируссодержащий материал, включающий пенициллин - стрептомициновую смесь (200-300 Ед/см³), инокулируют в объеме 0,2 см³ на хориоаллантоиссную оболочку (ХАО) в области пуги. Инфицированные эмбрионы содержат при стандартных условиях. Специфическое действие вируса проявляется между 24 и 96 часами с момента заражения. В этот период производят овоскопию с интервалом 3-4 час. Эмбрионы с признаками остановки сердца (отсутствие кровенаполнения сосудов) и отбирают и охлаждают до 2-6^oС. На коллоидной мельнице или РТ-приборе из отобранных эмбрионов получают мелкодисперсный гомогенат тканей и жидкостей эмбрионов (30% суспензия на изотоническом фосфатно-буферном растворе (ФБР) со средним размером частиц 0,1-0,3 мм). Полученную суспензию замораживают при -70^oС, оттаивают и центрифугируют при 2000 g в течение 15 мин для осаждения крупнодисперсных компонентов. Супернатант используют в качестве вируссодержащего материала, который хранят в замороженном (при -70^oС) или лиофилизованном состоянии. Полученный вирус подвергают инактивации. Для этого в полученную вируссодержащую суспензию вносят аминоэтилэтиленимин до концентрации 0,2%. Инактивацию ведут при 27^oС в течение 24 час при периодическом перемешивании смеси. По окончании инактивации к полученному антигену добавляют 20% хлороформа и смесь шуттелируют в течение 10 минут. Полученную взвесь центрифугируют при 3000 g в течение 15-20 мин и отбирают супернатант. Для осаждения антигена к супернатанту добавляют 7,5% ПЭГ и выдерживают при 4^oС в течение 16 часов. Осадок собирают центрифугированием при 17000 g в течение 20 мин и ресуспендируют в ФБР из расчета 1/20 от исходного объема. Затем антиген фракционируют дополнительно в сформированном ступенчатом градиенте плотности хлористого цезия и сахарозы. Для этого в стаканах для ультрацентрифугирования образуют градиент, состоящий из равных объемов раствора CsCl раствора сахарозы. Инактивированную суспензию в объеме 1/5 от общего объема наносят на градиент и центрифугируют при 70000 g в течение 3 часов. Фракционирование градиента проводят на проточном спектрофотометре при длине волны 280 нм. Фракции, соответствующие пикам оптической плотности, объединяют и диализируют при ФБР при 4^oС в течение 12-18 час. Чистоту и гомогенность антигенных препаратов контролируют электронной микроскопией, спектрофотометрией и электрофорезом вирусных белков в SDS-ПААГе.For the manufacture of the antigen of the IBD virus, the production strain "BG" is used. The virus is cultured on 9-11-day-old SPF chicken embryos at 37 ^{° C.} and 60% humidity. The first passage is a matte seedling, which is used to obtain the required amount of virus-containing raw materials. Virus-containing material, including penicillin - a streptomycin mixture (200-300 U / cm ³ ), is inoculated in a volume of 0.2 cm ³ on the chorioallantoiss membrane (CAO) in the region of the feather. Infected embryos are kept under standard conditions. The specific action of the virus appears between 24 and 96 hours after infection. During this period, ovoscopy is performed with an interval of 3-4 hours. Embryos with signs of cardiac arrest (lack of blood supply to the vessels) are taken and cooled to 2-6 ^° C. At a colloid mill or a PT device, finely dispersed homogenate of tissue and embryonic fluids is obtained from selected embryos (30% suspension in isotonic phosphate-buffered solution (FBI ) with an average particle size of 0.1-0.3 mm). The resulting suspension was frozen at -70 ^o C, thawed and centrifuged at 2000 g for 15 min to precipitate coarse components. The supernatant is used as a virus-containing material, which is stored in a frozen (at -70 ^o C) or lyophilized state. The resulting virus is subjected to inactivation. For this, aminoethylethyleneimine is added to the resulting virus-containing suspension to a concentration of 0.2%. Inactivation is carried out at 27 ^o C for 24 hours with periodic stirring of the mixture. At the end of inactivation, 20% chloroform is added to the resulting antigen and the mixture is jutted for 10 minutes. The resulting suspension is centrifuged at 3000 g for 15-20 minutes and the supernatant is taken. To precipitate the antigen, 7.5% PEG was added to the supernatant and kept at 4 ^{° C.} for 16 hours. The precipitate was collected by centrifugation at 17000 g for 20 min and resuspended in the FBI at the rate of 1/20 of the original volume. Then the antigen is further fractionated in the formed stepwise density gradient of cesium chloride and sucrose. For this, a gradient consisting of equal volumes of a sucrose solution CsCl solution is formed in ultracentrifugation beakers. An inactivated suspension in a volume of 1/5 of the total volume is applied to the gradient and centrifuged at 70,000 g for 3 hours. Gradient fractionation is carried out on a flow spectrophotometer at a wavelength of 280 nm. The fractions corresponding to the peaks of optical density, are combined and dialyzed with PBS at 4 ^o C for 12-18 hours. The purity and homogeneity of antigenic preparations is controlled by electron microscopy, spectrophotometry and electrophoresis of viral proteins in SDS-PAGE.

