RU2199340C1

RU2199340C1 - Method for obtaining protective extracellular brucella antigen capable to provoke chronic forms of brucellosis

Info

Publication number: RU2199340C1
Application number: RU2001124872A
Authority: RU
Inventors: П.Е. Игнатов; А.И. Федоров
Original assignee: Игнатов Петр Евгеньевич; Федоров Андрей Иванович
Priority date: 2001-09-12
Filing date: 2001-09-12
Publication date: 2003-02-27

Abstract

FIELD: medicine, veterinary science. SUBSTANCE: protective antigen is characterized by sugars' content up to 60%, proteins up to 20%, nucleotides up to 5%, it has molecular weight below 30 kDa and maximum absorption within 250-265 nm wave lengths. Antigen is obtained during cultivation of Brucella in nutritive medium at 5.5- 7.0 pH. The former is isolated out of liquid fraction of culture liquid presubjected to either acidic or alkaline hydrolysis and purified due to ultrafiltration or liquid chromatography. The method provides to obtain antigen capable to provoke latent forms of brucellosis. EFFECT: higher efficiency. 3 cl, 12 ex, 2 tbl

Description

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению биологически активных веществ из микроорганизмов. The invention relates to the field of biotechnology, namely to the production of biologically active substances from microorganisms.

Уже более ста лет ведутся работы по поиску эффективных средств профилактики, лечения и выявления бруцеллезной инфекции, однако до сих пор нет надежных профилактических и диагностических средств при бруцеллезе. For over a hundred years, work has been carried out to find effective means of prevention, treatment and detection of brucellosis infection, however, there are still no reliable preventive and diagnostic agents for brucellosis.

Применяемые в настоящее время живые аттенуированные вакцины или инактивированные вызывают развитие патологических симптомов, весьма похожих на клинику заболевания. Тоже относится и к выделяемым в настоящее время антигенам. Currently used live attenuated vaccines or inactivated, cause the development of pathological symptoms, very similar to the clinic of the disease. The same applies to currently released antigens.

Известны методы получения бруцеллезных антигенов путем экстракции их из бактериальной массы химическими реагентами фенолом [1, 2], эфиром [3, 4], трихлоруксусной кислотой [5] . Эти антигены наряду с невысокой иммуногенностью вызывают ряд нежелательных явлений, таких как индукция S-антител и сенсибилизация организма. Known methods for producing brucellosis antigens by extracting them from the bacterial mass with chemical reagents phenol [1, 2], ether [3, 4], trichloroacetic acid [5]. These antigens, along with low immunogenicity, cause a number of undesirable phenomena, such as the induction of S-antibodies and sensitization of the body.

Наиболее близким методом получения антигена, который следует взять за ближайший аналог, является метод получения бруцеллезного антигена, включающий накопление бактериальной массы, получение из нее ацетонового порошка, уксуснокислый гидролиз этого порошка при 100^oС, отделение гидролизованной бакмассы от супернатанта и высаживание антигена этиловым спиртом на холоду [6] . Получаемый антиген представляет собой комплекс веществ поверхностного слоя клеточной стенки и содержит в своем составе сахара, белок, липиды, нуклеиновые кислоты и фосфаты [7]. Однако данный антиген обладает способностью вызывать синтез S-антител и сенсибилизацию организма.The closest method for producing antigen, which should be taken as the closest analogue, is the method for producing brucellosis antigen, including the accumulation of bacterial mass, the production of acetone powder from it, the acetic hydrolysis of this powder at 100 ^° C, the separation of the hydrolyzed bacmass from the supernatant, and the antigen is precipitated with ethyl alcohol on cold [6]. The resulting antigen is a complex of substances of the surface layer of the cell wall and contains sugar, protein, lipids, nucleic acids and phosphates in its composition [7]. However, this antigen has the ability to cause the synthesis of S-antibodies and sensitization of the body.

