RU2174233C1 - Способ получения иммунофлуоресцирующих антител для обнаружения возбудителя токсоплазмоза - Google Patents
Способ получения иммунофлуоресцирующих антител для обнаружения возбудителя токсоплазмозаInfo
- Publication number
- RU2174233C1 RU2174233C1 RU99127946A RU99127946A RU2174233C1 RU 2174233 C1 RU2174233 C1 RU 2174233C1 RU 99127946 A RU99127946 A RU 99127946A RU 99127946 A RU99127946 A RU 99127946A RU 2174233 C1 RU2174233 C1 RU 2174233C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- toxoplasmosis
- antibodies
- immunofluorescent antibodies
- producing
- fluorescein
- Prior art date
Links
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 title claims abstract description 17
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 title claims abstract description 17
- 201000005485 toxoplasmosis Diseases 0.000 title claims abstract description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 2
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 title description 2
- 244000052769 pathogens Species 0.000 title description 2
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 102000018358 Immunoglobulins Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 108060003951 Immunoglobulins Proteins 0.000 claims abstract description 8
- 230000001684 chronic Effects 0.000 claims abstract description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 5
- 229940072221 IMMUNOGLOBULINS Drugs 0.000 claims description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 2
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 claims description 2
- 241000223996 Toxoplasma Species 0.000 abstract description 15
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 5
- 241000223997 Toxoplasma gondii Species 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 210000002700 Urine Anatomy 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000070 antineoplastic Monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 229960000060 monoclonal antibodies Drugs 0.000 description 2
- 102000005614 monoclonal antibodies Human genes 0.000 description 2
- 108010045030 monoclonal antibodies Proteins 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 210000003754 Fetus Anatomy 0.000 description 1
- 206010019233 Headache Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 Lymph Nodes Anatomy 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 206010057179 Toxoplasma infection Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute Effects 0.000 description 1
- 230000001938 anti-toxoplasmosis Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 231100000869 headache Toxicity 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии, и касается получения антитоксоплазменных иммуноглобулинов для обнаружения токсоплазм в патологическом материале прямым методом флуоресцирующих антител (МФА). Задача настоящего изобретения заключается в упрощении способа получения высокоактивных и специфических антител к токсоплазмам для выявления антигенов T: gondii непосредственно в клиническом материале от больных токсоплазмозом, а также в патологоанатомических образцах в прямом варианте МФА. Сущность изобретения состоит в том, что сыворотку получают на 10-14 сутки обострения болезни от больных хронической формой токсоплазмоза, болеющих на протяжении 2-10 лет, в количестве 5-10 мл, с титрами антител НМФА ≥ 1: 640 или в ИФА ≥ 1: 3200, инактивируют при 56°С в течение 30 мин, после чего выделяют фракцию иммуноглобулинов двухкратным осаждением 20%-ным раствором полиэтиленгликоля, тип 6000, метят флуоресцеин-5-изотиоцианатом в соотношении Ig : ФИТЦ 20:1. Технический результат заключается в том, что предлагаемый способ позволяет получить иммунофлуоресцирующие антитела к токсоплазмам с высокой активностью (1: 256 - 1:2000), специфичностью и способностью экспрессно обнаружить токсоплазмы в клиническом и патологоанатомическом материале, имеющим посторонние примеси, в прямом варианте МФА, упростив тем самым метод диагностики токсоплазмоза. 1 табл.
Description
Изобретение относится к медицине, в частности к микробиологии, и касается получения антитоксоплазменных иммуноглобулинов для прямого обнаружения токсоплазм в патологическом материале.
В связи с разнообразием характера течения болезни при токсоплазмозе практически исключается возможность постановки диагноза только на основании клинической картины. В большинстве случаев при диагностике токсоплазмоза ориентируются на выявление в сыворотках крови токсоплазменных антител. В то же время способность токсоплазм поражать клетки всех типов тканей, определяющая многообразие клинических проявлений заболевания, не всегда сопровождается выработкой специфических антител. Поэтому вопрос о выделении токсоплазм и обнаружение их в клиническом материале у больных с подозрением на токсоплазмоз, а также в патологоанатомических образцах остается актуальным.