Полученный антиген контролируют на остаточную инфекционность. Для этого антиген восстанавливают пенициллин-стрептомициновой смесью на ФБР до объема, предшествующего процедуре концентрирования. Полученный материал исследуют на присутствие инфекционного вируса на куриных эмбрионах. В контроле используют не менее 30 эмбрионов, которые в течение 5 суток не должны проявлять специфических признаков развития инфекционного процесса, характерного для вируса ИББ. В случае сомнительного результата процедуру контроля повторяют. The resulting antigen is monitored for residual infectivity. For this, the antigen is reduced with the penicillin-streptomycin mixture on the FBI to the volume preceding the concentration procedure. The resulting material is examined for the presence of an infectious virus in chicken embryos. At least 30 embryos are used in the control, which within 5 days should not show specific signs of the development of the infectious process characteristic of the IBD virus. In case of doubtful results, the control procedure is repeated.

Полученный антиген подвергают морфологическому контролю путем оценки структурного состояния вирионов с помощью электронного микроскопа. Содержание разрушенных или частично поврежденных вирусных частиц не должно превышать 1/3 от числа наблюдаемых вирионов. The resulting antigen is subjected to morphological control by assessing the structural state of virions using an electron microscope. The content of destroyed or partially damaged viral particles should not exceed 1/3 of the number of observed virions.

Активность и специфичность полученного антигена определяют в непрямом варианте ИФА. Для этого антиген иммобилизуют на планшет в различных концентрациях (разведения от 1: 50 до 1:300) и исследуют в непрямом варианте ИФА. Определяют ту концентрацию (разведение), при которой специфичная к ИББ гипериммунная сыворотка кур демонстрирует титр не менее чем 1:12800. Исключают неспецифические реакции. Исследуемый антиген не должен специфически реагировать с сыворотками, имеющими антитела к вирусам: бронхита, ньюкаслской болезни, адено-, рео-, ларинготрахеита, а также к бактериальным антигенам: сальмонеллеза и пастереллеза. The activity and specificity of the obtained antigen is determined in an indirect ELISA. For this, the antigen is immobilized on a tablet in various concentrations (dilutions from 1: 50 to 1: 300) and examined in an indirect ELISA. The concentration (dilution) is determined at which the IBD-specific chicken hyperimmune serum shows a titer of at least 1: 12800. Exclude non-specific reactions. The studied antigen should not specifically react with sera having antibodies to viruses: bronchitis, Newcastle disease, adeno-, reo-, laryngotracheitis, as well as to bacterial antigens: salmonellosis and pasteurellosis.

