RU2148970C1 - Method for repairing skin cover - Google Patents
Method for repairing skin cover Download PDFInfo
- Publication number
- RU2148970C1 RU2148970C1 RU99104434A RU99104434A RU2148970C1 RU 2148970 C1 RU2148970 C1 RU 2148970C1 RU 99104434 A RU99104434 A RU 99104434A RU 99104434 A RU99104434 A RU 99104434A RU 2148970 C1 RU2148970 C1 RU 2148970C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- keratinocytes
- substrate
- skin
- cultured
- cultivation
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Настоящее изобретение относится к медицине, а более конкретно к хирургии, и может быть использовано для восстановления кожного покрова у пострадавших с обширными ожогами III-a и III-б степени и другими видами ран. The present invention relates to medicine, and more particularly to surgery, and can be used to restore the skin in patients with extensive burns of III-a and III-b degrees and other types of wounds.
К настоящему времени разработаны различные способы восстановления кожного покрова у обожженных путем пересадки выращенных in vitro кератиноцитов. Общими для всех известных способов являются следующие этапы: выделение из кожи кератиноцитов, культивирование их и последующая трансплантация на рану пострадавшего. Для выращивания кератиноцитов необходимо использовать ростовую среду сложного состава, в которую добавляют, помимо сыворотки, ряд ростовых добавок (эпидермальный фактор роста, холерный токсин, экстракт гипофиза крупного рогатого скота и другие добавки). Эффективность культивирования кератиноцитов повышается в случае использования фидерного слоя фибробластов, кондиционирующих ростовую среду биологически активными соединениями (см. Терских В.В., Васильева А.В. - Эпидермальные кератиноциты человека и животных. - М.: Наука, 1995, с. 103). To date, various methods have been developed to restore the skin of annealed keratinocytes grown in vitro by transplantation. The following steps are common to all known methods: the isolation of keratinocytes from the skin, their cultivation and subsequent transplantation onto the wound of the victim. For the growth of keratinocytes, it is necessary to use a growth medium of a complex composition, to which, in addition to serum, a number of growth additives are added (epidermal growth factor, cholera toxin, cattle pituitary extract and other additives). The efficiency of cultivation of keratinocytes is increased in the case of using a feeder layer of fibroblasts that condition the growth medium with biologically active compounds (see Terskikh VV, Vasilieva AV - Epidermal keratinocytes of humans and animals. - M .: Nauka, 1995, p. 103) .
Так, известен способ восстановления кожного покрова у тяжелообожженных, включающий получение кератиноцитов из биоптата кожи обожженного посредством обработки последней коллагеназой, культивирование клеток на подложке во флаконах с плоским дном. После достижения конфлюентности культуры клеток (примерно на 7-е сутки) осуществляют пересев клеток, для чего клеточный пласт обрабатывают смесью трипсина и этилендиаминтетрацетата (ЭДТА) и пересевают в новые флаконы в виде суспензии, и далее выращивают вторичную культуру кератиноцитов. На 14-е сутки, после достижения конфлюентности пассируемой культуры клеток ее подвергают воздействию раствора трипсина, что приводит к образованию суспензии из единичных клеток - кератиноцитов, которые собирают центрифугированием и затем ресуспендируют в стерильной пробирке в бессывороточной среде. Суспензию выдерживают в термостате при температуре 37,0oC с содержанием в атмосфере 5% CO2 в течение 20 минут. Затем суспензию клеток кератиноцитов наносят на раневую поверхность, сверху рану покрывают стерильным неадгезивным покрытием (см. Khalfan H., Aziz Hamza A., Saeed Tat al. - Novel method of skin substitution in plastic surgery. // Burns - 1989, v. 15, p. 335-337).Thus, there is a known method of restoring the skin of seriously burned skin, including obtaining keratinocytes from a biopsy of the skin burned by treatment with the last collagenase, culturing cells on a substrate in flat-bottomed vials. After the confluence of the cell culture is achieved (approximately on the 7th day), the cells are reseeded, for which the cell layer is treated with a mixture of trypsin and ethylenediaminetetraacetate (EDTA) and reseeded into new vials in the form of a suspension, and then a secondary keratinocyte culture is grown. On the 14th day, after the confluence of the passivated cell culture is achieved, it is exposed to trypsin solution, which leads to the formation of a suspension of single cells - keratinocytes, which are collected by centrifugation and then resuspended in a sterile tube in a serum-free medium. The suspension is kept in a thermostat at a temperature of 37.0 o C with an atmospheric content of 5% CO 2 for 20 minutes. Then, a suspension of keratinocyte cells is applied to the wound surface, on top of the wound is covered with a sterile non-adhesive coating (see Khalfan H., Aziz Hamza A., Saeed Tat al. - Novel method of skin substitution in plastic surgery. // Burns - 1989, v. 15 , p. 335-337).