Технический результат изобретения заключается в получении протективного внеклеточного антигена бруцелл, не вызывающего реакции гиперчувствительности замедленного типа и синтез антител к S- и R-антигенам бруцелл и способного провоцировать скрытые формы бруцеллеза. The technical result of the invention is to obtain a protective extracellular brucella antigen that does not cause a delayed-type hypersensitivity reaction and synthesis of antibodies to brucella S and R antigens and capable of provoking latent forms of brucellosis.

Предлагаемый способ заключается в том, что бруцелл культивируют в жидкой питательной среде. Культивирование ведут в течение 6-8 часов на стационарной фазе роста при перемешивании и аэрации. рН среды в процессе культивирования может колебаться в пределах от 5,0-7,0. После окончания культивирования бактериальную массу отделяют, а из культуральной жидкости получают после очистки целевой продукт, представляющий собой вещество, в котором определяются сахара до 60% (определяемые по Дюбуа [8]), белки до 20% (определяемые по Лоури [9] ) и нуклеотиды до 10% (определяемые спектрофотометрическим методом [10] ) с молекулярной массой менее 30 кД, содержащий в своем составе аминогруппы (определяемые тринитробензолсульфокислотным методом [11]). Полученный антиген в диапазоне волн от 250-265 имеет максимальный пик поглощения. The proposed method consists in the fact that brucella is cultivated in a liquid nutrient medium. Cultivation is carried out for 6-8 hours in the stationary phase of growth with stirring and aeration. The pH of the medium during the cultivation process can range from 5.0-7.0. After cultivation, the bacterial mass is separated, and after purification, the target product is obtained from the culture fluid, which is a substance in which sugars up to 60% (determined by Dubois [8]), proteins up to 20% (determined by Lowry [9]) are determined and nucleotides up to 10% (determined by the spectrophotometric method [10]) with a molecular mass of less than 30 kD containing amino groups (determined by the trinitrobenzenesulfonic acid method [11]). The resulting antigen in the wavelength range from 250-265 has a maximum absorption peak.

Патент иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1. Двухсуточную матричную культуру вакцинного штамма Вr. abortus 19, смытую с 2 матр, помещают в реактор с 1000 мл мясопептонно-печоночного-глюкозо-глицеринового бульона с рН 7,0 и культивируют в течение 18 часов при постоянном перемешивании и аэрации. Через 8 часов после достижения стационарной фазы роста и концентрации 40-50 млрд микробных клеток в одном мл бактериальную массу отделяют центрифугированием. Полученный супернатант дополнительно подвергают фильтрации через бактериальный фильтр. Обеззараженный супернатант лиофилизируют при общепринятых режимах. Высушенный препарат растворяют в 50 мл дистиллированной воды и в него вливают 150 мл охлажденного до 4^oС этанола. Смесь культуральной жидкости и этанола выдерживают в течение 16 часов при температуре 4^oС. Выпавший осадок отделяют от жидкой фазы центрифугированием при 5 тыс. g в течение 20 минут. Полученный осадок растворяют в дистиллированной воде. Из полученного раствора методом гель-фильтрации выделяют целевой продукт.The patent is illustrated by the following examples:
Example 1. Two-day matrix culture of the vaccine strain Br. abortus 19, washed off from 2 mats, was placed in a reactor with 1000 ml of meat-peptone-liver-glucose-glycerol broth with a pH of 7.0 and cultured for 18 hours with constant stirring and aeration. 8 hours after reaching the stationary phase of growth and a concentration of 40-50 billion microbial cells in one ml, the bacterial mass is separated by centrifugation. The resulting supernatant is further filtered through a bacterial filter. The disinfected supernatant is lyophilized under conventional conditions. The dried preparation is dissolved in 50 ml of distilled water and 150 ml of ethanol cooled to 4 ^{° C. are} poured into it. The mixture of the culture fluid and ethanol is maintained for 16 hours at a temperature of 4 ^o C. The precipitate is separated from the liquid phase by centrifugation at 5 thousand g for 20 minutes. The resulting precipitate was dissolved in distilled water. The target product is isolated from the resulting solution by gel filtration.

