RU2525141C1 - Method of production of bacteriophage - Google Patents
Method of production of bacteriophage Download PDFInfo
- Publication number
- RU2525141C1 RU2525141C1 RU2013126187/10A RU2013126187A RU2525141C1 RU 2525141 C1 RU2525141 C1 RU 2525141C1 RU 2013126187/10 A RU2013126187/10 A RU 2013126187/10A RU 2013126187 A RU2013126187 A RU 2013126187A RU 2525141 C1 RU2525141 C1 RU 2525141C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- bacteriophage
- culture
- nutrient medium
- host strain
- titer
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в биотехнологии получения продукции, содержащей бактериофаги.The invention relates to microbiology and can be used in biotechnology to obtain products containing bacteriophages.
Бактериофаги - это вирусы, характеризующиеся специфической способностью к избирательному инфицированию бактериальных клеток, принадлежащих к одному штамму или антигенно-гомологичным штаммам одного вида или рода с последующим лизисом (после внутриклеточной репликации) клетки-хозяина - вирулентные фаги или интегрированием в бактериальный геном с образованием лизогенов - умеренные фаги (Adams H.M. Bacteriophages. - New York: Interscience Publishers, Inc., London: Interscience Publishers ltd., 1959. - 592 p.). По многочисленным данным литературы, фаги могут быть использованы в качестве природных антимикробных агентов для борьбы с бактериальными инфекциями у людей, животных и сельскохозяйственных культур (Alisky J., Iczkowski К., Rapoport,A., Troitsky N. Bacterio-phages show promise as antimicrobial agents // The Journal of infection. - 1998. - Vol.36, №1. P.5-15; Brussow H. Phage therapy: the Escherichia coli experience // Microbiology. - 2005. - Vol.151, Pt.7. - P.2133-2140; Бондаренко В.М. Клинический эффект и пути рационального использования лечебных бактериофагов в медицинской практике // Приложение к Журналу инфектологии. - 2011. - Т.3, №3. - С.15-19). Ряд авторов допускают возможность практического применения бактериофагов как средств деконтаминации в пищевой промышленности как безопасной для человека и безвредной для окружающей среды альтернативы химическим и физическим методам элиминации бактерий (Greer G.G. Bacteriophage control of foodborne bacteria // Journal of food protection. - 2005. - Vol.68, №5. - P.1102-1111; Lang L.H. FDA approves use of bacteriophages to be added to meat and poultry products // Gastroenterology. - 2006. - Vol.131, №5. - P.1370-1372; Алешкин А.В., Зейгарник М.В. Возможности применения бактериофагов в качестве пробиотических средств деконтаминации в области питания // Вопросы диетологии. - 2012. - Т. 2, №4. - С.24-34).Bacteriophages are viruses characterized by a specific ability to selectively infect bacterial cells belonging to the same strain or antigenically homologous strains of the same species or genus, followed by lysis (after intracellular replication) of the host cell - virulent phages or integration into the bacterial genome with the formation of lysogens - moderate phages (Adams HM Bacteriophages. - New York: Interscience Publishers, Inc., London: Interscience Publishers ltd., 1959. - 592 p.). According to numerous literature data, phages can be used as natural antimicrobial agents to fight bacterial infections in humans, animals, and crops (Alisky J., Iczkowski K., Rapoport, A., Troitsky N. Bacterio-phages show promise as antimicrobial agents // The Journal of infection. - 1998. - Vol. 36, No. 1. P.5-15; Brussow H. Phage therapy: the Escherichia coli experience // Microbiology. - 2005. - Vol. 151, Pt. 7 . - P.2133-2140; Bondarenko V.M. Clinical effect and ways of rational use of therapeutic bacteriophages in medical practice // Appendix to the Journal of Infectology. - 2011. - T.3, No. 3. - P.15-19). A number of authors admit the possibility of the practical use of bacteriophages as a means of decontamination in the food industry as a safe and environmentally friendly alternative to chemical and physical methods for eliminating bacteria (Greer GG Bacteriophage control of foodborne bacteria // Journal of food protection. - 2005. - Vol. 68, No. 5. - P.1102-1111; Lang LH FDA approves use of bacteriophages to be added to meat and poultry products // Gastroenterology. - 2006. - Vol.131, No. 5. - P.1370-1372; Aleshkin A.V., Zeigarnik M.V. Possibilities of using bacteriophages as probiotic means of decontamination in the field of nutrition // V millet nutrition -. 2012. - T. 2, №4 -. S.24-34).
