RU2197254C2

RU2197254C2 - Method of production of protamine sulfate form mature fish milt

Info

Publication number: RU2197254C2
Application number: RU2000108562/14A
Authority: RU
Inventors: И.А. Маругин; В.В. Волков; В.Ф. Ивченко; В.Г. Силаев
Original assignee: Открытое акционерное общество "МАПО-ФОНД"
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2000-04-07
Publication date: 2003-01-27

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: invention relates to methods of production of protamine sulfate from milts of mature fishes. Method involves raw boiling out in water, milling, treatment with acetone, drying to granules formation followed by extraction of granules with 4% sulfuric acid solution, proteins precipitation from extract by addition of alcohol twofold volume, precipitate dissolving in hot water, treatment with barium hydroxide and addition of ammonia, treatment with kieselguhr, filtration, passing filtrate through cationite in H⁺-form, eluate concentration, precipitation of end product, its isolation and drying. EFFECT: improved processes of extraction and filtration in granules preparing. 1 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, в частности к производству фармацевтической субстанции протамина сульфат. Эта субстанция для обеспечения требуемой активности должна обладать определенной степенью чистоты от сопутствующих посторонних белков. The invention relates to medicine, in particular to the production of a pharmaceutical substance protamine sulfate. To ensure the required activity, this substance must have a certain degree of purity from related foreign proteins.

Известен способ производства протамина сульфата, по которому нежирные молоки лососевых рыб обрабатывают разбавленным раствором уксусной кислоты при нагревании и, минуя стадии обезжиривания и обезвоживания, протамины экстрагируют 1% раствором серной кислоты, а образующийся протамина сульфат осаждают этанолом. (Н.Е. Николаева и Л.В. Сысоева "Способ получения протамина (сальмина). Авторское свидетельство 170147. Заявлено 30.05.1964). A known method for the production of protamine sulfate, in which low-fat milk of salmon fish is treated with a dilute solution of acetic acid when heated and, bypassing the stage of degreasing and dehydration, protamines are extracted with 1% sulfuric acid, and the resulting protamine sulfate precipitated with ethanol. (N.E. Nikolaev and L.V. Sysoev "Method for the production of protamine (salmin). Copyright certificate 170147. Claimed 05/30/1964).

Недостатком такого способа является ограничение при отборе исходного сырья (только нежирные молоки), а также наличие большого количества сопутствующих посторонних белков и липидов, что является следствием их неудовлетворительного отделения и тем самым обуславливает невысокую антигепариновую активность, а также низкий процент выхода готового продукта. The disadvantage of this method is the limitation in the selection of raw materials (only non-fat milk), as well as the presence of a large number of concomitant foreign proteins and lipids, which is the result of their unsatisfactory separation and, therefore, leads to a low antiheparin activity, as well as a low percentage of the finished product.

По другому известному способу из молок рыб одновременно получают протамина сульфат и дезоксирибонуклеиновую кислоту. Предварительно измельченные молоки экстрагируют раствором хлористого натрия и выделяют дезоксирибонуклеиновую кислоту известными методами. Остаток после ее отделения обрабатывают 5% раствором серной кислоты, центрифугируют и осаждают ацетоном. Полученный осадок промывают горячей, подщелоченной раствором аммиака, водой до растворения при рН 8,0-9,0, осаждают ацетоном и сушат. According to another known method, protamine sulfate and deoxyribonucleic acid are simultaneously obtained from fish milk. The pre-ground milk is extracted with a solution of sodium chloride and the deoxyribonucleic acid is isolated by known methods. The residue after its separation is treated with 5% sulfuric acid solution, centrifuged and precipitated with acetone. The resulting precipitate is washed with hot, alkalized ammonia solution, water until dissolved at pH 8.0-9.0, precipitated with acetone and dried.

Недостатком этого способа является наличие повышенного количества сопутствующих посторонних белков и нуклеиновых кислот (РНК и ДНК), что является результатом неудовлетворительного их отделения и тем самым обуславливает невысокую антигепариновую активность. (Н.И. Супрунов, В.А. Рассказов, Б.А. Алексеенко и В.И. Головлев "Способ совместного получения протамин-сульфата и дезоксирибонуклеиновой кислоты". Авторское свидетельство 473720. Заявлено 15.09.72). Этот способ принят за прототип. The disadvantage of this method is the presence of an increased number of concomitant foreign proteins and nucleic acids (RNA and DNA), which is the result of unsatisfactory separation and thereby leads to low antiheparin activity. (N.I. Suprunov, V.A. Rasskazov, B.A. Alekseenko, and V.I. Golovlev, "A method for co-production of protamine sulfate and deoxyribonucleic acid." Copyright certificate 473720. Claim 15.09.72). This method is adopted as a prototype.