Хроматографическую очистку антигена проводят на колонке (1000•75), заполненой Сефадексом G-75 и уравновешенной дистиллированной водой, рН 6,2-6,4 при длине волны 254 нм. На колонку наносят раствор антигена в количестве 100-150 мл. В качестве элюента используют дистиллированную воду, рН 6,2-6,4. Скорость подачи элюента 1-1,5 мл/мин. Первый пик, выходящий в свободном объеме, удаляют. Собирают второй пик, выходящий в объеме колонки, и подвергают лиофильному высушиванию. Полученный антиген представляет собой вещество, в котором определяются сахара 60% (определяемые по Дюбуа), белки 20% (определяемые по Лоури) и нуклеотиды 5% (определяемые спектрофотометрическим методом) с молекулярной массой менее 30 кД, содержащее в своем составе аминогруппы (определяемые тринитробензолсульфокислотым методом). Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1. Chromatographic purification of antigen is carried out on a column (1000 • 75) filled with Sephadex G-75 and balanced with distilled water, pH 6.2-6.4 at a wavelength of 254 nm. A solution of antigen in an amount of 100-150 ml is applied to the column. Distilled water, pH 6.2-6.4, is used as an eluent. The flow rate of the eluent is 1-1.5 ml / min. The first peak leaving in the free volume is removed. A second peak is collected, leaving in the column volume, and freeze-dried. The resulting antigen is a substance in which 60% sugars (determined by Dubois), 20% proteins (determined by Lowry) and 5% nucleotides (determined by spectrophotometric method) with a molecular weight of less than 30 kD, containing amino groups (determined by trinitrobenzenesulfonic acid) are determined method). The results of the biological activity of the antigen are presented in table 1.

Пример 2. Антиген получают аналогично методу, описанному в примере 1, но вместо вакцинного штамма используют вирулентный штамм Вг. abortus 54, рН среды 6,0. После окончания культивирования и отделения культуральной жидкости от бакмассы культуральную жидкость подвергают ультрафильтрации через фильтр с полыми волокнами, которые пропускают вещества с молекулярной массой ниже 30 тысяч. Полученный антиген содержит в своем составе 28% сахаров, 1% белков и 1% нуклеотидов, молекулярная масса менее 30 кД. Полученный антигенсодержащий фильтрат подвергают лиофилизации. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1. Example 2. The antigen is obtained similarly to the method described in example 1, but instead of the vaccine strain using a virulent strain of Vg. abortus 54, pH 6.0. After cultivation and separation of the culture fluid from the back of the mass, the culture fluid is subjected to ultrafiltration through a hollow fiber filter that passes substances with a molecular weight below 30 thousand. The resulting antigen contains 28% sugars, 1% proteins and 1% nucleotides, a molecular weight of less than 30 kD. The resulting antigen-containing filtrate is lyophilized. The results of the biological activity of the antigen are presented in table 1.

Пример 3. Антиген получают методом, описанным в примере 1, но в качестве штамма продуцента используют вирулентный штамм Br. melitensis 16 М, рН среды доводят 40% молочной кислотой до 5,0. Удаление из антигенсодержащей культуральной среды высокомолекулярных примесей осуществляют путем кислотного гидролиза. Для этого в культуральную антигенсодержащую среду добавляют соляную кислоту до конечной концентрации 1% и проводят гидролиз при температуре 85-95^oС в течение часа. В результате гидролиза разрушаются все высокомолекулярные примеси. После гидролиза антигенсодержащую жидкость нейтрализуют 0,1 н. раствором NaOH до рН 6,5-7,0. Антиген выделяют спиртовым осаждением с последующей гель-хроматографией, описанным в примере 1. Полученный антиген содержит в своем составе 48% сахаров, 16% белков и 5% нуклеотидов, молекулярная масса менее 30 кД. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.Example 3. The antigen is obtained by the method described in example 1, but as a producer strain using a virulent strain of Br. melitensis 16 M, the pH of the medium is adjusted with 40% lactic acid to 5.0. Removal of high molecular weight impurities from an antigen-containing culture medium is carried out by acid hydrolysis. To do this, hydrochloric acid is added to the culture antigen-containing medium to a final concentration of 1% and hydrolysis is carried out at a temperature of 85-95 ^o C for one hour. As a result of hydrolysis, all high molecular weight impurities are destroyed. After hydrolysis, an antigen-containing liquid is neutralized with 0.1 N. NaOH solution to a pH of 6.5-7.0. The antigen is isolated by alcohol precipitation, followed by gel chromatography described in Example 1. The resulting antigen contains 48% sugars, 16% proteins and 5% nucleotides, a molecular weight of less than 30 kD. The results of the biological activity of the antigen are presented in table 1.