Недостатком известного способа восстановления кожного покрова являются: высокая сложность и трудоемкость технологии, сравнительно низкая эффективность и высокая стоимость лечения. В связи с тем, что выращивание кератиноцитов осуществляют в культуральных флаконах с плоским дном, площадь формирующегося клеточного пласта ограничена размерами используемой посуды и для увеличения количества клеток необходимо осуществлять их пересев, в результате клетки повреждаются, жизнеспособность их снижается. Процедура выращивания и подготовки клеточной культуры к пластике ран многоэтапна и сложна, требует использования специального оборудования, больших количеств дорогостоящих реактивов, сред, сывороток и посуды. Длительность процедур выделения и выращивания кератиноцитов (10-14 суток), сложность распределения взвеси кератиноцитов по поверхности раны также ограничивает область применения известного способа. The disadvantage of this method of restoring the skin are: high complexity and complexity of the technology, relatively low efficiency and high cost of treatment. Due to the fact that the cultivation of keratinocytes is carried out in culture bottles with a flat bottom, the area of the forming cell layer is limited by the size of the dishes used and to increase the number of cells it is necessary to reseed, as a result, the cells are damaged, their viability decreases. The procedure for growing and preparing a cell culture for plastic surgery of wounds is multi-stage and complex, requires the use of special equipment, large quantities of expensive reagents, media, serums and dishes. The duration of the procedures for the isolation and cultivation of keratinocytes (10-14 days), the complexity of the distribution of suspended keratinocytes over the surface of the wound also limits the scope of the known method.
Известен способ восстановления кожного покрова, включающий выращивание в искусственных условиях многослойных пластов кератиноцитов на поверхности культурального флакона, при этом для клеточного пласта ростовую среду добавляют в фермент диплазу и пересадку клеточной культуры на раневую поверхность осуществляют на поверхности парафинизированной марли (см. Green H., Kehinde O. , Thomas J. - Growth of cultured human epidermal cells into multiple epitelia suitable for grafting. // Proc. Nat. Acad. Sci. US. - 1979. - Vol. 76. - P. 5665-5668). A known method of restoring the skin, including the cultivation under artificial conditions of multilayer layers of keratinocytes on the surface of the culture bottle, while for the cell layer the growth medium is added to the enzyme diplase and transplantation of the cell culture on the wound surface is carried out on the surface of paraffinized gauze (see Green H., Kehinde O., Thomas J. - Growth of cultured human epidermal cells into multiple epitelia suitable for grafting. // Proc. Nat. Acad. Sci. US. - 1979. - Vol. 76. - P. 5665-5668).
Известному способу восстановления кожного покрова присущи серьезные недостатки. Он весьма сложен в осуществлении, так как состоит из большого числа этапов. На первом из них осуществляют подготовку фидерного слоя фибробластов линии 3Т3, выделяющих ряд биологически активных веществ в среду, с последующим их облучением радиацией или обработкой митомицином. Поверх слоя фибробластов засевают кератиноциты, которые периодически пересевают через каждые 5-7 дней. На каждом этапе выращивания возможно инфицирование клеточной культуры микроорганизмами. Известный способ отличает и его высокая стоимость, которая складывается из затрат на большое количество одноразовой культуральной посуды, изготавливаемой из специальных видов пластика, а также из стоимости сред, сыворотки, ростовых факторов, ферментов. Известный способ не позволяет быстро восстанавливать кожный покров на больших площадях, культивирование клеток обычно занимает 3-4 недели. Пласт, пригодный для трансплантации, должен содержать не менее 8-12 слоев клеток, необходимо добиваться "синхронизации" работы хирургов и биологов, т.е. к моменту пересадки должны быть подготовлены раны и клеточные пласты. Эффективность пересадки "недозрелых" и "переросших" пластов низкая. В случае недостаточной подготовки раны к пластике приживление вообще не наступает. Другим недостатком известного способа является то, что в процессе открепления пласта от поверхности культурального флакона, происходящего под действием фермента диспазы, происходит повреждение клеточных связей ("десмосом"), а также самих клеток, преимущественно базального слоя. Следует отметить также техническую сложность процедуры закрепления многослойного пласта клеток на поверхности парафинированной марли, при которой нередко происходит повреждение клеточного пласта, его разрыв и неполное снятие, что в конечном итоге также ведет к снижению эффективности трансплантации. The known method of restoring the skin is characterized by serious disadvantages. It is very difficult to implement, as it consists of a large number of stages. At the first of them, the feeder layer of 3T3 line fibroblasts is prepared, which release a number of biologically active substances into the medium, followed by their irradiation with radiation or mitomycin treatment. On top of the fibroblast layer, keratinocytes are seeded, which are periodically reseeded every 5-7 days. At each stage of cultivation, infection of the cell culture with microorganisms is possible. The known method is distinguished by its high cost, which consists of the cost of a large number of disposable culture dishes made from special types of plastic, as well as the cost of media, serum, growth factors, enzymes. The known method does not allow to quickly restore the skin over large areas, the cultivation of cells usually takes 3-4 weeks. A layer suitable for transplantation should contain at least 8-12 layers of cells; it is necessary to achieve "synchronization" of the work of surgeons and biologists, i.e. wounds and cell layers should be prepared at the time of transplantation. The efficiency of transplantation of "unripe" and "overgrown" layers is low. In case of insufficient preparation of the wound for plastic, engraftment does not occur at all. Another disadvantage of the known method is that in the process of detachment of the formation from the surface of the culture bottle, which occurs under the action of the enzyme dispase, damage to cellular bonds ("desmosomes"), as well as the cells themselves, mainly the basal layer. It should also be noted the technical complexity of the procedure of fixing a multilayer cell layer on the surface of a waxed gauze, in which damage to the cell layer often occurs, its rupture and incomplete removal, which ultimately also reduces the efficiency of transplantation.
