RU2189042C1 - Kit for detecting antibodies to infectious bronchitis virus in hens - Google Patents
Kit for detecting antibodies to infectious bronchitis virus in hens Download PDFInfo
- Publication number
- RU2189042C1 RU2189042C1 RU2001105773A RU2001105773A RU2189042C1 RU 2189042 C1 RU2189042 C1 RU 2189042C1 RU 2001105773 A RU2001105773 A RU 2001105773A RU 2001105773 A RU2001105773 A RU 2001105773A RU 2189042 C1 RU2189042 C1 RU 2189042C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dry
- kit
- kit according
- blood serum
- virus
- Prior art date
Links
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к области диагностики, ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к получению наборов для обнаружения антител к вирусу инфекционного бронхита кур (ИБК) иммуноферментным анализом (ИФА), и может быть использовано при диагностике ИБК в научно-исследовательских учреждениях, региональных и областных ветеринарных лабораториях и при изготовлении указанных наборов на предприятиях биологической промышленности. The invention relates to the field of diagnostics, veterinary virology and biotechnology, in particular to the production of kits for detecting antibodies to the chicken infectious bronchitis virus (IBS) by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and can be used in the diagnosis of IBS in research institutions, regional and regional veterinary laboratories and in the manufacture of these kits at the enterprises of the biological industry.
ИБК - это вирусное высококонтагиозное заболевание, характеризующееся поражением респираторного тракта почек, тонкого отдела кишечника, яичников и яйцевода, а также снижением яйценоскости и дифференциацией скорлупы. Возбудителем болезни является РНК-содержащий вирус из семейства Coronaviridae. В настоящее время болезнь распространена в большинстве стран Европы, Америки и Азии, в Австралии, Японии, России и др., которые имеют развитое промышленное птицеводство. Основным источником ИБК является больная и переболевшая птица, выделяющая вирус со слюной, истечениями из носовых отверстий и глаз, при кашле и с фекалиями, контаминируя объекты внешней среды: воздух, воду, подстилку, предметы ухода и т.д., которые служат средствами распространения возбудителя. Вирус передается вертикально и горизонтально. Однако основным способом передачи считается аэрогенный путь. При инфицировании интактной птицы в полевых условиях заболеваемость может достигать 90% с летальностью от 5 до 30%, а при ассоциированной инфекции - до 60% и более. Инфекция не имеет сезонности и поражает птиц всех возрастов. Экономический ущерб складывается за счет падежа, снижения яичной продуктивности, а также из-за затрат на проведение ветеринарно-санитарных мероприятий, в том числе специфическую профилактику. Предрасполагающими факторами вспышки ИБК могут служить возбудители инфекционного ларинготрахеита, бурсита (болезни Гамборо), адено- и реовирусных инфекций, колисептицемии, сальмонеллеза, кампилобактериоза и др. , а также различные стресс-факторы. IBC is a highly contagious viral disease characterized by damage to the respiratory tract of the kidneys, small intestine, ovaries and oviduct, as well as a decrease in egg production and differentiation of the shell. The causative agent of the disease is an RNA-containing virus from the Coronaviridae family. Currently, the disease is common in most countries of Europe, America and Asia, in Australia, Japan, Russia and others, which have developed industrial poultry farming. The main source of IBS is a sick and ill bird that secrets a virus with saliva, outflows from the nasal openings and eyes, when coughing and with feces, contaminating environmental objects: air, water, bedding, grooming items, etc., which serve as distribution vehicles pathogen. The virus is transmitted vertically and horizontally. However, the main mode of transmission is the aerogenic pathway. When an intact bird is infected in the field, the incidence can reach 90% with a mortality rate of 5 to 30%, and with an associated infection, up to 60% or more. The infection has no seasonality and affects birds of all ages. Economic damage is due to the death, decrease in egg productivity, and also due to the costs of veterinary and sanitary measures, including specific prophylaxis. Pathogens of infectious coronary heart disease can be caused by pathogens of infectious laryngotracheitis, bursitis (Gamboro disease), adeno- and reovirus infections, colisepticemia, salmonellosis, campylobacteriosis, etc., as well as various stress factors.
Важными средствами борьбы против ИБК является своевременная диагностика заболевания и его вакцинопрофилактика. ИБК протекает остро, с характерной клиникой заболевания. При острой форме болезни на первый план выступают клинические и патологоанатомические признаки, свойственные вторичным инфекциям, что создает затруднения при постановке диагноза. Диагноз на ИБК устанавливают на основании клинических, патологоанатомических и эпизоотических данных, а также вирусологических и серологических исследований. An important means of combating IBS is the timely diagnosis of the disease and its vaccination. IBC is acute, with a characteristic clinic of the disease. In the acute form of the disease, clinical and pathological signs characteristic of secondary infections come to the fore, which creates difficulties in making a diagnosis. The diagnosis of IB is established on the basis of clinical, pathological and epizootic data, as well as virological and serological studies.
Серологическая диагностика ИБК является наиболее распространенной как в аспекте ретроспективного отслеживания возможных вспышек заболевания, так и оценки эффективности его специфической профилактики. Для обнаружения вирусного антигена или специфических антител, свидетельствующих о контакте птиц с вирусом, используют различные серологические тесты, позволяющие выявлять комплексы антиген-антитело (иммунные комплексы). Такими тестами являются РЗГА, РДП, РПГА, РН, твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) и др. , в которых исследуют сыворотки крови переболевших птиц. Наиболее простыми, дешевыми и высокопроизводительными методами антител являются РЗГА, РТГА и твердофазный ИФА (1). Для массового серологического обследования птиц на наличие антител к вирусу ИБК чаще используют высокопроизводительный и автоматизированный твердофазный ИФА. Для выявления антител к вирусу ИБК и определения их концентрации в сыворотках крови получил распространение непрямой вариант твердофазного ИФА, в котором исследуемый образец взаимодействует с антигеном, иммобилизованном на планшете из оптически прозрачного полимера с 96 лунками. Далее антитела в составе иммунных комплексов реагируют с конъюгатом. Результаты анализа с высокой точностью фиксируют средствами спектрофотометрии. Для обнаружения и оценки титра антигена вируса ИБК в биологических материалах широко применяют непрямой сэндвич-вариант ИФА, при осуществлении которого исследуемый антиген вначале улавливается специфическими антителами, иммобилизованными на планшете, а затем выявляется детекторными антителами, с которыми взаимодействует конъюгат. Результаты анализа фиксируют также с помощью спектрофотометра. Serological diagnosis of IBS is the most common in terms of retrospective monitoring of possible outbreaks of the disease, and evaluating the effectiveness of its specific prophylaxis. To detect viral antigen or specific antibodies that indicate bird contact with the virus, various serological tests are used to detect antigen-antibody complexes (immune complexes). Such tests are RHCA, RDP, RPHA, PH, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), etc., which examine the blood serum of sick birds. The simplest, cheapest, and most efficient methods of antibodies are RZHA, RTGA, and solid-phase ELISA (1). For mass serological examination of birds for the presence of antibodies to the IBI virus, high-performance and automated solid-phase ELISA are more often used. To detect antibodies to IBA virus and determine their concentration in blood serum, an indirect variant of solid-phase ELISA was used, in which the test sample interacts with an antigen immobilized on a 96-well optically transparent polymer plate. Then antibodies in the composition of the immune complexes react with the conjugate. The results of the analysis are recorded with high accuracy by spectrophotometry. To detect and evaluate the titer of IBA virus antigen in biological materials, an indirect ELISA sandwich variant is widely used, during the implementation of which the test antigen is first captured by specific antibodies immobilized on a plate, and then detected by detection antibodies with which the conjugate interacts. The analysis results are also recorded using a spectrophotometer.
