RU2144376C1 - Dry virus-vaccine against mareck's disease and method of its preparing - Google Patents
Dry virus-vaccine against mareck's disease and method of its preparing Download PDFInfo
- Publication number
- RU2144376C1 RU2144376C1 RU99113381A RU99113381A RU2144376C1 RU 2144376 C1 RU2144376 C1 RU 2144376C1 RU 99113381 A RU99113381 A RU 99113381A RU 99113381 A RU99113381 A RU 99113381A RU 2144376 C1 RU2144376 C1 RU 2144376C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- strain
- vaccine
- arriah
- cell
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретения относятся к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и могут быть использованы при разработке и изготовлении средств специфической профилактики болезни Марека. The invention relates to veterinary virology and biotechnology and can be used in the development and manufacture of means of specific prophylaxis of Marek's disease.
Болезнь Марека (БМ) - высококонтагиозное, лимфопролиферативное, злокачественное, вирусное заболевание птиц. БМ регистрируется во всех странах мира, где развито промышленное птицеводство, в том числе и в нашей стране, вызывая большие экономические потери. Болезнь характеризуется образованием единичных (в начальной стадии) и множественных опухолей во внутренних органах, коже, мышцах, а также изменениями центральной и периферической нервной системы. Вирус болезни Марека (ВБМ) повреждает иммунокомпетентные органы (селезенку, тимус, клоакальную сумку) и обладает таким образом иммунодепрессивной активностью, что приводит к снижению общей резистентности птиц и повышению их чувствительности к другим болезням. В связи с этим БМ довольно часто протекает в ассоциации с другими заболеваниями. Важным средством предупреждения БМ и снижения потерь от заболевания является вакцинопрофилактика. Для борьбы с БМ в качестве вакцин используют следующее. Marek's disease (BM) is a highly contagious, lymphoproliferative, malignant, viral disease of birds. BM is registered in all countries of the world where industrial poultry farming is developed, including in our country, causing large economic losses. The disease is characterized by the formation of single (in the initial stage) and multiple tumors in the internal organs, skin, muscles, as well as changes in the central and peripheral nervous system. Marek’s disease virus (VBM) damages immunocompetent organs (spleen, thymus, cloacal sac) and thus has immunosuppressive activity, which leads to a decrease in the overall resistance of birds and increase their sensitivity to other diseases. In this regard, BM often occurs in association with other diseases. An important way to prevent BM and reduce losses from the disease is vaccination. To combat BM, the following are used as vaccines.
1. Аттенуированный ВБМ серотипа 1 (HPRS-16). Вакцинированные им птицы не рассеивают его во внешней среде. 1. Attenuated VBM serotype 1 (HPRS-16). The birds vaccinated by him do not scatter it in the external environment.
2. Авирулентный частично аттенуированный ВБМ серотипа 1 (CVI-988, штамм Rispens). Он имеет остаточную патогенность для генетически восприимчивых цыплят, реплицируется in vivo и быстро распространяется. 2. Avirulent partially attenuated VBM serotype 1 (CVI-988, strain Rispens). It has residual pathogenicity for genetically susceptible chickens, replicates in vivo and spreads rapidly.
3. Природные неонкогенные вирусы герпеса кур (ВГК) серотипа 2(SB-1, 30/В). Используются в бивалентных вакцинах. 3. Natural non-oncogenic chicken herpes viruses (HCV) serotype 2 (SB-1, 30 / B). Used in bivalent vaccines.
4. Авирулентный вирус герпеса индеек (ВГИ) серотипа 3. Это единственный вакцинный вирус, который удается отделить от культуральных клеток и подвергнуть лиофилизации. 4. Avirulent virus of turkey herpes (HVI)
5. Бивалентные вакцины на ВГИ серотипа 3 и ВГК серотипа 2. 5. Bivalent vaccines for
Наиболее широкое распространение во всем мире получила вакцина на основе ВГИ (штамм FC-126), поскольку вирус не требовал аттенуации, не опасен в плане риверсии и подвергается стабилизации во внеклеточном состоянии. На основе ВГИ готовят 2 типа вакцин: клеточно- ассоциированную (нативную) и свободную от клеток (сухую). The VGI-based vaccine (FC-126 strain) is the most widespread worldwide because the virus did not require attenuation, is not dangerous in terms of reversion, and undergoes stabilization in the extracellular state. Two types of vaccines are prepared on the basis of VGI: cell-associated (native) and cell-free (dry).
Преимущество клеточно-свободной вакцины заключается в том, что ее можно продолжительное время хранить при 4oC (1).The advantage of a cell-free vaccine is that it can be stored for a long time at 4 o C (1).
Известна сухая вирусвакцина против БМ, содержащая клеточно-свободный штамм ВГИ 3 серотипа в защитной среде. В качестве стабилизатора используют SPGA, содержащий сахарозу, фосфат, глютамат калия и альбумин (2). Known dry virus vaccine against BM, containing a cell-free strain of
Известна сухая вирусвакцина против БМ, содержащая клеточно-свободный штамм ВГИ 3 серотипа в защитной среде. В качестве стабилизатора используют гидроксиэтилкрахмал с м.м. 100000-300000 (3). Known dry virus vaccine against BM, containing a cell-free strain of
Известна сухая вирусвакцина против БМ, содержащая клеточно-свободный штамм ВГИ 3 серотипа в защитной среде. В качестве стабилизатора используют (отдельно или в сочетании SPGA, сорбитол, маннитол, сахарозу, декстран, глюкозу, альбумин, казеин и продукты их деградации (4). Known dry virus vaccine against BM, containing a cell-free strain of
Известна сухая вирусвакцина против БМ, содержащая клеточно-свободный штамм ВГИ 3 серотипа в защитной среде (5). A dry anti-BM virus vaccine is known containing a cell-free strain of
Недостатки указанных вакцин состоят в том, что они не устраняют носительства вирулентного вируса и опасность поражения лимфатических органов птиц от высоковирулентных онкогенных штаммов ВБМ. The disadvantages of these vaccines are that they do not eliminate the carriage of the virulent virus and the risk of damage to the lymphatic organs of birds from highly virulent oncogenic strains of VBM.
Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является сухая вирусвакцина против БМ, содержащая клеточно-свободный штамм ВГИ 3 серотипа в защитной среде. В качестве защитной среды используют 8% раствор сахарозы в фосфатном буфере (6). The closest to the invention according to the set of essential features is a dry vaccine against BM containing a cell-free strain of
Недостаток вакцины-прототипа состоит в том, что она также не обладает высокой иммуногенностью в хозяйствах с высоким уровнем заболеваемости БМ. The disadvantage of the prototype vaccine is that it also does not have high immunogenicity in farms with a high incidence of BM.