Одним из приоритетных показателей производства фагосодержащей продукции является получение фаголизатов с исходно высоким титром бактериофагов (Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. - М.: Медгиз, 1961. - С.17-19).One of the priority indicators for the production of phage-containing products is the production of phagolysates with an initially high titer of bacteriophages (Goldfarb D.M. Bacteriophagy. - M.: Medgiz, 1961. - P.17-19).
Известным, предложенным для различных бактериофагов способом получения фаголизатов с высоким титром бактериофагов является культивирование бактерий штамма-хозяина с бактериофагом на плотной питательной среде с последующим получением суспендированного фаголизата с поверхности плотной питательной среды (SU 64612, 30.04.1945; Кузьмин Н.А., Комаров Б.А. Способ быстрого получения сибиреязвенных фагов в высоких концентрациях // Лабораторное дело. - 1967. - №12. - С.741-743).A well-known method proposed for various bacteriophages for producing phagolysates with a high titer of bacteriophages is the cultivation of the bacteria of the host strain with the bacteriophage in a dense nutrient medium, followed by the preparation of a suspended phagolysate from the surface of a dense nutrient medium (SU 64612, 04/30/1945; Kuzmin N.A., Komarov B.A. A method for the rapid production of anthrax phages in high concentrations // Laboratory. - 1967. - No. 12. - S.741-743).
Основными недостатками данных аналогов заявляемого изобретения являются недостаточная универсальность способа для получения продукции с использованием различных бактериофагов, недостаточная стабильность титра бактериофагов в фаголизате и отсутствие или недостаточность очистки фаголизата для использования фагосодержащей продукции в пищевой промышленности при получении фаголизата с титром бактериофага 1011-1013 БОЕ/мл.The main disadvantages of these analogues of the claimed invention are the lack of versatility of the method for producing products using various bacteriophages, the insufficient stability of the titer of bacteriophages in the phagolysate, and the absence or inadequacy of purification of the phagolysate for the use of phage-containing products in the food industry upon receipt of the phagolysate with a titer of bacteriophage 10 11 -10 13 PFU / ml
Наиболее близким аналогом - прототипом - является способ получения концентрированных препаратов фага, заключающийся в посеве на чашки с агаром смеси из концентрированной культуры бактерий и фага в количестве, достаточном для получения сплошного лизиса. После инкубации при 37°C в течение 12-18 часов в чашки наливают 3-5 мл бульона и оставляют на 20 минут. Затем бульон сливают и центрифугируют. Надосадочную жидкость отсасывают. Согласно прототипу приготовленный таком образом фаг может содержать 1011-1012 частичек на 1 мл (Гольдфарб Д.М. Бактериофагия. - М.: Медгиз, 1961. - С.18).The closest analogue - the prototype - is a method for producing concentrated phage preparations, which consists in seeding on a plate with agar a mixture of a concentrated culture of bacteria and phage in an amount sufficient to obtain a continuous lysis. After incubation at 37 ° C for 12-18 hours, 3-5 ml of broth is poured into cups and left for 20 minutes. Then the broth is drained and centrifuged. The supernatant is aspirated. According to the prototype, a phage prepared in this way may contain 10 11 -10 12 particles per 1 ml (Goldfarb D.M. Bacteriophagy. - M .: Medghiz, 1961. - P.18).
Основными недостатками прототипа являются недостаточная универсальность способа для получения продукции с использованием различных бактериофагов, недостаточная стабильность титра бактериофагов в фаголизате и недостаточность очистки фаголизата для использования фагосодержащей продукции в пищевой промышленности при получении очищенного фаголизата с титром бактериофага 1011-1013 БОЕ/мл.The main disadvantages of the prototype are the lack of versatility of the method for producing products using various bacteriophages, the insufficient stability of the titer of bacteriophages in the phagolysate and the insufficient purification of the phagolysate for the use of phage-containing products in the food industry when obtaining purified phagolysate with a titer of bacteriophage 10 11 -10 13 PFU / ml.