Достоинством ИФА являются высокая чувствительность и специфичность, возможность проведения масштабных исследований в полевых условиях, оперативность проведения анализов, небольшие объемы исследуемых проб и возможность автоматизации практически всех стадий выполнения реакции, включая регистрацию и обработку получаемых результатов (2). The advantages of ELISA are high sensitivity and specificity, the possibility of large-scale field studies, the speed of analysis, small volumes of test samples and the ability to automate almost all stages of the reaction, including recording and processing the results (2).
В настоящее время фирмы, специализирующиеся на производстве средств для молекулярно-биологической диагностики, выпускают специальные наборы для проведения ИФА с целью обнаружения сывороточных антител к вирусам, вызывающим различные заболевания кур, в том числе и ИБК. Currently, firms specializing in the production of molecular biological diagnostics produce special kits for ELISA to detect serum antibodies to viruses that cause various diseases of chickens, including IB.
Известен набор для определения антител к вирусам ИББ, НБ и ИБК у птиц в крови, сыворотке крови или яичном желтке (полуколичественный метод) в ИФА. Антигены вирусов ИББ, НБ и ИБК нанесены отдельно на пластиковую гребенку. Реакция протекает внутри ячеек проявляющих пластин. В состав набора включены 3 карточки гребенки "Immunocomb", 3 проявляющие пластины, 3 листка бумаги для образцов с предварительно нанесенными дисками, 4 ланцета для взятия проб крови, 1 пинцет, 1 калибровочная цветовая шкала "CombScale", 1 пробирка с сывороткой для положительного контроля, 1 пробирка с сывороткой для отрицательного контроля, график "CombScore". Набор используется для оценки эффективности вакцинации, определения наиболее приемлемых сроков вакцинации и периодического серологического анализа стад с целью быстрой и эффективной диагностики заболеваний (3). A known kit for determining antibodies to viruses IBD, NB and IBC in birds in the blood, blood serum or egg yolk (semi-quantitative method) in ELISA. The antigens of the viruses IBC, NB and IBC are applied separately to a plastic comb. The reaction proceeds inside the cells of the developing plates. The kit includes 3 Immunocomb comb cards, 3 developing plates, 3 pieces of paper for samples with pre-applied discs, 4 lancets for taking blood samples, 1 tweezers, 1 calibration color scale "CombScale", 1 tube with serum for positive control , 1 tube with serum for negative control, graph "CombScore". The kit is used to evaluate the effectiveness of vaccination, determine the most appropriate timing of vaccination and periodic serological analysis of herds in order to quickly and efficiently diagnose diseases (3).
Известен набор для определения антител к вирусу ИБК в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса ИБК, иммобилизованный на твердом носителе, положительный и отрицательный контроли, препарат козьих антител к куриным IgG, конъюгированных с пероксидазой хрена, с гентамицином, буфер для разведения проб, буфер для разведения концентрата субстрата ТМВ, концентрат субстрата ТМВ, останавливающий раствор (0,12% HF). Значения титра антител определяют по формуле: IgT=1,09(IgS/P)+3,39 (4). A known kit for the determination of antibodies to IBA virus in ELISA, containing purified and inactivated IBA virus antigen immobilized on a solid carrier, positive and negative controls, goat anti-chicken IgG conjugated with horseradish peroxidase conjugated with gentamicin, sample dilution buffer, buffer for dilution of TMB substrate concentrate, TMB substrate concentrate, stopping solution (0.12% HF). The antibody titer values are determined by the formula: IgT = 1.09 (IgS / P) +3.39 (4).
Известен набор для определения антител к вирусу ИБК в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса ИБК,иммобилизованный на твердом носителе, положительную и отрицательную контрольные сыворотки, раствор козьих антител на куриных IgG, конъюгированных с пероксидазой хрена, буфер для разведения сывороток и конъюгата, субстратный раствор ABTS, 5-кратный концентрат SDS (останавливающий раствор), промывочный буфер (20-кратный концентрат). Значения титра антител определяют по формуле: IgT=1,642(IgS/P) + 3,568 (5). A known kit for the determination of antibodies to IBA virus in ELISA, containing purified and inactivated IBA virus antigen immobilized on a solid carrier, positive and negative control sera, a solution of goat antibodies on chicken IgG conjugated with horseradish peroxidase, a buffer for diluting serums and conjugate, substrate ABTS solution, 5-fold SDS concentrate (stopping solution), wash buffer (20-fold concentrate). The antibody titer values are determined by the formula: IgT = 1.642 (IgS / P) + 3.568 (5).
Известен набор для определения антител к вирусу ИБК в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса ИБК, иммобилизованный на твердом носителе, положительный и отрицательный контроли, конъюгат моноклональных антител к штамму М41 вируса ИБК с пероксидазой хрена, концентрат буферного раствора для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов, субстратный буфер АБТС, детергент, краситель (6). A known kit for determining antibodies to IBA virus in ELISA, containing purified and inactivated IBA virus antigen immobilized on a solid support, positive and negative controls, conjugate of monoclonal antibodies to IBA strain M41 with horseradish peroxidase, a buffer solution concentrate for dilution and washing of immunospecific components , ABTS substrate buffer, detergent, dye (6).
Общим недостатком указанных наборов является то, что они импортные, что определяет высокую себестоимость соответствующих исследований. A common drawback of these sets is that they are imported, which determines the high cost of relevant studies.
Известен также карбоксилсодержащий катионит КБ-4-П2, который является органическим ионообменным веществом слабокислотного типа в натриевой форме. Известно его применение для селективного удаления небольших количеств двухвалентных катионов из смесей с большими концентрациями одновалентных катионов, для очистки катионного обмена (7). Also known is a carboxyl-containing cation exchanger KB-4-P2, which is an organic ion-exchange substance of a weakly acid type in sodium form. It is known for its use for the selective removal of small amounts of divalent cations from mixtures with high concentrations of monovalent cations, for the purification of cation exchange (7).
Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является набор для определения антител к вирусу ИБК в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген вируса ИБК, иммобилизованный на твердом носителе, сухие положительную сыворотку крови кур к вирусу ИБК, отрицательную сыворотку крови кур к вирусу ИБК и антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащие 5% сахарозы или желатозы, или лактозы, буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов, субстратный буфер, краситель, детергент и гидроперит (8). The closest to the invention according to the set of essential features is a kit for determining antibodies to the IBA virus in ELISA, containing purified and inactivated antigen of the IBA virus, immobilized on a solid carrier, dried positive blood serum of chickens to the IBA virus, negative blood serum of chickens to the IBA virus and anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins, additionally containing 5% sucrose or gelatose, or lactose, a buffer solution for dilution and washing immunospecifically x components, substrate buffer, dye, detergent and hydroperite (8).
