RU2157847C2

RU2157847C2 - Dna molecule for expression of bile salt-stimulated lipase

Info

Publication number: RU2157847C2
Application number: RU97117367/13A
Authority: RU
Inventors: Дас Гоутам
Original assignee: Астра Актиеболаг (пабл)
Priority date: 1995-05-24
Filing date: 1996-03-12
Publication date: 2000-10-20
Also published as: WO1996037622A1; JP2000510683A; CN1185812A; SE9501939D0; HUP9802388A2; KR19980703238A; HUP9802388A3; TW434314B; CZ297397A3; EP0832257A1; TR199701010T1; PL322848A1; EE9700321A; IL118335A0; AU5165696A

Abstract

FIELD: molecular biology, genetic engineering. SUBSTANCE: invention relates to DNA molecules, recombinant vectors and cellular cultures used for expression of lipase stimulated by bile salts in methyltrophic yeast, Pichia pastoris. DNA molecule has region encoding polypeptide that presents human lipase stimulated by bile salts or its biologically active variant with amino acid sequence given in the invention description. Site is bound to 5'-terminating region encoding signal peptide that is able to operate the secretion of indicated polypeptide from Pichia pastoris cells transformed with indicated DNA molecule with amino acid sequence given in the invention description and methanol oxidizing promoter of Pichia pastoris operative-associated with encoding regions or functionally equivalent promoter. Invention describes plasmid vectors pARC 5771, pARC 5799, pARC 5797. Polypeptide is prepared by culturing host-cells transformed with indicated plasmids and its isolation from cultural medium. EFFECT: increased yield of end product as compared with known methods. 8 cl, 1 tbl, 5 ex

Description

Изобретение относится к молекулам ДНК, рекомбинантным векторам и клеточным культурам, предназначенным для использования в способах экспрессии стимулируемой солями желчи липазы (BSSL) в метилотрофных дрожжах Pichia pastoris. The invention relates to DNA molecules, recombinant vectors and cell cultures intended for use in methods for the expression of bile salt-stimulated lipase (BSSL) in methylotrophic Pichia pastoris yeast.

Считается, что стимулируемая солями желчи липаза (BSSL; EC 3.1.1.1) (см. ссылку на работу Wang и Hartsuck, 1993) ответственна за основную часть липолитической активности человеческого молока. Отличительный признак такой липазы состоит в том, что необходимо наличие первичных солей желчи для обеспечения ее активности в отношении эмульгированных длинных цепей триацилглицеринов. BSSL к настоящему времени была обнаружена только в молоке людей, горилл, кошек и собак (Hernell с сотр., 1989). It is believed that bile salt stimulated lipase (BSSL; EC 3.1.1.1) (see reference to Wang and Hartsuck, 1993) is responsible for the bulk of the lipolytic activity of human milk. A distinctive feature of such a lipase is that the presence of primary bile salts is necessary to ensure its activity against emulsified long chains of triacylglycerols. BSSL to date has only been found in the milk of humans, gorillas, cats, and dogs (Hernell et al., 1989).

BSSL приписывается решающая роль в процессе переваривания молочных липидов в кишечнике детей, кормящихся грудью (Fredrikzon с сотр., 1978). BSSL синтезируется в организме женщин в период лактации молочных желез и секретируется с молоком (Bläckberg с сотр., 1987). Считается, что она обеспечивает примерно 1% общего количества молочного белка (Bläckberg & Hernell, 1981). BSSL is attributed a crucial role in the process of digestion of milk lipids in the intestines of breastfeeding babies (Fredrikzon et al., 1978). BSSL is synthesized in the body of women during lactation of the mammary glands and is secreted with milk (Bläckberg et al., 1987). It is believed to provide approximately 1% of total milk protein (Bläckberg & Hernell, 1981).

Предполагается, что BSSL является основным лимитирующим скорость фактором в абсорбции жира и последующем росте, особенно в возрасте полового созревания, у детей с дефицитом собственного продуцирования BSSL и что добавка в рацион питания упомянутых выше детей рецептур, содержащих очищенный энзим, существенно улучшает пищеварение и способствует росту детей (US 4944944; Медицинский Исследовательский Фонд Оклахомы). Этот факт является весьма важным в клинической практике в области составления детских рецептур, содержащих относительно высокое процентное содержание триглицеридов и основанных на молочных белках растительного или нечеловеческого происхождения, так как новорожденные, питающиеся такими рецептурами, не способны переваривать жир в отсутствие добавляемой BSSL. It is assumed that BSSL is the main rate-limiting factor in fat absorption and subsequent growth, especially at puberty, in children with deficiency of their own production of BSSL and that supplementing the diets of the children mentioned above containing purified enzyme significantly improves digestion and promotes growth Children (US 4,944,944; Oklahoma Medical Research Foundation). This fact is very important in clinical practice in the field of preparing children's formulations containing a relatively high percentage of triglycerides and based on milk proteins of plant or non-human origin, since newborns eating such formulations are not able to digest fat in the absence of added BSSL.

Структуры кДНК как молочной BSSL, так и карбонового сложного эфира гидролазы поджелудочной железы (СЕН) были охарактеризованы (Baba с сотр., 1991; Hui и Kissel, 1991; Nilsson с сотр., 1991; Reue с сотр., 1991) и был сделан вывод, что молочный энзим и фермент поджелудочной железы являются продуктами одного и того же гена, гена CEL. Последовательность кДНК (SEQ ID N: 1) CEL гена раскрыта в патенте США 5200183 (Медицинский Исследовательский Фонд Оклахомы); WO 91/18293 (Actiebolaret Astra); Nilsson с сотр. (1990); a также Baba с сотр. (1991). Выведенная аминокислотная последовательность белка BSSL, включающая сигнальную последовательность из 23 аминокислот, представлена как Последовательность SEQ ID N: 2 в Перечне последовательностей, приведенном в конце описания, тогда как последовательность нативного белка, состоящего из 722 аминокислот, представлена как SEQ ID N: 3. The cDNA structures of both mammary BSSL and the carboxylic ester of pancreatic hydrolase (CEN) have been characterized (Baba et al., 1991; Hui and Kissel, 1991; Nilsson et al., 1991; Reue et al., 1991) and were made the conclusion that the milk enzyme and pancreatic enzyme are products of the same gene, the CEL gene. The cDNA sequence (SEQ ID N: 1) of the CEL gene is disclosed in US Pat. No. 5,200,183 (Oklahoma Medical Research Foundation); WO 91/18293 (Actiebolaret Astra); Nilsson et al. (1990); and also Baba et al. (1991). The deduced amino acid sequence of the BSSL protein including the signal sequence of 23 amino acids is presented as SEQ ID N: 2 in the Sequence List at the end of the description, while the sequence of a native protein consisting of 722 amino acids is presented as SEQ ID N: 3.

C-терминальная область белка содержит 16 повторов из 11 аминокислотных остатков каждый, за которыми следует консервативный участок из 11 аминокислот. Нативный белок имеет высокую степень гликозилирования, и имеются сообщения о широком интервале наблюдаемых молекулярных весов. Вероятно, этот факт может быть объяснен изменением степени гликозилирования (Abouakil с сотр., 1988). N-терминальная половина белка гомологична ацетилхолинэстеразе и некоторым другим эстеразам (Nilsson с сотр., 1990). The C-terminal region of the protein contains 16 repeats of 11 amino acid residues each, followed by a conserved region of 11 amino acids. Native protein has a high degree of glycosylation, and there are reports of a wide range of observed molecular weights. Probably, this fact can be explained by a change in the degree of glycosylation (Abouakil et al., 1988). The N-terminal half of the protein is homologous to acetylcholinesterase and some other esterases (Nilsson et al., 1990).

Рекомбинантная BSSL может быть продуцирована экспрессией в таком подходящем хозяине, как E.coli, Saccharomyces serevisiae или клеточные линии млекопитающих. Для масштабирования системы экспрессии BSSL с целью достижения коммерчески приемлемой стоимости производства может рассматриваться применение гетерологических экспрессирующих систем. Как упоминалось выше, человеческая BSSL имеет 16 повторов из 11 аминокислот на C-терминальном конце. Для определения биологической значимости такого участка повторов конструировались различные мутанты человеческой BSSL, у которых частично или полностью отсутствовали участки повтора (Hansson с сотр., 1993). Так, например, вариант BSSL-C (SEQ ID N: 4) имеет делеции от аминокислотных остатков 536-568 и аминокислотных остатков 591-711. Исследования экспрессии с использованием линии клеток млекопитающего C127 и сектора экспрессии на основе вируса коровьей папиломы показали, что различные варианты могут экспрессироваться в активных формах (Hansson с сотр., 1993). Из исследований экспрессии был также сделан вывод, что повторы, обогащенные пролином, в человеческой BSSL не играют существенной роли в каталитической активности или активации BSSL солями желчи. Однако получение BSSL или ее мутантов в экспрессионной системе млекопитающего оказывается слишком дорогостоящим для рутинного терапевтического использования. Recombinant BSSL can be produced by expression in a suitable host such as E. coli, Saccharomyces serevisiae or mammalian cell lines. To scale the BSSL expression system to achieve a commercially acceptable production cost, the use of heterologous expression systems may be considered. As mentioned above, human BSSL has 16 repeats of 11 amino acids at the C-terminal end. To determine the biological significance of such a repeat site, various mutants of human BSSL were constructed in which partially or completely there were no repeat sites (Hansson et al., 1993). So, for example, the BSSL-C variant (SEQ ID N: 4) has deletions from amino acid residues 536-568 and amino acid residues 591-711. Studies of expression using the mammalian cell line C127 and the expression sector based on bovine papilloma virus have shown that various variants can be expressed in active forms (Hansson et al., 1993). From expression studies, it was also concluded that proline-rich repeats in human BSSL do not play a significant role in the catalytic activity or activation of BSSL by bile salts. However, obtaining BSSL or its mutants in a mammalian expression system is too expensive for routine therapeutic use.