Известен способ производства протамина сульфата, в большей степени свободный от недостатков вышеприведенных способов. (Т.Ю. Андреечива, А.В. Баланда, Г.М. Горшкова, И.А. Донецкий, С.П. Карасенко, П.М. Кочергин, Е.И. Люстгартен, М. Ю. Мазов, И.А. Маругин "Способ получения протамина". Авторское свидетельство 1072311. Заявлено 07.07.81). A known method for the production of protamine sulfate, more free from the disadvantages of the above methods. (T.Yu. Andreechiva, A.V. Balanda, G.M. Gorshkova, I.A. Donetsky, S.P. Karasenko, P.M. Kochergin, E.I. Lustgarten, M. Yu. Mazov, I .A. Marugin "Method for the production of protamine. Copyright certificate 1072311. Claimed 07.07.81).

По этому способу молоки предварительно измельчают, обезвоживают, обезжиривают, высушивают, измельчают и экстрагируют 4% раствором серной кислоты с последующим осаждением ацетоном. Затем осадок растворяют в горячей воде (55-60^oС), обрабатывают кристаллическим гидратом окиси бария до рН 7,5, подщелачивают концентрированным раствором аммиака до рН 8,5-9,5 и добавляют активированный уголь. После центрифугирования и промывания осадка проводят обессоливание раствора протамина сульфата с последующим его осаждением ацетоном.According to this method, the milk is pre-crushed, dehydrated, degreased, dried, crushed and extracted with 4% sulfuric acid solution, followed by precipitation with acetone. Then the precipitate is dissolved in hot water (55-60 ^o C), treated with crystalline barium oxide hydrate to a pH of 7.5, alkalized with a concentrated ammonia solution to a pH of 8.5-9.5 and activated carbon is added. After centrifugation and washing of the precipitate, a solution of protamine sulfate is desalted, followed by precipitation with acetone.

Однако такой способ имеет ряд существенных недостатков, состоящих в недостаточной степени очистки целевого продукта от сопутствующих белков и реакционных примесей, а именно: применение на всех стадиях производства ацетона приводит к тому, что в конечном продукте содержание ацетона значительно превышает существующие нормы; применение активированного угля изменяет цвет конечного продукта, что не соответствует существующим требованиям; применение кристаллического гидрата окиси бария не дает полного осаждения избытка серной кислоты, что снижает эффективность последующих стадий очистки и выделения протамина сульфата. However, this method has a number of significant drawbacks consisting in insufficient degree of purification of the target product from concomitant proteins and reaction impurities, namely: the use of acetone at all stages of production leads to the fact that the acetone content in the final product significantly exceeds existing standards; the use of activated carbon changes the color of the final product, which does not meet existing requirements; the use of crystalline barium oxide hydrate does not completely precipitate the excess sulfuric acid, which reduces the effectiveness of the subsequent stages of purification and isolation of protamine sulfate.

Предлагаемый способ состоит в изменении производственного процесса на следующих стадиях:
1. Обработка половозрелых молок до получения гранул размером не более 3-5 мм.The proposed method consists in changing the production process in the following stages:
1. Processing of matured milk to obtain granules with a size of not more than 3-5 mm.

2. Процесс отделения посторонних белков в ИЭТ разделен на две стадии с использованием 10% раствора гидроокиси бария. 2. The process of separation of foreign proteins in the IET is divided into two stages using a 10% solution of barium hydroxide.

3. Концентрирование фильтрата упариванием или методом баромембранного концентрирования. 3. Concentration of the filtrate by evaporation or by the method of baromembrane concentration.

4. Осаждение готового продукта производится двукратным объемом спирта. 4. Precipitation of the finished product is carried out in a double volume of alcohol.

5. Использование кизельгура не изменяет цвет конечного продукта. 5. The use of kieselguhr does not change the color of the final product.