Недостатки набора - прототипа состоят в его низкой активности и специфичности, а также высокой себестоимости изготовления. Это объясняется тем, что в наборе-прототипе используются лиофилизированные биокомпоненты, сложность получения которых заключается в том, что для лиофилизации необходимо использовать оптимальные объемы нативного материала (минимум 0,5 см3), иначе невозможно получить нормальную таблетку. Даже используя для лиофилизации такие минимальные объемы, существует опасность размораживания материала при загрузке и потери активности при высушивании, особенно конъюгата и специфической сыворотки. Процесс лиофилизации с предварительным замораживанием продолжается около 3 сут. Кроме того, при регидратации таблеток и разведении конъюгата до рабочего состояния после использования излишки ценных биокомпонентов подвергают утилизации, так как они не подлежат хранению.The disadvantages of the prototype kit are its low activity and specificity, as well as the high cost of manufacturing. This is because the prototype kit uses lyophilized biocomponents, the difficulty of obtaining which is that for lyophilization it is necessary to use the optimal volumes of native material (at least 0.5 cm 3 ), otherwise it is impossible to get a normal tablet. Even using such minimal volumes for lyophilization, there is a danger of thawing of the material during loading and loss of activity during drying, especially the conjugate and specific serum. The freeze-drying process with preliminary freezing lasts about 3 days. In addition, during rehydration of the tablets and dilution of the conjugate to a working state after use, excess valuable biocomponents are disposed of, since they are not subject to storage.
В задачу создания настоящего изобретения входила разработка набора для определения антител к вирусу ИБК в ИФА, обладающего более высокой активностью и специфичностью и низкой себестоимостью изготовления. The task of creating the present invention was the development of a kit for determining antibodies to the IBA virus in ELISA, with higher activity and specificity and low manufacturing cost.
Технический результат от использования изобретения заключается в повышении активности и специфичности набора и снижении себестоимости его изготовления. The technical result from the use of the invention is to increase the activity and specificity of the kit and reduce the cost of its manufacture.
Указанный технический результат достигнут созданием изобретения, охарактеризованного следующей совокупностью признаков:
1. Набор для определения антител к вирусу ИБК в ИФА.The specified technical result is achieved by the creation of the invention, characterized by the following set of features:
1. A kit for the determination of antibodies to the IBS virus in ELISA.
1.1. Очищенный и инактивированный антиген вируса ИБК, иммобилизованный на твердом носителе. 1.1. Purified and inactivated IBA virus antigen immobilized on a solid support.
1.2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 1.2. Dry positive blood serum of chickens to the IBC virus, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.
1.2.1. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Положительная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
1.2.2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК, полученная контактным обезвоживанием.1.2.1. Dry positive blood serum of hens to the IBC virus and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Positive serum - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
1.2.2. Dry positive blood serum of chickens to the IBI virus obtained by contact dehydration.
1.3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 1.3. Dry negative blood serum of chickens, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.
1.3.1. Сухая отрицательная сыворотка крови кур к вирусу ИБК и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Отрицательная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
1.3.2. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, полученная контактным обезвоживанием.1.3.1. Dry negative blood serum of chickens to the IBC virus and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Negative Serum - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
1.3.2. Dry negative blood serum of chickens obtained by contact dehydration.
1.4. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащий карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 1.4. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.
1.4.1. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Антивидовой иммунопероксидазный конъюгат - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
1.4.2. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.1.4.1. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins and carboxyl-containing cation exchanger KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Anti-Immunoperoxidase Conjugate - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
1.4.2. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins obtained by contact dehydration.
1.5. Буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов. 1.5. Buffer solution for dilution and washing of immunospecific components.
1.5.1. В качестве буферного раствора для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов набор содержит трио-буферный раствор. 1.5.1. As a buffer solution for dilution and washing of immunospecific components, the kit contains a trio-buffer solution.
1.6. Субстратный буфер. 1.6. Substrate buffer.
1.6.1. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер. 1.6.1. As a substrate buffer, the kit contains a phosphate-citrate buffer.
1.7. Детергент. 1.7. Detergent.
1.7.1. Из детергентов набор содержит твин-20. 1.7.1. Of the detergents, the kit contains tween-20.
1.8. Краситель. 1.8. Dye.
1.8.1. Из красителей набор содержит ортофенилендиамин (ОФД). 1.8.1. Of the dyes, the kit contains orthophenylenediamine (CRF).
1.8.2. Из красителей набор содержит АБТС. 1.8.2. Of the dyes, the kit contains ABTS.
1.9. Гидроперит. 1.9. Hydroperite.
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1. Набор для определения антител к вирусу ИБК в ИФА.The present invention includes the following set of essential features that provide a technical result in all cases for which legal protection is sought:
1. A kit for the determination of antibodies to the IBS virus in ELISA.
1.1. Очищенный и инактивированный антиген вируса ИБК, иммобилизованный на твердом носителе. 1.1. Purified and inactivated IBA virus antigen immobilized on a solid support.
1.2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 1.2. Dry positive blood serum of chickens to the IBC virus, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.
1.3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 1.3. Dry negative blood serum of chickens, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.
1.4. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащий карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 1.4. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.
1.5. Буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов. 1.5. Buffer solution for dilution and washing of immunospecific components.
1.6. Субстратный буфер. 1.6. Substrate buffer.
1.7. Детергент. 1.7. Detergent.
1.8. Краситель. 1.8. Dye.
1.9. Гидроперит. 1.9. Hydroperite.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования:
1. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Положительная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК, полученная контактным обезвоживанием.The present invention is also characterized by other features expressing specific forms of its implementation or special conditions of use:
1. Dry positive blood serum of hens to the IBC virus and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Positive serum - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
2. Dry positive blood serum of chickens to the IBC virus obtained by contact dehydration.
3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Отрицательная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
4. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, полученная контактным обезвоживанием.3. Dry negative blood serum of chickens and carboxyl-containing cation exchanger KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Negative Serum - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
4. Dry negative serum of chickens obtained by contact dehydration.
5. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Конъюгат - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
6. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.5. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Conjugate - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
6. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins obtained by contact dehydration.
7. В качестве буферного раствора для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор. 7. As a buffer solution for dilution and washing of immunospecific components, the kit contains a Tris buffer solution.
8. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер. 8. The kit contains a phosphate citrate buffer as a substrate buffer.
9. Из детергентов набор содержит твин-20. 9. Of the detergents, the kit contains tween-20.
10. Из красителей набор содержит ОФД. 10. Of the dyes, the kit contains OFD.
11. Из красителей набор содержит АБТС. 11. Of the dyes, the kit contains ABTS.
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый набор и совпадающим и с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1. Набор для определения антител к вирусу ИБК в ИФА.The signs of the invention, characterizing the proposed set and coinciding with the signs of the prototype, including the generic concept, reflecting the purpose, are:
1. A kit for the determination of antibodies to the IBS virus in ELISA.
1.2. Очищенный и инактивированный антиген ИББ кур, иммобилизованный на твердом носителе. 1.2. Purified and inactivated IBD chicken antigen, immobilized on a solid carrier.
1.3. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК. 1.3. Dry positive blood serum of chickens to the IBI virus.
1.4. Сухая отрицательная сыворотка крови кур. 1.4. Dry negative blood serum of chickens.