Прошедший необходимые тесты препарат антигена вируса ИББ используют для иммобилизации на планшеты. Количество антигена, необходимое для изготовления партии наборов, размораживают и готовят рабочее разведение в буфере для разведения антигена. После инкубации в течение 18 часов при 4^oС или 2 часов при 37^oС раствор антигена удаляют, планшеты промывают буфером и вносят по 0,1 см³ блокирующего раствора. Инкубируют 1 час при комнатной температуре и промывают 3 раза буфером. Планшеты высушивают на воздухе и упаковывают в полиэтиленовые пакеты поштучно.IBC virus antigen preparation that has passed the necessary tests is used for immobilization on tablets. The amount of antigen needed to make a batch of sets is thawed and a working dilution is prepared in the buffer for dilution of the antigen. After incubation for 18 hours at 4 ^° C or 2 hours at 37 ^° C, the antigen solution is removed, the plates are washed with buffer and 0.1 cm ^{3 of} blocking solution are added. Incubated for 1 hour at room temperature and washed 3 times with buffer. The tablets are air dried and packaged in plastic bags individually.

Пример 3. Для получения положительной сыворотки в качестве доноров используют безлейкозных цыплят в возрасте 21-42 дней, которым инокулируют производственный штамм "БГ" вируса инфекционной бурсальной болезни кур с инфекционной активностью не ниже 10000 ЭИД₅₀/см³ в дозе 100 ЭИД₅₀/0,2 см³ интраназально. Через 21 сутки птицу подвергают гипериммунизации. Для гипериммунизации используют антиген вируса ИББ, полученный так, как описано в примере 1. Предварительно антиген эмульгируют 3-5минут в тканевом гомогенизаторе с равным объемом масляного адъюванта типа неполного адъюванта Фрейнда. Препарат вводят цыплятам внутримышечно в грудную мышцу или подкожно в область шеи в дозе 0,5 см³. Спустя 10 суток проводят пробное взятие крови для определения активности гипериммунной сыворотки в РДП. В случае, если она проявляется в разведениях не ниже 1:16, цыплят тотально обескровливают с соблюдением правил асептики и антисептики в увлажненные физиологическим раствором пробирки. Если активность сывороток ниже указанного максимального уровня, проводят дополнительную иммунизацию свежеприготовленным антигеном с адъювантом, а спустя 10 суток доноров тотально обескровливают. Индивидуальные пробы крови выдерживают сначала при +37^oС в течение 30-60 мин, а затем при +4^oС в течение суток. Отстоявшуюся сыворотку отсасывают в стерильные пробирки, не допуская попадания эритроцитов и других форменных элементов крови, инактивируют при +57^oС в течение 30 минут, консервируют хинозолом в соотношении 1:1000. Полученную сыворотку смешивают с карбоксилсодержащим катионитом КБ-4П-2 в соотношении, мас.%, 2:98-15:85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию.Example 3. To obtain a positive serum are used as donors bezleykoznyh chickens aged 21-42 days, which was inoculated production strain "BG" viral infectious bursal disease of chickens with infectious activity of not lower than 10,000 EID ₅₀ / cm ³ at a dose of 100 EID _50/0 , 2 cm ³ intranasally. After 21 days, the bird is subjected to hyperimmunization. For hyperimmunization, the IBD virus antigen obtained as described in Example 1 is used. Preliminarily, the antigen is emulsified in a tissue homogenizer for 3-5 minutes with an equal volume of an oil adjuvant of the type of incomplete Freund adjuvant. The drug is administered to chickens intramuscularly in the pectoral muscle or subcutaneously in the neck at a dose of 0.5 cm ³ . After 10 days, a test blood sample is taken to determine the activity of hyperimmune serum in the RDP. In the event that it manifests itself in dilutions of at least 1:16, the chickens are totally bled with observing the rules of asepsis and antiseptics in tubes moistened with physiological saline. If the activity of the sera is below the indicated maximum level, an additional immunization is carried out with a freshly prepared antigen with adjuvant, and after 10 days the donors are totally bled. Individual blood samples can withstand first at +37 ^o C for 30-60 minutes, and then at +4 ^o C for a day. The settled serum is aspirated into sterile tubes, preventing the ingress of red blood cells and other formed blood elements, inactivated at +57 ^° C for 30 minutes, and preserved with quinosol in a ratio of 1: 1000. The resulting serum is mixed with carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 in the ratio, wt.%, 2: 98-15: 85 (these ratios are optimal) and subjected to contact dehydration.

