RU2171842C2

RU2171842C2 - Method of anthrax bacteriophage gamma a-26 preparing

Info

Publication number: RU2171842C2
Application number: RU99109950/13A
Authority: RU
Inventors: Б.В. Солодовников; И.С. Тюменцева; В.И. Ефременко; Е.Н. Афанасьев
Original assignee: Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт
Priority date: 1999-05-11
Filing date: 1999-05-11
Publication date: 2001-08-10

Abstract

FIELD: microbiology, biotechnology. SUBSTANCE: vegetative culture of anthrax bacterium is grown in Hottinger's solid agar for 14- -18 h and specific lysis of culture is carried out in liquid synthetic medium by simultaneous suspending of culture and mother bacteriophage followed by incubation of suspension for 5-10 h, filtration and lyophilic drying the ready product in protective medium for 18-20 h. Invention can be used for preparing anthrax medical-biological preparations. EFFECT: decreased cost, enhanced stability, retained necessary biological properties. 1 ex

Description

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в биотехнологии получения сибиреязвенных медико-биологических препаратов. The invention relates to microbiology and can be used in biotechnology for producing anthrax medical-biological preparations.

Принципиальная технологическая схема получения фага включает добавление в бульонную культуру специального производственного фага, размножение при 37^oC в течение суток, фильтрацию и проверку на чистоту, стерильность и активность (К.Д. Пяткин, Ю.С. Кривошеин, Микробиология, М., "Медицина", 1980, с. 108).The basic technological scheme for obtaining phage includes the addition of a special production phage to the broth culture, reproduction at 37 ^° C for 24 hours, filtering and checking for purity, sterility and activity (K.D. Pyatkin, Yu.S. Krivoshein, Microbiology, M., "Medicine", 1980, p. 108).

Известен способ выращивания сибиреязвенного бактериофага Гамма, предусматривающий последовательное получение вегетативной культуры и специфическое лизирование культуры в жидком питательном бульоне Хоттингера с добавлением в него активирующих добавок (з. РФ N 96123389/13, C 12 N 7/00//C 12 N 1/20). A known method of growing anthrax bacteriophage Gamma, providing for the sequential production of a vegetative culture and specific lysis of the culture in a liquid nutrient broth Hottinger with the addition of activating additives (Z. RF N 96123389/13, C 12 N 7/00 // C 12 N 1/20 )

Способ осуществляется следующим образом. Готовят питательную среду из бульона Хоттингера, добавляют в нее дрожжевой экстракт 2,5 г/л, 3 мл/л 10% раствор кальция хлористого, устанавливают pH в пределах 7,4. Питательная среда засевается взвесью спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55 из расчета 6-10 млн. спор на 1 мл среды. Культивирование проводят при встряхивании в течение 5-6 ч, затем вносят препарат маточного фага Гамма из расчета 1-2 мл на 100 мл бульонной культуры. Проводят инкубацию посевов при 37^oC в течение 24 ч. Препарат фильтруют на установке "Millipore" с применением стерилизующих фильтров. По Аппельману определяют специфичность и активность готового продукта. Фаг имеет высокую концентрацию - 10⁹.The method is as follows. A nutrient medium is prepared from Hottinger broth, 2.5 g / l yeast extract, 3 ml / l 10% calcium chloride solution are added to it, the pH is adjusted to 7.4. The nutrient medium is inoculated with a suspension of spores of anthrax vaccine strain 55 at the rate of 6-10 million spores per 1 ml of medium. Cultivation is carried out with shaking for 5-6 hours, then the uterine phage preparation Gamma is added at the rate of 1-2 ml per 100 ml of broth culture. Crops are incubated at 37 ^° C for 24 hours. The preparation is filtered on a Millipore apparatus using sterilizing filters. Appelman determines the specificity and activity of the finished product. The phage has a high concentration of 10 ⁹ .

При достаточной простоте и кратковременности процесса (30 ч) этот способ нерационально применять в биотехнологии диагностического препарата из-за его высокой себестоимости за счет использования дорогостоящего животного сырья в питательных средах. Кроме того, фаг в жидком виде недостаточно стабилен, срок его годности составляет 6-12 месяцев. With sufficient simplicity and short duration of the process (30 hours), this method is irrationally used in biotechnology of a diagnostic drug because of its high cost due to the use of expensive animal raw materials in nutrient media. In addition, the phage in liquid form is not stable enough, its shelf life is 6-12 months.