Главной задачей заявляемого изобретения является обеспечение универсальности способа получения фаголизата с использованием различных бактериофагов, стабильности титра бактериофагов в фаголизате с его очисткой для использования фагосодержащей продукции в пищевой промышленности при получении очищенного фаголизата с титром бактериофага 1011-1013 БОЕ/мл.The main objective of the claimed invention is to ensure the versatility of the method for producing a phagolysate using various bacteriophages, the stability of the titer of bacteriophages in the phagolysate with its purification for the use of phage-containing products in the food industry when obtaining purified phagolysate with a titer of bacteriophage 10 11 -10 13 PFU / ml.
Задача решена тем, что бактериальную культуру штамма-хозяина в титре 108-109 КОЕ/мл засевают в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм, культивируют в течение 3-3,5 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма-хозяина, затем на полученный газон культуры штамма-хозяина засевают маточный бактериофаг в титре 105-106 БОЕ/мл, герметично закрывают сосуд для культивирования, культивируют в течение 13-15 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм, получают фаголизат при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором или буферным раствором с pH 7,0-7,2 в количестве 0,04-0,045 мл на 1 см2 поверхности плотной питательной среды, отсасывают фаголизат в стерильную емкость, добавляют хлороформ, выдерживают в течение 30-45 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугируют в течение 30-45 минут при 5000-6000 об./мин, стерилизуют надосадочную жидкость фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2-0,22 мкм и пропускают полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину. После центрифугирования можно смешивать надосадочные жидкости, содержащие бактериофаги, затем стерилизовать смесь надосадочных жидкостей фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2-0,22 мкм и пропускать полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину. В качестве сосуда для культивирования можно использовать стеклянный микробиологический матрац.The problem is solved in that the bacterial culture of the host strain in a titer of 10 8 -10 9 CFU / ml is sown in a culture vessel on a beveled solid nutrient medium with a layer thickness of 10 mm to 25 mm, cultured for 3-3.5 hours at the optimum temperature for the growth of the culture of the host strain, then the uterine bacteriophage in the titer of 10 5 -10 6 PFU / ml is sown on the obtained grass lawn of the culture of the host strain, the culture vessel is sealed, cultivated for 13-15 hours at the optimum temperature for culture growth bacteriophage strain and strata without an air layer above the surface of a dense nutrient medium from 25 mm to 40 mm, a phagolysate is obtained when the bacteriophage is suspended from the surface of a dense nutrient medium with physiological saline or buffer solution with a pH of 7.0-7.2 in an amount of 0.04-0.045 ml per 1 cm 2 surfaces of a dense nutrient medium, the phagolysate is sucked off in a sterile container, chloroform is added, it is kept for 30-45 minutes with continuous shuttling, centrifuged for 30-45 minutes at 5000-6000 rpm, the supernatant is sterilized by filtration through a filter with a pore meter of 0.2-0.22 microns and pass the filtrate through a column containing an agent affinity for endotoxin. After centrifugation, you can mix the supernatant containing bacteriophages, then sterilize the mixture of supernatant by filtration through a filter with a pore diameter of 0.2-0.22 microns and pass the obtained filtrate through a column containing an agent affinity for endotoxin. As a vessel for cultivation, you can use a glass microbiological mattress.
В результате впервые проведенных нами исследований была определена обеспечивающая решение поставленной задачи новая совокупность оригинальных отличительных признаков: установлены универсальные, промышленно применимые условия эффективного культивирования бактериофагов (форма и толщина слоя плотной питательной среды, толщина слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды, герметизация сосуда для культивирования), подобран титр маточного бактериофага, определены варианты и количества суспендирующего раствора, необходимые для обеспечения высокой концентрации бактериофагов в фаголизате и качественной очистки фагов, предложена оптимальная последовательность и продолжительность операций очистки фаголизата.As a result of our first research, we determined a new set of original distinctive features that provides a solution to the problem: universal, industrially applicable conditions for the effective cultivation of bacteriophages are established (the shape and thickness of the layer of a dense nutrient medium, the thickness of the layer of air above the surface of a dense nutrient medium, the sealing of a culture vessel) the titer of the uterine bacteriophage is selected, the variants and quantities of the suspending solution are determined, necessary to provide a high concentration of bacteriophages in fagolizate qualitative and purification of phages proposed optimal sequence and duration fagolizata cleaning operations.