Пример 4. Example 4

Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к вирусу ИББ, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Положительная сыворотка - 2,0
Катионит КБ-4П-2 - 98,0.Comparative tests were performed in ELISA of dry positive blood serum of chickens to the IBB virus, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 and obtained by contact dehydration, while the content of ingredients in this mixture is, wt.%:
Positive serum - 2.0
Cation exchange resin KB-4P-2 - 98.0.

Результаты испытаний представлены в таблице 1. The test results are presented in table 1.

Представленные в таблице 1 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ превосходит по активности и специфичности таковую прототипа, полученную методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев. The data presented in table 1 indicate that the dry positive blood serum of chickens for IBD virus obtained by contact dehydration exceeds the activity and specificity of that of the prototype obtained by freeze drying and is stored without decrease in activity for 12 months.

Пример 5. Example 5

Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к вирусу ИББ, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КП-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Положительная сыворотка - 7,0
Катионит КБ-4П-2 - 93,0
Результаты испытаний представлены в таблице 2.Comparative tests were performed in ELISA of dry positive blood serum of chickens to the IBB virus, additionally containing carboxyl-containing cation exchanger KP-4P-2 and obtained by contact dehydration, while the content of ingredients in this mixture is, wt.%:
Positive serum - 7.0
Cation exchange resin KB-4P-2 - 93.0
The test results are presented in table 2.

Представленные в таблице 2 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ превосходит по активности и специфичности таковую прототипа, полученного методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев. The data presented in table 2 indicate that obtained by contact dehydration dry positive blood serum of chickens to the IBD virus exceeds the activity and specificity of that of the prototype obtained by freeze drying and is stored without decrease in activity for 12 months.

Пример 6. Example 6

Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к вирусу ИББ, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет мас.%:
Положительная сыворотка - 15,0
Катионит КБ-4П-2 - 85,0
Результаты испытаний представлены в таблице 3.Comparative tests were carried out in ELISA of dry positive blood serum of chickens to the IBB virus, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 and obtained by contact dehydration, while the content of ingredients in this mixture is wt.%:
Positive serum - 15.0
Cation exchange resin KB-4P-2 - 85.0
The test results are presented in table 3.

Представленные в таблице 3 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИББ превосходит по активности и специфичности таковую прототипа, полученную методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев. The data presented in table 3 indicate that obtained by contact dehydration dry positive blood serum of chickens to the IBD virus exceeds the activity and specificity of that of the prototype obtained by freeze drying, and is stored without decrease in activity for 12 months.

Пример 7. Example 7

Используемую в качестве компонента набора отрицательную сыворотку крови кур к вирусу ИББ получают от здоровой безлейкозной птицы. К полученной сыворотке добавляют карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 в соотношении, мас.%, 2: 98-15: 85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию. Used as a component of the kit, negative chicken blood serum for the IBD virus is obtained from a healthy non-leukemic bird. To the resulting serum add carboxyl-containing cation exchanger KB-4P-2 in the ratio, wt.%, 2: 98-15: 85 (these ratios are optimal) and subjected to contact dehydration.

Пример 8. Example 8

В предлагаемом наборе используют антивидовые коммерческие конъюгаты, выпускаемые НИИЭМ имени Н.Ф.Гамалея, представляющие собой глобулиновую фракцию, выделенную из антисыворотки, полученной иммунизацией кур и меченную пероксидазой хрена. К конъюгату добавляют карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 в соотношении, мас.%, 2:98-15:85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию. The proposed kit uses anti-species commercial conjugates manufactured by the NF Gamalei Research Institute of Nuclear Power Engineering, representing a globulin fraction isolated from antiserum obtained by immunization of chickens and labeled with horseradish peroxidase. To the conjugate add carboxyl-containing cation exchanger KB-4P-2 in the ratio, wt.%, 2: 98-15: 85 (these ratios are optimal) and subjected to contact dehydration.

Пример 9. Example 9

Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученный контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Конъюгат - 2,0
Катионит КБ-4П-2 - 98,0
Результаты испытаний представлены в таблице 4.Comparative tests were carried out in ELISA of a dry antiviral immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 and obtained by contact dehydration, while the content of ingredients in this mixture is, wt.%:
Conjugate - 2.0
Cation exchange resin KB-4P-2 - 98.0
The test results are presented in table 4.