Эукариотическая система, например дрожжи, может обеспечить значительные преимущества по сравнению с использованием прокариотических систем в плане получения некоторых полипептидов, кодируемых рекомбинантной ДНК. Так, например, дрожжи обычно могут расти до более высокой плотности клеток, чем бактерии, и могут оказаться способными к гликозилированию экспрессированных полипептидов в том случае, когда такое гликозилирование важно для биологической активности. Однако применение дрожжей разновидности Saccharomyces cerevisiae в качестве организма-хозяина часто приводит к плохим уровням экспрессии и плохой секреции рекомбинантного белка (Cregg с сотр., 1987). Максимальные уровни содержания гетерологических белков в S.cerevisiae составляют величину порядка 5% от общего количества клеточного белка (Kingsman с сотр., 1985). Дополнительным недостатком применения Saccharomyces cerevisiae в качестве хозяина является то, что рекомбинантные белки проявляют тенденцию к сверхгликозилированию, которое может оказывать влияние на активность гликозилированных белков млекопитающих. A eukaryotic system, such as yeast, can provide significant advantages compared with the use of prokaryotic systems in terms of obtaining certain polypeptides encoded by recombinant DNA. For example, yeast can usually grow to a higher cell density than bacteria, and may be able to glycosylate expressed polypeptides when such glycosylation is important for biological activity. However, the use of yeast species of Saccharomyces cerevisiae as a host organism often leads to poor levels of expression and poor secretion of the recombinant protein (Cregg et al., 1987). The maximum levels of heterologous proteins in S. cerevisiae are about 5% of the total amount of cellular protein (Kingsman et al., 1985). An additional disadvantage of using Saccharomyces cerevisiae as a host is that recombinant proteins tend to overglycosylate, which may affect the activity of mammalian glycosylated proteins.

Pichia pastoris представляют собой метилотрофные дрожжи, которые способны расти на метаноле в качестве единственного источника углерода и энергии, поскольку для такого микроорганизма характерен высокорегулируемый путь утилизации метанола (Ellis с сотр., 1985). P. pastoris также способны подвергаться эффективной технологии ферментации с высокой плотностью клеточной популяции. В связи с этим технология рекомбинантной ДНК и эффективные способы трансформации дрожжей позволили использовать P.pastoris в качестве хозяина для экспрессии гетерологического белка в большом количестве с помощью экспрессионной системы на основе метанолоксидазного промотора (Cregg с сотр. , 1987). Pichia pastoris is a methylotrophic yeast that can grow on methanol as the sole source of carbon and energy, since such a microorganism is characterized by a highly regulated way of utilization of methanol (Ellis et al., 1985). P. pastoris are also able to undergo efficient fermentation technology with high cell density. In this regard, recombinant DNA technology and efficient methods of yeast transformation allowed the use of P. pastoris as a host for the expression of a heterologous protein in large quantities using an expression system based on a methanol oxidase promoter (Cregg et al., 1987).

Применение Pichia pastoris в качестве хозяина для экспрессии известно из литературы, например, следующих гетерологических белков: фактора некроза человеческих опухолей (EP-A-0263311); пертактиновых антигенов Bordetella (WO 91/15571); поверхностного антигена вируса гепатита В (Cregg с сотр., 1987); человеческого лизоцимного белка (WO 92/04441); апротинина (WO 92/01048). Однако успешная экспрессия гетерологического белка в активной, растворимой и секретированной форме зависит от большого числа факторов, например правильного выбора сигнального пептида, надлежащего конструирования участка слияния между сигнальным пептидом и зрелым белком, условий роста и т.д. The use of Pichia pastoris as a host for expression is known from the literature, for example, the following heterologous proteins: human tumor necrosis factor (EP-A-0263311); Bordetella pertactin antigens (WO 91/15571); hepatitis B virus surface antigen (Cregg et al., 1987); human lysozyme protein (WO 92/04441); aprotinin (WO 92/01048). However, the successful expression of a heterologous protein in an active, soluble and secreted form depends on a large number of factors, for example, the correct choice of the signal peptide, the proper construction of the fusion site between the signal peptide and the mature protein, growth conditions, etc.

Цель настоящего изобретения состоит в преодолении упомянутых выше недостатков известных систем и разработке способа получения человеческой BSSL, который являлся бы экономически выгодным и давал выходы продукта, сравнимые или превосходящие производительность процесса в других микроорганизмах. Эта цель была достигнута разработкой способов экспрессии BSSL в клетках Pachia pastoris. The purpose of the present invention is to overcome the above-mentioned disadvantages of known systems and to develop a method for producing human BSSL, which would be cost-effective and give product yields comparable or superior to the performance of the process in other microorganisms. This goal was achieved by the development of methods for the expression of BSSL in Pachia pastoris cells.

Таким образом, с помощью настоящего изобретения было показано, что человеческая BSSL и вариантная BSSL-C могут экспрессироваться в активной форме, секретируемой из P. pastoris. Нативный сигнальный пептид, а также гетерологический сигнальный пептид, являющийся произведенным белка инвертазы S. cerevisiae, были использованы для транслокации зрелого белка в культуральную среду в активной, надлежащим образом процессированной форме. Thus, using the present invention, it was shown that human BSSL and variant BSSL-C can be expressed in an active form secreted from P. pastoris. The native signal peptide, as well as the heterologous signal peptide that is produced by the S. cerevisiae invertase protein, were used to translate the mature protein into the culture medium in an active, properly processed form.

В соответствии с первым аспектом изобретение предусматривает ДНК-молекулу, содержащую:
(a) область, кодирующую полипептид, представляющий собой человеческую BSSL или ее биологически активный вариант;
(b) присоединенный к 5'-концу области, кодирующей полипептид, участок, кодирующий сигнальный пептид, способный управлять секрецией указанного полипептида из клеток Pichia pastoris, трансформированных с помощью указанной ДНК-молекулы; и
(c) оперативно связанный с кодирующими областями, указанными в (a) и (b), метанолоксидазный промотор Pichia pastoris или функционально эквивалентный промотор.According to a first aspect, the invention provides a DNA molecule comprising:
(a) a region encoding a polypeptide representing human BSSL or a biologically active variant thereof;
(b) attached to the 5'-end of the region encoding the polypeptide, a region encoding a signal peptide capable of controlling the secretion of said polypeptide from Pichia pastoris cells transformed with said DNA molecule; and
(c) operably linked to the coding regions indicated in (a) and (b), the Pichia pastoris methanol oxidase promoter or a functionally equivalent promoter.

Под термином "биологически активный вариант" BSSL понимается полипептид, обладающий BSSL активностью и содержащий часть аминокислотной последовательности, представленной последовательностью SEQ ID N: 3 в Перечне последовательностей (Перечень последовательностей приведен в конце описания). Под термином "полипептид, обладающий BSSL активностью", в настоящем контексте понимается полипептид, обладающий следующими свойствами: (a) пригодностью для орального применения; (b) способностью активироваться специфическими солями желчи; и (c) способностью к действию в качестве неспецифической липазы в содержимом тонкого кишечника, т.е. способностью к гидролизу липидов независимо от их химической структуры и физического состояния (эмульгированного, мицеллярного, растворимого). By the term “biologically active variant” of BSSL is meant a polypeptide having BSSL activity and containing part of the amino acid sequence represented by the sequence SEQ ID N: 3 in the Sequence List (Sequence List is provided at the end of the description). The term "polypeptide having BSSL activity", in the present context, refers to a polypeptide having the following properties: (a) suitability for oral use; (b) the ability to be activated by specific bile salts; and (c) the ability to act as a non-specific lipase in the contents of the small intestine, i.e. ability to hydrolyze lipids regardless of their chemical structure and physical state (emulsified, micellar, soluble).

Указанный BSSL-вариант может представлять собой, например, вариант, содержащий менее 16 повторяющихся единиц, вследствие чего термин "повторяющаяся единица" понимается как повторяющаяся единица из 11 аминокислот, закодированных нуклеотидной последовательностью, обозначенной как "повторяющаяся единица" в разделе под заголовком "(IX) Отличительный признак" в "Информации для SEQ ID N: 1" в Перечне последовательностей. Главным образом BSSL-вариант может представлять собой вариант BSSL-C, в котором аминокислоты 536-568 и 591-711 подвергнуты делеции (SEQ ID N: 4 в Перечне последовательностей). Said BSSL variant may be, for example, a variant containing less than 16 repeating units, whereby the term “repeating unit” is understood to be a repeating unit of 11 amino acids encoded by the nucleotide sequence designated as “repeating unit” in the section under the heading "(IX ) Distinctive feature "in" Information for SEQ ID N: 1 "in the List of sequences. Basically, the BSSL variant may be a BSSL-C variant in which amino acids 536-568 and 591-711 are deleted (SEQ ID N: 4 in the Sequence Listing).