1.5. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур. 1.5. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins.
1.6. Буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов. 1.6. Buffer solution for dilution and washing of immunospecific components.
1.7. Субстратный буфер. 1.7. Substrate buffer.
1.8. Детергент. 1.8. Detergent.
1.9. Краситель. 1.9. Dye.
1.10. Гидроперит. 1.10. Hydroperite.
По сравнению с набором-прототипом существенными отличительными признаками предлагаемого набора являются:
1. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.Compared with the prototype kit, the salient features of the proposed kit are:
1. Dry positive blood serum of chickens to the IBC virus, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.
2. Сухая отрицательная сыворотка кур, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 2. Dry negative chicken serum, optionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.
3. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащий карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2. 3. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования:
1. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Положительная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
2. Сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК, полученная контактным обезвоживанием.The present invention is also characterized by other distinctive features expressing specific forms of its implementation or special conditions of use:
1. Dry positive blood serum of hens to the IBC virus and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Positive serum - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
2. Dry positive blood serum of chickens to the IBC virus obtained by contact dehydration.
3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Отрицательная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
4. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, полученная контактным обезвоживанием.3. Dry negative blood serum of chickens and carboxyl-containing cation exchanger KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Negative Serum - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
4. Dry negative serum of chickens obtained by contact dehydration.
5. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Антивидовой иммунопероксидазный конъюгат - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
6. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.5. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt.%:
Anti-Immunoperoxidase Conjugate - 2-15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
6. Dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins obtained by contact dehydration.
7. В качестве буферного раствора для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор. 7. As a buffer solution for dilution and washing of immunospecific components, the kit contains a Tris buffer solution.
8. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер. 8. The kit contains a phosphate citrate buffer as a substrate buffer.
9. Из детергентов набор содержит твин-20. 9. Of the detergents, the kit contains tween-20.
10. Из красителей набор содержит ОФД. 10. Of the dyes, the kit contains OFD.
11. Из красителей набор содержит АБТС. 11. Of the dyes, the kit contains ABTS.
Предлагаемый набор обладает более высокой активностью и специфичностью и низкой себестоимостью изготовления. The proposed set has a higher activity and specificity and low manufacturing cost.
Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого набора, изложенных в независимом пункте формулы изобретения. The analysis of the prior art by the applicant, including a search by patent and scientific and technical sources of information, and the identification of sources containing information about analogues of the invention, allowed to establish that the applicant did not find sources characterized by signs that are identical (identical) to all the essential features of the invention. The definition from the list of identified analogues of the prototype, as the closest in the totality of features, made it possible to establish a set of essential distinguishing features of the proposed set with respect to the technical result perceived by the applicant as set forth in the independent claim.
Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна". Therefore, the claimed invention meets the condition of patentability "novelty."
Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. В результате поиска установлено следующее. To verify the conformity of the proposed solution to the patentability condition "inventive step", an additional search for known solutions was carried out to identify features included in the distinctive part of the independent claim. The search resulted in the following.
Известно использование карбоксилсодержащего катионита КБ-4П-2 для селективного удаления небольших количеств двухвалентных катионов из смесей с большими концентрациями одновалентных катионов, а также для очистки стрептомицина и других реакций катионного обмена (9). Для высушивания микроколичеств иммуноспецифических компонентов предлагаемого набора авторами использован впервые карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2, при этом авторами обнаружено новое, ранее неизвестное свойство катионита КБ-4П-2 не изменять нативные характеристики иммуноспецифических компонентов при обезвоживании и одновременно повышать их специфичность и активность. It is known to use carboxyl-containing cation exchanger KB-4P-2 for the selective removal of small amounts of divalent cations from mixtures with high concentrations of monovalent cations, as well as for the purification of streptomycin and other cation exchange reactions (9). The authors used the carboxyl-containing cation exchanger KB-4P-2 for drying the micro quantities of the immunospecific components of the proposed kit, while the authors discovered a new, previously unknown property of the cation exchanger KB-4P-2 not to change the native characteristics of the immunospecific components during dehydration and at the same time increase their specificity and activity.
Результаты поиска показывают, что предлагаемое изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены аналогичные решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата. Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень". The search results show that the proposed invention does not follow explicitly from the prior art set forth in the corresponding section of the description (similar solutions have not been identified that have features matching the distinctive features of the proposed invention), and the effect of the essential features of the proposed invention is not revealed transformations to achieve a technical result. Therefore, the present invention meets the condition of patentability "inventive step".
Сущность изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения. The invention is illustrated by examples of its execution, which do not limit the scope of the invention.
Пример 1
Набор для определения антител к вирусу ИБК в ИФА содержит следующие компоненты: очищенный и инактивированный антиген вируса ИБК, штамм Н120 или "Чапаевский", нанесенный на пластиковый планшет (два планшета), дополнительно содержащие карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 сухие положительную сыворотку крови кур к вирусу ИБК (одна ампула), отрицательную сыворотку крови кур (одна ампула) и антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобинов кур (одна ампула), а также набор солей для приготовления трис-буферного раствора, используемого для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов и содержащего трис (оксиметил) аминометан в количестве 0,97 г, трис (оксиметил) аминометан гидрохлорид в количестве 6,61 г, хлористый натрий в количестве 11,7 г (три флакона), набор солей для приготовления субстратного буфера, содержащего натрий фосфорнокислый двузамещенный в количестве 5,37 г и лимонную кислоту в количестве 1,57 г (фосфатно-цитратный буфер - два флакона), ОФД (одна таблетка) или АБТС (одна таблетка), детергент твин-20 (один флакон), гидроперит (одна таблетка). Препараты антигена вируса ИБК, контрольных вирусспецифических антител и конъюгата антивидовых антител с пероксидазой хрена могут использоваться как самостоятельные диагностикумы.Example 1
The kit for the determination of antibodies to IBA virus in ELISA contains the following components: purified and inactivated IBA virus antigen, strain H120 or Chapaevsky, applied to a plastic tablet (two tablets), optionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 dry positive chicken blood serum IBC virus (one ampoule), negative blood serum of chickens (one ampoule) and anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobins (one ampoule), as well as a set of salts for the preparation of Tris buffer solution used for dilution and washing of immunospecific components and containing tris (oxymethyl) aminomethane in an amount of 0.97 g, tris (oxymethyl) aminomethane hydrochloride in an amount of 6.61 g, sodium chloride in an amount of 11.7 g (three bottles), a set of salts for the preparation a substrate buffer containing sodium phosphate disubstituted in an amount of 5.37 g and citric acid in an amount of 1.57 g (phosphate-citrate buffer - two bottles), OFD (one tablet) or ABTS (one tablet), tween-20 detergent (one bottle), hydroperit (one tablet). Preparations of the IBC virus antigen, control virus-specific antibodies and the conjugate of antispecies antibodies with horseradish peroxidase can be used as independent diagnostics.