Из патентно-технической литературы и практики производства фагосодержащей продукции неизвестно о способе получения бактериофага с использованием культивирования бактериофагов на культуре бактерий на плотной питательной среде, который был бы идентичен заявляемому.From the patent technical literature and the practice of manufacturing phage-containing products, it is not known about the method for producing a bacteriophage using culturing bacteriophages in a bacterial culture in a solid nutrient medium that would be identical to the claimed one.
Отсюда правомерен вывод о соответствии заявляемого решения критерию «новизна».Hence, the conclusion about the conformity of the proposed solution to the criterion of "novelty" is legitimate.
Указанная выше совокупность существенных признаков необходима и достаточна для получения технического результата - обеспечения универсальности способа получения фаголизата с использованием различных бактериофагов, стабильности титра бактериофагов в фаголизате с его очисткой для использования фагосодержащей продукции в пищевой промышленности при получении очищенного фаголизата с титром бактериофага 1011-1013 БОЕ/мл.The above set of essential features is necessary and sufficient to obtain a technical result - to ensure the universality of the method for producing a phagolysate using various bacteriophages, the stability of the titer of bacteriophages in the phagolysate with its purification for the use of phage-containing products in the food industry when obtaining purified phagolysate with a titer of bacteriophage 10 11 -10 13 PFU / ml.
Между существующими признаками и решаемой задачей существует причинно-следственная связь, где каждый признак необходим и влияет на получение технического результата, а вместе взятые признаки достаточны для его получения. Правомерен вывод о соответствии заявляемого технического решения критерию «изобретательский уровень».There is a causal relationship between the existing features and the problem to be solved, where each feature is necessary and influences the receipt of a technical result, and the combined features are sufficient to obtain it. The conclusion that the claimed technical solution meets the criterion of "inventive step" is legitimate.
Предлагаемый способ может быть реализован многократно с использованием присущих ему существенных признаков, а значит, заявляемое техническое решение соответствует критерию «промышленная применимость».The proposed method can be implemented repeatedly using its essential features, which means that the claimed technical solution meets the criterion of "industrial applicability".
Заявляемое изобретение апробировано при получении вариантов очищенного фаголизата, содержащего различные бактериофаги. Ниже приводятся результаты этой апробации. При этом приведенные примеры получения бактериофагов показывают конкретную реализацию заявляемого изобретения, но не ограничивают объем притязаний формулы заявляемого изобретения.The invention is tested in obtaining variants of purified phagolysate containing various bacteriophages. The results of this testing are given below. Moreover, the examples of bacteriophage production show a specific implementation of the claimed invention, but do not limit the scope of claims of the claims of the claimed invention.
Пример 1. Для получения бактериофага, активного в отношении Salmonella enterica серовар Typhimurium, бактериальную культуру штамма-хозяина - Salmonella enterica серовар Typhimurium - в титре 108 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм.Example 1. To obtain a bacteriophage active against Salmonella enterica, Typhimurium serovar, the bacterial culture of the host strain — Salmonella enterica Typhimurium serovar — in a titer of 10 8 CFU / ml was seeded into a culture vessel on a beveled solid nutrient medium with a layer thickness of 10 mm to 25 mm.
Штамм-хозяин культивировали в течение 3,5 часов при оптимальной температуре для его роста (+37°C), затем на полученный газон культуры Salmonella enterica серовар Typhimurium засевали маточный бактериофаг в титре 105 БОЕ/мл, герметично закрывали сосуд для культивирования (стекляный микробиологический матрац) и культивировали бактериофаг в течение 13 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+37°C) и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.The host strain was cultured for 3.5 hours at the optimum temperature for its growth (+ 37 ° C), then a uterine bacteriophage in the titer of 10 5 PFU / ml was seeded on the obtained lawn of the Salmonella enterica culture serovar Typhimurium, and the culture vessel was sealed (glass microbiological mattress) and the bacteriophage was cultured for 13 hours at the optimum temperature for the growth of the culture of the bacteriophage strain (+ 37 ° C) and the thickness of the air layer above the surface of a dense nutrient medium from 25 mm to 40 mm.
Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды физиологическим раствором в количестве 0,04 мл на 1 см2 поверхности плотной питательной среды.The phagolysate was obtained by suspending the bacteriophage from the surface of a dense nutrient medium with physiological saline in an amount of 0.04 ml per 1 cm 2 of the surface of a dense nutrient medium.
Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость, добавляли хлороформ, выдерживали в течение 30 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугировали в течение 30 минут при 6000 об./мин, стерилизовали надосадочную жидкость фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,2 мкм и пропускали полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину.Then the phagolysate was aspirated into a sterile container, chloroform was added, kept for 30 minutes with continuous shuttling, centrifuged for 30 minutes at 6000 rpm, the supernatant was sterilized by filtration through a filter with a pore diameter of 0.2 μm, and the obtained filtrate was passed through a column containing an agent affinity for endotoxin.
Полученный очищенный фаголизат в виде элюата содержал бактериофаги в титре 1013 БОЕ/мл при отсутствии бактерий, ингредиентов использованной питательной среды и при концентрации эндотоксина менее 50 единиц эндотоксина на 1 мл очищенного фаголизата (ЕЭ/мл).The resulting purified phagolysate in the form of an eluate contained bacteriophages in a titer of 10 13 PFU / ml in the absence of bacteria, ingredients of the used nutrient medium and at an endotoxin concentration of less than 50 units of endotoxin per 1 ml of purified phagolysate (EU / ml).
Пример 2. Для получения бактериофага, активного в отношении Escherichia coli O104:H4, бактериальную культуру непатогенного штамма-хозяина - Escherichia coli К 12 С600 - в титре 109 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм.Example 2. To obtain a bacteriophage active against Escherichia coli O104: H4, a bacterial culture of a non-pathogenic host strain - Escherichia coli K 12 C600 - in a titer of 10 9 CFU / ml was seeded into a culture vessel on a beveled solid nutrient medium with a layer thickness of 10 mm to 25 mm.
Штамм-хозяин культивировали в течение 3,2 часов при оптимальной температуре для его роста (+37°C), затем на полученный газон культуры Escherichia coli К12 С600 засевали маточный бактериофаг в титре 106 БОЕ/мл, герметично закрывали сосуд для культивирования (стекляный микробиологический матрац) и культивировали бактериофаг в течение 14 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+37°C) и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.The host strain was cultured for 3.2 hours at the optimum temperature for its growth (+ 37 ° C), then the uterine bacteriophage in the titer of 10 6 PFU / ml was sown on the obtained lawn of the Escherichia coli K12 C600 culture, and the culture vessel was sealed (glass microbiological mattress) and the bacteriophage was cultured for 14 hours at the optimum temperature for the growth of the culture of the bacteriophage strain (+ 37 ° C) and the thickness of the air layer above the surface of a dense nutrient medium from 25 mm to 40 mm.
Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды буферным раствором с pH 7,0 в количестве 0,042 мл на 1 см2 поверхности плотной питательной среды.The phagolysate was obtained by suspending the bacteriophage from the surface of a dense nutrient medium with a buffer solution with a pH of 7.0 in the amount of 0.042 ml per 1 cm 2 of the surface of a dense nutrient medium.
Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость, добавляли хлороформ, выдерживали в течение 40 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугировали в течение 40 минут при 5500 об./мин.Then the phagolysate was aspirated into a sterile container, chloroform was added, kept for 40 minutes with continuous shuttling, centrifuged for 40 minutes at 5500 rpm.
Для получения бактериофага, активного в отношении Listeria monocytogenes, бактериальную культуру непатогенного штамма-хозяина - Listeria innocua - в титре 109 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм.To obtain a bacteriophage active against Listeria monocytogenes, a bacterial culture of a non-pathogenic host strain, Listeria innocua, was seeded in a titer of 10 9 CFU / ml into a culture vessel on a beveled solid nutrient medium with a layer thickness of 10 mm to 25 mm.
Штамм-хозяин культивировали в течение 3 часов при оптимальной температуре для его роста (+37°C), затем на полученный газон культуры Listeria innocua засевали маточный бактериофаг в титре 105 БОЕ/мл, герметично закрывали сосуд для культивирования (стекляный микробиологический матрац) и культивировали бактериофаг в течение 15 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+22°C) и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.The host strain was cultured for 3 hours at the optimum temperature for its growth (+ 37 ° C), then the uterine bacteriophage in the titer of 10 5 PFU / ml was sown on the obtained grass lawn of the Listeria innocua culture, the cultivation vessel was tightly closed (glass microbiological mattress) and the bacteriophage was cultured for 15 hours at the optimum temperature for the growth of the culture of the bacteriophage strain (+ 22 ° C) and the thickness of the air layer above the surface of a dense nutrient medium from 25 mm to 40 mm.
Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды буферным раствором с pH 7,2 в количестве 0,045 мл на 1 см2 поверхности плотной питательной среды.The phagolysate was obtained by suspending the bacteriophage from the surface of a dense nutrient medium with a buffer solution with a pH of 7.2 in an amount of 0.045 ml per 1 cm 2 of the surface of a dense nutrient medium.
Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость, добавляли хлороформ, выдерживали в течение 45 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугировали в течение 45 минут при 5000 об./мин.Then the phagolysate was aspirated into a sterile container, chloroform was added, kept for 45 minutes with continuous shuttling, centrifuged for 45 minutes at 5000 rpm.
Смешивали надосадочные жидкости двух полученных фаголизатов.The supernatants of the two phagolysates obtained were mixed.
Смесь надосадочных жидкостей стерилизовали фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и пропускали полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину.The mixture of supernatants was sterilized by filtration through a filter with a pore diameter of 0.22 μm and the resulting filtrate was passed through a column containing an endotoxin affinity agent.
Полученная очищенная смесь (коктейль) фаголизатов в виде элюата содержала эшерихиозный бактериофаг в титре 101 БОЕ/мл и листериозный бактериофаг в титре 1011 БОЕ/мл при отсутствии бактерий, ингредиентов использованной питательной среды и при концентрации эндотоксина менее 50 ЕЭ/мл.The obtained purified mixture (cocktail) of phagolysates in the form of an eluate contained an Escherichia bacteriophage in a titer of 10 1 PFU / ml and a listeriosis bacteriophage in a titer of 10 11 PFU / ml in the absence of bacteria, ingredients of the nutrient medium used and at an endotoxin concentration of less than 50 U / ml.
Пример 3. Для получения бактериофага, активного в отношении Salmonella enterica серовар Typhimurium, бактериальную культуру штамма-хозяина - Salmonella enterica серовар Typhimurium - в титре 108 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм.Example 3. To obtain a bacteriophage active against Salmonella enterica, Typhimurium serovar, the bacterial culture of the host strain — Salmonella enterica Typhimurium serovar — in a titer of 10 8 CFU / ml was seeded into a culture vessel on a beveled solid nutrient medium with a layer thickness of 10 mm to 25 mm.
Штамм-хозяин культивировали в течение 3,5 часов при оптимальной температуре для его роста (+37°C), затем на полученный газон культуры Salmonella enterica серовар Typhimurium засевали маточный бактериофаг в титре 105 БОЕ/мл, герметично закрывали сосуд для культивирования (стекляный микробиологический матрац) и культивировали бактериофаг в течение 13 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+37°C) и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.The host strain was cultured for 3.5 hours at the optimum temperature for its growth (+ 37 ° C), then a uterine bacteriophage in the titer of 10 5 PFU / ml was seeded on the obtained lawn of the Salmonella enterica culture serovar Typhimurium, and the culture vessel was sealed (glass microbiological mattress) and the bacteriophage was cultured for 13 hours at the optimum temperature for the growth of the culture of the bacteriophage strain (+ 37 ° C) and the thickness of the air layer above the surface of a dense nutrient medium from 25 mm to 40 mm.
Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды буферным раствором с pH 7,1 в количестве 0,042 мл на 1 см2 поверхности плотной питательной среды.The phagolysate was obtained by suspending the bacteriophage from the surface of a dense nutrient medium with a buffer solution with a pH of 7.1 in the amount of 0.042 ml per 1 cm 2 of the surface of a dense nutrient medium.
Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость, добавляли хлороформ, выдерживали в течение 32 минуты при непрерывном шуттелировании, центрифугировали в течение 32 минуты при 6000 об./мин.Then the phagolysate was aspirated into a sterile container, chloroform was added, kept for 32 minutes with continuous shuttling, centrifuged for 32 minutes at 6000 rpm.