Известен способ постановления кожного покрова у тяжелообожженных, включающий выделение и культивирование кератиноцитов на коллагеновых микроносителях в течение 1-7 дней, после чего суспензию микроносителей с прикрепленными к ним кератиноцитами наносят на раневую поверхность (см. патент РФ N 2010028 по кл. C 12 N 5/00, опубликован 30.04.94 г.). There is a method of setting the skin of heavily burnt skin, including the isolation and cultivation of keratinocytes on collagen microcarriers for 1-7 days, after which a suspension of microcarriers with attached keratinocytes is applied to the wound surface (see RF patent N 2010028 according to class C 12 N 5 / 00, published on April 30, 94).
Известный способ позволяет повысить эффективность культивирования кератиноцитов, однако для его реализации специальное оборудование (роллерные и другие биотехнические системы) и определенные виды микроносителей типа "Цитолар" или "Цитопол". Кроме того, при трансплантации выращенных кератиноцитов трудно достичь равномерного распределения микроносителей с прикрепленными к их поверхности клетками по раневой поверхности. The known method allows to increase the efficiency of keratinocyte cultivation, however, for its implementation, special equipment (roller and other biotechnological systems) and certain types of microcarriers of the type "Cytolar" or "Cytopol". In addition, during transplantation of grown keratinocytes, it is difficult to achieve a uniform distribution of microcarriers with cells attached to their surface over the wound surface.
Известен способ восстановления кожного покрова, включающий получение так называемого "дермального эквивалента", представляющего собой коллагеновый гель с включенными в его состав живыми фибробластами, на поверхности которого выращивают кератиноциты и затем такой "живой эквивалент кожи" пересаживают на раневую поверхность (см. Bell E., Sher S., Hull B. et al. - The reconstitution of living skin // J. Invest. Dermatol. - 1983. - Vol. 81, N 1. - supp. - P. 2 - 10). A known method of restoring the skin, including obtaining the so-called "dermal equivalent", which is a collagen gel with live fibroblasts included in its composition, on the surface of which keratinocytes are grown and then such a "living skin equivalent" is transplanted onto the wound surface (see Bell E. , Sher S., Hull B. et al. - The reconstitution of living skin // J. Invest. Dermatol. - 1983. - Vol. 81, N 1. - supp. - P. 2-10).
Известный способ восстановления кожного покрова путем пересадки "живого эквивалента кожи" является наиболее сложным и многоэтапным, к тому же при получении "дермального эквивалента" в результате функционирования фибробластов его площадь значительно уменьшается (иногда в 5 раз), что не позволяет получать большие по площади клеточные трансплантаты. В результате известный способ имеет ограниченное применение. The known method of restoring the skin by transplanting the "living skin equivalent" is the most complex and multi-stage, in addition, when receiving the "dermal equivalent" as a result of the functioning of fibroblasts, its area is significantly reduced (sometimes by 5 times), which does not allow to obtain large-area cellular transplants. As a result, the known method has limited application.
Наиболее близким по совокупности существенных признаков к заявляемому техническому решению является способ восстановления кожного покрова, принятый за прототип, включающий выделение кератиноцитов, селективное формирование межклеточного матрикса, а затем культивирование кератиноцитов на полимерной пористой подложке в виде пластины толщиной 4-6 мм с размерами пор 10 - 30 мкм с последующей пересадкой находящейся на пористой пластине выросшей клеточной культуры кератиноцитов на раневую поверхность наложением пластины в положении клеток, обращенных в раневой поверхности (см. патент РФ N 2014359 по кл. C 12 N 5/00, опубликован 15.06.94 г.). The closest set of essential features to the claimed technical solution is the method of restoring the skin, adopted as a prototype, including the isolation of keratinocytes, the selective formation of the intercellular matrix, and then the cultivation of keratinocytes on a polymer porous substrate in the form of a plate 4-6 mm thick with pore sizes of 10 - 30 μm, followed by transplantation of the grown keratinocyte cell culture located on the porous plate onto the wound surface by applying the plate in the position of the cells, facing the wound surface (see RF patent N 2014359 according to class C 12 N 5/00, published June 15, 94).
Известный способ-прототип позволяет стимулировать пролиферацию, миграцию и функционирование кератиноцитов, при этом пористая структура полимерной пластины позволяет включать и длительно удерживать в порах растворы разнообразных цитокинов. The known prototype method allows to stimulate the proliferation, migration and functioning of keratinocytes, while the porous structure of the polymer plate allows you to include and for a long time to keep in the pores solutions of various cytokines.