Пример 2
Для изготовления антигена вируса ИБК используют производственный штамм Н120 или "Чапаевский", относящиеся к серотипу Массачустс и не требующие адаптации к куриным эмбрионам. Вирус культивируют на 9-11-дневных SPF-эмбрионах кур. Первый пассаж является матровой расплодкой, которую используют для получения необходимого количества вируссодержащего сырья. Для получения матрового вируса вируссодержащим материалом из производственного штамма в объеме 0,2 см3 инокулируют эмбрионы в аллантоисную полость в области пуги. Зараженные куриные эмбрионы помещают в термальную комнату или инкубатор и выдерживают при 37,4oС и относительной влажности 60-70oС в течение 72 ч. Каждые 24 ч эмбрионы овоскопируют. Эмбрионы, павшие через 48-72 ч с момента заражения, а также живые зараженные эмбрионы через 72 ч используют для сбора вируссодержащей экстраэмбриональной жидкости (ВСЭЭЖ). Вскрытие эмбрионов проводят в отдельном помещении с соблюдением правил асептики. ВСЭЭЖ из полости эмбриона отсасывают в стерильные флаконы емкостью 500-1000 см3. Затем полученную ВСЭЭЖ центрифугируют при 2000 g в течение 30 мин. Центрифугированный материал объединяют в 10,0-15,0 дм3 стеклянные бутыли, после чего разливают в стерильные флаконы емкостью 500 см3, заполняя флаконы на 1/3 их объема. Матровый вирус хранят при -40oС. Для изготовления производственной серии антигена матровый вирус разводят в соотношении 1:10 стерильном физиологическом раствором рН 7,2-7,4 с добавлением антибиотиков. Время контакта антибиотиков с материалом 3 ч при 4-8oС. Матричный материал разводят в объеме, необходимом для заражения производственной партии куриных эмбрионов из расчета 0,2 см3 на одни эмбрион. Полученный вирус подвергают инактивации. Для этого в полученную ВСЭЭЖ вносят аминоэтилэтиленимин до концентрации 0,15-0,2%. Инактивацию ведут при 37,0±0,5oС в течение 48 ч с периодическим перемешиванием смеси.Example 2
For the production of the IBC virus antigen, the production strain H120 or Chapaevsky is used, which are related to the Massachusts serotype and do not require adaptation to chicken embryos. The virus is cultured on 9-11-day-old SPF chicken embryos. The first passage is a matte seedling, which is used to obtain the required amount of virus-containing raw materials. To obtain the mother virus the virus-containing material from the production strain in a volume of 0.2 cm 3 inoculate the embryos in the allantoic cavity in the area of the pug. Infected chicken embryos are placed in a thermal room or incubator and incubated at 37.4 ° C and relative humidity 60-70 ° C for 72 hours. Every 24 hours, the embryos are ovoscopically. Embryos that have fallen after 48-72 hours from the moment of infection, as well as live infected embryos after 72 hours, are used to collect virus-containing extra-embryonic fluid (WEEE). The opening of the embryos is carried out in a separate room in compliance with aseptic rules. Vseezh from the embryo cavity is sucked into sterile bottles with a capacity of 500-1000 cm 3 . Then, the obtained HPEC was centrifuged at 2000 g for 30 minutes. The centrifuged material is combined into 10.0-15.0 dm 3 glass bottles, after which it is poured into sterile bottles with a capacity of 500 cm 3 , filling the bottles to 1/3 of their volume. The mother virus is stored at -40 o C. For the production of the production series of antigen, the mother virus is diluted 1:10 with a sterile physiological solution of pH 7.2-7.4 with the addition of antibiotics. The contact time of antibiotics with the material is 3 hours at 4-8 o C. The matrix material is diluted in the amount necessary to infect a production batch of chicken embryos at the rate of 0.2 cm 3 per embryo. The resulting virus is subjected to inactivation. To do this, aminoethylethylenimine is added to the obtained WEEE to a concentration of 0.15-0.2%. Inactivation is carried out at 37.0 ± 0.5 o C for 48 hours with periodic stirring of the mixture.
По истечении срока инактивации для нейтрализации инактиванта к полученному антигену добавляют тиосульфат натрия до концентрации 0,03 М. Нейтрализацию проводят при комнатной температуре в течение 2 ч при перемешивании смеси. Инактивированный вирус контролируют на авирулентность путем трех последовательных пассажей длительностью 72 ч на 10 развивающихся куриных эмбрионах в возрасте 9-11 сут. После этого антиген осветляют в течение 20 мин при 3000 об/мин на центрифуге "Beckman", очищают и концентрируют через 30% раствор сахарозы 70 мин на высокоскоростной центрифуге "Sorvall" при 25000 об/мин. Затем осадок ресуспендируют в 0,05М трис-НСl с добавлением 0,2 М NaCl pH 7,5 в соотношении 1:100 от первоначального объема вируса. Очищенный, концентрированный и Инактивированный препарат антигена вируса ИБК расфасовывают по 0,5±0,1 см3 и хранят при -70oС.At the end of the inactivation period, sodium thiosulfate is added to the resulting antigen to neutralize the inactivant to a concentration of 0.03 M. Neutralization is carried out at room temperature for 2 hours while the mixture is stirred. Inactivated virus is monitored for avirulence by three consecutive passages lasting 72 hours in 10 developing chicken embryos aged 9-11 days. After that, the antigen is clarified for 20 minutes at 3000 rpm on a Beckman centrifuge, purified and concentrated through a 30% sucrose solution for 70 minutes on a Sorvall high-speed centrifuge at 25,000 rpm. Then the precipitate is resuspended in 0.05 M Tris-Hcl with the addition of 0.2 M NaCl pH 7.5 in a ratio of 1: 100 of the original volume of the virus. The purified, concentrated and inactivated preparation of the IBA virus antigen are packaged in 0.5 ± 0.1 cm 3 and stored at -70 o C.
Определение специфической активности антигена проводят в непрямом варианте ИФА. Для его постановки антиген разводят в буфере для разведения антигена с 1:25 до 1:800. Каждое разведение вносят в лунки 12 вертикальных рядов 2 планшетов. Вирусспецифическую и неиммунную сыворотки в разведении 1: 100 вносят в первый горизонтальный ряд планшетов. Затем готовят двукратные разведения сывороток от 1:100 до 1:12800. Первый вертикальный ряд планшетов заполняют буфером для испытуемых проб, что служит контролем неспецифической активности исследуемых препаратов. После инкубации в течение 2 ч при 37oС и 3-кратной промывки буфером для промывания в каждую лунку вносят по 0,1 мл раствора субстрата и выдерживают при комнатной температуре 10-15 мин. Реакцию останавливают внесением в каждую лунку стоп-раствора. Результаты реакции учитывают визуально или с помощью многоканального спектрофотометра Multiskan, Flow. Предельным титром активности препарата считают его максимальное разведение, оптическая плотность которого в 2-2,1 раза превышает таковую отрицательного контроля (реакция с неиммунной сывороткой). К выпуску разрешают препараты антигена вируса ИБК с титром не менее 1:50, контрольной вирусспецифической сыворотки не менее 1:3200.Determination of specific antigen activity is carried out in an indirect version of ELISA. For its formulation, the antigen is diluted in a buffer for diluting the antigen from 1:25 to 1: 800. Each dilution is added to the wells of 12 vertical rows of 2 tablets. Virus-specific and non-immune serum at a dilution of 1: 100 make in the first horizontal row of tablets. Then prepare double dilutions of sera from 1: 100 to 1: 12800. The first vertical row of tablets is filled with buffer for the test samples, which serves as a control of non-specific activity of the studied drugs. After incubation for 2 hours at 37 ° C and 3-time washing with washing buffer, 0.1 ml of substrate solution is added to each well and kept at room temperature for 10-15 minutes. The reaction is stopped by adding a stop solution to each well. The results of the reaction are taken into account visually or using a multichannel spectrophotometer Multiskan, Flow. The maximum titer of drug activity is considered its maximum dilution, the optical density of which is 2-2.1 times higher than that of the negative control (reaction with non-immune serum). The release of IBA virus antigen with a titer of at least 1:50 and a control virus-specific serum of at least 1: 3200 is allowed for release.