Пример 4. Антиген получают методом, описанным в примере 1, но в качестве штамма продуцента используют вирулентный штамм Br. melitensis 16 М, рН среды доводят 40% молочной кислотой до 5,0. Удаление из антигенсодержащей культуральной среды высокомолекулярных примесей осуществляют путем щелочного гидролиза. Для этого в культуральную антигенсодержащую среду добавляют раствор NaOH до 1% конечной концентрации и проводят гидролиз при температуре 85-95^oС в течение часа. В результате гидролиза разрушаются все высокомолекулярные примеси. После гидролиза антигенсодержащую жидкость нейтрализуют до рН 6,5-7,0 0,1 н. соляной кислотой. Антиген выделяют спиртовым осаждением с последующей гель-хроматографией, описанным в примере 1. Полученный антиген содержит в своем составе 58% сахаров, 14% белков и 2% нуклеотидов, молекулярная масса менее 30 кД. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.Example 4. The antigen is obtained by the method described in example 1, but as a producer strain using a virulent strain of Br. melitensis 16 M, the pH of the medium is adjusted with 40% lactic acid to 5.0. Removal of high molecular weight impurities from an antigen-containing culture medium is carried out by alkaline hydrolysis. To do this, add NaOH solution to a 1% final concentration in the culture antigen-containing medium and carry out hydrolysis at a temperature of 85-95 ^o C for one hour. As a result of hydrolysis, all high molecular weight impurities are destroyed. After hydrolysis, the antigen-containing liquid is neutralized to a pH of 6.5-7.0 0.1 N. hydrochloric acid. The antigen is isolated by alcohol precipitation, followed by gel chromatography described in Example 1. The resulting antigen contains 58% sugars, 14% proteins and 2% nucleotides, a molecular weight of less than 30 kD. The results of the biological activity of the antigen are presented in table 1.

Пример 5. Антиген получают методом, описанным в примере 1, но в качестве питательной среды используют среду Вейбриджа. Полученный антиген содержит в своем составе 48% сахаров, 20% белков и 5% нуклеотидов, молекулярная масса менее 30 кД. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1. Example 5. The antigen is obtained by the method described in example 1, but the medium is Weibridge. The resulting antigen contains 48% sugars, 20% proteins and 5% nucleotides, a molecular weight of less than 30 kD. The results of the biological activity of the antigen are presented in table 1.

Пример 6. Антиген получают методом, описанным в примере 1, но в качестве среды используют бульон на переваре Хоттингера. Полученный антиген содержит в своем составе 30% сахаров, 12% белков и 3% нуклеотидов. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1. Example 6. The antigen is obtained by the method described in example 1, but as the medium used broth on the Hottinger digest. The resulting antigen contains 30% sugars, 12% proteins and 3% nucleotides. The results of the biological activity of the antigen are presented in table 1.