Однако известному способу-прототипу присущи и серьезные недостатки. Известный способ-прототип являются сложным и многоэтапным, а следовательно, и длительным, так как предусматривает предварительное формирование на полимерной пластине биооактивной поверхности из межклеточного матрикса. В случае неплоской раневой поверхности невозможно обеспечить плотное прилегание к ней всей поверхности пластины со слоем кератиноцитов, в результате чего не обеспечивается равномерное распределение клеток по раневой поверхности. Из-за непрозрачности пористой полимерной пластины отсутствует возможность визуального контроля за состоянием раны. Все это снижает эффективность применения способа-прототипа. However, the known prototype method is inherent and serious disadvantages. The known prototype method is complex and multi-stage, and therefore, lengthy, as it involves the preliminary formation on a polymer plate of a bioactive surface from an intercellular matrix. In the case of a non-planar wound surface, it is impossible to ensure a tight fit of the entire surface of the plate to it with a layer of keratinocytes, as a result of which the uniform distribution of cells along the wound surface is not ensured. Due to the opacity of the porous polymer plate, it is not possible to visually monitor the condition of the wound. All this reduces the effectiveness of the prototype method.
Задачей заявляемого изобретения являлась разработка такого способа восстановления кожного покрова, который был бы более простым по выполнению, обеспечивал повышение эффективности лечения при одновременном снижении стоимости его осуществления, а также позволял осуществлять визуальный контроль за регенерацией кожного покрова на раневой поверхности. The objective of the invention was the development of such a method of restoring the skin, which would be simpler to implement, provide increased treatment efficiency while reducing the cost of its implementation, and also allows visual monitoring of the regeneration of the skin on the wound surface.
Поставленная задача решается тем, что в способе восстановления кожного покрова, включающем выделение и культивирование кератиноцитов на полимерной пористой подложке с последующей пересадкой их на раневую поверхность, кератиноциты культивируют на подложке из оптически прозрачного полимера со сквозными порами диаметром D, равным (0,01 - 3,0) мкм, и плотностью пор N, равной (103-109)1/см2, до формирования монослоя кератиноцитов. Кератиноциты можно культивировать в присутствии фибробластов линии 3Т3, размещенных на противоположной стороне подложки. Подложка может быть выполнена из полиэтилентерефталата, полиимида, карбоксиметилцеллюлозы и других подобных по своим физико-механическим, а также биоафинным свойствам химически инертных полимерных материалов. Указанные выше подложки обеспечивают высокую степень адгезии клеток к их поверхности и способствуют их дальнейшей пролиферации. При этом подложка имеет одинаковый электростатический заряд обеих ее поверхностей. Размеры в количестве сквозных пор (диаметр D от 0,01 мкм до 3,0 мкм, плотность распределения пор N от 103 1/см2 до 109 1/см2) делают возможным проникновение водорастворимых веществ через подложку, в то же время клетки через такие поры не проникают. Подложка может иметь толщину от 3 до 100 мкм. Подложка толщиной менее 3 мкм имеет недостаточную механическую прочность. Использовать подложку толщиной более 100 мкм нецелесообразно из-за недостаточной эластичности подложки. Разделение кератиноцитов и фибробластов полимерной пористой подложкой, через которую диффундируют продуцируемые фибробластами компоненты внеклеточного матрикса и цитокины, необходимые для стимуляции роста кератиноцитов, делают возможным не облучать фибробласты радиацией (сублетально) или не обрабатывать их митомицином.The problem is solved in that in a method of restoring the skin, including the isolation and cultivation of keratinocytes on a porous polymer substrate, followed by their transplantation onto a wound surface, keratinocytes are cultured on a substrate of optically transparent polymer with through pores with a diameter D of (0.01 - 3 , 0) μm, and pore density N equal to (10 3 -10 9 ) 1 / cm 2 until the keratinocyte monolayer is formed. Keratinocytes can be cultured in the presence of 3T3 line fibroblasts located on the opposite side of the substrate. The substrate can be made of polyethylene terephthalate, polyimide, carboxymethyl cellulose and others similar in their physicomechanical as well as bioaffin properties of chemically inert polymeric materials. The above substrates provide a high degree of adhesion of cells to their surface and contribute to their further proliferation. In this case, the substrate has the same electrostatic charge on both of its surfaces. The dimensions in the number of through pores (diameter D from 0.01 μm to 3.0 μm, pore density N from 10 3 1 / cm 2 to 10 9 1 / cm 2 ) make it possible for water-soluble substances to penetrate through the substrate, at the same time cells through such pores do not penetrate. The substrate may have a thickness of 3 to 100 μm. The substrate with a thickness of less than 3 μm has insufficient mechanical strength. Using a substrate with a thickness of more than 100 μm is impractical due to insufficient elasticity of the substrate. The separation of keratinocytes and fibroblasts with a polymeric porous substrate, through which the components of the extracellular matrix and cytokines produced by fibroblasts diffuse, which are necessary to stimulate the growth of keratinocytes, makes it possible not to irradiate fibroblasts with radiation (sublethally) or not to treat them with mitomycin.
Авторам из научно-технической, в том числе патентной литературы не известна совокупность признаков заявляемого технического решения, что, по мнению авторов, свидетельствует о соответствии заявляемого способа критерию "новизна". The authors of the scientific and technical, including patent literature, do not know the totality of the features of the claimed technical solution, which, according to the authors, indicates the conformity of the proposed method to the criterion of "novelty."
