RU2157269C2

RU2157269C2 - Method for treating burn wounds

Info

Publication number: RU2157269C2
Application number: RU98110551A
Authority: RU
Inventors: И.И. Горяйнов; А.М. Гапонов; А.И. Красноухов; А.М. Чухраев; А.И. Конопля; Л.А. Князева
Original assignee: Горяйнов Игорь Иванович
Priority date: 1998-05-26
Filing date: 1998-05-26
Publication date: 2000-10-10

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves pretreating diploid embryo fibroblasts cultured outside the organism before the operation with low intensity magnetolaser radiation in infrared bandwidth being used. The exposure time is selected to be equal to 4 min. EFFECT: accelerated complete wound epithelialization process; quick arrest of local inflammation process. 3 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к трансплантологии, и может быть использовано для лечения ожоговых ран. The invention relates to medicine, namely to transplantology, and can be used to treat burn wounds.

Известен способ лечения ожоговых ран с использованием диплоидных эмбриональных фибробластов (ДЭФ) (Д. С. Саркисов с соавт., 1991 г., а. с. N 1699047). При реализации данного метода конечный результат лечения зависит от способности трансплантируемых клеток синтезировать компоненты внеклеточного матрикса с одной стороны, а с другой - от реакции раневой поверхности на трансплантируемые клетки. Очевидно, что в ряде случаев результаты лечения по данному способу труднопрогнозируемы (до 17,6% отрицательных результатов). A known method of treating burn wounds using diploid embryonic fibroblasts (DEF) (D. S. Sarkisov et al., 1991, a. S. N 1699047). When implementing this method, the final result of treatment depends on the ability of transplanted cells to synthesize extracellular matrix components on the one hand, and on the other hand, on the reaction of the wound surface to transplanted cells. Obviously, in some cases, the results of treatment by this method are difficult to predict (up to 17.6% of negative results).

Известно, что развитие и течение воспалительных реакций в значительной мере определяется гиперпродукцией провоспалительных цитокинов (ФНО, ИЛ-1, ИЛ- 6, ИЛ-8). Среди последних наибольшим провоспалительным потенциалом обладает ФНО. Поэтому разработка способов ограничения продукции данного цитокина является актуальной для оптимизации местного противовоспалительного лечения ран. Предположили, что воздействие на трансплантируемые клетки, приводящее к появлению желаемых свойств у этих клеток, будет способствовать оптимизации течения раневого процесса. Среди возможных способов обработки клеток нами предлагается использование низкоинтенсивного магнитно-лазерного облучения (МЛО). Основанием для этого послужили данные о его высокой биологической активности (А.С.Крюк, В.А.Мостовников и др., 1986; В.Е.Илларионов, 1990). It is known that the development and course of inflammatory reactions is largely determined by the overproduction of pro-inflammatory cytokines (TNF, IL-1, IL-6, IL-8). Among the latter, TNF possesses the greatest pro-inflammatory potential. Therefore, the development of methods to limit the production of this cytokine is relevant for optimizing local anti-inflammatory treatment of wounds. It was suggested that the effect on transplanted cells, leading to the appearance of the desired properties of these cells, will help optimize the course of the wound process. Among the possible methods of processing cells, we propose the use of low-intensity magnetic laser irradiation (MLO). The basis for this was data on its high biological activity (A.S. Kryuk, V.A. Mostovnikov et al., 1986; V.E. Illarionov, 1990).

Задачей изобретения является ускорение процесса заживления гранулирующих ожоговых ран. The objective of the invention is to accelerate the healing process of granulating burn wounds.

Поставленная задача достигается тем, что культивируемые вне организма диплоидные эмбриональные фибробласты, используемые для лечения ожоговых ран, перед трансплантацией подвергают низкоинтенсивному магнитно-лазерному облучению инфракрасного диапазона при экспозиции 4 мин. This object is achieved by the fact that diploid embryonic fibroblasts cultivated outside the body used to treat burn wounds are subjected to low-intensity magnetic laser irradiation of the infrared range before transplantation for 4 minutes before transplantation.

Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.