Пример 7. В синтетическую питательную среду 199 вносят предварительно выращенную двухсуточную культуру штамма Br. abortus 54. Конечная концентрация засевной культуры в 199 среде составляет 60 млрд микробных клеток в мл, рН среды доводят 0,1 н. раствором соляной кислоты до 7,0 единиц. Питательную среду инкубируют при 37^oС в течение 4 часов при перемешивании. Через 6 часов бактериальную массу отделяют центрифугированием. Полученный супернатант дополнительно подвергают фильтрации через бактериальный фильтр Зейца. Обеззараженный супернатант лиофилизируют при общепринятых режимах. Высушенный препарат растворяют в 50 мл дистиллированной воды и в него вливают 150 мл охлажденного до 4^oС этанола. Смесь культуральной жидкости и этанола выдерживают в течение 16 часов при температуре 4^oС. Выпавший осадок отделяют от жидкой фазы центрифугированием при 5 тыс. g в течение 20 минут. Полученный осадок растворяют в дистиллированной воде. Из полученного раствора методом гель-фильтрации выделяют целевой продукт.Example 7. In a synthetic nutrient medium 199 make pre-grown two-day culture of strain Br. abortus 54. The final concentration of inoculum in 199 medium is 60 billion microbial cells per ml, the pH of the medium is adjusted to 0.1 N. hydrochloric acid solution up to 7.0 units. The nutrient medium is incubated at 37 ^o C for 4 hours with stirring. After 6 hours, the bacterial mass is separated by centrifugation. The resulting supernatant is additionally filtered through a Seitz bacterial filter. The disinfected supernatant is lyophilized under conventional conditions. The dried preparation is dissolved in 50 ml of distilled water and 150 ml of ethanol cooled to 4 ^{° C. are} poured into it. The mixture of the culture fluid and ethanol is maintained for 16 hours at a temperature of 4 ^o C. the Precipitate is separated from the liquid phase by centrifugation at 5 thousand g for 20 minutes. The resulting precipitate was dissolved in distilled water. The target product is isolated from the resulting solution by gel filtration.

Хроматографическую очистку антигена проводят на колонке (1000•75), заполненой Сефадексом G-75 и уравновешенной дистиллированной водой, рН 6,2-6,4 при длине волны 254 нм. На колонку наносят раствор антигена в количестве 100-150 мл. В качестве элюента используют дистиллированную воду, рН 6,2-6,4. Скорость подачи элюента 1-1,5 мл/мин. Первый пик, выходящий в свободном объеме, удаляют. Собирают второй пик, выходящий в объеме колонки, и подвергают лиофильному высушиванию. Полученный антиген содержит в своем составе 30% сахаров, 5% белков и 1% нуклеотидов, молекулярная масса менее 30 кД. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1. Chromatographic purification of antigen is carried out on a column (1000 • 75) filled with Sephadex G-75 and balanced with distilled water, pH 6.2-6.4 at a wavelength of 254 nm. A solution of antigen in an amount of 100-150 ml is applied to the column. Distilled water, pH 6.2-6.4, is used as an eluent. The flow rate of the eluent is 1-1.5 ml / min. The first peak leaving in the free volume is removed. A second peak is collected, leaving in the column volume, and subjected to freeze drying. The resulting antigen contains 30% sugars, 5% proteins and 1% nucleotides, a molecular weight of less than 30 kD. The results of the biological activity of the antigen are presented in table 1.

Пример 8. Антиген получают методом, описанным в примере 7, но в качестве среды культивирования используют солевой раствор Хенкса. Концентрацию клеток бруцелл в нем доводят до 100 млрд/мл, а время инкубации увеличивают до 16 часов. Очистку антигена от высокомолекулярных примесей проводят путем гидролиза в 1 н. уксусной кислоте. Антиген из гидролизованной питательной среды выделяют путем осаждения этиловым спиртом с последующей гель-фильтрацией на колонках с Сефадексом. Полученный антиген содержит в своем составе 30% сахаров, 2% белка и 5% нуклеотидов, молекулярная масса менее 30 кД. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1. Example 8. The antigen is obtained by the method described in example 7, but Hanks saline solution is used as the culture medium. The concentration of brucella cells in it was adjusted to 100 billion / ml, and the incubation time was increased to 16 hours. Purification of antigen from high molecular weight impurities is carried out by hydrolysis in 1 N. acetic acid. The antigen from the hydrolyzed culture medium is isolated by precipitation with ethanol, followed by gel filtration on Sephadex columns. The resulting antigen contains 30% sugars, 2% protein and 5% nucleotides, a molecular weight of less than 30 kD. The results of the biological activity of the antigen are presented in table 1.