Известен способ изготовления сухой вирусвакцины против БМ, включающий инфицирование культуры клеток штаммом ВГИ 3 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащей клеточной массы, добавление защитной среды, обработку вируссодержащей суспензии ультразвуком, ее замораживание с последующей лиофилизацией целевого продукта (2). A known method of manufacturing a dry anti-BM virus vaccine, including infection of a cell culture with a strain of
Известен способ изготовления сухой вирусвакцины против БМ, включающий инфицирование культуры клеток штаммом ВГИ 3 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащей клеточной массы, очистку вируссодержащей суспензии от клеточного детрита, добавление защитной среды, замораживание препарата с последующей его лиофилизацией (3). There is a method of manufacturing a dry anti-BM virus vaccine, including infection of a cell culture with a strain of
Известен способ изготовления сухой вирусвакцины против БМ, включающий инфицирование культуры клеток штаммом ВГИ 3 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащей клеточной массы, добавление защитной среды, обработку вируссодержащей суспензии ультразвуком, ее замораживание с последующей лиофилизацией целевого продукта (4). A known method of manufacturing a dry anti-BM virus vaccine, including infection of a cell culture with a strain of
Известен способ изготовления сухой вирусвакцины против БМ, включающий инфицирование культуры клеток штаммом ВГИ 3 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащей клеточной массы, добавление защитной среды, обработку вируссодержащей суспензии ультразвуком, ее замораживание с последующей лиофилизацией целевого продукта (5). A known method of manufacturing a dry anti-BM virus vaccine, including infection of a cell culture with a strain of
Недостатки данных способов состоят в том, что полученные в соответствии с ними вакцины не обеспечивают достаточную защиту птиц от заболеваний БМ. The disadvantages of these methods are that the vaccines obtained in accordance with them do not provide sufficient protection for birds from diseases of BM.
Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ изготовления сухой вирусвакцины против БМ, включающий инфицирование культуры клеток фибробластов СПФ-эмбрионов кур (ФЭК) штаммом ВГИ 3 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащей клеточной массы, добавление защитной среды, обработку вируссодержащей суспензии ультразвуком, ее замораживание с последующей лиофилизацией целевого продукта (6). The closest to the invention according to the set of essential features is a method of manufacturing a dry anti-BM virus vaccine, including infection of a fibroblast cell culture of SPF chicken embryos (FEC) with a strain of
Недостаток способа-прототипа состоит в том, что полученная данным способом вакцина обладает низкой иммуногенной активностью в хозяйствах с высоким уровнем заболеваемости БМ. The disadvantage of the prototype method is that the vaccine obtained by this method has low immunogenic activity in farms with a high incidence of BM.
В задачу создания группы настоящих изобретений входила разработка сухой вирусвакцины против БМ на основе нового штамма ВГИ 3 серотипа, обладающей более высокой иммуногенной активностью по сравнению с вакциной-прототипом, и способа ее изготовления. The task of creating the group of the present inventions included the development of a dry vaccine against BM based on a new strain of
Технический результат от использования группы предлагаемых изобретений заключается в повышении иммуногенной активности препарата. The technical result from the use of the group of the proposed inventions is to increase the immunogenic activity of the drug.
Указанный технический результат достигнут созданием группы изобретений, образующих единый изобретательский замысел. В группу включены изобретения, одно из которых предназначено для получения другого. The specified technical result is achieved by creating a group of inventions that form a single inventive concept. The group includes inventions, one of which is intended to obtain the other.
Указанный технический результат достигнут созданием сухой вирусвакцины против БМ, охарактеризованной следующей совокупностью признаков:
1) сухая вирусвакцина против БМ;
2) клеточно-свободный штамм ВГИ 3 серотипа;
3) из штаммов 3 серотипа вакцина содержит штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ;
4) штамм "ВНИИЗЖ/N110" взят в эффективном количестве;
5) вакцина содержит штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ с биологической активностью не менее 2•105 ФОЕ/см3;
6) защитная среда;
7) в качестве защитной среды вакцина содержит 8% раствор сахарозы в фосфатном буфере;
8) клеточно-свободный штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ и защитная среда взяты в соотношении, мас.%:
штамм "ВНИИЗЖ/N110" - 40-60
защитная среда - остальное.The specified technical result is achieved by the creation of a dry virus vaccine against BM, characterized by the following set of features:
1) dry virus vaccine against BM;
2) cell-free strain of
3) of the strains of
4) the strain "ARRIAH / N110" taken in an effective amount;
5) the vaccine contains the strain "ARRIAH / N110" VGI with biological activity of at least 2 • 10 5 FOU / cm 3 ;
6) protective environment;
7) as a protective environment, the vaccine contains an 8% solution of sucrose in phosphate buffer;
8) cell-free strain "ARRIAH / N110" VGI and the protective environment are taken in the ratio, wt.%:
strain "ARRIAH / N110" - 40-60
protective environment - the rest.
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1) сухая вирусвакцина против БМ:
2) клеточно-свободный штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ:
3) штамм "ВНИИЗЖ/N110" взят в эффективном качестве;
4) защитная среда.The present invention includes the following set of essential features that provide a technical result in all cases for which legal protection is sought:
1) dry anti-BM virus vaccine:
2) cell-free strain "ARRIAH / N110" VGI:
3) the strain "ARRIAH / N110" taken in effective quality;
4) protective environment.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1) вакцина содержит штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ с биологической активностью не менее 2•105 ФОЕ/см3;
2) в качестве защитной среды вакцина содержит 8% раствор сахарозы в фосфатном буфере;
3) клеточно-свободный штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ и защитная среда взяты в соотношении, мас.%:
штамм "ВНИИЗЖ/N110" - 40-60
защитная среда - остальное.The present invention is also characterized by other features expressing specific forms of execution or special conditions for its use:
1) the vaccine contains the strain "ARRIAH / N110" VGI with biological activity of at least 2 • 10 5 FOU / cm 3 ;
2) as a protective environment, the vaccine contains an 8% solution of sucrose in phosphate buffer;
3) cell-free strain "ARRIAH / N110" VGI and the protective environment are taken in the ratio, wt.%:
strain "ARRIAH / N110" - 40-60
protective environment - the rest.
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемую вакцину и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются
1) сухая вирусвакцина против БМ;
2) клеточно-свободный штамм ВГИ 3 серотипа;
3) защитная среда.The signs of the invention, characterizing the proposed vaccine and coinciding with the signs of the prototype, including the generic concept, reflecting the purpose, are
1) dry virus vaccine against BM;
2) cell-free strain of
3) protective environment.
По сравнению с вакциной-прототипом существенным отличительным признаком изобретения является то, что из штаммов 3 серотипа вакцина содержит штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ, взятый в эффективном количестве. Compared with the prototype vaccine, an essential distinguishing feature of the invention is that of the strains of
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1) вакцина содержит штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ с биологической активностью не менее 2•105 ФОЕ/см3;
2) в качестве защитной среды вакцина содержит 8% раствор сахарозы в фосфатном буфере;
3) клеточно-свободный штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ и защитная среда взяты в соотношении, мас.%:
штамм "ВНИИЗЖ/N110" - 40-60
защитная среда - остальное.The present invention is also characterized by other distinctive features that express specific forms of execution or special conditions for its use:
1) the vaccine contains the strain "ARRIAH / N110" VGI with biological activity of at least 2 • 10 5 FOU / cm 3 ;
2) as a protective environment, the vaccine contains an 8% solution of sucrose in phosphate buffer;
3) cell-free strain "ARRIAH / N110" VGI and the protective environment are taken in the ratio, wt.%:
strain "ARRIAH / N110" - 40-60
protective environment - the rest.