Перевиваемые линии ДЭФ получали стандартными методами ферментативной дезагрегации тканей трипсином, с последующим культивированием в питательной среде ТС 199, дополненной 10% сыворотки крупного рогатого скота, в стандартных условиях. За 24 часа до основного опыта клетки высевали в лунки 24-луночного планшета при плотности посева 2•10⁶ клеток/см² в той же питательной среде. В день основного опыта из периферической крови здоровых доноров выделяли фракцию мононуклеарных клеток (МНК) с использованием сепарирующей среды "Limphoprep". МНК трижды отмывали центрифугированием при 3000 об/мин по 10 мин, средой ТС 199 без сыворотки. После последнего центрифугирования клетки подсчитывали и ресуспендировали в среде RPMI-1640 с добавлением 5% сыворотки АВ, инактивированной нагреванием при 56^oC, 30 мин. Конечная концентрация клеток 2•10⁶ /мл.The transplanted DEF lines were obtained using standard methods of enzymatic tissue disaggregation with trypsin, followed by cultivation in TC 199 supplemented with 10% cattle serum under standard conditions. 24 hours before the main experiment, the cells were sown in the wells of a 24-well plate at a density of inoculation of 2 • 10 ⁶ cells / cm ² in the same nutrient medium. On the day of the main experiment, a fraction of mononuclear cells (MNC) was isolated from the peripheral blood of healthy donors using a Limphoprep separation medium. MNCs were washed three times by centrifugation at 3000 rpm for 10 min, using TC 199 medium without serum. After the last centrifugation, the cells were counted and resuspended in RPMI-1640 medium with the addition of 5% AB serum inactivated by heating at 56 ^° C for 30 minutes. The final cell concentration is 2 • 10 ⁶ / ml.

ДЭФ подвергали МЛО непосредственно в лунках панели, аппаратом "Узор", производства Калужского радиолампового завода, в инфракрасном диапазоне с длиной волны 0,89 мкм, с импульсным режимом излучения при частоте 150 Гц и выходной мощности не более 2 Вт. Постоянное магнитное поле использовалось одновременно с лазерным облучением, при этом магнитная насадка крепилась к излучателю и имела напряженность магнитного поля 25-35 мТл. Время облучения (экспозиция) составляло 2, 4 и 8 минут. После облучения и замены среды в лунки вносили 1 мл взвеси МНК. В качестве индуктора продукции ФНО использовали липополисахарид (ЛПС) E. coli (Calbiochem, USA) в концентрации 50 мкг/мл. Клетки культивировали 12 часов в CO₂ инкубаторе и по окончании культивирования определяли содержание ФНО в супернатанте в биологическом тесте с использованием клеток L-929.DEF was subjected to MLO directly in the panel wells, using the Uzor apparatus, manufactured by the Kaluga Radio Lamp Plant, in the infrared range with a wavelength of 0.89 μm, with a pulsed radiation mode at a frequency of 150 Hz and an output power of no more than 2 W. A constant magnetic field was used simultaneously with laser irradiation, while the magnetic nozzle was attached to the emitter and had a magnetic field strength of 25-35 mT. The exposure time (exposure) was 2, 4 and 8 minutes. After irradiation and medium replacement, 1 ml of MNC suspension was added to the wells. E. coli lipopolysaccharide (LPS) (Calbiochem, USA) at a concentration of 50 μg / ml was used as an inducer of TNF production. Cells were cultured for 12 hours in a CO ₂ incubator, and at the end of the culture, the TNF content of the supernatant was determined in a biological test using L-929 cells.

Результаты проведенных экспериментов представлены в таблице 1. The results of the experiments are presented in table 1.

Установлено, что МЛО при экспозиции 2 и 4 мин способствует ингибиции продукции ФНО в смешанной культуре ДЭФ и МНК. Предположили, что предварительное МЛО трансплантируемых на рану ДЭФ будет способствовать купированию местного воспалительного процесса и тем самым оптимизировать заживление ожоговых ран. It was found that MDR at an exposure of 2 and 4 min promotes inhibition of TNF production in the mixed culture of DEF and MNCs. It was suggested that preliminary MDR transplanted onto the wound of DEF will help to relieve the local inflammatory process and thereby optimize the healing of burn wounds.

Клиническая апробация предлагаемого метода проведена нами у 31 человека, которые составили 3 группы: 1-я традиционное лечение; 2-я с использованием необработанных ДЭФ; 3-я с использованием ДЭФ, подвергнутых МЛО в течении 4 мин, за 5-10 мин до трансплантации ДЭФ. Clinical testing of the proposed method was carried out by us in 31 people, who were 3 groups: 1st traditional treatment; 2nd using untreated DEF; 3rd using DEF subjected to MDR for 4 min, 5-10 min before DEF transplantation.