Для получения бактериофага, активного в отношении Listeria monocytogenes, бактериальную культуру непатогенного штамма-хозяина - Listeria innocua - в титре 109 КОЕ/мл засевали в сосуд для культивирования на скошенную плотную питательную среду с толщиной слоя от 10 мм до 25 мм.To obtain a bacteriophage active against Listeria monocytogenes, a bacterial culture of a non-pathogenic host strain, Listeria innocua, was seeded in a titer of 10 9 CFU / ml into a culture vessel on a beveled solid nutrient medium with a layer thickness of 10 mm to 25 mm.
Штамм-хозяин культивировали в течение 3 часов при оптимальной температуре для его роста (+37°C), затем на полученный газон культуры Listeria innocua засевали маточный бактериофаг в титре 105 БОЕ/мл, герметично закрывали сосуд для культивирования (стекляный микробиологический матрац) и культивировали бактериофаг в течение 15 часов при оптимальной температуре для роста культуры штамма бактериофага (+24°C) и толщине слоя воздуха над поверхностью плотной питательной среды от 25 мм до 40 мм.The host strain was cultured for 3 hours at the optimum temperature for its growth (+ 37 ° C), then the uterine bacteriophage in the titer of 10 5 PFU / ml was sown on the obtained grass lawn of the Listeria innocua culture, the cultivation vessel was tightly closed (glass microbiological mattress) and the bacteriophage was cultured for 15 hours at the optimum temperature for the growth of the culture of the bacteriophage strain (+ 24 ° C) and the thickness of the air layer above the surface of a dense nutrient medium from 25 mm to 40 mm.
Фаголизат получали при суспендировании бактериофага с поверхности плотной питательной среды буферным раствором с pH 7,2 в количестве 0,045 мл на 1 см2 поверхности плотной питательной среды.The phagolysate was obtained by suspending the bacteriophage from the surface of a dense nutrient medium with a buffer solution with a pH of 7.2 in an amount of 0.045 ml per 1 cm 2 of the surface of a dense nutrient medium.
Затем отсасывали фаголизат в стерильную емкость, добавляли хлороформ, выдерживали в течение 45 минут при непрерывном шуттелировании, центрифугировали в течение 45 минут при 5000 об./мин.Then the phagolysate was aspirated into a sterile container, chloroform was added, kept for 45 minutes with continuous shuttling, centrifuged for 45 minutes at 5000 rpm.
Смешивали надосадочные жидкости двух полученных фаголизатов.The supernatants of the two phagolysates obtained were mixed.
Смесь надосадочных жидкостей стерилизовали фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и пропускали полученный фильтрат через колонку, содержащую агент, аффинный к эндотоксину.The mixture of supernatants was sterilized by filtration through a filter with a pore diameter of 0.22 μm and the resulting filtrate was passed through a column containing an endotoxin affinity agent.
Полученная очищенная смесь (коктейль) фаголизатов в виде элюата содержала сальмонеллезный бактериофаг в титре 1012 БОЕ/мл и листериозный бактериофаг в титре 1011 БОЕ/мл при отсутствии бактерий, ингредиентов использованной питательной среды и при концентрации эндотоксина менее 50 ЕЭ/мл.The resulting purified mixture (cocktail) of phagolysates in the form of an eluate contained salmonella bacteriophage in a titer of 10 12 PFU / ml and listeriosis bacteriophage in a titer of 10 11 PFU / ml in the absence of bacteria, ingredients of the nutrient medium used and at an endotoxin concentration of less than 50 U / ml.