Прошедший необходимые тесты препарат антигена вируса ИБК используют для иммобилизации на 96-луночные планшеты. Для этого количество антигена, необходимое для изготовления партии наборов, размораживают и готовят рабочее разведение в 0,01 М карбонатнобикарбонатном буфере рН 9,5-9,6. Затем в каждую лунку планшета вносят по 100 мкл рабочего разведения антигена. После инкубации в течение 18 ч при 4oС раствор антигена удаляют, планшеты промывают буфером, содержащим 0,05 М Трис-НСl с 0,2 М NaCl и 0,1% твина-20, и вносят по 0,1 мл блокирующего раствора, содержащего концентрированный 5-кратный раствор 5% раствора додецилсульфата натрия. Ингибируют 1 ч при комнатной температуре и промывают 3 раза буфером, содержащим 0,05 М трис-НСl с 0,2 NaCl и 0,1% твина 20. Планшеты высушивают на воздухе и упаковывают в полиэтиленовые пакеты поштучно.An IBC virus antigen preparation that has passed the necessary tests is used for immobilization on 96-well plates. For this, the amount of antigen required for the manufacture of a batch of sets is thawed and a working dilution is prepared in 0.01 M carbonate-bicarbonate buffer pH 9.5-9.6. Then, 100 μl of working dilution of antigen are added to each well of the plate. After an incubation of 18 hours at 4 ° C, the antigen solution is removed, the plates are washed with a buffer containing 0.05 M Tris-Hcl with 0.2 M NaCl and 0.1% Tween-20, and 0.1 ml of blocking solution are added containing a concentrated 5-fold solution of 5% sodium dodecyl sulfate solution. Inhibit 1 h at room temperature and wash 3 times with buffer containing 0.05 M Tris-Hcl with 0.2 NaCl and 0.1% Tween 20. The tablets are dried in air and packaged in plastic bags individually.
Пример 3. Для получения положительной сыворотки кур иммунизируют очищенным, концентрированным и инактивированный антигеном вируса ИБК, полученным так, как описано в примере 2. 10 см3 антигена с содержанием вирусного белка не менее 100 мкг/см3 эмульгируют с равным объемом адъюванта Фрейнда (полного или неполного) на микроизмельчителе ткани РТ-1 в течение 3 мин. Иммунизацию кур проводят двукратно с интервалом 21 сут, причем первую иммунизацию - внутримышечно в дозе 1 см3 в область бедренной мышцы, вторую - внутримышечно в дозе 2 см3 в область грудных мышц по 1 см3 в каждую сторону. Через 7 дней после второй иммунизации проводят пробное взятие крови из подкрыльцовой вены для определения специфической активности сыворотки в ИФА. Кур обескровливают в том случае, если активность сыворотки в РЗГА не ниже 1:12800. Если активность сыворотки ниже, то проводят дополнительную инъекцию очищенным, концентрированным и инактивированным антигеном вируса ИБК с содержанием вирусного белка не ниже 100 мкг/см3. Индивидуальные пробы крови выдерживают сначала при температуре 37±1oС в течение 30-60 мин, а затем при 4±2oС в течение суток. Отстоявшуюся сыворотку отсасывают в стерильные пробирки, не допуская попадания эритроцитов и других форменных элементов крови, инактивируют при 57±1oС в течение 30 мин, консервируют хинозолом 1:1000 и выдерживаний при 4±2oС не менее 20 дней. Проверку индивидуальных проб сыворотки крови на активность и специфичность проводят в ИФА с набором специфических и нормальных антигенов. Полученную сыворотку смешивают с карбоксилсодержащим катионитом КБ-4П-2 в соотношении, мас.%: 2:98-15:85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию.Example 3. To obtain positive serum, chickens are immunized with purified, concentrated and inactivated IBA virus antigen, obtained as described in example 2. 10 cm 3 of antigen with a viral protein content of at least 100 μg / cm 3 are emulsified with an equal volume of Freund's adjuvant (full or incomplete) on a micro-grinder tissue RT-1 for 3 minutes Immunization of chickens is carried out twice with an interval of 21 days, the first immunization being administered intramuscularly at a dose of 1 cm 3 to the area of the femoral muscle, and the second immunization is administered intramuscularly at a dose of 2 cm 3 to the area of the pectoral muscles, 1 cm 3 to each side. 7 days after the second immunization, a test blood sample is taken from the axillary vein to determine the specific serum activity in ELISA. Chickens are bled if the serum activity in the RHCA is not lower than 1: 12800. If the serum activity is lower, then an additional injection is carried out with a purified, concentrated and inactivated IBA virus antigen with a viral protein content of at least 100 μg / cm 3 . Individual blood samples are kept first at a temperature of 37 ± 1 o C for 30-60 minutes, and then at 4 ± 2 o C for a day. The settled serum is aspirated into sterile tubes, preventing the ingress of red blood cells and other blood cells, inactivated at 57 ± 1 o C for 30 minutes, preserved with chinosol 1: 1000 and kept at 4 ± 2 o C for at least 20 days. Testing of individual blood serum samples for activity and specificity is carried out in ELISA with a set of specific and normal antigens. The resulting serum is mixed with carboxyl-containing cation exchanger KB-4P-2 in the ratio, wt.%: 2: 98-15: 85 (these ratios are optimal) and subjected to contact dehydration.
Пример 4
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к вирусу ИБК, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, маc. %:
Положительная сыворотка - 2,0
Катионит КБ-4П-2 - 98,0
Результаты испытаний представлены в табл.1.Example 4
Comparative tests in ELISA of dry positive blood serum of chickens against IBA virus, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 and obtained by contact dehydration, while the content of ingredients in this mixture is, wt. %:
Positive serum - 2.0
Cation exchange resin KB-4P-2 - 98.0
The test results are presented in table 1.
Представленные в табл. 1 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК превосходит по активности и специфичности таковую прототипа, полученную методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев. Presented in the table. 1 data indicate that obtained by contact dehydration dry positive blood serum of chickens to the IBC virus exceeds the activity and specificity of that of the prototype obtained by freeze drying, and is stored without decrease in activity for 12 months.
Пример 5
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к вирусу ИБК, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КП-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, маc. %:
Положительная сыворотка - 7,0
Катионит КБ-4П-2 - 93,0
Результаты испытаний представлены в табл.2.Example 5
Comparative tests in ELISA of dry positive blood serum of chickens against IBA virus, additionally containing carboxyl-containing cation exchanger KP-4P-2 and obtained by contact dehydration, while the content of ingredients in this mixture is, wt. %:
Positive serum - 7.0
Cation exchange resin KB-4P-2 - 93.0
The test results are presented in table.2.