Отличительные признаки заявляемого технического решения обеспечивают достижение нового технического результата - повышение эффективности способа восстановления кожного покрова и существенное снижение стоимости при одновременной возможности визуального контроля за регенерацией тканей, что соответствует критерию "изобретательский уровень". Distinctive features of the proposed technical solution ensure the achievement of a new technical result - increasing the efficiency of the method of restoration of the skin and a significant reduction in cost while at the same time being able to visually monitor tissue regeneration, which meets the criterion of "inventive step".
Заявляемый способ восстановления кожного покрова осуществляют следующим образом. The inventive method of restoring the skin is as follows.
На первом этапе отбирают и транспортируют кусочки кожи для последующего культивирования кератиноцитов. Аутологичные кератиноциты выделяют из кусочков интактной кожи. Аллогенные кератиноциты получают из кожи здоровых доноров (во время косметических операций) или плодов после осуществления по медицинским показаниям операции аборт. Культивирование клеток проводят только при условии отрицательных анализов на вирус СПИДа, герпеса, гепатита, реакции Вассермана и других трансмиссивных заболеваний. Кусочки кожи для выращивания клеток срезают в стерильных условиях различными способами (скальпелем, дерматомом, ножом Тирша или другим способом) под общей или местной анестезией. Жизнеспособность выделяемых из кусочков кожи кератиноцитов в определенной мере зависит от толщины срезаемых лоскутов кожи. Это связано с необходимостью проведения их ферментной обработки. При отборе кожных лоскутов для выращивания клеток кератиноцитов следует стремиться срезать кожные лоскуты толщиной не более 0,2-0,3 мм. Биоптаты кожи лучше всего отбирать в первые часы после травмы или непосредственно после выхода пострадавшего из состояния ожогового шока. После срезания кожные лоскуты помещают в ростовую среду (Игла, 199 или другую) и в охлажденном состоянии (при температуре не выше +4oC) доставляют в лабораторию. На следующем этапе осуществляют выделение клеток по одному из известных вариантов для последующего их культивирования. Приведем один из известных вариантов выделения клеток. Кожу промывают в солевом растворе Хенкса, содержащем 200 U/мл гентамицина, разрезают на мелкие кусочки площадью 0,2-0,5 см2. Кусочки кожи инкубируют в 0,5%-ном растворе диспазы (или смеси 0,5%-ного раствора диспазы с 0,2%-ным раствором коллагеназы), в сбалансированном солевом фосфатно-буферном растворе при температуре от 0oC до +4oC в течение 12-18 часов. Затем кусочки кожи переносят в фосфатный солевой буферный раствор Дульбекко и с помощью пинцета отделяют эпидермис от дермы. Эпидермис инкубируют в 0,125%-ном растворе трипсина в течение 10-15 минут при перемешивании со скоростью 50 об/мин, после чего действие ферментов останавливают добавлением 5%-ной эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Полученную суспензию клеток фильтруют через нейлоновую марлю и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 минут. Затем полученную взвесь клеток высевают на чашки Петри, на дно которых помещают предварительно простерилизованные (обработкой в автоклаве, кипячением или другим известным способом) полимерные пористые подложки. Культивирование кератиноцитов проводят на полимерной пористой подложке толщиной от 3 до 100 мкм с диаметром пор D от 0,01 мкм до 3,0 мкм и плотностью распределения пор N от 103 1/см до 109 1/см, которую получают по известной технологии изготовления ядерных мембран - облучением пленки высокоэнергетичными тяжелыми ионами (азота, кислорода, неона, аргона, криптона, ксенона), последующим облучением ультрафиолетовым излучением и химическим травлением в водном растворе гидроокиси натрия. Так, при облучении полиэтилентерефталатной пленки толщиной 10 мкм ионами семизарядного аргона, ускоренными до энергий 43 МэВ, последующим облучением в течение 40 минут ультрафиолетовым излучением и химическим травлением в 3,5 N водном растворе NaOH при температуре 75oC в течение 4 минут получают прозрачную подложку со сквозными цилиндрическими порами диаметром D=0,5 мкм и плотностью пор N = 107 1/см2. Культивирование в зависимости от используемой ростовой среды и добавок можно проводить по ряду известных вариантов. Например, один из них осуществляют следующим образом. Для выращивания клеток используют ростовую среду FAD, состоящую из смеси сред DMEM и F12 в соотношении 3:1, с добавлением 10%-ной эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 50 мкг/мл инсулина (Sigma), 0,4 - 0,5 мкг/мл гидрокортизона гемисукцината (Sigma), аденина - 1,8•104М, трансферрина - 51 мкг/мл, лиотиронина - 2•10-10 М, холерного токсина - 10-10 М, эпидермального фактора роста (ЭФР) - 10 нг/мл. При этом культивирование кератиноцитов могут осуществлять как в присутствии фидерного слоя фибробластов 3Т3, так и без него. Чашки Петри размещают в термостате-инкубаторе при 37oC в атмосфере углекислоты (до 5%). Смену среды производят через каждые 48 часов. Интенсивность пролиферации клеточной культуры контролируют с помощью инвертированного микроскопа. Выращивание кератиноцитов на подложке и подготовку раны к пластике осуществляют параллельно. Подготовку ран к пластике осуществляют разными способами:
- выполнением радикальных и послойных (тангенциальных) некрэктомий;