Предлагаемая вакцина обладает более высокой иммуногенной активностью по сравнению с вакциной-прототипом. The proposed vaccine has a higher immunogenic activity compared to the prototype vaccine.
Штамм "ВНИИЗЖ/N110" является новым, ранее неизвестным вариантом ВГИ. The strain "ARRIAH / N110" is a new, previously unknown version of the VGI.
Указанный технический результат достигнут также созданием способа изготовления сухой вирусвакцины против БМ, охарактеризованного следующей совокупностью признаков:
1) способ изготовления сухой вирусвакцины против БМ;
2) инфицирование культуры клеток штаммом ВГИ 3 серотипа;
3) из штаммов 3 серотипа используют штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ в эффективном количестве;
4) штамм "ВНИИЗЖ/110" ВГИ используют с биологической активностью не менее 2•105 ФОЕ/см3;
5) в качестве клеточного субстрата используют культуру клеток ФЭК;
6) инкубирование зараженной культуры;
7) сбор вируссодержащей клеточной массы;
8) добавление защитной среды;
9) в качестве защитной среды используют 8% раствор сахарозы в фосфатном буфере;
10) клеточно-свободный штамм "ВНИИЗЖ/N110" и защитную среду смешивают в соотношении 1:1;
11) обработка вируссодержащей суспензии ультразвуком;
12) замораживание вируссодержащей суспензии;
13) лиофилизация целевого продукта.The specified technical result was also achieved by the creation of a method of manufacturing a dry virus vaccine against BM, characterized by the following set of features:
1) a method of manufacturing a dry vaccine against BM;
2) infection of the cell culture with a strain of
3) from strains of 3 serotypes use the strain "ARRIAH / N110" VGI in an effective amount;
4) the strain "ARRIAH / 110" VGI used with biological activity of at least 2 • 10 5 FOE / cm 3 ;
5) a cell culture of FEC is used as a cell substrate;
6) incubation of the infected culture;
7) collection of virus-containing cell mass;
8) the addition of a protective environment;
9) use a 8% solution of sucrose in phosphate buffer as a protective medium;
10) the cell-free strain "ARRIAH / N110" and the protective medium are mixed in a ratio of 1: 1;
11) sonication of the virus-containing suspension;
12) freezing of a virus-containing suspension;
13) lyophilization of the target product.
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1) способ изготовления сухой вирусвакцины против БМ;
2) инфицирование культуры клеток штаммом "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ;
3) инкубирование зараженной культуры:
4) сбор вируссодержащей клеточной массы;
5) добавление защитной среды:
6) обработка вируссодержащей суспензии ультразвуком;
7) замораживание вируссодержащей суспензии:
8) лиофилизация целевого продукта.The present invention includes the following set of essential features that provide a technical result in all cases for which legal protection is sought:
1) a method of manufacturing a dry vaccine against BM;
2) infection of cell culture with strain "ARRIAH / N110"VGI;
3) incubation of the infected culture:
4) collection of virus-containing cell mass;
5) adding a protective environment:
6) sonication of the virus-containing suspension;
7) freezing of a virus-containing suspension:
8) lyophilization of the target product.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1) в качестве клеточного субстрата используют культуру клеток ФЭК;
2) штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ используют с биологической активностью не менее 2•105 ФОЕ/см3;
3) в качестве защитной среды используют 8% раствор сахарозы в фосфатном буфере;
4) клеточно-свободный штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ и защитную среду смешивают в соотношении 1:1.The present invention is also characterized by other features expressing specific forms of execution or special conditions for its use:
1) as a cell substrate using cell culture FEC;
2) the strain "ARRIAH / N110" VGI used with biological activity of at least 2 • 10 5 FOE / cm 3 ;
3) as a protective environment using an 8% solution of sucrose in phosphate buffer;
4) the cell-free strain "ARRIAH / N110" VGI and the protective medium are mixed in a ratio of 1: 1.
Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1) способ изготовления сухой вирусвакцины против БМ;
2) инфицирование культуры клеток штаммом ВГИ 3 серотипа;
3) инкубирование зараженной культуры;
4) сбор вируссодержащей клеточной массы;
5) добавление защитной среды;
6) обработка вируссодержащей суспензии ультразвуком;
7) замораживание вируссодержащей суспензии;
8) лиофилизация целевого продукта.The signs of the invention, characterizing the proposed method and coinciding with the signs of the prototype, including the generic concept, reflecting the purpose, are:
1) a method of manufacturing a dry vaccine against BM;
2) infection of the cell culture with a strain of
3) incubation of the infected culture;
4) collection of virus-containing cell mass;
5) the addition of a protective environment;
6) sonication of the virus-containing suspension;
7) freezing of a virus-containing suspension;
8) lyophilization of the target product.
По сравнению со способом-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемого изобретения является использование нового штамма "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ в эффективном количестве. Compared with the prototype method, an essential distinguishing feature of the invention is the use of a new strain of ARRIAH / N110 VGI in an effective amount.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1) в качестве клеточного субстрата используют культуру клеток ФЭК;
2) штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ используют с биологической активностью не менее 2•105 ФОЕ/см3;
3) в качестве защитной среды используют 8% раствор сахарозы в фосфатном буфере;
4) клеточно-свободный штамм "ВНИИЗЖ/110" ВГИ и защитную среду смешивают в соотношении 1:1.The present invention is also characterized by other distinctive features that express specific forms of execution or special conditions for its use:
1) as a cell substrate using cell culture FEC;
2) the strain "ARRIAH / N110" VGI used with biological activity of at least 2 • 10 5 FOE / cm 3 ;
3) as a protective environment using an 8% solution of sucrose in phosphate buffer;
4) the cell-free strain "ARRIAH / 110" VGI and the protective medium are mixed in a ratio of 1: 1.
Достижение технического результата от использования предлагаемого способа объясняется тем, что при изготовлении вакцины используют новый штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ, обладающий по сравнению со штаммом FC-126 ВГИ более высокой иммуногенной активностью. The achievement of the technical result from the use of the proposed method is due to the fact that in the manufacture of the vaccine using a new strain "ARRIAH / N110" VGI, which has a higher immunogenic activity compared to strain FC-126 VGI.
Исходный вирус для получения штамма "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ выделен в 1998 году из эпителия перьевых фолликулов СПФ-цыплят, иммунизированных вируссодержащим материалом из штамма FC-126 ВГИ. Производственный штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ получен методом перемежающихся пассажей через организм СПФ-цыплят и культуру клеток ФЭК. Штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ представляет собой апатогенный генетически однородный вирусный материал, легко культивируемый в культуре куриных эмбриональных фибробластов с высокой биологической активностью (титр вируса 2,0-3,0•106 ФОЕ/см3) и вызывающий напряженный иммунитет по сравнению со штаммом FC-126 у привитой птицы.The original virus for obtaining strain "ARRIAH / N110" VGI was isolated in 1998 from the epithelium of feather follicles of SPF chickens immunized with virus-containing material from strain FC-126 VGI. The production strain "ARRIAH / N110" VGI obtained by the method of intermittent passages through the body of SPF chickens and cell culture FEC. The strain "ARRIAH / N110" VGI is a pathogenic genetically homogeneous viral material that is easily cultivated in a culture of chicken embryonic fibroblasts with high biological activity (virus titer 2.0-3.0 • 10 6 CFU / cm 3 ) and causing intense immunity compared with strain FC-126 in a vaccinated bird.
Штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации, сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 18.12.98 под регистрационным номером "ВНИИЗЖ/N110-ДЕП". The strain "ARRIAH / N110" VGI is deposited in the collection of microorganisms of the All-Russian State Research Institute for Control, Standardization, Certification of Veterinary Medicines (VGNKI) 12/18/98 under the registration number "ARRIAH / N110-DEP".
Сущность изобретения пояснена на графическом материале (чертеж), на котором представлена нуклеотидная последовательность фрагмента гена gB 966-1296 штамма "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ (жирным шрифтом отмечены его нуклеотидные отличия от штамма FC-126). The invention is illustrated in graphic material (drawing), which shows the nucleotide sequence of the gene fragment gB 966-1296 strain "ARRIAH / N110" VGI (bold indicates its nucleotide differences from strain FC-126).
Штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ характеризуется следующими признаками и свойствами. The strain "ARRIAH / N110" VGI is characterized by the following features and properties.
Морфологические признаки
Штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ относится к семейству Herpesviridae, роду Herpesvirus, серотипу 3.Morphological features
The strain "ARRIAH / N110" VGI belongs to the family Herpesviridae, genus Herpesvirus,
На основании сравнительного элкектронно-микроскопического изучения производственного штамма FC-126 и штамма "ВНИИЗЖ/N110" при репродукции их в культурах клеток установлена идентичность характеристик обоих штаммов. Эти вирусы проходили онтогенетический цикл развития в нуклеоплазме, а в цитоплазме - завершающие стадии морфогенеза. Внутриядерный цикл развития включает стадии виропласта, нуклеоида, сборку нуклеокапсида, формирование наружной суперкапсидной мембраны. Наиболее частой формой, присутствующей на всех стадиях культивирования, является нуклеокапсид с нуклеотидом, представленным плотным образованием, заключенным в капсидную белковую оболочку. При электронно-микроскопическом исследовании штамм "ВНИИЗЖ/N110" представлен типичными для вирусов герпеса группами В вирионами, имеющими икосаэдрическую форму, нуклеокапсид содержит 2-нитевую ДНК. В ядре пораженной клетки вирион имеет величину 90-100 нм, в цитоплазме размер его увеличивается за счет белковой оболочки до 180-200 нм. Оболочка состоит из 162 капсомеров, расположенных в кубической симметрии. Based on a comparative electron microscopic study of the production strain FC-126 and the strain "ARRIAH / N110" during their reproduction in cell cultures, the characteristics of both strains are identical. These viruses went through the ontogenetic developmental cycle in the nucleoplasm, and in the cytoplasm - the final stages of morphogenesis. The intranuclear development cycle includes the stages of a viroplast, a nucleoid, assembly of a nucleocapsid, and the formation of an external supercapsid membrane. The most common form present at all stages of cultivation is a nucleocapsid with a nucleotide represented by a dense formation encapsulated in a capsid protein coat. During electron microscopic examination, the strain "ARRIAH / N110" is represented by groups B typical of herpes viruses in virions having an icosahedral shape, the nucleocapsid contains 2-strand DNA. In the nucleus of the affected cell, the virion has a value of 90-100 nm, in the cytoplasm its size increases due to the protein membrane to 180-200 nm. The shell consists of 162 capsomeres arranged in cubic symmetry.
Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ относится к серотипу 3. При введении в организм вызывает латентно протекающую вирусемию. Антитела к данному вирусу обнаруживают в крови у цыплят к 14-21-дневному сроку с дальнейшим нарастанием к 40-60 дню. При вакцинации вирус индуцирует образование специфических антител, выявляемых в РДП и ИФА. Активность в РСК не установлена. Концентрированный антиген "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ реагирует в РДП со специфическими сыворотками ВГИ и ВБМ. Выявляются общие антигены с ВБМ в прямой и непрямой РИФ. При разрушении клетки вступает в реакцию с антителами к ВГИ и ВБМ в РН. В ИФА вступает в реакцию с антителами к ВГИ и ВБМ.Antigenic properties
According to its antigenic properties, the strain “ARRIAH / N110” VGI belongs to serotype 3. When introduced into the body, it causes latent viremia. Antibodies to this virus are found in the blood of chickens by 14-21 days with a further increase by 40-60 days. During vaccination, the virus induces the formation of specific antibodies detected in RDP and ELISA. Activity in the CSC has not been established. The concentrated antigen "ARRIAH / N110" VGI reacts in RDP with specific serum VGI and VBM. Common antigens with VBM in the direct and indirect RIF are detected. When the cell is destroyed, it reacts with antibodies to VGI and VBM in the pH. The ELISA reacts with antibodies to HBV and VBM.
Биотехнологические характеристики
Штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ активно размножается в СПФ-эмбрионах кур и в первично-трипсинизированной культуре клеток ФЭК. Трипсинизацию эмбрионов и культивирование фибробластов проводят по общепринятым методикам с использованием смеси сред на основе ГЛА, Игла и 199, взятых в равных частях, с добавлением 10% сыворотки крови КРС. Клетки фибробластов выращивают во флаконах емкостью 50 см3 и 100 см3 (Повицкого), в матрасах емкостью 1,5 дм3 и в роллерных 3-литровых сосудах. Посевная концентрация для флаконов и матрасов составляет 400-500 кл/см3, для роллерных сосудов от 1,2 до 1,5 млн. кл/см3. При размножении в культуре фибробластов вирус проявляет ярко выраженный цитопатический эффект-образование характерных фокусов, состоящих из рефрактильных округлых клеток (поликариоцитов). Размеры фокуса достигают 0,1-0,2 мм. При проведении последовательных пассажей в культуре клеток ФЭК инфекционный титр вируса увеличивался и достигал 2,0-3,0•106 ФОЕ/см3 (фокусообразующих единиц).Biotechnological characteristics
The strain "ARRIAH / N110" VGI actively propagates in SPF-embryos of chickens and in the primary trypsinized cell culture of FEC. Trypsinization of embryos and cultivation of fibroblasts is carried out according to generally accepted methods using a mixture of media based on GLA, Needle and 199, taken in equal parts, with the addition of 10% serum of cattle. Fibroblast cells are grown in bottles with a capacity of 50 cm 3 and 100 cm 3 (Povitsky), in mattresses with a capacity of 1.5 dm 3 and in roller 3-liter vessels. The seed concentration for bottles and mattresses is 400-500 cells / cm 3 , for roller vessels from 1.2 to 1.5 million cells / cm 3 . When propagated in a culture of fibroblasts, the virus exhibits a pronounced cytopathic effect-the formation of characteristic foci consisting of refractory rounded cells (polykaryocytes). Focus sizes reach 0.1-0.2 mm. During consecutive passages in the cell culture of FEC, the infectious titer of the virus increased and reached 2.0-3.0 • 10 6 FOU / cm 3 (focus-forming units).