Следовательно, ДНК-молекула в соответствии с изобретением предпочтительно представляет собой молекулу ДНК, которая кодирует BSSL (SEQ ID N: 3) или BSSL-C (SEQ ID N: 4). Therefore, the DNA molecule in accordance with the invention is preferably a DNA molecule that encodes BSSL (SEQ ID N: 3) or BSSL-C (SEQ ID N: 4).

Однако ДНК-молекулы согласно настоящему изобретению не должны строго ограничиваться молекулами ДНК, кодирующими полипептиды с аминокислотными последовательностями, идентичными SEQ ID N: 3 или 4 в Перечне последовательностей. Наоборот, изобретение охватывает молекулы ДНК, кодирующие полипептиды, несущие такие модификации, как замены, небольшие делеции, инсерции или инверсии, причем такие полипептиды в значительной мере обладают биологическими активностями BSSL. Таким образом, настоящее изобретение включает молекулы ДНК, кодирующие BSSL-варианты, упомянутые выше, а также молекулы ДНМ, кодирующие полипептиды, аминокислотные последовательности которых по крайней мере на 90% гомологичны, предпочтительно по крайней мере на 95% гомологичны аминокислотной последовательности, представленной последовательностью SEQ ID N: 3 или 4 в Перечне последовательностей. However, the DNA molecules of the present invention should not be strictly limited to DNA molecules encoding polypeptides with amino acid sequences identical to SEQ ID N: 3 or 4 in the Sequence Listing. On the contrary, the invention encompasses DNA molecules encoding polypeptides bearing modifications such as substitutions, small deletions, insertions or inversions, moreover, such polypeptides substantially possess biological activities of BSSL. Thus, the present invention includes DNA molecules encoding the BSSL variants mentioned above, as well as DNM molecules encoding polypeptides whose amino acid sequences are at least 90% homologous, preferably at least 95% homologous to the amino acid sequence represented by the SEQ sequence ID N: 3 or 4 in the List of sequences.

Сигнальный пептид, на который ссылались выше, может представлять собой пептид, идентичный или в значительной мере подобный пептиду с аминокислотной последовательностью, представленной как аминокислоты от -20 до -1 в SEQ ID N: 2 в Перечне последовательностей. С другой стороны, это может быть пептид, включающий сигнальный пептид инвертазы Saccharomyces cerevisiae. The signal peptide referred to above may be a peptide that is identical or substantially similar to a peptide with an amino acid sequence represented as amino acids -20 to -1 in SEQ ID N: 2 in the Sequence Listing. Alternatively, it may be a peptide comprising the Saccharomyces cerevisiae invertase signal peptide.

В соответствии с другим аспектом изобретение предусматривает вектор, содержащий молекулу ДНК, упомянутую выше. Предпочтительно такой вектор представляет собой способный к репликации вектор экспрессии, который несет и способен управлять экспрессией в клетках вида Pichia ДНК-последовательности, кодирующей человеческую BSSL или ее биологически активный вариант. Такой вектор может представлять собой, например, плазмидный вектор pARC 5771 (NCIMB 40721), pARC 5799 (NCIMB 40723) или pARC 5797 (NCIMB 40722). In accordance with another aspect, the invention provides a vector containing the DNA molecule mentioned above. Preferably, such a vector is a replicable expression vector that carries and is capable of controlling the expression in cells of the Pichia species of a DNA sequence encoding a human BSSL or a biologically active variant thereof. Such a vector may be, for example, plasmid vector pARC 5771 (NCIMB 40721), pARC 5799 (NCIMB 40723) or pARC 5797 (NCIMB 40722).

Согласно еще одному аспекту изобретение предусматривает культуру клеток-хозяев, содержащую клетки вида Pichia, трансформированные с помощью упомянутых выше молекулы ДНК или вектора. Предпочтительно клетки-хозяева представляют собой клетки Pichia pastoris такого штамма, как PPF-1 или GS115. В качестве указанных клеточных культур могут использоваться, например, культура PPF-1 [pARC 5771] (NCIMB 40721), GS115 [pARC 5799] (NCIMB 40723) или GS115 [pARC 5797] (NCIMB 40722). According to yet another aspect, the invention provides a host cell culture comprising Pichia spp. Cells transformed with the aforementioned DNA molecule or vector. Preferably, the host cells are Pichia pastoris cells of a strain such as PPF-1 or GS115. As these cell cultures can be used, for example, a culture of PPF-1 [pARC 5771] (NCIMB 40721), GS115 [pARC 5799] (NCIMB 40723) or GS115 [pARC 5797] (NCIMB 40722).

В соответствии с еще одним аспектом изобретение предусматривает способ получения полипептида, представляющего собой человеческую BSSL или ее биологически активный вариант, заключающийся в культивировании клеток-хозяев согласно изобретению в условиях, при которых указанный полипептид секретируется в культурную среду, и выделении указанного полипептида из культурной среды. In accordance with another aspect, the invention provides a method for producing a polypeptide comprising human BSSL or a biologically active variant thereof, comprising culturing the host cells of the invention under conditions under which said polypeptide is secreted into the culture medium and isolating said polypeptide from the culture medium.

ПРИМЕР 1: Экспрессия BSSL в Pichia pastoris PPF-1. EXAMPLE 1: Expression of BSSL in Pichia pastoris PPF-1.

1.1. Конструкция pARC 0770. 1.1. Construction pARC 0770.

Последовательность кДНК (SEQ ID N: 1), кодирующую BSSL-белок, включающий нативный сигнальный пептид (на который ниже ссылаются, как на NSP), клонировали в pTZl9R (Фармация) в виде фрагмента EcoRI-SacI. Клонирование кДНК NSP-BSSL в S.cerevisiae экспрессионный вектор pSCW 231 (полученный от профессора L. Prakash, Рочестерский университет, NY, США), представляющий собой вектор экспрессии дрожжей с низким числом копий, в котором экспрессия осуществляется под контролем конститутивного ADH1 промотора, проводили в две стадии. Вначале кДНК NSP-BSSL клонировали в pYES 2.0 (Инвитроген, США) в виде фрагмента EcoRI-SpbI из pTZ19R-SP-BSSL. Избыточные 89 пар оснований между EcoRI и NcoI в начале кодирующей последовательности сигнального пептида удаляли созданием слияния EcoRI/NcoI (89) и регенерацией EcoRI сайта. Полученный в результате клон pARC 0770 содержал ATG кодон, первоначально закодированный в NcoI сайте, за которым сразу же располагался регенерированный EcoRI сайт в рамке считывания информации с оставшейся NSP-BSSL последовательностью. The cDNA sequence (SEQ ID N: 1) encoding a BSSL protein comprising a native signal peptide (referred to below as NSP) was cloned into pTZl9R (Pharmacy) as an EcoRI-SacI fragment. Cloning of NSP-BSSL cDNA in S. cerevisiae expression vector pSCW 231 (obtained from Professor L. Prakash, University of Rochester, NY, USA), which is a low copy number yeast expression vector in which expression is controlled by the constitutive ADH1 promoter, in two stages. Initially, NSP-BSSL cDNA was cloned into pYES 2.0 (Invitrogen, USA) as an EcoRI-SpbI fragment from pTZ19R-SP-BSSL. Excess 89 base pairs between EcoRI and NcoI at the beginning of the coding sequence of the signal peptide was removed by creating an EcoRI / NcoI fusion (89) and regenerating the EcoRI site. The resulting pARC clone 0770 contained an ATG codon originally encoded at the NcoI site, immediately after which the regenerated EcoRI site was located in the reading frame with the remaining NSP-BSSL sequence.

1.2. Конструкция pARC 5771 плазмиды. 1.2. Construction of pARC 5771 plasmid.

Для конструирования подходящего экспрессионного вектора для экспрессии BSSL, кДНК фрагмент, кодирующий BSSL белок, совместно с его нативным сигнальным пептидом клонировали с экспрессионным вектором pDM 148 P.pastoris. Векторный pDM 148 (полученный от д-ра S. Subramani, UCSD) конструировали следующим образом: расположенную против хода транскрипции нетранслированную область (5'-UTR) и расположенную по ходу транскрипции нетранслированную область (3'-UTR) гена метанолоксидазы (MOX1) выделяли методом PCR и помещали тандемно в множественную клонирующую последовательность (MCS) вектора pSK⁺ E.coli (полученного от Стратаген, США).To construct a suitable expression vector for BSSL expression, a cDNA fragment encoding a BSSL protein, together with its native signal peptide, was cloned with P. pastoris pDM 148 expression vector. Vector pDM 148 (obtained from Dr. S. Subramani, UCSD) was constructed as follows: the upstream region of the untranslated region (5'-UTR) and the downstream region of the transcription (3'-UTR) of the methanol oxidase gene (MOX1) were isolated by PCR and placed in tandem in the multiple cloning sequence (MCS) of the pSK ⁺ E. coli vector (obtained from Stratagen, USA).