С целью стандартизировать условия проводимого исследования и избежать последствий тяжелой ожоговой травмы, затрудняющих трактовку результатов, нами отбирались больные с ожогами IIIб - IV степени, не превышающими в среднем 9,2 ± 0,9% поверхности тела. Все больные не имели тяжелой сопутствующей патологии. Трансплантация ДЭФ осуществлялась на 3-5 сутки после отхождения струпа на чистые, созревшие грануляции. На 1-3 сутки после трансплантации ДЭФ выполнялась аутодермопластика расщепленным (1:4) сетчатым кожным лоскутом с одномоментным закрытием всей площади раны. In order to standardize the conditions of the study and to avoid the consequences of a severe burn injury that complicate the interpretation of the results, we selected patients with burns of IIIb - IV degree, not exceeding on average 9.2 ± 0.9% of the body surface. All patients did not have severe comorbidity. DEF transplantation was carried out 3-5 days after the scab had left for clean, mature granulations. On 1-3 days after DEF transplantation, autodermoplasty was performed with a split (1: 4) mesh skin flap with simultaneous closure of the entire wound area.

Выраженность воспалительной реакции в ране оценивали по клеточному составу мазков-отпечатков грануляционной ткани, окрашенных гематоксилин-эозином. Мазки-отпечатки получали до трансплантации ДЭФ и непосредственно перед закрытием раны расщепленным кожным лоскутом. The severity of the inflammatory reaction in the wound was assessed by the cellular composition of smears of fingerprints of granulation tissue stained with hematoxylin-eosin. Imprint smears were obtained before transplantation of DEF and immediately before the closure of the wound with a split skin flap.

Результаты цитологического исследования представлены в таблице 2. The results of cytological studies are presented in table 2.

Из представленных данных можно видеть, что предварительное МЛО трансплантируемых ДЭФ приводит к более полному купированию воспалительного процесса в гранулирующей ожоговой ране, по сравнению с группой сравнения (группа 2). From the presented data it can be seen that the preliminary MDR of transplanted DEF leads to a more complete relief of the inflammatory process in the granulating burn wound, compared with the comparison group (group 2).

Анализ клинической эффективности предлагаемого метода включал оценку времени полной эпителизации раны и площади неприжившихся сетчатых трансплантатов аутокожи на 5-7 сутки после аутодермопластики. An analysis of the clinical effectiveness of the proposed method included an assessment of the time of complete epithelization of the wound and the area of autologous autologous skin grafts that were not taken for 5-7 days after autodermoplasty.

Результаты анализа этих показателей представлены в таблице 3. The results of the analysis of these indicators are presented in table 3.

Из таблицы видно, что в 3 группе, где использовались ДЭФ, обработанные МЛО, площадь лизировавшегося трансплантанта и время эпителизации значительно меньше. It can be seen from the table that in group 3, where DEF treated with MDR were used, the area of the lysed transplant and the epithelization time were much shorter.

Пример клинического выполнения. An example of clinical performance.

Больной П.,37 лет, история болезни N 5416, поступил в ожоговое отделение 23.02.98 г. с диагнозом термический контактный ожог IIIб-IV ст. (S-20%) грудной клетки. Больному при поступлении произведена субфасциальная некрэктомия, затем имплантация диплоидных эмбриональных фибробластов, предварительно подвергнутых магнитно-лазерному облучению в течение 4 мин. Через 1 сутки произведена кожная пластика расщепленным перфорированным (1:4) кожным лоскутом. На 4 сутки после операции ячейки перфорированного лоскута на всей площади закрылись эпителием. По цитограммам и клинически отмечено уменьшение воспалительного процесса, активизация иммунных реакций и ускорение эпителизации. Приживление лоскута 100%, реакции отторжения трансплантанта не было. Patient P., 37 years old, medical history N 5416, was admitted to the burn department 02/23/98, with a diagnosis of thermal contact burn IIIb-IV Art. (S-20%) of the chest. Upon admission, the patient underwent subfascial necrectomy, then implantation of diploid embryonic fibroblasts, previously subjected to magnetic laser irradiation for 4 minutes. After 1 day, skin plastic was made with split perforated (1: 4) skin flap. On the 4th day after the operation, the cells of the perforated flap over the entire area were closed with epithelium. According to cytograms and clinically, a decrease in the inflammatory process, activation of immune reactions and acceleration of epithelization are noted. The flap engraftment was 100%; there was no graft rejection reaction.

Таким образом, поставленная задача решена за счет купирования воспалительного процесса в ожоговой ране, что приводит к уменьшению площади лизирования кожного трансплантанта и сокращению времени полной эпителизации. Thus, the task is solved by stopping the inflammatory process in the burn wound, which leads to a decrease in the area of lysis of the skin transplant and the time of complete epithelization.

Claims

A method of treating granular burn wounds using diploid embryonic human fibroblasts cultured externally, characterized in that low-intensity magnetic laser irradiation of the infrared range is used for pre-transplantation treatment of cells at an exposure of 4 minutes