- посредством проведения местного консервативного лечения с использованием растворов антисептиков и многокомпонентных мазей на водорастворимой основе ("Левосин", "Левомеколь", "Диоксидиновая" мазь и другие).At the first stage, pieces of skin are selected and transported for subsequent cultivation of keratinocytes. Autologous keratinocytes are isolated from pieces of intact skin. Allogeneic keratinocytes are obtained from the skin of healthy donors (during cosmetic surgeries) or fetuses after an abortion is performed on medical grounds. Cell cultivation is carried out only under the condition of negative tests for the AIDS virus, herpes, hepatitis, Wasserman reaction and other vector-borne diseases. Pieces of skin for growing cells are cut under sterile conditions in various ways (with a scalpel, dermatome, Tirsch knife or other method) under general or local anesthesia. The viability of keratinocytes secreted from pieces of skin to a certain extent depends on the thickness of the cut flaps of the skin. This is due to the need for their enzymatic processing. When selecting skin flaps for growing keratinocyte cells, one should strive to cut off the skin flaps with a thickness of not more than 0.2-0.3 mm. Skin biopsy samples are best taken in the first hours after an injury or immediately after the victim leaves the state of burn shock. After cutting, the skin flaps are placed in a growth medium (Needle, 199 or another) and in a cooled state (at a temperature not exceeding + 4 o C) delivered to the laboratory. The next step is the selection of cells according to one of the known options for their subsequent cultivation. Here is one of the known cell isolation options. The skin is washed in Hanks saline solution containing 200 U / ml gentamicin, cut into small pieces with an area of 0.2-0.5 cm 2 . Pieces of skin are incubated in a 0.5% dispase solution (or a mixture of a 0.5% dispase solution with a 0.2% collagenase solution), in a balanced saline phosphate-buffered solution at a temperature from 0 o C to +4 o C for 12-18 hours. Then the skin pieces are transferred to Dulbecco's phosphate buffered saline and the epidermis is separated from the dermis with tweezers. The epidermis is incubated in a 0.125% trypsin solution for 10-15 minutes with stirring at a speed of 50 rpm, after which the action of the enzymes is stopped by the addition of 5% cattle fetal serum. The resulting cell suspension is filtered through nylon gauze and centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. Then, the obtained suspension of cells is plated on Petri dishes, on the bottom of which are placed pre-sterilized (by autoclaving, boiling or other known method) polymer porous substrates. The cultivation of keratinocytes is carried out on a polymeric porous substrate with a thickness of 3 to 100 μm with a pore diameter D of 0.01 μm to 3.0 μm and a pore density N of 10 3 1 / cm to 10 9 1 / cm, which is obtained by known technology manufacturing of nuclear membranes - by irradiating the film with high-energy heavy ions (nitrogen, oxygen, neon, argon, krypton, xenon), subsequent irradiation with ultraviolet radiation and chemical etching in an aqueous solution of sodium hydroxide. Thus, by irradiating a polyethylene terephthalate film 10 μm thick with seven-charged argon ions accelerated to energies of 43 MeV, followed by irradiation for 40 minutes with ultraviolet radiation and chemical etching in a 3.5 N aqueous NaOH solution at a temperature of 75 o C for 4 minutes, a transparent substrate is obtained with through cylindrical pores with a diameter of D = 0.5 μm and a pore density of N = 107 1 / cm 2 . Cultivation depending on the growth medium used and additives can be carried out according to a number of known options. For example, one of them is as follows. For cell growth, FAD growth medium is used, consisting of a mixture of DMEM and F12 media in a ratio of 3: 1, with the addition of 10% fetal bovine serum, 50 μg / ml insulin (Sigma), 0.4 - 0.5 μg / ml of hydrocortisone hemisuccinate (Sigma), adenine - 1.8 • 10 4 M, transferrin - 51 μg / ml, lyothyronine - 2 • 10 -10 M, cholera toxin - 10 -10 M, epidermal growth factor (EGF) - 10 ng / ml In this case, the cultivation of keratinocytes can be carried out both in the presence of a feeder layer of 3T3 fibroblasts and without it. Petri dishes are placed in a thermostat-incubator at 37 o C in an atmosphere of carbon dioxide (up to 5%). A change of medium is performed every 48 hours. The proliferation rate of the cell culture is monitored using an inverted microscope. The cultivation of keratinocytes on the substrate and preparation of the wound for plastic is carried out in parallel. Preparing wounds for plastic surgery is carried out in various ways:
- performing radical and layered (tangential) necrectomies;
- through local conservative treatment using solutions of antiseptics and multicomponent ointments on a water-soluble basis (Levosin, Levomekol, Dioxidine ointment and others).
Критериями готовности ран к пересадке является отсутствие экссудации, кровоточивости, гноя, наличие красных мелкозернистых грануляций, наличие краевой эпителизации. The criteria for the readiness of wounds for transplantation are the absence of exudation, bleeding, pus, the presence of red fine-grained granulations, and the presence of marginal epithelization.