При заражении 6-суточных СПФ-эмбрионов кур в желточный мешок штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ вызывает их гибель до 20% на 3-5 сутки инкубации. У павших эмбрионов отмечают отставание в росте, гепатиты, увеличение селезенки и почек. На хориоаллантоисной оболочке образуются мелкие бляшки серовато-белого цвета звездчатой формы размером до 1 мм в небольших количествах. У эмбрионов развивается гепатит. Штамм "ВНИИЗЖ/N110" предназначен для использования в качестве сырья для приготовления живой вакцины против БМ. When 6-day-old SPF chicken embryos are infected in the yolk sac, the strain “ARRIAH / N110” VGI causes their death to 20% on 3-5 days of incubation. In fallen embryos, growth retardation, hepatitis, an increase in the spleen and kidneys are noted. On the chorioallantoic membrane, small grayish-white star-shaped plaques up to 1 mm in size are formed in small amounts. Embryos develop hepatitis. The strain "ARRIAH / N110" is intended for use as a raw material for the preparation of a live vaccine against BM.
Результаты определения репродуктивной способности штамма "ВНИИЗЖ/N110" в культуре клеток ФЭК представлены в таблице 1. The results of determining the reproductive ability of the strain "ARRIAH / N110" in cell culture FEC are presented in table 1.
Хемо- и генотаксономическая характеристика
Штамм "ВНИИЗЖ/N110" является ДНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 108-120х106 Да. Нуклеиновая кислота представлена двуцепочечной линейной молекулой. Содержание G+C-46%. Вирион состоит из нуклеоида, икосаэдрического капсида, асимметрично расположенного вокруг капсида электронно-плотного материала, обозначаемого как тегумент, и липопротеидной оболочки. Вирионная ДНК участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники в свою очередь расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Основными антигенными белками являются гликопротеины А (gA) и В(gB). Гликопротеин В играет важную роль в индукции защитного иммунитета и является высококонсервативным среди герпесвирусов. Он представляет собой комплекс трех гликопротеинов: gp 49; gp 60 и gp 100.Chemo- and genotaxonomic characterization
The strain "ARRIAH / N110" is a DNA-containing virus with a molecular weight of 108-120x10 6 Yes. Nucleic acid is a double-stranded linear molecule. The content of G + C-46%. The virion consists of a nucleoid, an icosahedral capsid asymmetrically located around the capsid of electron-dense material, designated as tegument, and a lipoprotein membrane. Virionic DNA is involved in the formation of precursor proteins in infected cells. The precursors, in turn, cleave to form more stable structural and non-structural virus polypeptides. The main antigenic proteins are glycoproteins A (gA) and B (gB). Glycoprotein B plays an important role in the induction of protective immunity and is highly conserved among herpes viruses. It is a complex of three glycoproteins: gp 49; gp 60 and
Проведено определение первичной структуры фрагмента гена gB вируса с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирования амплифицированного фрагмента. The primary structure of the virus gB gene fragment was determined using polymerase chain reaction (PCR) and amplified fragment sequencing.
Изучение нуклеотидной последовательности генома штамма "ВНИИЗЖ/N110" методом секвенирования по Сенгеру показало, что фрагмент гена gB966-1296 H имеет 2 нуклеотидные замены в позициях 1038H "C" на "Т", 1200H "А" на "G" и одну замену в позиции 1175H с "Т" на "C" в отличие от штамма FC-126, представленного в международном генбанке. Таким образом, штамм "ВНИИЗЖ/N110" отличается от штамма FC-126 по трем нуклеотидным основаниям, однако все три мутации не приводят к заменам соответствующих аминокислот. Гомология нуклеотидной структуры исследованного фрагмента штаммов FC-126 и "ВНИИЗЖ/N110" составляет 99,1%. Результаты исследований представлены на прилагаемом графическом материале. The study of the nucleotide sequence of the genome of strain ARRIAH / N110 by Senger sequencing showed that the gene fragment gB966-1296 H has 2 nucleotide substitutions at positions 1038H "C" with "T", 1200H "A" with "G" and one change in positions 1175H from "T" to "C" in contrast to strain FC-126, presented in the international genebank. Thus, the strain "ARRIAH / N110" differs from the strain FC-126 in three nucleotide bases, however, all three mutations do not lead to replacements of the corresponding amino acids. The homology of the nucleotide structure of the studied fragment of the FC-126 and ARRIAH / N110 strains is 99.1%. The research results are presented on the attached graphic material.
Устойчивость к внешним факторам
Устойчивость штамма "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ к физическим и химическим факторам характеризуется следующими данными. Центрифугирование при 50000 g осаждает вирус в течение 1 часа. В пределах рН 4-10 вирус чувствителен к эфиру.Resistance to external factors
The resistance of the strain "ARRIAH / N110" VGI to physical and chemical factors is characterized by the following data. Centrifugation at 50,000 g precipitates the virus for 1 hour. In the range of pH 4-10, the virus is sensitive to ether.
Вирус выдерживает неоднократное замораживание-оттаивание и воздействие ультразвуком в течение 10 мин. Полная термоинактивация вируса происходит при 4oC через 2 недели хранения, при 20-25oC - через 4 дня, при 37oC - через 18 часов и при 60oC - за 10 мин.The virus can withstand repeated freezing-thawing and exposure to ultrasound for 10 minutes. Complete thermal inactivation of the virus occurs at 4 o C after 2 weeks of storage, at 20-25 o C after 4 days, at 37 o C after 18 hours and at 60 o C in 10 minutes.
Хранение и консервирование
Вирус сохраняется в клеточно-ассоциированном виде в смеси равных объемов сред на основе гидролизата лактальбумина (ГЛА), Игла и 199 с 20% сыворотки крови КРС и 10% диметилсульфоксида в герметически запаянных ампулах в жидком азоте при -196oC в течение 24 месяцев.Storage and preservation
The virus is stored in a cell-associated form in a mixture of equal volumes of media based on lactalbumin hydrolyzate (GLA), Needle and 199 with 20% cattle serum and 10% dimethyl sulfoxide in hermetically sealed ampoules in liquid nitrogen at -196 o C for 24 months.
Патогенные свойства
Не вызывает инфекции у птиц, контагиозность не установлена.Pathogenic properties
It does not cause infection in birds; contagiousness has not been established.
Лабораторные и домашние животные к вирусу не чувствительны. Laboratory and domestic animals are not sensitive to the virus.
Иммуногенность штамма
Штамм "ВНИИЗЖ/N110" вызывает иммунитет в дозе 1000 ФОЕ у 90-98% цыплят в производственных условиях. Иммуногенность не меняется в течение 5 последовательных пассажей.The immunogenicity of the strain
The strain "ARRIAH / N110" causes immunity in a dose of 1000 IU in 90-98% of chickens in a production environment. Immunogenicity does not change for 5 consecutive passages.