Для надлежащего отбора предполагаемых трансформантов Р.pastoris ДНК последовательность, кодирующую ген ARG4 S.cerevisiae совместно с его собственной промоторной последовательностью, вставляли между 5'- и 3'-UTR в pSK^-. Полученная в результате конструкция pDM 148 имела следующие отличительные признаки: в MCS области pSK^- клонировали 5'-UTR МОХ, геномную последовательность ARG4 S.cerevisiae и 3'-UTR МОХ. Между 5'-UTR MOX и геномной последовательностью ARG4 располагали серии уникальных рестрикционных сайтов (SalI, ClaI, EcoRI, PstI, SmaI и BamHI) так, что кодирующая последовательность гетерологического белка может клонироваться для экспрессии под контролем MOX промотора в P.pastoris. Для облегчения интеграции такого полигенного экспрессирующего кластера в MOX1-локус в хромосоме Р.pastoris такой экспрессирующий полигенный кластер может быть отщеплен от оставшейся части pSK^- вектора путем расщепления рестрикционным энзимом NotI.For proper selection of putative P. pastoris transformants, the DNA sequence encoding the S. cerevisiae ARG4 gene, together with its own promoter sequence, was inserted between 5'- and 3'-UTR in pSK ^- . The resulting pDM 148 construct had the following distinguishing features: in the MCS region of pSK ^{, the} 5'-UTR of MOX, the genomic sequence of ARG4 of S. cerevisiae, and 3'-UTR of MOX ^were cloned. Between the 5'-UTR of MOX and the genomic sequence of ARG4, a series of unique restriction sites (SalI, ClaI, EcoRI, PstI, SmaI and BamHI) were located so that the coding sequence of the heterologous protein can be cloned for expression under the control of the MOX promoter in P. pastoris. To facilitate integration of this expression cassette into the MOX1-locus in P. pastoris chromosome polygenic expression of such cluster can be cleaved from the remainder of pSK ^- vector by digestion with restriction enzyme NotI.

5'-UTR MOX1 разновидности P. pastoris, клонированная в pDM 148, имела длину около 150 bp, тогда как 3'-UTR MOX1 из Р.pastoris, клонированная в pDM 148, имела длину около 1000 bp. Для инсерции NSP-BSSL кДНК-последовательности между 5'-UTR MOX1 и ARG4 кодирующей последовательностью S.cerevisiae в pDM 148, кДНК-вставку (SP-BSSL) выделяли из pARC 0770 путем расщепления EcoRI и BamHI (фрагмент ДНК размером примерно 2.2 kb) и клонировали между EcoRI и BamHI сайтами в pDM 148. The 5'-UTR MOX1 of P. pastoris species cloned in pDM 148 was about 150 bp long, while the 3'-UTR MOX1 of P. pastoris cloned in pDM 148 was about 1000 bp. To insert the NSP-BSSL cDNA sequence between the 5'-UTR of MOX1 and the ARG4 coding sequence of S. cerevisiae in pDM 148, the cDNA insert (SP-BSSL) was isolated from pARC 0770 by cleaving EcoRI and BamHI (DNA fragment about 2.2 kb in size) and cloned between EcoRI and BamHI sites in pDM 148.

Полученная в результате конструкция pARG 5771 (NCIMB 40721) содержала 5'-UTR MOX1 P. pastoris с последующей NSP-BSSL кодирующей последовательностью, за которой следовала ARG4 генная последовательность S.cerevisiae и 3'-UTR MOX1 гена P.pastoris, тогда как ДНК сегмент от 5'-UTR MOX1 до 3'-UTR MOX1 клонировали в MCS pSK^-.The resulting pARG 5771 construct (NCIMB 40721) contained P. pastoris 5'-UTR MOX1 followed by the NSP-BSSL coding sequence, followed by the S. cerevisiae ARG4 gene sequence and the P. pastoris 3'-UTR MOX1 gene, whereas DNA a segment of 5'-UTR MOX1 to 3'-UTR MOX1 was cloned into MCS pSK ^- .

1.3. Трансформация BSSL в P.pastoris PPF-1. 1.3. Transformation of BSSL into P. pastoris PPF-1.

Для экспрессии BSSL в P.pastoris PPF-1 (his4, arg4; получено от Филлипс Петролеум Ко.) плазмиду pARC 5771 переваривали NotI и всю расщепленную смесь (10 мкг общей ДНК) использовали для трансформации PPF-1. Используемый протокол трансформации был практически таким же, как метод для дрожжевого сферопласта, описанный Cragg с сотр. (1987). Трансформанты регенерировали на минимальной среде с дефицитом аргинина так, чтобы можно было осуществлять селекцию Arg+ колоний. Регенерационный верхний агар, содержащий трансформанты, снимали и гомогенизировали в воде и дрожжевые клетки культивировали до образования примерно 250 колоний в расчете на пластину на минимальных глюкозных пластинах с дефицитом аргинина. Затем мутантные колонии идентифицировали методом реплик на минимальных метанольных пластинах. Примерно 15% от всего числа трансформантов образовывалось в виде Mut^s (медленный рост в метаноле) фенотипа.To express BSSL in P. pastoris PPF-1 (his4, arg4; obtained from Phillips Petroleum Co.), plasmid pARC 5771 was digested with NotI and the entire digested mixture (10 μg of total DNA) was used to transform PPF-1. The transformation protocol used was almost the same as the method for the yeast spheroplast described by Cragg et al. (1987). Transformants were regenerated on minimal arginine deficient medium so that Arg + colonies could be selected. Regenerative upper agar containing transformants was removed and homogenized in water and the yeast cells were cultured to form approximately 250 colonies per plate on minimal arginine-deficient glucose plates. Then, the mutant colonies were identified by the replica method on minimal methanol plates. About 15% of the total number of transformants formed in the form of Mut ^s (slow growth in methanol) phenotype.

1.4. Скрининг трансформантов у экспрессирующих BSSL. 1.4. Screening for transformants expressing BSSL.

С целью быстрого скрининга большого числа трансформантов на экспрессию липазы был разработан метод анализа липазы на платах. Использовали следующую методику для приготовления таких пластин: к раствору 2% агарозы (конечная концентрация) добавляли 10 х Na-холатный раствор в воде до конечной концентрации 1%. Липидный субстратный трибутин добавляли в смесь до конечной концентрации 1% (об./об.). Для поддержания роста трансформантов смесь дополняли 0.25% дрожжевого азотистого основания (конечное значение) и 0.5% метанола (конечная концентрация). Ингредиенты тщательно перемешивали и переливали на пластины до толщины 3-5 мм. Сразу после отвердевания смеси трансформанты полосками наносили на пластины и полученные пластины дополнительно инкубировали при +37^oC в течение 12 часов. Липаза-продуцирующие клоны демонстрировали прозрачный гало вокруг клона. В типичном эксперименте 7 из 93 трансформантов идентифицировали, как BSSL продуцирующие трансформанты. Два клона (NN 39 и 86), продуцирующие самые крупные гало (ореолы) вокруг полоски колонии, отбирали для дальнейшей характеристики.In order to quickly screen a large number of transformants for lipase expression, a method for analyzing lipase on boards was developed. The following procedure was used to prepare such plates: to a solution of 2% agarose (final concentration) was added a 10 x Na-cholate solution in water to a final concentration of 1%. The lipid substrate tributin was added to the mixture to a final concentration of 1% (v / v). To maintain the growth of transformants, the mixture was supplemented with 0.25% yeast nitrogenous base (final value) and 0.5% methanol (final concentration). The ingredients were thoroughly mixed and poured onto plates to a thickness of 3-5 mm. Immediately after hardening the mixture, transformants were applied in strips to the plates and the resulting plates were further incubated at +37 ^° C for 12 hours. Lipase-producing clones showed a clear halo around the clone. In a typical experiment, 7 out of 93 transformants were identified as BSSL producing transformants. Two clones (NN 39 and 86) producing the largest halo (halos) around the colony strip were selected for further characterization.

1.5. Экспрессия BSSL из PPF-1 [pARC 5771]. 1.5. Expression of BSSL from PPF-1 [pARC 5771].