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013126187/10A RU2525141C1 (en) | 2013-06-07 | 2013-06-07 | Method of production of bacteriophage |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2013126187/10A RU2525141C1 (en) | 2013-06-07 | 2013-06-07 | Method of production of bacteriophage |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2525141C1 true RU2525141C1 (en) | 2014-08-10 |
Family
ID=51355238
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2013126187/10A RU2525141C1 (en) | 2013-06-07 | 2013-06-07 | Method of production of bacteriophage |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2525141C1 (en) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2603730C1 (en) * | 2015-08-12 | 2016-11-27 | Андрей Владимирович Алёшкин | Method of producing bacteriophage |
| RU2613423C1 (en) * | 2015-12-28 | 2017-03-16 | Евгений Олегович Рубальский | Bacteriophages production method |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2109055C1 (en) * | 1996-11-27 | 1998-04-20 | Дочернее предприятие "Биофаг" Научно-производственного объединения "Иммунопрепарат" | Method of bacteriophage isolation |
| RU2171842C2 (en) * | 1999-05-11 | 2001-08-10 | Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт | Method of anthrax bacteriophage gamma a-26 preparing |
| US20070010001A1 (en) * | 2002-12-09 | 2007-01-11 | Phage Biopharm Llc | Production of bacteriophage compositions for use in phage therapy |
-
2013
- 2013-06-07 RU RU2013126187/10A patent/RU2525141C1/en active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2109055C1 (en) * | 1996-11-27 | 1998-04-20 | Дочернее предприятие "Биофаг" Научно-производственного объединения "Иммунопрепарат" | Method of bacteriophage isolation |
| RU2171842C2 (en) * | 1999-05-11 | 2001-08-10 | Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт | Method of anthrax bacteriophage gamma a-26 preparing |
| US20070010001A1 (en) * | 2002-12-09 | 2007-01-11 | Phage Biopharm Llc | Production of bacteriophage compositions for use in phage therapy |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2603730C1 (en) * | 2015-08-12 | 2016-11-27 | Андрей Владимирович Алёшкин | Method of producing bacteriophage |
| RU2613423C1 (en) * | 2015-12-28 | 2017-03-16 | Евгений Олегович Рубальский | Bacteriophages production method |
| WO2017116282A1 (en) * | 2015-12-28 | 2017-07-06 | Евгений Олегович РУБАЛЬСКИЙ | Method of producing a bacteriophage |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109207440B (en) | Vibrio bacteriophage and preparation method and application of bactericidal composition thereof | |
| EP1587520B1 (en) | Bacteriophage for the treatment of bacterial biofilms | |
| JP5651407B2 (en) | Acinetobacter baumannii phage | |
| Easwaran et al. | Characterization of bacteriophage pAh-1 and its protective effects on experimental infection of Aeromonas hydrophila in Zebrafish (Danio rerio) | |
| CN113430173B (en) | Wide-cracking-spectrum high-temperature-resistant salmonella bacteriophage and application thereof | |
| CN112680423A (en) | Wide-spectrum escherichia coli bacteriophage capable of simultaneously cracking four bacteria and composition, kit and application thereof | |
| CA2717534A1 (en) | Method for producing a mixture of bacteriophages and the use thereof in the therapy of antibiotic-resistant staphylococci | |
| Keary et al. | Bacteriophages and their endolysins for control of pathogenic bacteria | |
| WO2016003307A1 (en) | Bacteriophage strains, compositions and related methods | |
| CN109097298A (en) | A kind of method of enrichment culture method preparation phage bdellovibro preparation | |
| CN113337480A (en) | Broad-spectrum coliphage and application thereof | |
| JP2011050373A (en) | Staphylococcus aureus bacteriolytic bacteriophage | |
| RU2525141C1 (en) | Method of production of bacteriophage | |
| CN109310721A (en) | Phage strain and its application | |
| CN104472550B (en) | A kind of broad spectrum type salmonella phage biocontrol bactericide and its application | |
| RU2613423C1 (en) | Bacteriophages production method | |
| CN106754751B (en) | Enterohemorrhagic escherichia coli bacteriophage and application thereof | |
| RU2603730C1 (en) | Method of producing bacteriophage | |
| Kiani et al. | Naturally-occurring and cultured bacteriophages in human therapy. | |
| Adibi et al. | Isolation, purification and identification of E. coli O157 phage for medical purposes | |
| RU2503716C1 (en) | SPECIES-SPECIFIC BACTERIOPHAGE STRAIN HAVING LYTIC ACTIVITY IN RELATION TO Staphylococcus aureus, INCLUDING MULTI-DRUG RESISTANT STRAINS | |
| CN113528461B (en) | Isolated aeromonas salmonicida phage, compositions and uses thereof | |
| Lee et al. | Characteristics and growth inhibition of isolated bacteriophages for Enterococcus faecalis | |
| CN114369579B (en) | Bacteriophage for efficiently cracking cronobacter sakazakii and application thereof | |
| CN110129282A (en) | Vibrio alginolyticus bacteriophage and bacteriophage composition and its application |