Существующие методы исследования возбудителя токсоплазмоза включают поиск его путем непосредственной микроскопии материала в гистологических срезах внутренних органов либо с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также выделение микроорганизма на восприимчивых лабораторных животных.
Перечисленные методы диагностики токсоплазмоза не пользуются широкой популярностью в практической медицине. Несмотря на то, что метод прямой микроскопии несложен и доступен, он не всегда информативен и его отрицательный результат не исключает наличия токсоплазменной инфекции. Выделение токсоплазм методом биопробы предполагает работу с живым возбудителем и восприимчивыми лабораторными животными (белые мыши, морские свинки, кролики или хомяки), трудоемок, дорогостоящ и продолжителен по времени получения результата. (Эпидемиология, клиника, диагностика и лечение токсоплазмоза. Методические рекомендации. Авторы: Л.И.Грачева, Д.Б.Гончаров -М., 1998, с. 24). ПЦР - дорогостоящий диагностический тест и доступен не всем лабораториям.
Наиболее близким аналогом предлагаемого способа является сэндвичная иммунологическая проба. При выполнении данного теста для обнаружения в образце биологической жидкости животных антигена Toxsoplasma gondii, который вызывает острую форму токсоплазмоза, на поверхности твердого субстрата сорбируют F (ав1)2 - фрагмент Ig-антител к упомянутому антигену либо моноклональные антитела к нему, добавляют к сорбируемому материалу исследуемый образец и инкубируют полученную смесь. Разделяют адсорбируемые и неадсорбируемые фракции инкубируемой смеси и к первой из них добавляют меченые антитела к Т. gondii. Вторую смесь также инкубируют и затем разделяют адсорбированную и неадсорбированную ее фракции. В первой определяют присутствие меченого антитела (США, патент N 4361647).
Недостатками выполнения данного иммунологического теста является его многоэтапность, дороговизна, необходимость иммунизации животных для получения иммунных специфических к T.gondii сывороток и F (ав1)2 фрагмента либо моноклональных антител, которые используются в качестве "подложки".
Целью настоящего изобретения является упрощение способа получения высокоактивных и специфических антител к токсоплазмам для выявления антигенов Т. gondii непосредственно в клиническом материале от больных токсоплазмозом, а также в патологоанатомических образцах в прямом варианте МФА.
Поставленная цель достигается тем, что иммунную сыворотку к токсоплазмам получают от больных людей хронической формой токсоплазмоза, болеющих в течение 2-10 лет, на 10-14 сутки периода обострения (повышение температуры, увеличение периферических лимфатических узлов, головная боль, сильная слабость) отбирают сыворотку в количестве 5-10 мл от одного больного и определяют титры специфических антител НМФА и в ИФА. Сыворотку с высоким титром специфических токсоплазменных антител (≥ 1:640 в НМФА или ≥ 1:3200 в ИФА) инактивируют при 56oC в течение 30 мин и центрифугируют при 13000 об/мин для удаления аггрегированных белков в течение 30 мин. Надосадочную жидкость отсасывают и помещают на мешалку. Добавляют равный объем 20% раствора полиэтиленгликоля, тип 6000. После экспозиции 20 мин при комнатной температуре осадок отделяют центрифугированием при 13000 об/мин в течение 30 мин. Надосадок удаляют, а осадок растворяют в 0,1 М фосфатно-буферном растворе, pH 7,5, до первоначального объема. Снова добавляют равный объем раствора ПЭГ и после экспозиции центрифугируют повторно. Надосадок удаляют, а осадок растворяют в 0,1 М фосфатно-буферном растворе, pH 7,5, до первоначального объема (5 мл). Добавляют 1% хлороформа, перемешивают, помещают в холодильник и через 2 часа центрифугируют при 13000 об/мин - 30 мин. Надосадочная жидкость представляет собой раствор иммуноглобулина (Ig). Осуществляют метку флуоресцеин-5-изотиоцианатом (ФИТЦ) в соотношении Ig:ФИТЦ 20:1.