Представленные в таблице 4 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат превосходит по активности и специфичности таковой прототипа, полученный методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев. The data presented in table 4 indicate that the dry antiviral immunoperoxidase conjugate obtained by contact dehydration is superior in activity and specificity to that of the prototype obtained by freeze drying, and is stored without decrease in activity for 12 months.

Пример 10. Example 10

Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученного контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Конъюгат - 7,0
Катионит КБ-4П-2 - 93,0.Comparative tests were performed in ELISA of a dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 and obtained by contact dehydration, while the content of ingredients in this mixture is, wt.%:
Conjugate - 7.0
Cation exchange resin KB-4P-2 - 93.0.

Результаты испытаний представлены в таблице 5. The test results are presented in table 5.

Представленные в таблице 5 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат превосходит по активности и специфичности таковой прототипа, полученный методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев. The data presented in table 5 indicate that the dry antiviral immunoperoxidase conjugate obtained by contact dehydration is superior in activity and specificity to that of the prototype obtained by freeze drying and is stored without decrease in activity for 12 months.

Пример 11. Example 11

Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученного контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Конъюгат - 15,0
Катионит КБ-4П-2 - 85,0
Результаты испытаний представлены в таблице 6.Comparative tests were performed in ELISA of a dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 and obtained by contact dehydration, while the content of ingredients in this mixture is, wt.%:
Conjugate - 15.0
Cation exchange resin KB-4P-2 - 85.0
The test results are presented in table 6.

Представленные в таблице 6 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат превосходит по активности и специфичности таковой прототипа, полученный методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев. The data presented in table 6 indicate that the dry antiviral immunoperoxidase conjugate obtained by contact dehydration is superior in activity and specificity to that of the prototype obtained by freeze drying, and is stored without decrease in activity for 12 months.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- набор для определения антител к вирусу ИББ кур в ИФА, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов %;
- набор для определения антител к вирусу ИББ кур в ИФА, приготовленный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой активностью и специфичностью, а также низкой себестоимостью изготовления.Thus, the above information indicates the fulfillment when using the invention of the following set of conditions:
- a kit for determining antibodies to the IBD virus of chickens in ELISA, embodying the invention, is intended for use in agriculture, namely in veterinary virology and biotechnology;
- for the proposed invention in the form described in the independent claim, the possibility of its implementation using the means and methods described in the application or known prior to the priority date is confirmed%;
- a kit for determining antibodies to the IBD virus of chickens in ELISA, prepared in accordance with the invention, has high activity and specificity, as well as low manufacturing costs.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость". Therefore, the present invention meets the condition of patentability "industrial applicability".

Источники информации
1. Manual of standards for diagnostic tests and Vaccines. Office International des Epizooties, world Organisation for Animal Health. Paris, 1966, 723 p.Sources of information
1. Manual of standards for diagnostic tests and Vaccines. Office International des Epizooties, world Organization for Animal Health. Paris, 1966, 723 p.

2. Cullen G.A., Wyeth P.J. Quantitation of antibodies to infectious bursal disease. Vet. Rec., 1975, 97, 315. 2. Cullen G.A., Wyeth P.J. Quantitation of antibodies to infectious bursal disease. Vet. Rec., 1975, 97, 315.

3. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я. и др. Вирусные болезни животных. М., ВНИТИБП, 1998, 65-84. 3. Syurin V.N., Samuilenko A.Ya. and other viral diseases of animals. M., VNITIBP, 1998, 65-84.

4. Временное наставление по применению диагностического набора "Иммунокомб IBD/ND/IBV для определения антител против возбудителей инфекционной бурсальной болезни (ИББ), болезни Нью-Кастла (БН) и инфекционного бронхита (ИБ) у птиц (фирма "Биогал", Израиль). Одобрено Советом по ветеринарным препаратам. Протокол 2 от 27.03.96, 10 с. 4. Temporary instruction on the use of the diagnostic kit "Immunocomb IBD / ND / IBV for the determination of antibodies against pathogens of infectious bursal disease (IBD), New Castle disease (BN) and infectious bronchitis (IB) in birds (Biogal company, Israel) Approved by the Veterinary Medicines Board Protocol 2 of 03/27/96, 10 pp.