Два трансформанта NN 39 и 86, описанные в Разделе 1.4, отбирали и выращивали в BMGY жидкой среде (1% дрожжевого экстракта, 2% бактопептона, 1.34% дрожжевого азотистого основания без аминокислоты, 100 мМ KPO₄ буфера, pH 6.0, 400 мкг/л биотина и 2% глицерина) в течение 24 часов при 30^oC до достижения культурами значения A₆₀₀, близкого к 40. Культуры осаждали и ресуспендировали в BMMY (2% глицерина, замененного 0.5% метанола в BMGY) среде при A₆₀₀ = 300. Индуцированные культуры инкубировали при 30^oC при встряхивании в течение 120 часов. Супернатанты культуры отбирали через различные промежутки времени для анализа на экспрессию BSSL путем осуществления анализа на активность энзима, SDS-PAGE анализа и вестерн-блоттинга.The two transformants Nos. 39 and 86 described in Section 1.4 were selected and grown in BMGY liquid medium (1% yeast extract, 2% bactopeptone, 1.34% yeast nitrogenous base without amino acids, 100 mM KPO ₄ buffers, pH 6.0, 400 μg / L biotin and 2% glycerol) for 24 hours at 30 ^° C. until the cultures reached A ₆₀₀ close to 40. The cultures were precipitated and resuspended in BMMY (2% glycerol replaced with 0.5% methanol in BMGY) medium at A ₆₀₀ = 300. The induced cultures were incubated at 30 ^° C. with shaking for 120 hours. Culture supernatants were selected at various time intervals for analysis of BSSL expression by analysis of enzyme activity, SDS-PAGE analysis and Western blotting.

1.6. Детекция ферментативной активности BSSL в культуральных супернатантах клонов NN 39 и 86. 1.6. Detection of BSSL enzymatic activity in culture supernatants of clones NN 39 and 86.

Для определения ферментативной активности в бесклеточном культуральном супернатанте индуцированных культур NN 39 и 86, как описано в Разделе 1.5, культуры центрифугировали и 2 мкл бесклеточного супернатанта анализировали на BSSL-энзимную активность в соответствии со способом, описанным Hernell и Olivecrona (1974). Как показано в таблице, было установлено, что обе культуры содержат BSSL-энзимную активность при максимальном значении активности на 96 час после индукции. To determine the enzymatic activity in the cell-free culture supernatant of induced cultures NN 39 and 86, as described in Section 1.5, the cultures were centrifuged and 2 μl of cell-free supernatant was analyzed for BSSL enzyme activity in accordance with the method described by Hernell and Olivecrona (1974). As shown in the table, it was found that both cultures contain BSSL enzyme activity with a maximum activity value at 96 hours after induction.

1.7. Вестерн-блоттинг анализ культуральных супернатантов PPF-1: pARC 5771 трансформантов (NN 39 и 86). 1.7. Western blot analysis of culture supernatants of PPF-1: pARC 5771 transformants (NN 39 and 86).

Для определения наличия рекомбинантной BSSL в культуральных супернатантах NN 39 и 86 PPF-1 [pARC 5771] трансформантов, культуры выращивали и индуцировали, как описано в Разделе 1.5. Культуры отбирали через различные промежутки времени после индукции и подвергали Вестерн-блоттинг анализу с использованием анти-BSSL поликлонального антитела. Полученные результаты указывают на присутствие BSSL в культуральном супернатанте в виде полосы в 116 кДа. To determine the presence of recombinant BSSL in culture supernatants NN 39 and 86 PPF-1 [pARC 5771] transformants, cultures were grown and induced as described in Section 1.5. Cultures were selected at various time intervals after induction and subjected to Western blot analysis using anti-BSSL polyclonal antibodies. The results indicate the presence of BSSL in the culture supernatant in the form of a band of 116 kDa.

ПРИМЕР 2: Экспрессия BSSL в Pichia pastoris GS115. EXAMPLE 2: Expression of BSSL in Pichia pastoris GS115.

2.1. Конструкция pARC 5799. 2.1. Construction pARC 5799.

Поскольку 5'-MOX UTR и 3'-MOX UTR не выражены надлежащим образом и поскольку в pDM 148 векторе отсутствует какой-либо другой подходящий маркер (например, G418 устойчивый ген) для мониторинга числа копий BSSL, интегрированных в Pichia хромосоме, кДНК вставку нативной BSSL совместно с ее сигнальным пептидом клонировали в другой P. pastoris экспрессионный вектор, pHIL D4. Интеграционную плазмиду pHIL D4 получали от Филлипс Петролеум Компани. Плазмида содержала 5'-MOX1, сегмент алкогольоксидазного промотора размером примерно 1000 bp и уникальный EcoRI - клонирующий сайт. Она также содержала примерно 250 bp 3'-MOX1 участка, содержащего терминационную последовательность алкогольоксидазы после EcoRI-сайта. Район "терминации" сопровождался гистидинолдегидрогеназным геном HIS4 P.pastoris, содержащимся на 2.8-kb фрагменте для комплементации дефектного HIS4 гена в хозяине GS115 (см. ниже). 650-bp участок, содержащий 3'-MOX1 ДНК, был слит с 3'-окончанием HIS4 гена, что совместно с 5'-MOX1 участком необходимо для сайт-направленной интеграции. Бактериальный канамицин-устойчивый ген из pUC-4K (PL-Биокэмикал) подвергали инсерции по уникальному NaeI-сайту между HIS4 и 3'-MOX1 участку на 3'-окончании HIS4 гена. Since the 5'-MOX UTR and 3'-MOX UTR are not properly expressed and since there is no other suitable marker (e.g., G418 resistant gene) in the pDM 148 vector for monitoring the number of BSSL copies integrated into the Pichia chromosome, the cDNA insert is native BSSL, together with its signal peptide, was cloned into another P. pastoris expression vector, pHIL D4. The pHIL D4 integration plasmid was obtained from the Phillips Petroleum Company. The plasmid contained 5'-MOX1, an alcohol oxidase promoter segment of approximately 1000 bp, and a unique EcoRI cloning site. It also contained approximately 250 bp of the 3'-MOX1 region containing the alcohol oxidase termination sequence after the EcoRI site. The “termination” region was accompanied by the histidinol dehydrogenase HIS4 gene of P. pastoris contained in a 2.8-kb fragment to complement the defective HIS4 gene in the GS115 host (see below). The 650-bp region containing 3'-MOX1 DNA was fused to the 3'-end of the HIS4 gene, which together with the 5'-MOX1 region is necessary for site-directed integration. The bacterial kanamycin-resistant gene from pUC-4K (PL-Biocemical) was inserted at the unique NaeI site between the HIS4 and 3'-MOX1 region at the 3'-end of the HIS4 gene.

Для клонирования NSP-BSSL-кодирующего фрагмента кДНК по уникальному EcoRI сайту pHIL D4, двухнитевой олиголинкер с положением расщепления BamHI-EcoRI лигировали с BamHI переваренной плазмидой pARC 5771, и полную NSP-BSSL-кодирующую последовательность объединяли в виде EcoRI-фрагмента размером 2.2 kb. Этот фрагмент клонировали в EcoRI-сайт pHIL D4 и правильно ориентированную плазмиду обозначали как pARC 5799 (NCIMB 40723). To clone the NSP-BSSL coding cDNA fragment at the unique EcoRI site pHIL D4, a double-stranded oligolinker with a BamHI-EcoRI cleavage position was ligated with BamHI digested plasmid pARC 5771, and the entire NSP-BSSL coding sequence was combined as a 2.2 kRI EcoRI fragment. This fragment was cloned into the EcoRI site of pHIL D4 and a correctly oriented plasmid was designated as pARC 5799 (NCIMB 40723).

2.2. Трансформация pARC 5799. 2.2. Transformation pARC 5799.

Для облегчения интеграции NSP-BSSL кодирующей последовательности по геномному локусу MOX1 в P.pastoris плазмиду pARC 5799 переваривали BglII и использовали для трансформации P.pastoris штамма GS115(his4) (Филлипс Петролеум Компани) в соответствии с протоколом, описанным в Разделе 1.5. Однако в этом случае селекцию проводили на His прототрофность. Трансформанты отбирали после серийно разбавленного посева регенерированного верхнего агара и непосредственно тестировали анализом культивирования липазы, как описано в Разделе 1.4. Два трансформированных клона (NN 9 и 21) отбирали на основе размера ореола на пластинке для анализа липазы и дополнительно проверяли на экспрессию BSSL. Было установлено, что такие клоны являются Mut⁺.To facilitate the integration of the NSP-BSSL coding sequence at the MOX1 genomic locus into P. pastoris, plasmid pARC 5799 was digested with BglII and used to transform P. pastoris strain GS115 (his4) (Phillips Petroleum Company) in accordance with the protocol described in Section 1.5. However, in this case, selection was carried out on His prototrophy. Transformants were selected after serially diluted plating of regenerated top agar and were directly tested by lipase culture analysis as described in Section 1.4. Two transformed clones (NN 9 and 21) were selected based on the size of the halo on the lipase assay plate and were further tested for BSSL expression. It was found that such clones are mut ⁺ .

2.3. Определение BSSL энзимной активности в культуральных супернатантах GS115[pARC 5799] трансформантов NN 9 и 21. 2.3. Determination of BSSL enzyme activity in culture supernatants of GS115 [pARC 5799] transformants NN 9 and 21.