Представленные в табл.2 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК превосходит по активности и специфичности таковую прототипа, полученного методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев. The data presented in Table 2 indicate that the dry positive blood serum of chickens for IBA virus obtained by contact dehydration exceeds the activity and specificity of that of the prototype obtained by freeze drying and is stored without decrease in activity for 12 months.
Пример 6
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к вирусу ИБК, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет мас.%:
Положительная сыворотка - 15,0
Катионит КБ-4П-2 - 85,0
Результаты испытаний представлены в табл. 3.Example 6
Comparative tests in ELISA of dry positive blood serum of chickens against IBA virus, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 and obtained by contact dehydration, while the content of ingredients in this mixture is wt.%:
Positive serum - 15.0
Cation exchange resin KB-4P-2 - 85.0
The test results are presented in table. 3.
Представленные в табл.3 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к вирусу ИБК превосходит по активности и специфичности таковую прототипа, полученную методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев. The data presented in table 3 indicate that the dry positive blood serum of chickens to the IBI virus obtained by contact dehydration exceeds the activity and specificity of that of the prototype obtained by freeze drying and is stored without decrease in activity for 12 months.
Пример 7
Используемую в качестве компонента набора отрицательную сыворотку крови кур к вирусу ИБК получают от здоровой безлейкозной птицы. К полученной сыворотке добавляют карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 в соотношении, мас.%: 2: 98 - 15:85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию.Example 7
Used as a component of the kit, the negative blood serum of chickens for the IBI virus is obtained from a healthy non-leukemic bird. To the resulting serum add carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 in the ratio, wt.%: 2: 98 - 15:85 (these ratios are optimal) and subjected to contact dehydration.
Пример 8
В предлагаемом наборе используют антивидовые коммерческие конъюгаты, выпускаемые НИИЭМ имени Н.Ф. Гамалея, представляющие собой глобулиновую фракцию, выделенную из антисыворотки, полученной иммунизацией кур и меченную пероксидазой хрена. К конъюгату добавляют карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 в соотношении, мас. %: 2:98 - 15:85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию.Example 8
The proposed kit uses anti-species commercial conjugates manufactured by NIEM named after N.F. Gamalea, which is a globulin fraction isolated from antiserum obtained by immunization of chickens and labeled with horseradish peroxidase. To the conjugate add carboxyl-containing cation exchanger KB-4P-2 in the ratio, wt. %: 2:98 - 15:85 (these ratios are optimal) and are subjected to contact dehydration.
Пример 9
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученный контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Конъюгат - 2,0
Катионит КБ-4П-2 - 98,0
Результаты испытаний представлены в табл. 4.Example 9
Comparative tests were carried out in ELISA of a dry antiviral immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 and obtained by contact dehydration, while the content of ingredients in this mixture is, wt.%:
Conjugate - 2.0
Cation exchange resin KB-4P-2 - 98.0
The test results are presented in table. 4.
Представленные в табл. 4 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат превосходит по активности и специфичности таковой прототипа, полученный методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев. Presented in the table. 4 data indicate that the dry antiviral immunoperoxidase conjugate obtained by contact dehydration is superior in activity and specificity to that of the prototype obtained by freeze drying and is stored for 12 months without loss of activity.
Пример 10
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученного контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Конъюгат - 7,0
Катионит КБ-4П-2 - 93,0
Результаты испытаний представлены в табл.5.Example 10
Comparative tests were performed in ELISA of a dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 and obtained by contact dehydration, while the content of ingredients in this mixture is, wt.%:
Conjugate - 7.0
Cation exchange resin KB-4P-2 - 93.0
The test results are presented in table.5.
Представленные в табл. 5 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат превосходит по активности и специфичности таковой прототипа, полученный методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев. Presented in the table. 5 data indicate that the dry antiviral immunoperoxidase conjugate obtained by contact dehydration is superior in activity and specificity to that of the prototype obtained by freeze drying and is stored for 12 months without loss of activity.
Пример 11
Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученного контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Конъюгат - 15,0
Катионит КБ-4П-2 - 85,0
Результаты испытаний представлены в табл.6.Example 11
Comparative tests were performed in ELISA of a dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins, additionally containing carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 and obtained by contact dehydration, while the content of ingredients in this mixture is, wt.%:
Conjugate - 15.0
Cation exchange resin KB-4P-2 - 85.0
The test results are presented in table.6.
Представленные в табл.6 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат превосходит по активности и специфичности таковой прототипа, полученный методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев. The data presented in table 6 indicate that the dry antiviral immunoperoxidase conjugate obtained by contact dehydration is superior in activity and specificity to that of the prototype obtained by freeze drying, and is stored without decrease in activity for 12 months.
Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- набор для определения антител к вирусу ИБК в ИФА, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в диагностике ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- набор для определения антител к вирусу ИБК в ИФА, приготовленный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой активностью и специфичностью, а также низкой себестоимостью изготовления.Thus, the above information indicates the fulfillment when using the invention of the following set of conditions:
- a kit for the determination of antibodies to the IBS virus in ELISA, embodying the invention, is intended for use in agriculture, namely in the diagnosis of veterinary virology and biotechnology;
- for the proposed invention in the form as described in the independent claim, the possibility of its implementation using the means and methods described in the application or known prior to the priority date is confirmed;
- a kit for the determination of antibodies to the virus IBA in ELISA, prepared in accordance with the invention, has a high activity and specificity, as well as low manufacturing costs.
Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость". Therefore, the present invention meets the condition of patentability "industrial applicability".
ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
"Набор для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур"
1. Вишняков И.Ф., Лагуткин Н.А. и др. Коронавирусные инфекции. Покров, ВНИИВВ и М., Россельхозакадемия, 1997, 42-55.SOURCES OF INFORMATION
"A kit for determining antibodies to the chicken infectious bronchitis virus"
1. Vishnyakov I.F., Lagutkin N.A. and other Coronavirus infections. Pokrov, VNIIVV and M., Russian Agricultural Academy, 1997, 42-55.
2. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я. и др. Вирусные болезни животных. М., ВНИТИБП, 1998, 65-84. 2. Syurin V.N., Samuilenko A.Ya. and other viral diseases of animals. M., VNITIBP, 1998, 65-84.
3. Временное наставление по применению диагностического набора "Иммунокомб IBD/ND/IBV для определения антител против возбудителей инфекционной бурсальной болезни (ИББ), болезни Нью-Кастла (БН) и инфекционного бронхита (ИБ) у птиц (фирма "Биогал", Израиль). Одобрено Советом по ветеринарным препаратам. Протокол 2 от 27.03.96 г. 10 с. 3. Interim guidance on the use of the diagnostic kit "Immunocomb IBD / ND / IBV for the determination of antibodies against pathogens of infectious bursal disease (IBD), New Castle disease (BN) and infectious bronchitis (IB) in birds (Biogal company, Israel) Approved by the Veterinary
4. Наставление к набору "Infectous Bronchitis virus Antibody Test Kit". IDEXX Laboratories, Inc., One IDEXX Drive, Westbrook, Maine 04092 USA. 4. Instruction for the kit "Infectous Bronchitis virus Antibody Test Kit". IDEXX Laboratories, Inc., One IDEXX Drive, Westbrook, Maine 04092 USA.