Полученные таким образом иммуноглобулины в разведении 1:256 - 1:2000 способны обнаруживать антигены токсоплазм как в клиническом материале от больных, так и в патологоанатомических образцах от плода при поздних выкидышах и от мертворожденных детей.
Примеры конкретного выполнения.
I. Отбор сывороток
1. У больных хронической формой токсоплазмоза, болеющих в течение 2-10 лет, на 10-14 сутки периода обострения проводят забор крови в количестве 5-10 мл.
1. У больных хронической формой токсоплазмоза, болеющих в течение 2-10 лет, на 10-14 сутки периода обострения проводят забор крови в количестве 5-10 мл.
2. Определяют титры антител к токсоплазмам в сыворотке крови в НМФЛ или ИФА.
3. При наличии специфических антител в титре ≥ 1:640 в НМФА или ≥ 1: 3200 в ИФА выделяют иммуноглобулин двухкратным осаждением 20% раствором ПЭГ.
4. Метят в соотношении Ig: ФИТЦ - 20:1.
5. Определяют рабочее разведение полученного конъюгата Igтокс -ФИТЦ.
II. Обнаружение T.gondii в образце мочи новорожденного с подозрением на токсоплазмоз.
1. Пробу мочи от новорожденного центрифугируют при 2,5 тыс. об/мин в течение 10 мин и осадок (10 мкл) наносят на предметное стекло.
2. Фиксируют спиртом или ацетоном 15 мин.
3. Наносят Igтокс - ФИТЦ, в рабочем разведении 1:256 в количестве 10 мкл.
4. Экспозиция 30 мин при 37oC во влажной камере.
5. Отмывают физиологическим раствором 3 раза по 5 мин.
6. Промывают дистиллированной водой.
7. Высушивают.
8. Просматривают в ЛЮМ микроскопе после нанесения на препарат монтирующей жидкости.
III. Проверка специфичности - см. таблицу.
Результаты проверки специфичности флуоресцирующих токсоплазменных иммуноглобулинов даны в табллице.
В результате предлагаемого способа были получены иммунофлуоресцирующие антитела к токсоплазмам (Igтокс-ФИТЦ) с высокой активностью (1:256 - 1:2000) и специфичностью, позволяющие экспрессно обнаружить в прямом варианте МФА токсоплазмы в клиническом и патологоанатомическом материале, имеющим посторонние примеси, упростив тем самым метод диагностики токсоплазмоза. 5 мл специфической токсоплазменной сыворотки достаточно на 1000 исследуемых образцов. Полученный препарат сохраняет свои свойства на протяжении 12 месяцев.
Claims (1)
- Способ получения иммунофлуоресцирующих антител для обнаружения возбудителя токсоплазмоза, включающий выделение из сыворотки иммуноглобулинов, отличающийся тем, что сыворотку получают на 10-14 сутки обострения болезни от больных хронической формой токсоплазмоза, болеющих на протяжении 2-10 лет в количестве 5-10 мл, с титрами антитела в НМФА > 1 : 640 или в ИФА > 1 : 3200, инактивируют при 56°С в течение 30 мин, после чего выделяют фракцию иммуноглобулинов двухкратным осаждением 20%-ным раствором полиэтиленгликоля, тип 6000, и метят флуоресцеин-5-изотиоцианатом в соотношении Igтокс-ФИТЦ-20 : l.