Два этих трансформированных клона NN 9 и 21 GS115[pARC 5799] выращивали практически полностью следуя протоколу, описанному в Разделе 1.5. Культуральные супернатанты в различные периоды времени после индукции анализировали на BSSL-энзимную активность в соответствии с описанным в Разделе 1.6. Как показано в таблице, было установлено, что оба культуральных супернатанта содержат BSSL-энзимную активность, причем наивысшая энзимная активность наблюдалась через 72 часа индукции. Оба клона демонстрировали улучшенную экспрессию BSSL по сравнению с клонами PPF-1[pARC 5771]. These two transformed clones NN 9 and 21 GS115 [pARC 5799] were grown almost completely following the protocol described in Section 1.5. Cultural supernatants at various time periods after induction were assayed for BSSL enzyme activity as described in Section 1.6. As shown in the table, both culture supernatants were found to contain BSSL enzyme activity, with the highest enzyme activity observed after 72 hours of induction. Both clones showed improved BSSL expression compared to clones of PPF-1 [pARC 5771].

2.4. SDS-PAGE и Вестерн-блоттинг анализ культуральных супернатантов GS115 [pARC 5799] трансформантов NN 9 и 21. 2.4. SDS-PAGE and Western blot analysis of culture supernatants of GS115 [pARC 5799] transformants NN 9 and 21.

Культуральные супернатанты, собранные в различные периоды времени, как описано в Разделе 2.3, подвергали анализу SDS-PAGE и Вестерн-блоттингу. Из SDS-PAGE профиля было оценено, что около 60-75% общего белка, присутствующего в культуральных супернатантах индуцированных культур, представляет собой BSSL. Молекулярный вес такого белка составил величину около 116 кДа. Данные Вестерн-блоттинга также подтвердили, что основная часть белка, присутствующего в культуральном супернатанте, представляет собой BSSL. Такой белок, по-видимому, имеет тот же молекулярный вес, что нативная BSSL. Cultured supernatants collected at different time periods, as described in Section 2.3, were subjected to SDS-PAGE and Western blotting. From the SDS-PAGE profile, it was estimated that about 60-75% of the total protein present in the culture supernatants of the induced cultures is BSSL. The molecular weight of such a protein was about 116 kDa. Western blotting data also confirmed that the bulk of the protein present in the culture supernatant is BSSL. Such a protein appears to have the same molecular weight as native BSSL.

ПРИМЕР 3: Масштабирование BSSL экспрессии. EXAMPLE 3: Scaling of BSSL expression.

3.1. Масштабирование экспрессии BSSL из трансформированного клона GS115 [pARC 5799] (N 21). 3.1. Scaling of BSSL expression from transformed GS115 clone [pARC 5799] (N 21).

Использовали ферментер Б. Брауна емкостью 23 л. Пять литров среды, содержащей 1% YE, 2% Пептона, 1.34 YNB и 4% вес./об. глицерина обрабатывали в автоклаве при 121^oC в течение 30 минут и биотин (400 мкг/л, конечная концентрация) добавляли в ходе инокуляции после фильтрационной стерилизации. В качестве прививочного материала глицериновую массу GS115 [pARC 5799] (N 21) инокулировали в синтетическую среду, содержащую YNB (67%) плюс 2% глицерина (150 мл), и выращивание проводили в течение 36 часов при +30^oC. Применяли следующие условия ферментации: температура составляла +30^oC; pH 5.0 поддерживали с использованием 3.5 N NH₄OH и 2 N HCl; концентрация растворенного кислорода составляла 20-40% от насыщения воздуха; в качестве противопенного агента использовали полипропиленгликоль 2000.Used B. Brown fermenter with a capacity of 23 liters. Five liters of medium containing 1% YE, 2% Peptone, 1.34 YNB and 4% w / v. glycerol was autoclaved at 121 ^° C. for 30 minutes and biotin (400 μg / L, final concentration) was added during inoculation after filtration sterilization. As a grafting material, the GS115 [pARC 5799] glycerol mass (N 21) was inoculated into a synthetic medium containing YNB (67%) plus 2% glycerol (150 ml), and cultivation was carried out for 36 hours at +30 ^o C. The following were used fermentation conditions: temperature was +30 ^o C; pH 5.0 was maintained using 3.5 N NH ₄ OH and 2 N HCl; the concentration of dissolved oxygen was 20-40% of air saturation; polypropylene glycol 2000 was used as an anti-foaming agent.

За ходом роста следили через регулярные интервалы времени, определяя значение оптической плотности (OD) при длине волны 600 нм. Величина A₆₀₀ достигала максимума, равного 50-60, за 24 часа. К этому моменту протекала фаза периодического роста, о чем свидетельствовали повышенные уровни растворенного кислорода.The growth progress was monitored at regular time intervals, determining the optical density (OD) value at a wavelength of 600 nm. The value of A ₆₀₀ reached a maximum of 50-60 in 24 hours. At this point, the phase of periodic growth proceeded, as evidenced by increased levels of dissolved oxygen.

Фаза роста сразу сопровождалась фазой индукции. В ходе этой фазы загружали метанол, содержащий 12 мл/л PTM1 солей. Скорость подачи метанола составляла 6 мкл/ч в ходе первых 10-12 часов, после чего скорость постепенно повышали каждые 7-8 часов на 6 мл/ч, до максимального значения 36 мл/ч. Аммиак, используемый для регулирования pH, выполнял функции источника азота. Накопление метанола проверяли каждые 6-8 часов путем зондирования растворенного кислорода, и было установлено, что такая аккумуляция является ограниченной в ходе всей фазы индукции. Значение OD при 600 нм увеличивалось от 50-60 до 150-170 в ходе 86 часов подачи метанола. Дрожжевой экстракт и пептон добавляли каждые 24 часа до получения конечной концентрации 0.25% и 0.5% соответственно. The growth phase was immediately followed by the induction phase. During this phase, methanol containing 12 ml / L PTM1 salts was charged. The methanol feed rate was 6 μl / h during the first 10-12 hours, after which the speed was gradually increased every 6 hours to 6 ml / h, to a maximum value of 36 ml / h. The ammonia used to control the pH served as a nitrogen source. Methanol accumulation was checked every 6-8 hours by probing dissolved oxygen, and it was found that such accumulation was limited during the entire induction phase. The OD value at 600 nm increased from 50-60 to 150-170 during 86 hours of methanol supply. Yeast extract and peptone were added every 24 hours to obtain a final concentration of 0.25% and 0.5%, respectively.

Образцы отбирали через 24-часовые промежутки времени и анализировали на BSSL-энзимную активность в бесклеточном бульоне. Бульон также подвергали анализу SDS-PAGE и Вестерн-блоттингу. Samples were taken at 24-hour intervals and analyzed for BSSL enzyme activity in cell-free broth. The broth was also subjected to SDS-PAGE analysis and Western blotting.

3.2. Белковый анализ секретированной BSSL из выращенной в ферментере культуры GS115 [pARC 5799] (N 21). 3.2. Protein analysis of secreted BSSL from a GS115 culture grown in a fermenter [pARC 5799] (No. 21).

BSSL-энзимная активность в бесклеточном бульоне повышалась от 40-70 мг/л (что эквивалентно для нативного белка) к 24 часу до максимального значения 200-227.0 мг/л (что эквивалентно нативному белку) к концу 86-90 часа. SDS-PAGE анализ бесклеточного бульона показал полосу интенсивного окрашивания Кумасс голубым с мол. вес. порядка 116 кДа. Идентичность такой полосы была подтверждена Вестерн-блоттингом, осуществленным, как описано в Разделе 1.7, для нативного BSSL. BSSL enzyme activity in acellular broth increased from 40-70 mg / L (which is equivalent for a native protein) by 24 hours to a maximum value of 200-227.0 mg / L (which is equivalent to a native protein) by the end of 86-90 hours. SDS-PAGE analysis of acellular broth showed a band of intense Kumass blue staining with mol. weight. about 116 kDa. The identity of this band was confirmed by Western blotting, as described in Section 1.7, for native BSSL.

3.3. Очистка рекомбинантной BSSL, секретированной в культуральный супернатант GS115 [pARC 5799] (N 21) клонов. 3.3. Purification of recombinant BSSL secreted into the GS115 [pARC 5799] (N 21) culture supernatant of clones.