Известен способ, выбранный прототипом получения сибиреязвенного фага Гамма путем его культивирования на комбинированной плотной среде, для которой использовался 2% агар и жидкий перевар Хоттингера, в который на 1 л добавляли 20 мг триптофана, по 100 мг хлористого магния и сульфата магния и 5 г глюкозы. Использовали препараты фагов γ и K исходной концентрацией 6 • 10⁸ и 1 • 10⁸ соответственно. В качестве вегетативной культуры чувствительный клон штамма B.anthracis N 303 (Н.А. Кузьмин, Б.А. Комаров, Лабораторное дело N 12, 1967, с. 741-743).The known method selected by the prototype for the production of anthrax phage Gamma by culturing it in a combined dense medium for which 2% agar and Hottinger liquid digest were used, to which 20 mg of tryptophan, 100 mg of magnesium chloride and magnesium sulfate and 5 g of glucose were added per 1 liter . We used phage preparations γ and K with the initial concentration of 6 • 10 ⁸ and 1 • 10 ^8, respectively. As a vegetative culture, a sensitive clone of strain B.anthracis N 303 (N.A. Kuzmin, B.A. Komarov, Laboratory No. 12, 1967, p. 741-743).

Режим выращивания включает засев 12-14-часовой агаровой культуры, смытой с косяка переваром Хоттингера, на матрас с плотной средой. После 6-7 ч инкубации на газон подливают перевар Хоттингера с внесенным в него маточным фагом с титром 10⁸ - 10⁹ м.к./мл. Процесс лизирования вегетативной культуры проводят в термостате при 37^oC в течение 16-17 ч. Затем лизат из матраса центрифугируют со скоростью 5-6 тыс. об/мин в течение 6 мин и супернатант фильтруют через асбестовые пластинки аппарата Зейтца.The growing regime includes sowing a 12-14-hour agar culture, washed from the jamb by Hottinger's digest, on a mattress with a dense environment. After 6-7 hours of incubation, a Hottinger digest with a uterine phage with a titer of 10 ⁸ - 10 ⁹ m.c. / ml is added onto the lawn. The process of lysing a vegetative culture is carried out in a thermostat at 37 ^o C for 16-17 hours. Then, the lysate from the mattress is centrifuged at a speed of 5-6 thousand rpm for 6 minutes and the supernatant is filtered through asbestos plates of the Seitz apparatus.

Способ обеспечивает получение фага с титром не менее 10¹⁰. При оптимальном показателе множественности инфекции для фага на штамме N 303, 0,35 урожайность достигает 100-400 фаговых частиц на одну бактериальную клетку.The method provides phage with a titer of at least 10 ¹⁰ . With an optimal indicator of the multiplicity of infection for phage on strain N 303, 0.35, the yield reaches 100-400 phage particles per bacterial cell.

Недостатком способа является многоступенчатость и использование дорогого животного сырья, что существенно осложняет его промышленное производство. The disadvantage of this method is the multi-stage and the use of expensive animal raw materials, which significantly complicates its industrial production.

В жидком виде препарат недостаточно стабилен. In liquid form, the drug is not stable enough.

Целью изобретения является достижение технологичности способа, обеспечивающего снижение себестоимости препарата в промышленном производстве, повышение стабильности при сохранении высоких показателей по выходу продукта, специфической активности и биологических свойств. The aim of the invention is to achieve the manufacturability of the method, which reduces the cost of the drug in industrial production, increases stability while maintaining high rates of product yield, specific activity and biological properties.

Поставленная цель достигается тем, что способ получения сибиреязвенного бактериофага включает выращивание вегетативной культуры на плотном питательном агаре Хоттингера в течение 14-18 ч, специфическое лизирование культуры в жидкой синтетической среде путем одновременного суспендирования культуры и маточного бактериофага и инкубирование взвеси в течение 5-10 ч, фильтрование и стабилизацию готового продукта методом лиофильного высушивания в защитной среде в течение 18-20 ч. This goal is achieved by the fact that the method of producing anthrax bacteriophage includes growing a vegetative culture on a solid nutrient agar Hottinger for 14-18 hours, specific lysis of the culture in a liquid synthetic medium by simultaneously suspending the culture and uterine bacteriophage and incubating suspension for 5-10 hours, filtering and stabilization of the finished product by freeze drying in a protective environment for 18-20 hours