Пример 9. Антиген получают методом, описанным в примере 1, но рН среды устанавливают равным 4,5. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1. Example 9. The antigen is obtained by the method described in example 1, but the pH of the medium is set equal to 4.5. The results of the biological activity of the antigen are presented in table 1.

Пример 10. Антиген получают методом, описанным в примере 1, но рН среды устанавливают равным 7,5. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1. Полученный антиген содержит в своем составе 48% сахаров, 9% белков и 5% нуклеотидов, молекулярная масса менее 30 кД. Example 10. The antigen is obtained by the method described in example 1, but the pH of the medium is set equal to 7.5. The results of the biological activity of the antigen are presented in table 1. The resulting antigen contains 48% sugars, 9% proteins and 5% nucleotides, molecular weight less than 30 kD.

Пример 11. Биологические свойства полученных антигенов в сравнении с прототипом проверяют на морских свинках. Антиген вводят внутримышечно в дозе 0,2 мг. На 7 и 15 день у животных берут кровь и исследуют ее на предмет обнаружения антител к S- и R-антигенам бруцелл. На 30 день проводят внутрикожную пробу Бюрне. Через 35 дней животных опытных и контрольных групп заражают 2 ИД₁₀₀. И через месяц после заражения проводят убой и бактериологическое исследование лимфатических узлов и паренхиматозных органов. Животное считается заразившимся, если удается выделить культуру из какого-либо объекта.Example 11. The biological properties of the obtained antigens in comparison with the prototype is tested on guinea pigs. The antigen is administered intramuscularly at a dose of 0.2 mg. On days 7 and 15, blood was collected from animals and examined for detection of antibodies to Brucella S and R antigens. On day 30, an intradermal Burne test is performed. After 35 days, the animals of the experimental and control groups are infected with 2 ID ₁₀₀ . And a month after infection, a slaughter and bacteriological examination of the lymph nodes and parenchymal organs is carried out. An animal is considered infected if it is possible to isolate the culture from any object.

Пример 12. Изучение способности бруцеллезного внеклеточного антигена выявлять скрытые формы бруцеллеза. Example 12. The study of the ability of brucellosis extracellular antigen to detect latent forms of brucellosis.

Для определения способности бруцеллезного антигена выявлять скрытые формы бруцеллеза тридцати морским свинкам вводят вакцинный штамм Br. abortus 19 в дозе 15 тыс. микробных клеток. Всех животных разделяют на 6 групп. Через 45 дней после иммунизации морским свинкам 5 групп вводят антиген, полученный по методам, описанным в примерах 1, 3, 6, 7 и 9 в дозе 0,2 мг, а пять животных оставляют в качестве контроля. Через 15 дней у всех животных берут кровь и исследуют на наличие S-агглютининов в реакции агглютинации (РА), начиная с разведения 1:10. Результаты исследований приведены в таблице 2. To determine the ability of brucellosis antigen to detect latent forms of brucellosis, thirty Guinea pigs are injected with the Br vaccine strain. abortus 19 at a dose of 15 thousand microbial cells. All animals are divided into 6 groups. 45 days after immunization, guinea pigs of the 5 groups are injected with the antigen obtained by the methods described in examples 1, 3, 6, 7 and 9 at a dose of 0.2 mg, and five animals are left as a control. After 15 days, blood was taken from all animals and examined for the presence of S-agglutinins in the agglutination reaction (RA), starting from a 1:10 dilution. The research results are shown in table 2.

Таким образом, полученный внеклеточный протективный антиген бруцелл обладает выраженной протективной активностью, не вызывает сенсибилизации организма и синтеза антител к S- и R-антигенам и способен провоцировать синтез антител при скрыто протекающих формах бруцеллеза. Thus, the obtained extracellular protective antigen of brucella has a pronounced protective activity, does not cause sensitization of the body and the synthesis of antibodies to S- and R-antigens, and is capable of provoking the synthesis of antibodies with latent forms of brucellosis.