P. pastoris клон GS115 [pARC 5799] выращивали и индуцировали в ферментере, как описано в Разделе 3.1. Для очистки рекомбинантной BSSL 250 мл культурной среды (индуцированной к 90 часу) центрифугировали с силой 12.000 х г в течение 30 минут для удаления всего мелкозернистого материала. Бесклеточный культуральный супернатант ультрафильтровали в устройстве Амикон с использованием мембраны, отсекающей фракции 10 кДа. Соли и низкомолекулярные белки, а также пептиды культурального супернатанта удаляли повторным разбавлением в ходе фильтрации. Буфер, используемый для такого разбавления, представлял собой 5 мМ Барбитола при pH 7.4. После концентрирования культурального супернатанта ретентат доводили до объема 250 мл с использованием 5 мМ Барбитола, pH 7.4 и 50 мМ NaCl и загружали в Гепарин-Сефарозную колонку (объем слоя 15 мл), которую предварительно уравновешивали с помощью того же буфера. Загрузку образца осуществляли с объемной скоростью 10 мл/ч. После загрузки колонку промывали 5 мМ Барбитола, pH 7.4 и 0.1 M NaCl (200 мкл промывного буфера) до тех пор, пока поглощение при длине волны 250 нм не становилось ниже уровня детекции. BSSL элюировали 200 мл Барбитольного буфера (5 мМ, pH 7.4) и линейным градиентом NaCl в интервале 0.1 М - 0.7 М. Фракции (2.5 мл) собирали и анализировали на элюированный белок путем мониторинга поглощения при 250 нм. Фракции, содержащие белок, анализировали на BSSL-энзимную активность. Соответствующие фракции анализировали на 8.0% SDS-PAGE для проверки профиля очистки. P. pastoris clone GS115 [pARC 5799] was grown and induced in a fermenter as described in Section 3.1. To purify recombinant BSSL, 250 ml of culture medium (induced by 90 hours) was centrifuged with a force of 12,000 x g for 30 minutes to remove all the fine-grained material. The cell-free culture supernatant was ultrafiltered in an Amicon device using a 10 kDa cut-off membrane. Salts and low molecular weight proteins, as well as peptides of the culture supernatant were removed by repeated dilution during filtration. The buffer used for this dilution was 5 mM Barbitol at pH 7.4. After concentrating the culture supernatant, the retentate was adjusted to a volume of 250 ml using 5 mM Barbitol, pH 7.4 and 50 mM NaCl and loaded onto a Heparin-Sepharose column (15 ml bed volume), which was previously equilibrated with the same buffer. Sample loading was carried out with a bulk velocity of 10 ml / h. After loading, the column was washed with 5 mM Barbitol, pH 7.4 and 0.1 M NaCl (200 μl wash buffer) until the absorbance at a wavelength of 250 nm fell below the detection level. BSSL was eluted with 200 ml of Barbitol buffer (5 mM, pH 7.4) and a linear NaCl gradient in the range 0.1 M - 0.7 M. Fractions (2.5 ml) were collected and analyzed for the eluted protein by monitoring absorbance at 250 nm. Fractions containing protein were analyzed for BSSL enzyme activity. The appropriate fractions were analyzed on 8.0% SDS-PAGE to verify the purification profile.

3.4. Характеристика очищенной рекомбинантной BSSL, секретированной в культуральный супернатант GS115 [pARC 5799]. 3.4. Characterization of purified recombinant BSSL secreted into the GS115 culture supernatant [pARC 5799].

SDS-PAGE и Вестерн-блоттинг анализы фракций (описанных в Разделе 3.3), проявляющих максимальную BSSL-энзимную) активность, продемонстрировали, что рекомбинантный белок имеет чистоту примерно 90%. В соответствии с данными SDS-PAGE и Вестерн-блоттинг анализов молекулярный вес очищенного белка имел величину около 116 кДа. При перегрузке образцов для SDS-PAGE анализа полоса, соответствующая низкомолекулярному белку, может быть детектирована окрашиванием красителем Кумасс Бриллиантовым голубым, которая не проявляется при Вестерн-блоттинге. Очищенный белок подвергали N-терминальному анализу в автоматизированном белковом секвенаторе. Полученные результаты показали, что белок соответствующим образом процессирован из нативного сигнального пептида и что рекомбинантный белок имеет N-терминальную последовательность A K L G A V Y. Удельная активность очищенного рекомбинантного белка, как было установлено, аналогична активности нативного белка. Сведения о ферментативной активности в культуральных супернатантах трансформантов Pichia pastoris приведены в таблице. SDS-PAGE and Western blot analyzes of fractions (described in Section 3.3) exhibiting maximum BSSL enzyme activity) showed that the recombinant protein has a purity of about 90%. According to SDS-PAGE and Western blot analyzes, the molecular weight of the purified protein was about 116 kDa. When samples are overloaded for SDS-PAGE analysis, the band corresponding to a low molecular weight protein can be detected by staining with Kumass Brilliant Blue dye, which does not appear during Western blotting. The purified protein was subjected to N-terminal analysis in an automated protein sequencer. The results showed that the protein was appropriately processed from the native signal peptide and that the recombinant protein has an N-terminal sequence A K L G A V Y. The specific activity of the purified recombinant protein was found to be similar to that of the native protein. Information on the enzymatic activity in the culture supernatants of Pichia pastoris transformants is given in the table.

ПРИМЕР 4: Экспрессия BSSL-C в Pichia pastoris GS115. EXAMPLE 4: Expression of BSSL-C in Pichia pastoris GS115.

4.1. Конструкция pARC 5797. 4.1. Construction pARC 5797.

кДНК кодирующую последовательность для BSSL варианта BSSL-C сливали по ее 5'-окончанию с кодирующей последовательностью сигнального пептида S.cerevisiae SUC2 генного продукта (инвертаза), сохраняя целостность открытой рамки считывания, инициированной по первому ATG кодону сигнального пептида инвертазы. Такую слитую генную конструкцию вначале клонировали в S.cerevisiae экспрессионный вектор pSCW 231 (pSCW 231 представляет собой вектор экспрессии дрожжей с низким числом копий, и экспрессия осуществляется под контролем конститутивного ADH1 промотора) между свитами EcoRI и BamHI с целью создания экспрессионного вектора pARC 0788. The cDNA coding sequence for the BSSL variant of BSSL-C was fused at its 5'-end with the coding sequence of the signal signal peptide of S. cerevisiae SUC2 gene product (invertase), while maintaining the integrity of the open reading frame initiated by the first ATG codon of the signal invertase peptide. Such a fusion gene construct was first cloned into S. cerevisiae expression vector pSCW 231 (pSCW 231 is a low copy number yeast expression vector and expression is controlled by the constitutive ADH1 promoter) between EcoRI and BamHI suites to create the pARC 0788 expression vector.

кДНК слитого гена дополнительно субклонировали в P.pastoris экспрессионный вектор pDM 148 (описанный в разделе 1.2) путем высвобождения соответствующего 1.8-kb фрагмента с помощью EcoRI и BamHI переваривания pARC 0788 и субклонирования фрагмента в pDM 148 переваренную с EcoRI и BamHI. Сконструированный в результате pARC 5790 переваривали с BamHI и двухнитевой олигонуклеотидный линкер физической структуры BamHI-EcoRI-BamHI подвергали лигированию для создания сконструированной pARC 5796, главным образом, для выделения кДНК фрагмента слитого гена, следуя при этом стратегии, описанной в Разделе 2.1. The fusion gene cDNA was further subcloned into P. pastoris by the expression vector pDM 148 (described in section 1.2) by releasing the corresponding 1.8-kb fragment using EcoRI and BamHI digestion of pARC 0788 and subcloning the fragment into pDM 148 digested with EcoRI and BamHI. The resulting pARC 5790 was digested with BamHI and the BamHI-EcoRI-BamHI double-stranded oligonucleotide linker of the physical structure was ligated to create the constructed pARC 5796, mainly to isolate the cDNA fragment of the fusion gene, following the strategy described in Section 2.1.

Наконец, 1.8-kb фрагмент, содержащий систему сигнальный пептид инвертазы/BSSL-C слитый ген, высвобождали из pARC 5796 путем EcoRI переваривания и клонировали в pHIL D4 по EcoRI сайту. В результате соответствующего рестрикционного анализа был идентифицирован вектор экспрессии, содержащий вставку в надлежащей ориентации, и он был обозначен как pARC 5797 (NCIMB 40722). Finally, a 1.8-kb fragment containing the invertase signal peptide / BSSL-C fusion gene system was released from pARC 5796 by EcoRI digestion and cloned into pHIL D4 at the EcoRI site. As a result of an appropriate restriction analysis, an expression vector was identified containing the insert in the proper orientation and was designated as pARC 5797 (NCIMB 40722).

4.2. Экспрессия рекомбинантной BSSL-C из P.pastoris. 4.2. Expression of recombinant BSSL-C from P. pastoris.

Для экспрессии рекомбинантной BSSL-C из P.pastoris Р. pastoris хозяин GS115 трансформировали с pARC 5797 по способу, описанному в Разделах 1.3 и 2.2. Трансформанты проверяли на продуцирование липазы по способу, описанному в Разделах 1.4 и 2.2. Единственный трансформант (N 3) отбирали на основе высокой липаза-продуцирующей способности с помощью метода детекции при анализе липазных пластин и дополнительно анализировали на продуцирование BSSL-энзимной активности в культуральном супернатанте, следуя, по существу, способу, описанному в разделах 1.6 и 2.3. Как следует из данных, представленных в таблице, культуральный супернатант GS115 [pARC 5797] (N 3) содержал BSSL-энзимную активность, и ее количество прогрессивно увеличивалось вплоть до 72 часа после индукции. To express recombinant BSSL-C from P. pastoris P. pastoris, the GS115 host was transformed with pARC 5797 according to the method described in Sections 1.3 and 2.2. Transformants were tested for lipase production by the method described in Sections 1.4 and 2.2. A single transformant (N 3) was selected based on high lipase-producing ability using the detection method in the analysis of lipase plates and further analyzed for the production of BSSL enzyme activity in the culture supernatant, following essentially the method described in sections 1.6 and 2.3. As follows from the data presented in the table, the culture supernatant of GS115 [pARC 5797] (N 3) contained BSSL enzyme activity, and its amount progressively increased up to 72 hours after induction.