Следует стремиться к тому, чтобы готовность раны к пластике и клеточной культуры к пересадке совпали во времени между собой. It should strive to ensure that the readiness of the wound for plastic and cell culture for transplantation coincide in time with each other.
Выращенный на подложке монослой кератиноцитов пересаживают на различные виды ран. Раневая поверхность должна быть хорошо васкуляризирована. Подложку поворачивают к раневой поверхности стороной, на которой находится монослой кератиноцитов, и накладывают на рану. Поверх пленки накладывают сухие марлевые повязки, которые меняют по мере необходимости. После заживления раны подложку удаляют. A monolayer of keratinocytes grown on a substrate is transplanted into various types of wounds. The wound surface should be well vascularized. The substrate is turned to the wound surface with the side on which the keratinocyte monolayer is located, and applied to the wound. Dry gauze dressings are applied over the film, which are changed as necessary. After wound healing, the substrate is removed.
Пример 1. Больная Ч., 1938 г.р., история болезни N 99827, поступила в ожоговый центр ГНИИ скорой помощи им. Ю.Ю. Джанелидзе 25.05.1998 г. Диагноз: химический ожог II-IIIа 8% нижних конечностей. Проводилось местное консервативное лечение, направленное на очищение ран от омертвевших тканей, снятие воспалительных явлений, профилактику развития инфекционных осложнений. 03.06.1998 г. на раны в области колен и голеней пересажено 320 см2 аллогенных кератиноцитов, культивированных в виде монослоя на подложке из полиэтилентерефталата толщиной 10 мкм со сквозными порами диаметром D = 0,5 мкм и плотностью пор N = 107 1/см2 Поверх подложки были наложены сухие марлевые повязки. 10.06.1998 г. подложку удалили. Приживление клеточной культуры составило 100%. На участках, где осуществляли пересадку, имелся восстановленный кожный покров.Example 1. Patient Ch., Born in 1938, medical history N 99827, was admitted to the burn center of the GNII them. Yu.Yu. Janelidze 05/25/1998, the Diagnosis: chemical burn II-IIIa 8% of the lower extremities. Local conservative treatment was carried out, aimed at cleansing the wounds from dead tissue, removing inflammatory phenomena, and preventing the development of infectious complications. 06/03/1998, 320 cm 2 allogeneic keratinocytes cultured as a monolayer on a substrate of 10 μm thick polyethylene terephthalate with through pores with a diameter of D = 0.5 μm and a pore density of N = 10 7 1 / cm were transplanted onto wounds in the area of the knees and lower legs. 2 Dry gauze dressings were applied over the substrate. 06/10/1998, the substrate was removed. Cell culture engraftment was 100%. In the areas where the transplant was carried out, there was a restored skin cover.
На контрольных участках, где лечение проводилось с использованием мазей, заживление ран завершилось на 10-12 дней позднее. In the control areas where the treatment was carried out using ointments, wound healing was completed 10-12 days later.
Пример 2. Больной П. , 1974 г.р., история болезни N 30257, поступил в клинику термических поражений Военно-медицинской академии 23.03.1998 г. с диагнозом: ожог пламенем II-IIIб 8% (2%) спины и бедер. Проводилось местное консервативное лечение, антибактериальная терапия, физиотерапевтическое лечение. 10.04.1998 г. на раны площадью 320 см2 в области ягодиц, имеющие "мозаичный характер" (чередование участков ожога III-а и III-б степени), трансплантировали культуру аллогенных кератиноцитов, выращенных на поверхности подложки из полиэтилентерефталата толщиной 50 мкм со сквозными порами диаметром D = 0,1 мкм и плотностью пор N = 108 1/см2. Поверх подложки были наложены сухие марлевые повязки. 14.04.1998 г. осуществили смену марлевых повязок, небольшие участки пленки (S=25 см2), где скопился экссудат, были удалены. 18.04.1998 г. во время перевязки удалили подложку, под которой отмечено наличие тонкой пленки вновь образованного эпителия. Местами пересаженная клеточная культура не прижилась, вместе с тем в этих участках отмечено развитие процесса краевой эпителизации. Приживление клеточной культуры составило около 80% от пересаженной на поверхности подложки.Example 2. Patient P., born in 1974, medical history N 30257, was admitted to the clinic of thermal lesions of the Military Medical Academy on 03/23/1998 with a diagnosis of a burn burn II-IIIb 8% (2%) of the back and hips. Local conservative treatment, antibiotic therapy, and physiotherapy were carried out. 04/10/1998, on wounds with an area of 320 cm 2 in the buttock region, having a "mosaic character" (alternating burn sections of III-a and III-b degrees), a culture of allogeneic keratinocytes grown on a surface of a substrate of 50 μm thick with translucent was transplanted pores with a diameter of D = 0.1 μm and a pore density of N = 10 8 1 / cm 2 . Dry gauze dressings were applied over the substrate. On April 14, 1998, gauze dressings were changed; small sections of the film (S = 25 cm 2 ) where exudate accumulated were removed. 04/18/1998, during the ligation, the substrate was removed, under which the presence of a thin film of the newly formed epithelium was noted. In some places, the transplanted cell culture did not take root, however, in these areas, the development of the process of regional epithelization was noted. The cell culture engraftment was about 80% of the substrate transplanted on the surface.