Список литературы
1. Proc. Soc. Exp. Biol. 1961, - v.106, - N4, - р.748-752.List of references
1. Proc. Soc. Exp. Biol. 1961, - v.106, - N4, - p. 748-752.

2. International symposium on Brucellosis. Develop. Biol. Standart - Rabat, - 1975, - v.31, - p.68-91. 2. International symposium on Brucellosis. Develop. Biol. Standart - Rabat, - 1975, - v.31, - p. 68-91.

3. Jornal Bactereology. - 1962, - v.94, - N 2, - p.256-268. 3. Jornal Bactereology. - 1962, - v. 94, - N 2, - p. 256-268.

4. Вершилова П.А., Чернышева М.И., Князева Э.Н. Патогенез и иммунология бруцеллеза - Медгиз - 1974 - с.178-179. 4. Vershilova P.A., Chernysheva M.I., Knyazev E.N. The pathogenesis and immunology of brucellosis - Medgiz - 1974 - p. 178-179.

5. Jornal Bacteriology - 1965, - v.90, - p. 895-902. 5. Jornal Bacteriology - 1965, - v.90, - p. 895-902.

6. Авторское свидетельство СССР 467933 от 1972 г. 6. USSR author's certificate 467933 of 1972

7. Гадельшин И.А. Определение реактогенности, безвредности и антигенной активности бруцеллезной химической вакцины. Автореферат дисс. кан. мед. наук. - Алма-Ата - 1986 г., - с.20. 7. Gadelshin I.A. Determination of reactogenicity, safety and antigenic activity of brucellosis chemical vaccine. Abstract of diss. can honey. sciences. - Alma-Ata - 1986, - p.20.

8. Dubois М, Gilles К.A., Hamilton J.К. Colorimetric method of determination of sugar and related substances. //Anal. Chem. 1956. - v.28., - P. 350-356. 8. Dubois M, Gilles K.A., Hamilton J.K. Colorimetric method of determination of sugar and related substances. // Anal. Chem. 1956.- v. 28., - P. 350-356.

9. Protein measurement with the Folin phenol reagent. /Lowry O.H., Resenbrough N.J., Farr A.L, Randalle R.J. // J. Biol. Chem. - 1951. - v.193. - P.265-275. 9. Protein measurement with the Folin phenol reagent. / Lowry O.H., Resenbrough N.J., Farr A.L., Randalle R.J. // J. Biol. Chem. - 1951. - v.193. - P.265-275.

10. World Health Organization Expert Commitee on Biological Standartion 1977, Technical Report Series 610. World Health Organization, Geneva. 10. World Health Organization Expert Commitee on Biological Standartion 1977, Technical Report Series 610. World Health Organization, Geneva.

11. Snyder S.L., Sobocinsky P.Z. Improved 2,4,6-trinitrobenzenesolfonic acid metod for the determination of amine. // Analit. Biochem. - 1975. - v. 64., - N 1. - P.284-288. 11. Snyder S.L., Sobocinsky P.Z. Improved 2,4,6-trinitrobenzenesolfonic acid metod for the determination of amine. // Analit. Biochem. - 1975. - v. 64., - N 1. - P.284-288.

Claims

1. A method of obtaining a protective extracellular antigen of brucella with the ability to provoke chronic forms of brucellosis, characterized in that the brucella is cultured in a liquid nutrient medium at pH 5.5-7.0, then the culture medium containing the antigen is separated from the bacterial mass, followed by isolation and purification of the antigen, characterized by up to 60% sugar, up to 20% protein, up to 5% nucleotides from mol.m. less than 30 kDa and having a maximum absorption peak in the wavelength range of 250-265 nm.

2. The method according to claim 1, characterized in that before isolating the antigen, the culture medium is subjected to acid or alkaline hydrolysis.

3. The method according to claim 2, characterized in that the antigen is purified by ultrafiltration of the culture medium through filters with a pore size of 30 kD.

4. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the purification of the antigen is carried out by liquid chromatography.