Среда SM для специфического лизирования культуры содержит 5,8 г/л NaCl, 2 г/л MgSO₄; 7H₂O, 5 мл/л 2% желатина, 50 мл/л 1 M трис-буферного раствора с pH 7,5 (Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук, Молекулярное клонирование, М., Мир, 1984, с. 497).Medium SM for specific culture lysis contains 5.8 g / l NaCl, 2 g / l MgSO ₄ ; 7H ₂ O, 5 ml / l of 2% gelatin, 50 ml / l of 1 M Tris-buffer solution with a pH of 7.5 (T. Maniatis, E. Fritsch, J. Sambrook, Molecular Cloning, M., Mir, 1984, p. 497).

Защитная среда для лиофильного высушивания продукта содержит 1,5 г желатина и 20 г сахарозы на 100 мл дистиллированной воды. The protective environment for freeze drying the product contains 1.5 g of gelatin and 20 g of sucrose per 100 ml of distilled water.

Известно использование аналогичной защитной среды при лиофильном высушивании умеренных холерных фагов (А.с. СССР N 1296578, C 12 N 7/00, 1/04, от 15.03.87, Бюл. 310). It is known to use a similar protective medium for lyophilic drying of moderate cholera phages (A.S. USSR N 1296578, C 12 N 7/00, 1/04, 03.15.87, Bull. 310).

Бактериофаг смешивают с защитной средой в соотношении 1:2, предварительное замораживание осуществляют в течение 3-4 мин, в охлажденном до минус 55^oC этиловом спирте, а высушивание проводят в течение 26-27 ч.The bacteriophage is mixed with a protective medium in a ratio of 1: 2, preliminary freezing is carried out for 3-4 minutes, in ethanol chilled to minus 55 ^o C, and drying is carried out for 26-27 hours

Существенным отличительным признаком заявляемого способа являются следующие. Получение вегетативной культуры на чашках с агаром Хоттингера позволяет отбирать типичные колонии сибиреязвенного микроба, что обеспечивает специфическую чистоту процесса лизирования и экономию дорогостоящей среды. Использование синтетической среды для лизирования вегетативной культуры позволяет получать стабильный выход бактериофага в высоких титрах и снижает себестоимость продукта. Жидкий препарат, полученный по этой технологии, является более чистым и может использоваться для получения антифаговой сыворотки, а также в генетических исследованиях. Стабилизация готового продукта методом лиофильного высушивания в защитной среде в течение 18-20 ч, обеспечивает увеличение срока годности готового препарата с 6-12 мес до 3-х лет. An essential distinguishing feature of the proposed method are the following. Obtaining a vegetative culture on plates with Hottinger agar allows the selection of typical colonies of anthrax microbe, which ensures the specific purity of the lysis process and the saving of an expensive environment. Using a synthetic medium for lysing a vegetative culture allows one to obtain a stable yield of bacteriophage in high titers and reduces the cost of the product. The liquid preparation obtained by this technology is cleaner and can be used to obtain antiphage serum, as well as in genetic studies. Stabilization of the finished product by freeze drying in a protective environment for 18-20 hours, provides an increase in the shelf life of the finished product from 6-12 months to 3 years.

Возможность практического использования изобретения подтверждается примером его конкретного выполнения. The possibility of practical use of the invention is confirmed by an example of its specific implementation.

Пример 1. Бактериологической петлей засевают газоном взвесь спор сибиреязвенного вакцинного штамма N 55 на чашку с агаром Хоттингера и инкубируют в термостате при 37^oC 18 ч.Example 1. A bacteriological loop inoculated with a lawn suspension of spores of anthrax vaccine strain N 55 on a Cup with Hottinger agar and incubated in an incubator at 37 ^o C for 18 hours

Готовят синтетическую питательную среду. Prepare a synthetic nutrient medium.