Для получения протамина сульфата повышенной антигепариновой активности необходимо повысить экстракцию протамина из молок раствором серной кислоты. Этого можно достичь путем предварительного перевода сырых молок в сухие гранулы. Сырые молоки вываривают в кипящей воде в течение 10-15 минут, затем измельчают на электромясорубке и обрабатывают 2-3-кратным объемом ацетона и высушивают до образования гранул размером не более 3-5 мм. Использование таких гранул качественно улучшает процесс экстракции и скорость фильтрации. Гранулы экстрагируют 4% раствором серной кислоты и экстракт обрабатывают двойным объемом ацетона. Полученный осадок растворяют в горячей воде (50-60^oС) и обрабатывают в две стадии. Первая - добавляют 10% раствор гидроокиси бария до рН - 7,0-7,5, при котором происходит полное осаждение избытка серной кислоты, полученную взвесь обрабатывают 25% раствором гидроокиси аммония до рН - 9,0-9,5, при котором посторонние белки осаждаются в ИЭТ. Осадок смеси посторонних белков и сульфата бария выводят методом декантации и центрифугированием. Вторая стадия - полученные центрифугат и осветленный маточный раствор центрифугируют, обрабатывают 2-3% кизельгура и фильтруют на нутч-фильтре. Удаление из раствора минеральных солей производят на ионообменной колонке с катионитом в Н-форме
Концентрирование элюата можно производить на вакуумвыпарной установке или методом баромембранного концентрирования до 50%, после чего производят осаждение целевого продукта двукратным объемом спирта, отделяют осадок и высушивают его при температуре 55-65^oС в течение 7-12 часов.To obtain protamine sulfate with increased antiheparin activity, it is necessary to increase the extraction of protamine from milk with a solution of sulfuric acid. This can be achieved by first converting raw milk into dry granules. Raw milk is boiled in boiling water for 10-15 minutes, then ground in an electric meat grinder and treated with a 2-3-fold volume of acetone and dried to form granules of no more than 3-5 mm in size. The use of such granules qualitatively improves the extraction process and the filtration rate. The granules are extracted with 4% sulfuric acid and the extract is treated with a double volume of acetone. The resulting precipitate is dissolved in hot water (50-60 ^o C) and treated in two stages. First, add a 10% solution of barium hydroxide to a pH of 7.0-7.5, in which there is a complete precipitation of the excess sulfuric acid, the resulting suspension is treated with a 25% solution of ammonium hydroxide to a pH of 9.0-9.5, in which extraneous proteins are precipitated in the IET. The precipitate of a mixture of foreign proteins and barium sulfate is removed by decantation and centrifugation. The second stage - the resulting centrifugate and clarified mother liquor are centrifuged, treated with 2-3% kieselguhr and filtered on a suction filter. Removal of mineral salts from the solution is carried out on an ion-exchange column with cation exchange resin in the H-form
Concentration of the eluate can be carried out on a vacuum boiling unit or by the method of baromembrane concentration up to 50%, after which the target product is precipitated with a double volume of alcohol, the precipitate is separated and dried at a temperature of 55-65 ^o C for 7-12 hours.

Полученный протамина сульфат - порошок белого, с желтоватым оттенком цвета, мелкокристаллический, со слабым специфическим запахом и вяжущим вкусом с антигепариновой активностью от 85 до 95 ЕД. The obtained protamine sulfate is a white powder with a yellowish tint, fine crystalline, with a weak specific odor and astringent taste with antiheparin activity from 85 to 95 PIECES.

При таком способе резко повышается достижимая степень чистоты, так как значительно повышается антигепариновая активность и достаточно серьезно снижается содержание сопутствующих белков. Кроме того, снижаются затраты на реактивы, особенно на органические растворители, в частности ацетон, что ощутимо повышает экологичность производства, увеличивает производительность установки и снижает энергозатраты. With this method, the achievable degree of purity is sharply increased, since the antiheparin activity is significantly increased and the content of concomitant proteins is seriously reduced. In addition, costs for reagents, especially for organic solvents, in particular acetone, are reduced, which significantly increases the environmental friendliness of production, increases plant productivity and reduces energy costs.

В таблице приведены сравнительные данные основных показателей, характеризующих степень очистки протамина сульфата от сопутствующих посторонних белков. The table shows comparative data of the main indicators characterizing the degree of purification of protamine sulfate from related foreign proteins.

Из данных таблицы видно, что заявленный способ производства протамина сульфата обладает существенными преимуществами перед ранее использованными. From the table it is seen that the claimed method for the production of protamine sulfate has significant advantages over previously used.

1. Снижается наличие сопутствующих посторонних белков (показатели в УФ-спектре наличие посторонних белков и сульфатной золы). 1. The presence of concomitant foreign proteins is reduced (indicators in the UV spectrum of the presence of foreign proteins and sulfate ash).

2. Повышение антигепариновой активности. 2. Increased antiheparin activity.

Claims

A method for the production of protamine sulfate from the milk of mature fish, characterized in that the milk is boiled in boiling water, crushed, treated with acetone, dried to form granules, the granules are extracted with 4% sulfuric acid solution, the proteins are precipitated from the extract by adding a double volume of alcohol, and the precipitate is dissolved in hot water, the solution is treated with barium hydroxide to pH 7.0-7.5, ammonia is added to pH 9.0-9.5, the precipitate is separated by decantation and centrifugation, the mother liquor and centrifugate are treated with kieselguhr, filtered on a suction filter, the filtrate is conducted via the cation exchanger in the H form to separate the inorganic salts, the eluate was concentrated by evaporation under vacuum or baromembrane method, the product is precipitated from the eluate twice the volume of an alcohol the precipitate is isolated and dried product at a temperature of 55-65 ^o C for 7 -12 hours