Дополнительные признаки и свойства
Штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ свободен от контаминации бактериальной и грибковой флорой, чужеродными вирусами и микоплазмами, безвреден в 10-кратной дозе для суточных цыплят.Additional features and properties
The strain "ARRIAH / N110" VGI is free from contamination by bacterial and fungal flora, foreign viruses and mycoplasmas, harmless in a 10-fold dose for day old chickens.
На основании полученных данных можно утверждать, что штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным изолятом ВГИ. Based on the data obtained, it can be argued that the strain "ARRIAH / N110" VGI is an original, taxonomically new, previously unknown isolate of VGI.
В таблице 2 приведены результаты сравнительного изучения признаков и свойств штамма "ВНИИЗЖ/N110" и штамма FC-126. Table 2 shows the results of a comparative study of the characteristics and properties of the strain "ARRIAH / N110" and strain FC-126.
Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемых изобретений, позволили установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемых изобретений. Определение из перечня выявленных аналогов прототипов, как наиболее близких по совокупности признаков аналогов, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой вакцины и способа ее изготовления, изложенных в независимых пунктах формулы. The analysis of the prior art by the applicant, including a search by patent and scientific and technical sources of information, and the identification of sources containing information about analogues of the proposed inventions, made it possible to establish that the applicant did not find sources characterized by features that are identical (identical) to all the essential features of the proposed inventions. The determination from the list of identified analogues of prototypes as the closest in the totality of the characteristics of analogues made it possible to establish the set of essential distinguishing features of the proposed vaccine and the method of its manufacture, as compared to the claimed technical result, as set forth in the independent claims.
Следовательно, заявляемые изобретения соответствуют условию патентоспособности "новизна". Therefore, the claimed invention meets the condition of patentability "novelty."
Для проверки соответствие предлагаемых решений условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительные части независимых пунктов формулы. Результаты поиска показали, что предлагаемые решения не вытекают для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемых изобретений), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемых изобретений преобразований для достижения технического результата. To check the compliance of the proposed solutions with the patentability condition "inventive step", an additional search for known solutions was carried out to identify features included in the distinctive parts of the independent claims. The search results showed that the proposed solutions do not follow explicitly for the specialist from the prior art set forth in the corresponding section of the description (no solutions having features matching the distinguishing features of the proposed inventions have been identified), and the effect of the transformations provided for by the essential features of the proposed inventions has not been identified to achieve a technical result.
Следовательно, предлагаемая вакцина и способ ее изготовления соответствуют условию патентоспособности "изобретательский уровень". Therefore, the proposed vaccine and method of its manufacture meet the condition of patentability "inventive step".
Сущность предлагаемых изобретений пояснена примерами их исполнения. The essence of the proposed invention is illustrated by examples of their implementation.
Пример 1
Для получения клеточной суспензии, выращивания первичных культур клеток ФЭК и культивирования ВГИ, штамм "ВНИИЗЖ/N110", используют трипсин, солевой раствор Хенкса или Эрла, среду Игла, 0,5% раствор ГЛА на растворе Хенкса (ГЛАХ) или Эрла (ГЛАЭ), среду 199 и сыворотку крови КРС. В качестве ростовой среды используют смесь равных объемов среды Игла, среды ГЛАЭ, среды 199 и 10% сыворотки крови КРС. pH ростовой среды устанавливают в пределах 7,0-7,2. В качестве поддерживающей среды для культивирования ВГИ, штамм "ВНИИЗЖ/N110", используют смесь равных объемов среды Игла, среды ГЛАЭ, среды 199 и 2% сыворотки КРС. рН поддерживающей среды устанавливают в пределах 7,4-7,6.Example 1
To obtain a cell suspension, growing primary cultures of FEK cells and culturing VGI, strain ARRIAH / N110, trypsin, Hanks or Earle saline, Eagle’s medium, 0.5% GLA solution in Hanks (GLAH) or Earle (GLAE) solution are used , Wednesday 199 and cattle serum. As the growth medium, a mixture of equal volumes of Eagle medium, GLAE medium, 199 medium and 10% cattle serum is used. The pH of the growth medium is set in the range of 7.0-7.2. As a supporting medium for the cultivation of VGI, strain "ARRIAH / N110", a mixture of equal volumes of Eagle medium, GLAE medium, 199 medium and 2% cattle serum is used. The pH of the support medium is set in the range of 7.4-7.6.
Для получения первичной культуры клеток используют СПФ-эмбрионы кур 11-12-суточного возраста. Эмбрионы разделывают в асептических условиях и промывают 3-5 раз раствором Хенкса, содержащим по 200 ед/мл пенициллина и стрептомицина. После этого эмбрионы помещают в плоскодонный сосуд объемом 1-2 дм3 и заливают теплым (36-37oC) 0,25-0,3% раствором трипсина в соотношении ткани и жидкости 1:5. Сосуд устанавливают на термостатирующую магнитную мешалку на 35 минут. Сосуд снимают с магнитной мешалки, жидкость фильтруют в центрифужный флакон, в который добавляют 2% к объему жидкости сыворотки крови КРС для нейтрализации действия трипсина. Отфильтрованную клеточную суспензию немедленно центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 минут. После центрифугирования трипсин сливают, а к клеточному осадку добавляют ростовую среду в объеме, равном объему удаленного трипсина, и энергичным встряхиванием ресуспендируют. Полученную клеточную суспензию фильтруют. Фильтр промывают ростовой средой в объеме 100-200 см3. Концентрация данной суспензии должна составлять ≈ 10 млн. кл/см3. Количество клеток подсчитывают в камере Горяева. Концентрированную суспензию клеток разводят до посевной концентрации 1,3-1,5 млн/см3 для бутылей и 0,6-0,7 млн/см3 для 50 см3 флаконов, используемых для титрования вакцинного вируса, и расфасовывают по емкостям. Бутыли вращают со скоростью 8-10 об/мин. Для заражения вирусом используют 48-72-часовой монослой клеток.To obtain the primary cell culture, SPF embryos of chickens of 11-12 days old are used. Embryos are cut under aseptic conditions and washed 3-5 times with a Hanks solution containing 200 units / ml of penicillin and streptomycin. After that, the embryos are placed in a flat-bottomed vessel with a volume of 1-2 dm 3 and filled with a warm (36-37 o C) 0.25-0.3% trypsin solution in a tissue to liquid ratio of 1: 5. The vessel is mounted on a thermostatic magnetic stirrer for 35 minutes. The vessel is removed from the magnetic stirrer, the liquid is filtered into a centrifuge bottle, to which 2% of the volume of blood serum of cattle is added to neutralize the action of trypsin. The filtered cell suspension is immediately centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes. After centrifugation, trypsin is drained, and the growth medium is added to the cell pellet in an amount equal to the volume of the removed trypsin, and resuspended by vigorous shaking. The resulting cell suspension is filtered. The filter is washed with growth medium in a volume of 100-200 cm 3 . The concentration of this suspension should be ≈ 10 million cells / cm 3 . The number of cells is counted in the Goryaev’s chamber. The concentrated cell suspension is diluted to a seed concentration of 1.3-1.5 million / cm 3 for bottles and 0.6-0.7 million / cm 3 for 50 cm 3 bottles used for titration of the vaccine virus, and packaged in containers. The bottles are rotated at a speed of 8-10 rpm. A 48-72-hour cell monolayer is used to infect the virus.