Трис 11,1 растворяют в 100 мл дистиллированной воды, доводят концентрацию HCl pH до 7,5. 100 мг желатина растворяют в 5 мл воды. Навески 5,8 г NaCl, 2 г MgSO₄ • 7H₂O растворяют в 100 мл воды. 50 мл триса с pH 7,5 и остальные растворы соединяют, доводят общий объем до 1 л. Среду стерилизуют автоклавированием при 1 атм в течение 20 мин или фильтрованием через мембранные фильтры. В колбе со 100 мл жидкой среды суспендируют 3 бактериологических петли вегетативной культуры и добавляют 10 мл бактериофага Гамма А-26 с титром не менее 10⁷. Смесь перемешивают, колбы помещают в термостатируемую качалку и инкубируют при 37^oC в течение 5-10 ч в зависимости от просветления лизата.Tris 11.1 is dissolved in 100 ml of distilled water, the concentration of HCl pH is adjusted to 7.5. 100 mg of gelatin is dissolved in 5 ml of water. Samples of 5.8 g of NaCl, 2 g of MgSO ₄ • 7H ₂ O are dissolved in 100 ml of water. 50 ml of Tris with a pH of 7.5 and the remaining solutions are combined, the total volume is adjusted to 1 liter. The medium is sterilized by autoclaving at 1 atm for 20 minutes or by filtration through membrane filters. In a flask with 100 ml of liquid medium, 3 bacteriological loops of the vegetative culture are suspended and 10 ml of the bacteriophage Gamma A-26 with a titer of at least 10 ⁷ are added. The mixture is stirred, the flasks are placed in a thermostatic shaker and incubated at 37 ^o C for 5-10 hours, depending on the lysate clarification.

Препарат стерилизуют через мембранные фильтры с диаметром пор 0,25-0,45 мкм на установке "Millipore". По методу Аппельмана в модификации Грациа определяют литическую активность и специфичность готового препарата. Титр бактериофага составляет 10⁹.The drug is sterilized through membrane filters with a pore diameter of 0.25-0.45 microns on the installation "Millipore". According to the Appelman method, in the modification of Grazia, the lytic activity and specificity of the finished preparation are determined. The bacteriophage titer is 10 ⁹ .

Приготовляют защитную среду для лиофильного высушивания препарата. В 100 мл дистиллированной воды растворяют 1,5 г желатина и 20 г сахарозы, автоклавируют при 1 атм 30 мин. Prepare a protective environment for freeze drying of the drug. 1.5 g of gelatin and 20 g of sucrose are dissolved in 100 ml of distilled water, autoclaved at 1 atm for 30 minutes.

К готовому жидкому бактериофагу добавляют приготовленную защитную среду в соотношении 1:1 и направляют на лиофильное высушивание. To the prepared liquid bacteriophage, the prepared protective medium is added in a ratio of 1: 1 and sent for freeze drying.

Предварительное замораживание осуществляют в морозильной камере при минус 40^oC в течение 6-8 ч. Лиофильное высушивание проводят в вакуумсушильной установке ТГ-5 в течение 18-20 ч. При этом температуру постепенно повышают в течение 6 ч от минус 40^oC до 0^oC, в течение 5 ч от 0^oC до 10^oC, 5 ч от 10^oC до 25^oC и 2 часа при постоянной температуре. Рабочее давление в камере - 30 Па. Ампулы с готовым продуктом запаивают на газокислородной горелке.Preliminary freezing is carried out in a freezer at minus 40 ^o C for 6-8 hours. Freeze drying is carried out in a vacuum drying unit TG-5 for 18-20 hours. The temperature is gradually increased over the course of 6 hours from minus 40 ^o C to 0 ^o C, for 5 hours from 0 ^o C to 10 ^o C, 5 hours from 10 ^o C to 25 ^o C and 2 hours at a constant temperature. The working pressure in the chamber is 30 Pa. Ampoules with the finished product are sealed on an oxy-fuel burner.

Таким образом, изобретение практически осуществимо, его использование в биотехнологии позволит организовать промышленный выпуск высококонцентрированных сибиреязвенных диагностических бактериофагов Гамма А-26 с длительным сроком хранения. Thus, the invention is practicable, its use in biotechnology will make it possible to organize the industrial production of highly concentrated anthrax diagnostic bacteriophages Gamma A-26 with a long shelf life.

Claims

A method of producing anthrax bacteriophage, including cultivating a vegetative culture on a solid nutrient medium, reseeding, incubating in the presence of phage, filtering and sterilizing the resulting lysate, characterized in that the vegetative culture is reseeded in a synthetic liquid with the addition of a uterine bacteriophage, incubated for 5-10 hours, and the obtained sterilized lysate filtrate is stabilized by freeze drying in a protective medium for 18-20 hours