4.3. SDS-PAGE и Вестерн-блоттинг анализы культурального супернатанта GS115 [pARC 5797] трансформанта (N 3). 4.3. SDS-PAGE and Western blot analyzes of the culture supernatant of GS115 [pARC 5797] transformant (N 3).

Культуральный супернатант, собранный в различные периоды времени, как описано в Разделе 4.2, подвергали SDS-PAGE и Вестерн-блоттинг анализам в соответствии с описанным в разделах 1.7 и 2.4. Из SDS-PAGE профиля было установлено, что примерно 75-80% общего количества внеклеточного белка представляет собой BSSL. В соответствии с данными SDS-PAGE анализа молекулярный вес белка составил примерно 66 кДа. При Вестерн-блоттинге было обнаружено, что лишь две полосы (дублет) в области 66 кДа являются иммунореактивными, и эти данные подтверждают экспрессию рекомбинантной BSSL-C. The culture supernatant collected at different time periods, as described in Section 4.2, was subjected to SDS-PAGE and Western blotting assays as described in sections 1.7 and 2.4. From the SDS-PAGE profile, it was found that approximately 75-80% of the total amount of extracellular protein is BSSL. According to the SDS-PAGE analysis, the molecular weight of the protein was approximately 66 kDa. During Western blotting, it was found that only two bands (doublet) in the 66 kDa region are immunoreactive, and these data confirm the expression of recombinant BSSL-C.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ ПРИМЕР: Экспрессия BSSL в S.cerevisiae. COMPARATIVE EXAMPLE: Expression of BSSL in S. cerevisiae.

Были предприняты попытки экспрессии BSSL в Saccharomyces cerevisiae. BSSL плохо секретировалась в S. cerevisiae, и нативный сигнальный пептид функционировал неэффективно. Кроме этого, нативный сигнальный пептид не отщеплялся от зрелого белка в S.cerevisiae. Attempts have been made to express BSSL in Saccharomyces cerevisiae. BSSL was poorly secreted in S. cerevisiae, and the native signal peptide did not function effectively. In addition, the native signal peptide was not cleaved from the mature protein in S. cerevisiae.

Депонирование микроорганизмов. Deposition of microorganisms.

Следующие плазмиды, трансформированные в Pichia pastoris культуры, были депонированы в соответствии с Будапештским договором в Национальных коллекциях Промышленных и морских бактерий (NCIMB), Абердин, Шотландия, Великобритания. Дата депонирования - 2 мая 1995 г. The following plasmids transformed into Pichia pastoris cultures were deposited under the Budapest Treaty at the National Collections of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), Aberdeen, Scotland, UK. Date of deposit - May 2, 1995

Штамм [плазмида] - N по NCIMB
PPF-1[pARC 5771] - 40721
GS115[pARC 5799] - 40723
GS115[pARC 5797] - 40722
Список литературы
Abouakil, N., Rogalska, E., Bonicel, J. and Lombardo, D. (1988) Biochim. Biophys. Acta. 961, 299-308.Strain [plasmid] - N by NCIMB
PPF-1 [pARC 5771] - 40721
GS115 [pARC 5799] - 40723
GS115 [pARC 5797] - 40722
List of references
Abouakil, N., Rogalska, E., Bonicel, J. and Lombardo, D. (1988) Biochim. Biophys. Acta. 961, 299-308.

Baba, Т., Downs, D., Jackson, K.W., Tang, J. and Wang, C-S (1991) Biochemistry 30, 500-510. Baba, T., Downs, D., Jackson, K.W., Tang, J. and Wang, C-S (1991) Biochemistry 30, 500-510.

Bläckberg, L. and Hernell, O. (1981) Eur. J. Biochem. 116, 221-225. Bläckberg, L. and Hernell, O. (1981) Eur. J. Biochem. 116, 221-225.

Bläckberg,L.,Ängquist, K.A. and Hernell, O. (1987) FEBS Lett. 217, 37-41. Bläckberg, L., Ängquist, K.A. and Hernell, O. (1987) FEBS Lett. 217, 37-41.

Cregg, J.M. et al. (1987) Bio/Technology 5, 479-485. Cregg, J.M. et al. (1987) Bio / Technology 5, 479-485.

Ellis, S.B. et al. (1985) Mol. CelL Biol 5, 1111-1121. Ellis, S.B. et al. (1985) Mol. CelL Biol 5, 1111-1121.

Fredrikzon, В. , Hernell, О., Bläckberg, L. and Olivecrona, T. (1978) Pediatric Res. 12, 1048-1052. Fredrikzon, B., Hernell, O., Bläckberg, L. and Olivecrona, T. (1978) Pediatric Res. 12, 1048-1052.

Hansson, L., Bläckberg, L., Edlund, M., Lundberg, L., Strömqvist, M. and Hernell, O. (1993) J. Biol. Chem. 268, 26692-26698. Hansson, L., Bläckberg, L., Edlund, M., Lundberg, L., Strömqvist, M. and Hernell, O. (1993) J. Biol. Chem. 268, 26692-26698.

Hernell, O. and Olivecrona, T. (1974) Biochim. Biophys. Acta 369, 234-244. Hernell, O. and Olivecrona, T. (1974) Biochim. Biophys. Acta 369, 234-244.

Hernell, O. , Bläckberg, L. and Olivecrona, T. (1989) in: Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy (Lebenthal, E., ed.) 347-354, Raven Press, NY. Hernell, O., Bläckberg, L. and Olivecrona, T. (1989) in: Textbook of gastroenterology and nutrition in infancy (Lebenthal, E., ed.) 347-354, Raven Press, NY.

Hernell, O. and Bläckberg, L. (1982) Pediatric Res. 16, 882-885. Hernell, O. and Bläckberg, L. (1982) Pediatric Res. 16, 882-885.

Hui, D. Y. and Kissel, J. A. (1990) FEBS Letters 276, 131-134. Hui, D. Y. and Kissel, J. A. (1990) FEBS Letters 276, 131-134.

Kingsman, et al. (1985) Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 3, 377-416. Kingsman, et al. (1985) Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 3, 377-416.

Nilsson, J., Bläckberg, L., Carlsson, P., Enerbäck, S., Hernell, O. and Bjursell, G. (1990) Eur. J. Biochem. 192, 543-550. Nilsson, J., Bläckberg, L., Carlsson, P., Enerbäck, S., Hernell, O. and Bjursell, G. (1990) Eur. J. Biochem. 192, 543-550.

Reue, К. , Zambaux, J., Wong, H., Lee, G., Leete, T.H., Ronk, M., Shively, J. E., Sternby, B., Borgström, B., Ameis, D. and Scholtz, M.C. (1991) J. Lipid. Res. 32, 267-276. Reue, K., Zambaux, J., Wong, H., Lee, G., Leete, TH, Ronk, M., Shively, JE, Sternby, B., Borgström, B., Ameis, D. and Scholtz, MC (1991) J. Lipid. Res. 32, 267-276.

Wang, C-S, and Hartsuck, J.A. (1993) Biochim. Biphys Acta 1166, 1-19. Wang, C-S, and Hartsuck, J.A. (1993) Biochim. Biphys Acta 1166, 1-19.

Claims

1. A DNA molecule containing: (a) a region encoding a polypeptide that is a human BSSL having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, or a biologically active variant thereof, in which: amino acids 536-568 and 591-711 can be deleted, as presented in SEQ ID NO: 4, or at least one of the repeating units of 11 amino acids indicated in SEQ ID NO: 1, corresponding to amino acids 679-689, 690-700 and 701-711 in SEQ ID NO : 3, deleted, although the indicated amino acid sequence can be at least 95 % homologous to the sequence corresponding to SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4; (b) attached to the 5'-end of the specified region encoding a polypeptide, a section encoding a signal peptide that is identical or substantially similar to a peptide with the amino acid sequence shown by amino acids -20 to -1 in the sequence of SEQ ID NO: 2 in the List sequences capable of controlling the secretion of a polypeptide from Pichia pastoris cells transformed with said DNA molecule, or said signal peptide may comprise a Saccharomyces cerevisiae invertase signal peptide; and (c) operably associated with said coding regions defined in (a) and (b),
Pichia pastoris methanol oxidase promoter or functionally equivalent promoter.

2. Plasmid vector pARC 5771 (NCIMB 40721) containing the DNA molecule according to claim 1.

3. The plasmid vector according to claim 2, transformed into strain PPF-1 (NCIMB 40721) Pichia pastoris.

4. Plasmid vector pARC 5799 (NCIMB 40723) containing the DNA molecule according to claim 1.

5. The plasmid vector according to claim 4, transformed into the strain GS115 (NCIMB 40723) Pichia pastoris.

6. Plasmid vector pARC 5797 (NCIMB 40722) containing the DNA molecule according to claim 1.

7. The plasmid vector according to claim 6, transformed into a strain of GS115 (NCIMB 40722) Pichia pastoris.

8. A method of obtaining a polypeptide representing human BSSL or its biologically active variant, which consists in culturing host cells transformed with a plasmid comprising the DNA molecule according to claim 1, under the conditions when the specified polypeptide is secreted into the culture medium, and the selection of the specified polypeptide from the culture medium.