Для изготовления производственной серии вакцины используют вирус маточной расплодки, проверенный на стерильность, безвредность, отсутствие контаминации чужеродными вирусами и микоплазмами и имеющий активность не ниже 1•105 ФОЕ/см3.For the manufacture of the production series of vaccines, uterine brood virus is used, tested for sterility, safety, lack of contamination with foreign viruses and mycoplasmas and having an activity of at least 1 • 10 5 FOU / cm 3 .
Изготовление производственной серии вакцины включает следующие этапы: "освежение" и поддержание вируса в пассажах, съем инфицированных клеток с последующим диспергированием и сушкой, формирование серии вакцины и ее контроль. The production of a vaccine production series includes the following steps: refreshment and maintenance of the virus in passages, removal of infected cells, followed by dispersion and drying, formation of a vaccine series and its control.
Освежение вируса проводят двумя последовательными пассажами. Для этого в бутылях с монослоем культуры клеток ФЭК проводят замену ростовой среды на поддерживающую и вносят в бутыль вирус из расчета 200000 ФОЕ. Количество ампул, используемых для заражения, определяют, исходя из титра маточного штамма вируса. Ампулы достают из жидкого азота и немедленно помещают в воду с температурой 27oC до полного размораживания, затем ампулы обрабатывают 3% раствором перекиси водорода, фламбируют и вскрывают. Содержимое ампул объединяют и разводят питательной средой из расчета, чтобы в каждом см3 суспензии содержалось 10000 ФОЕ. Для первого пассажа заражают не менее 6 бутылей. Бутыли с зараженным монослоем помещают в термальные комнаты на 3-4 суток при температуре 37-38oC. К моменту сбора вируса типичное ЦПД в виде фокусов должно быть отчетливо видно под микроскопом (50-70% поражения монослоя). Из бутылей удаляют поддерживающую среду и вносят подогретый до 37oC 0,25 раствор трипсина в объеме 90-120 см3 на бутыль. Монослой смачивают раствором трипсина в течение 1-3 минут, затем его быстро удаляют, а бутыли помещают в термальную комнату на 10-15 минут или вращают при комнатной температуре 5-7 минут со скоростью 20 об/мин. По истечении времени в бутыли вносят поддерживающую среду без сыворотки, энергичным встряхиванием отслаивают клетки от стекла и суспендируют в ней, не допуская образования пены. Полученным вирусом проводят второй пассаж из расчета 1:8-1:10, т.е. инфицированными клетками, снятыми с 1 бутыли, можно заразить 8-10 бутылей. Вирус второго пассажа культивируют в течение 48-72 часов до появления ЦПД на 70-80% поверхности монослоя.The virus is refreshed by two consecutive passages. To do this, in bottles with a monolayer of FEC cell culture, the growth medium is replaced with a support one and virus is added to the bottle at the rate of 200,000 IU. The number of ampoules used for infection is determined based on the titer of the uterine strain of the virus. The ampoules are removed from liquid nitrogen and immediately placed in water with a temperature of 27 o C until completely thawed, then the ampoules are treated with a 3% hydrogen peroxide solution, flambered and opened. The contents of the ampoules are combined and diluted with nutrient medium in the calculation so that in every cm 3 of the suspension contains 10,000 IU. For the first passage, at least 6 bottles are infected. Bottles with an infected monolayer are placed in thermal rooms for 3-4 days at a temperature of 37-38 o C. By the time the virus is collected, a typical FOC in the form of foci should be clearly visible under a microscope (50-70% of the damage to the monolayer). The support medium is removed from the bottles and a 0.25 trypsin solution heated to 37 ° C. is added in a volume of 90-120 cm 3 per bottle. The monolayer is moistened with a trypsin solution for 1-3 minutes, then it is quickly removed, and the bottles are placed in a thermal room for 10-15 minutes or rotated at room temperature for 5-7 minutes at a speed of 20 rpm. After the lapse of time, the serum-free support medium was introduced into the bottles, and the cells were vigorously shaken from the glass and suspended in it, preventing the formation of foam. The resulting virus conducts the second passage at the rate of 1: 8-1: 10, i.e. infected cells taken from 1 bottle can infect 8-10 bottles. The virus of the second passage is cultured for 48-72 hours until the appearance of the CPP on 70-80% of the surface of the monolayer.
Затем проводят съем инфицированных клеток. Для этого из бутылей удаляют поддерживающую среду, в каждую бутыль вносят по 60-90 см3 0,25% раствора трипсина, подогретого до 37oC, и вращают бутыли 5-7 минут в термальной комнате. Резким встряхиванием клетки отслаивают от стекла. Затем полученным вирусом проводят третий пассаж из расчета 1:10-1:20, четвертый пассаж из расчета 1: 50-1:100 и при необходимости пятый. В третьем, четвертом и пятом пассажах вирус культивируют 48-72 часа до появления ЦПД на 80-90% поверхности монослоя. Съем клеток осуществляют также, как и после второго пассажа. После третьего, четвертого и пятого пассажей полученный клеточно-ассоциированный вирус подвергают центрифугированию при 1000 об/мин в течение 10 минут для удаления трипсина. После этого вируссодержащую суспензию сливают в охлаждаемые тающим льдом мерные цилиндрические флаконы объемом 250,0 или 500,0 см3, в которые вносят в соотношении 1:1 к объему суспензии защитную среду, содержащую 8% раствор сахарозы в фосфатном буфере. Смесь подвергают ультразвуковой обработке для получения клеточно-свободного вируса. Ультразвуковую дезинтеграцию клеток осуществляют при частоте 20 кГц и мощности 600 Вт в течение 250-300 секунд с 10-секундным перерывом через каждые 10 секунд. После завершения ультразвуковой обработки вакцину сливают в емкости. В вакцине клеточно-свободный вирус должен быть с активностью не ниже 2,0•105 ФОЕ/см3 и свободен от контаминации бактериальной и грибковой флорой. Емкости с вакциной помещают в мелко наколотый лед так, чтобы охлаждалась равномерно вся суспензия, и вакцину фасуют по 1,0-2,0 см3 в заранее промаркированные пенициллиновые флаконы, которые помещают в стерильные кассеты. При расфасовке в 2,0 см3 пенициллиновые флаконы титр клеточно-свободного вируса должен быть не ниже 2,0•105 ФОЕ/см3 и при расфасовке в 1 см3 флаконы - не ниже 4,0-105 ФОЕ/см3. Кассеты закрывают 2-слойной стерильной марлей и загружают в холодильник для замораживания.Then carry out the removal of infected cells. To do this, the support medium is removed from the bottles, 60-90 cm 3 of a 0.25% trypsin solution heated to 37 ° C is added to each bottle and the bottles are rotated for 5-7 minutes in a thermal room. Shaking the cells flakes off the glass. Then the obtained passage is used to conduct the third passage at the rate of 1: 10-1: 20, the fourth passage at the rate of 1: 50-1: 100 and, if necessary, the fifth. In the third, fourth and fifth passages, the virus is cultured 48-72 hours before the appearance of the CPP on 80-90% of the surface of the monolayer. Cell removal is carried out as well as after the second passage. After the third, fourth and fifth passages, the resulting cell-associated virus is subjected to centrifugation at 1000 rpm for 10 minutes to remove trypsin. After that, the virus-containing suspension is poured into 250.0 or 500.0 cm 3 volumetric cylindrical cylindrical bottles, cooled by melting ice, into which a protective medium containing 8% sucrose solution in phosphate buffer is added in a ratio of 1: 1 to the volume of the suspension. The mixture is sonicated to obtain a cell-free virus. Ultrasonic disintegration of cells is carried out at a frequency of 20 kHz and a power of 600 W for 250-300 seconds with a 10-second break every 10 seconds. After ultrasonic treatment is complete, the vaccine is poured into containers. In the vaccine, the cell-free virus should be with an activity of at least 2.0 • 10 5 IU / cm 3 and be free from contamination by bacterial and fungal flora. Vaccine containers are placed in finely chopped ice so that the entire suspension is cooled evenly, and the vaccine is packaged in 1.0-2.0 cm 3 in pre-marked penicillin vials, which are placed in sterile cassettes. When packaged in 2.0 cm 3 penicillin vials, the titer of cell-free virus should be at least 2.0 • 10 5 IU / cm 3 and when packaged in 1 cm 3 bottles should not be lower than 4.0-10 5 IU / cm 3 . The cassettes are covered with 2-layer sterile gauze and loaded into the refrigerator for freezing.