5. Infectious bursal disease antibody test fcit. Instruction. Catalog 54-81-01/КРL (Kirkegaard and Perry Laboratories), US, 2 Cessna Court Gaithersburg Maryland 20879, 8006383167. 5. Infectious bursal disease antibody test fcit. Instruction. Catalog 54-81-01 / KRL (Kirkegaard and Perry Laboratories), US, 2 Cessna Court Gaithersburg Maryland 20879, 8006383167.

6. Infectious bursal disease antibody test kit. Instruction. Catalog Code CK 113. BioChek C.V. Weth, Venteweg. 143.2805 J N Gonda, Holland. 6. Infectious bursal disease antibody test kit. Instruction. Catalog Code CK 113. BioChek C.V. Weth, Venteweg. 143.2805 J N Gonda, Holland.

7. IDEXX's instruction for an enzyme immunoassay for the detection of antibody in chicken serum. IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, USA, 1996, 30 р. 7. IDEXX's instruction for an enzyme immunoassay for the detection of antibody in chicken serum. IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, USA, 1996, 30 p.

8. Временное наставление по выявлению антител к вирусу ИББ кур иммуноферментным анализом. Утверждено Департаментом ветеринарии МСХП РФ 05.06.98, 13-7-2/1262. 8. Temporary guidance on the detection of antibodies to the IBD virus of chickens by enzyme immunoassay. Approved by the Veterinary Department of the Ministry of Agriculture of the Russian Federation on 05.06.98, 13-7-2 / 1262.

9. Краткая химическая энциклопедия. М., ГНИ "Сов. энциклопедия", 1963, т.2, 299-306. 9. Brief chemical encyclopedia. M., GNI "Sov. Encyclopedia", 1963, v.2, 299-306.

10. Инструкция по изготовлению и контролю диагностикумов и наборов для определения антител против вируса ИББ иммуноферментным методом, утвержденная директором ВНИИЗЖ 06.12.99. 10. Instructions for the manufacture and control of diagnostic kits and kits for determining antibodies against the IBD virus by the enzyme immunoassay method, approved by the director of ARRIAH 06.12.99.

11. ТУ 9388-028-00495527-99 на "Набор для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни иммуноферментным методом" (прототип). 11. TU 9388-028-00495527-99 on the "Kit for determining antibodies to the virus of infectious bursal disease by enzyme immunoassay" (prototype).

Claims

1. A kit for determining antibodies to the virus of infectious bursal disease of birds enzyme immunoassay, containing a purified and inactivated antigen of the virus of infectious bursal disease, immobilized on a solid carrier, dry positive blood serum of chickens to the virus of infectious bursal disease, dry negative blood serum of chickens and dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins, as well as a buffer solution for dilution and washing, substrate buffer, detergent, dye and hydroperite characterized in that the dry positive blood serum of chickens to the virus of infectious bursal disease, the dry negative blood serum of chickens and the dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins additionally contain a carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.

2. The kit according to claim 1, characterized in that the dry positive serum and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Positive serum - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
3. The kit according to claim 1, characterized in that it contains dry positive blood serum of chickens to the infectious bursal disease virus obtained by contact dehydration.

4. The kit according to p. 1, characterized in that the dry negative blood serum of chickens to the virus of infectious bursal disease and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Negative Serum - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
5. The kit according to claim 1, characterized in that it contains dry negative blood serum of chickens to the infectious bursal disease virus obtained by contact dehydration.

6. The kit according to claim 1, characterized in that the dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Conjugate - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
7. The kit according to claim 1, characterized in that it contains a dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins obtained by contact dehydration.

8. The kit according to claim 1, characterized in that it contains a Tris buffer solution as a buffer solution.

9. The kit according to claim 1, characterized in that as a substrate buffer it contains phosphate-citrate buffer.

10. The kit according to claim 1, characterized in that of the detergents it contains tween-200.

11. The kit according to claim 1, characterized in that of the dyes it contains orthophenylenediamine.

12. The kit according to claim 1, characterized in that of the dyes it contains 2,2'-azino-di [3-ethyl] benzthiazoline sulfonic acid.