Claims (6)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99104434A RU2148970C1 (en) | 1999-02-26 | 1999-02-26 | Method for repairing skin cover |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99104434A RU2148970C1 (en) | 1999-02-26 | 1999-02-26 | Method for repairing skin cover |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2148970C1 true RU2148970C1 (en) | 2000-05-20 |
Family
ID=20216722
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU99104434A RU2148970C1 (en) | 1999-02-26 | 1999-02-26 | Method for repairing skin cover |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2148970C1 (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013163512A1 (en) * | 2012-04-26 | 2013-10-31 | The General Hospital Corporation | Agents and methods for treating and preventing seborrheic keratosis |
| RU2530614C2 (en) * | 2012-05-04 | 2014-10-10 | Владимир Петрович Швецов | Biologically active complex for organogenesis and product of secretion of cells contained therein |
| RU2658707C1 (en) * | 2016-12-28 | 2018-06-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Method of skin recovery |
| US10508309B2 (en) | 2013-05-17 | 2019-12-17 | The General Hospital Corporation | Methods for detecting and treating variants of seborrheic keratoses |
| RU2717312C1 (en) * | 2019-09-09 | 2020-03-20 | Борис Алексеевич Парамонов | Porous base for dressing means |
-
1999
- 1999-02-26 RU RU99104434A patent/RU2148970C1/en active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| RU 94046192 10.10.96. * |
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013163512A1 (en) * | 2012-04-26 | 2013-10-31 | The General Hospital Corporation | Agents and methods for treating and preventing seborrheic keratosis |
| US9458462B2 (en) | 2012-04-26 | 2016-10-04 | The General Hospital Corporation | Agents and methods for treating and preventing seborrheic keratosis |
| US9658210B2 (en) | 2012-04-26 | 2017-05-23 | The General Hospital Corporation | Agents and methods for treating and preventing seborrheic keratosis |
| US10443038B2 (en) | 2012-04-26 | 2019-10-15 | The General Hospital Corporation | Agents and methods for treating and preventing seborrheic keratosis |
| US10822586B2 (en) | 2012-04-26 | 2020-11-03 | The General Hospital Corporation | Agents and methods for treating and preventing seborrheic keratosis |
| RU2530614C2 (en) * | 2012-05-04 | 2014-10-10 | Владимир Петрович Швецов | Biologically active complex for organogenesis and product of secretion of cells contained therein |
| US10508309B2 (en) | 2013-05-17 | 2019-12-17 | The General Hospital Corporation | Methods for detecting and treating variants of seborrheic keratoses |
| RU2658707C1 (en) * | 2016-12-28 | 2018-06-22 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова" (МГУ) | Method of skin recovery |
| RU2717312C1 (en) * | 2019-09-09 | 2020-03-20 | Борис Алексеевич Парамонов | Porous base for dressing means |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6043089A (en) | Skin culture and process for preparing the same | |
| US5015584A (en) | Epidermal graft system | |
| US6916655B2 (en) | Cultured skin and method of manufacturing the same | |
| US7741116B2 (en) | Surgical device for skin therapy or testing | |
| JP3311351B2 (en) | Novel keratinocyte cultures, their preparation and their use as wound healing substances | |
| KR101019916B1 (en) | Keratinocytes which may be used as biologically active substances for the treatment of wounds | |
| CN101954124B (en) | Tissue engineered skin with basilar membrane and construction method thereof | |
| JPH02174848A (en) | Cuticle sheet;and production, storage and usage thereof | |
| JPH05504497A (en) | cell culture products | |
| EP1115432B1 (en) | Dermal scaffold using neutralized chitosan sponge or neutralized chitosan/collagen mixed sponge | |
| AU760470B2 (en) | A living chimeric skin replacement | |
| CN107254431B (en) | Novel tissue engineering skin preparation method | |
| JPH0947503A (en) | Base material for cultivated skin, cultivated skin, and method of making it | |
| RU2148970C1 (en) | Method for repairing skin cover | |
| CN111518743A (en) | Method for constructing human dermal fibroblast in-vitro thermal injury model and application thereof | |
| CN115627256B (en) | Multi-layer tissue engineering skin composed of hair follicle cells and preparation method and application thereof | |
| US6585969B1 (en) | Non-viable keratinocyte cell composition or lysate for promoting wound healing | |
| JP2009225675A (en) | Feeder cell derived from same kind of skin for preparing epithelial cell sheet | |
| Hakim et al. | Use of biodegradable mesh as a transport for a cultured uroepithelial graft an improved method using collagen gel | |
| CN110302426B (en) | Stem cell skin adhesive sheet and preparation method and application thereof | |
| RU2195889C2 (en) | Method for dermabrasion | |
| RU2010028C1 (en) | Method of skin integument regeneration in critically burnt patients | |
| EP0013394A2 (en) | Process for growing human epidermal cells in tissue culture | |
| Boschi et al. | Cutaneous tissue engineering and lower extremity wounds (part 1) | |
| CN114657122A (en) | Nano polypeptide hydrogel of composite stem cell sphere and preparation method and application thereof |