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU99127946A RU99127946A (ru) | 2001-09-10 |
| RU2174233C1 true RU2174233C1 (ru) | 2001-09-27 |
Family
ID=
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2547594C2 (ru) * | 2013-12-04 | 2015-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Способ выявления белков в разных типах клеток млекопитающих и человека с помощью флуоресцеин-5-изотиоцианата на микроскопическом уровне |
| RU2704973C1 (ru) * | 2018-09-04 | 2019-11-01 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-внедренческий центр Агроветзащита" (ООО "НВЦ Агроветзащита") | Способ подготовки компонентов для проведения экспресс-теста на токсоплазмоз животных и экспресс-тест на токсоплазмоз |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| US № 4361647 A1, 13.11.1982. * |
| АУТЕНШЛЮС А.И., СТОЛЯРОВА В.М., ГАВРИЛОВА Л.А. Критерии лабораторной диагностики бактериальных инфекций и токсоплазмоза у новорожденных и детей раннего возраста. - Новосибирск, 1994, с.39-49. БОЙД У. Основы иммунологии, Из-во Мир. - М., 1960, с.562-568. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2547594C2 (ru) * | 2013-12-04 | 2015-04-10 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Способ выявления белков в разных типах клеток млекопитающих и человека с помощью флуоресцеин-5-изотиоцианата на микроскопическом уровне |
| RU2704973C1 (ru) * | 2018-09-04 | 2019-11-01 | Общество с ограниченной ответственностью "Научно-внедренческий центр Агроветзащита" (ООО "НВЦ Агроветзащита") | Способ подготовки компонентов для проведения экспресс-теста на токсоплазмоз животных и экспресс-тест на токсоплазмоз |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20090030054A1 (en) | Cytoplasmic antigens for detection of candida | |
| JP2010190899A (ja) | トリコモナスを検出するための方法および装置 | |
| JPH05264553A (ja) | ヘリコバクターピロリ検出用の抗原調製物 | |
| CN111521786A (zh) | 一种呼吸道病原体IgM抗体联合检测试剂盒及其制备方法 | |
| CN105334325A (zh) | 基于生物素和链霉亲和素系统的微流控免疫芯片分析方法 | |
| KR101678428B1 (ko) | 폐렴구군 검출방법 | |
| CN109633163B (zh) | 降钙素原/c反应蛋白二合一检测试剂盒 | |
| RU2174233C1 (ru) | Способ получения иммунофлуоресцирующих антител для обнаружения возбудителя токсоплазмоза | |
| CN1453588A (zh) | 胶体金层析法检测sars冠状病毒抗原的试剂 | |
| KR101894489B1 (ko) | Igm 반정량적 렙토스피라증 진단 키트 | |
| KR100574559B1 (ko) | 신속 면역크로마토그라피법에 의한 개 파보바이러스 항체진단키트 및 그 제조 방법 | |
| CN106802345A (zh) | 一种幽门螺旋杆菌IgG抗体酶联免疫诊断试剂盒 | |
| JP3547729B2 (ja) | アッセイ | |
| RU2394496C1 (ru) | Способ диагностики сифилиса путем одновременного определения реагиновых и трепонемоспецифических антител к t.pallidum на микроскопных альдегидных слайдах | |
| CA1127536A (en) | Identification of viral cell infections by antibody and bacteria | |
| Ueno et al. | Serological assessment of chlamydial infection in the koala by a slide EIA technique | |
| WO2008068554A1 (en) | Complement-based analyte assay | |
| JP3487642B2 (ja) | Ｈａｖ抗原及びその抗原と免疫学的に反応性の抗体の測定法 | |
| US20040096824A1 (en) | Specificity in the detection of anti-rubella IgM antibodies | |
| EP0503517A1 (en) | Improved assay for lyme disease | |
| RU2726484C1 (ru) | Способ диагностики риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки, иммуноферментная диагностическая тест-система для его осуществления | |
| AU7218000A (en) | Immunoassay of human medullasin and diagnosis of multiple sclerosis using the same | |
| RU2704973C1 (ru) | Способ подготовки компонентов для проведения экспресс-теста на токсоплазмоз животных и экспресс-тест на токсоплазмоз | |
| RU2702011C1 (ru) | Способ диагностики инфекционных, аллергических, аутоиммунных и онкологических заболеваний | |
| RU2251112C1 (ru) | Способ диагностики хламидиозов |