5. Временное наставление по применению набора для выявления антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным методом производства фирмы KPL (США). Приложения на 4 листах к сертификату соответствия РОСС US. ФВ01. А03398 02874792, выданному ИЦ ВГНКИ (РОСС RU. 0001.21.ФВ02) на основании протокола испытаний 5/229 от 15.03.99г. 5. Temporary instruction on the use of the kit for the detection of antibodies to the virus of the infectious bronchitis virus of hens by the enzyme immunoassay method manufactured by KPL (USA). Annexes on 4 sheets to the certificate of conformity ROSS US. FV01. A03398 02874792, issued by IC VGNKI (ROSS RU. 0001.21.FV02) on the basis of test report 5/229 of 03.15.99.
6. Moving V., Czifra G. et al. A monoclonal antibody blocking ELISA for the detection of IBV antibodies in fowl. (SVANOVA Biotech., National Veterinary Institute, Upsala, Sweden). ADV. Exp. Med. Biol., 1998, 440, 495-499. 6. Moving V., Czifra G. et al. A monoclonal antibody blocking ELISA for the detection of IBV antibodies in fowl. (SVANOVA Biotech., National Veterinary Institute, Upsala, Sweden). ADV. Exp. Med. Biol., 1998, 440, 495-499.
7. Краткая химическая энциклопедия М., ГНИ "Сов. энциклопедия", 1963, т. 2, 299-306. 7. Brief chemical encyclopedia M., STI "Sov. Encyclopedia", 1963, v. 2, 299-306.
8. Наставление по применению набора для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным методом. Утв. Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России от 25.11.99 г. 13-7-2/1791, 6 с. (прототип). 8. Guidance on the use of a kit for the determination of antibodies to the virus of hepatitis B virus. Approved Veterinary Department of the Ministry of Agriculture and Food of Russia dated November 25, 1999, 13-7-2 / 1791, 6 pp. (prototype).
Claims (9)
Положительная сыворотка - 2 - 15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
3. Набор по п. 1, отличающийся тем, что он содержит сухую положительную сыворотку крови кур к вирусу инфекционного бронхита кур, полученную контактным обезвоживанием.2. The kit according to claim 1, characterized in that the dry positive serum and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt. %:
Positive serum - 2 - 15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
3. The kit according to claim 1, characterized in that it contains dry positive blood serum of chickens to the chicken infectious bronchitis virus obtained by contact dehydration.
Отрицательная сыворотка - 2 - 15
Катионит КБ-4Б-2 - До 100
5. Набор по п. 1, отличающийся тем, что он содержит сухую отрицательную сыворотку крови кур, полученную контактным обезвоживанием.4. The kit according to claim 1, characterized in that the dry negative blood serum of chickens and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt. %:
Negative Serum - 2 - 15
Cation exchanger KB-4B-2 - Up to 100
5. The kit according to claim 1, characterized in that it contains dry negative blood serum of chickens obtained by contact dehydration.
Конъюгат - 2 - 15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
7. Набор по п. 1, отличающийся тем, что он содержит сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.6. The kit according to p. 1, characterized in that the dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins and carboxyl-containing cation exchange resin KB-4P-2 are contained in the ratio, wt. %:
Conjugate - 2 - 15
Cation exchanger KB-4P-2 - Up to 100
7. The kit according to claim 1, characterized in that it contains a dry anti-species immunoperoxidase conjugate against chicken immunoglobulins obtained by contact dehydration.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001105773A RU2189042C1 (en) | 2001-03-02 | 2001-03-02 | Kit for detecting antibodies to infectious bronchitis virus in hens |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2001105773A RU2189042C1 (en) | 2001-03-02 | 2001-03-02 | Kit for detecting antibodies to infectious bronchitis virus in hens |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2189042C1 true RU2189042C1 (en) | 2002-09-10 |
Family
ID=20246713
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001105773A RU2189042C1 (en) | 2001-03-02 | 2001-03-02 | Kit for detecting antibodies to infectious bronchitis virus in hens |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2189042C1 (en) |
-
2001
- 2001-03-02 RU RU2001105773A patent/RU2189042C1/en not_active IP Right Cessation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10852286B2 (en) | Ready to use porcine vaccine | |
| Yoon et al. | Comparison of a commercial H1N1 enzyme-linked immunosorbent assay and hemagglutination inhibition test in detecting serum antibody against swine influenza viruses | |
| BR112013004594B1 (en) | method for determining an antigen content | |
| Rodak et al. | Detection by radioimmunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay of coronavirus antibodies in bovine serum and lacteal secretions | |
| RU2189042C1 (en) | Kit for detecting antibodies to infectious bronchitis virus in hens | |
| CN107427572A (en) | The vaccine of new pig hepato-encephalomyelitis virus and diagnosis | |
| BR112019021004A2 (en) | kit and processes for indirect elisa testing based on crude native hapten and the use of lyophilized controls for confirmatory diagnoses of bovine brucellosis in blood serum and milk per animal and tank and selection and lyophilization process | |
| JP2002525605A (en) | Salmonella antigen formulation and kit for detecting Salmonella antibodies | |
| CN111398594B (en) | Immunodiagnosis kit for specifically detecting yellow fever virus NS1 antigen | |
| RU2202797C2 (en) | Kit for detecting antibodies to the agent of poultry respiratory mycoplasmosis | |
| RU2192014C1 (en) | Kit for detection of antibodies to infectious bursal disease virus in poultry | |
| Zeedan et al. | Optimization of serological diagnostic methods for rapid field detection of foot-and-mouth disease virus antigen and antibodies in natural infected bovine specimens. | |
| RU2640192C1 (en) | Elisa test system for segological diagnostics of cattle nodulous dermatitis - dermatitis nodularis bovum | |
| McHugh et al. | Bornavirus antigens in psittaciformes infected with psittaciform bornavirus and their use in diagnostic procedures | |
| RU2167673C1 (en) | Set for determining antibodies to egg yield drop syndrome-76 hen virus | |
| Cardoso et al. | Validation of an immunohistochemistry assay to detect turkey coronavirus: a rapid and simple screening tool for limited resource settings | |
| RU2297452C2 (en) | Asia-1-type foot-and-mouth disease virus strain for producing of diagnostic and/or vaccine preparations | |
| Cardoso et al. | A liquid phase blocking ELISA for the detection of antibodies against infectious bronchitis virus | |
| Ibrahim et al. | Conjugation Of Foot And Mouth Disease IgY In Chicken Egg Yolk With Horse Radish Peroxidase For Typing Of Foot And Mouth Disease Virus | |
| Wu et al. | Localization and dynamic expression of a 27.8 kDa receptor protein for lymphocystis disease virus infection in sea bass (Lateolabrax japonicus) tissues | |
| Ularamu et al. | Improving laboratory capacity for Foot-and-Mouth Disease diagnosis and control for sustainable livestock production in Nigeria. | |
| JP2950273B2 (en) | Bovine rotavirus disease vaccine | |
| RU2684417C1 (en) | Method of determining specific antibodies to type i ducklings hepatitis virus | |
| Durigon et al. | Comparison of Staphylococcal co-agglutination with other assays for rapid diagnosis of rotavirus infection in humans, calves and piglets | |
| Ignjatovic | Very virulent infectious bursal disease virus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070303 |