Процесс замораживания и сушки контролируется температурными датчиками. Вакцину замораживают до -45oC. Замороженную вакцину подвергают высушиванию методом сублимации. Сушка продолжается 24-28 часов. После окончания сушки флаконы с вакциной укупоривают пробками и закатывают металлическими колпачками. Готовую вакцину контролируют в соответствии с ТУ. Стабильность вируса в вакцине проверяют по величине снижения титра его инфекционности после хранения образцов сухой вакцины в течение 1 мес. при 4-6oC. Титр вируса при хранении в указанных условиях практически не меняется.The freezing and drying process is controlled by temperature sensors. The vaccine is frozen to -45 o C. The frozen vaccine is subjected to freeze-drying. Drying lasts 24-28 hours. After drying, the vaccine bottles are corked and sealed with metal caps. The finished vaccine is controlled in accordance with TU. The stability of the virus in the vaccine is checked by the magnitude of the decrease in the titer of its infectivity after storage of samples of the dry vaccine for 1 month. at 4-6 o C. The titer of the virus during storage under these conditions practically does not change.
Сухая культуральная вирусвакцина против БМ представляет собой заключенную во флаконы однородную мелкопористую массу белого цвета в виде таблетки цилиндрической формы. Срок годности вакцины 12 месяцев со дня изготовления при условии соблюдения правил хранения и транспортирования. Dry culture virus vaccine against BM is a homogeneous finely porous white mass enclosed in bottles in the form of a cylindrical tablet. The shelf life of the vaccine is 12 months from the date of manufacture, subject to the rules of storage and transportation.
Полученная сухая вирусвакцина против БМ имеет оптимальный компонентный состав, мас.%:
клеточно-свободный штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ - 40-60
защитная среда - остальное
Пример 2
Проведены испытания сухой вирусвакцины против БМ, содержащей, мас.%:
клеточно-свободный штамм "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ - 50
защитная среда - 50
Для определения иммуногенной активности полученной вакцины использовали односуточных цыплят. Для этого были сформированы 4 группы цыплят:
1 группа - контроль опыта;
2 группа - контроль вирулентного вируса;
3 группа - вакцинирована лиофилизированной вакциной на основе штамма "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ;
4 группа - вакцинирована лиофилизированной вакциной на основе штамма FC-126 ВГИ.The resulting dry anti-BM virus vaccine has an optimal component composition, wt.%:
cell-free strain "ARRIAH / N110" VGI - 40-60
protective environment - the rest
Example 2
Tests of dry virus vaccine against BM containing, wt.%:
cell-free strain "ARRIAH / N110" VGI - 50
protective environment - 50
One-day old chickens were used to determine the immunogenic activity of the obtained vaccine. For this, 4 groups of chickens were formed:
1 group - control of experience;
Group 2 - control of the virulent virus;
Group 3 - vaccinated with a lyophilized vaccine based on the strain "ARRIAH / N110"VGI;
Group 4 - vaccinated with a lyophilized vaccine based on strain FC-126 VGI.
Лиофилизированные вакцины разводили дистиллированной водой. Цыплятам вводили вакцины в объеме 0,2 см3 внутримышечно в области бедра. Через 14 дней после вакцинации цыплята групп 2, 3 и 4 были подвергнуты контрольному заражению вирулентным штаммом "Конкур" вируса БМ в объеме 0,2 см3 внутримышечно. Продолжительность испытаний зависела от падежа 60% голов контрольной группы, что составило 150 дней. На протяжении всего опыта за птицей вели клиническое наблюдение. Всех павших цыплят вскрывали и учитывали патологические изменения внутренних органов, на 65 и 150 дни было проведено контрольное взвешивание.Lyophilized vaccines were diluted with distilled water. The chickens were injected with vaccines in a volume of 0.2 cm 3 intramuscularly in the thigh. 14 days after vaccination, chickens of
Эффективность вакцинации определяли после убоя подопытной птицы с учетом изменений как при вскрытии, так и данных вскрытия павшей в процессе опыта птицы. The effectiveness of vaccination was determined after slaughter of the experimental bird, taking into account changes both during the autopsy and the autopsy data of the dead bird during the experiment.
Эффективность рассчитывали по формуле
где Э - эффективность вакцинации в %;
В - % птицы с признаками болезни Марека в вакцинированной группе;
К - % птицы с признаками болезни Марека в контрольной группе.Efficiency was calculated by the formula
where E is the vaccination efficiency in%;
In -% of birds with signs of Marek's disease in the vaccinated group;
K -% of birds with signs of Marek's disease in the control group.
Результаты эксперимента по определению иммуногенности образцов лиофилизированных вакцин против БМ представлены в таблице 3. The results of the experiment to determine the immunogenicity of samples of lyophilized vaccines against BM are presented in table 3.
Пример 3
Проведена оценка эффективности применения сухой вирусвакцины против БМ из штамма "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ в условиях птицефабрики "Дружба" Барановичского района Брестской области Республики Беларусь. Опыт проведен на суточных цыплятах-бройлерах в период откорма в течение 47,5 дней. Испытание проводилось в птичнике N 29 бригады 3. Результаты испытаний представлены в таблице 4.Example 3
The effectiveness of the use of dry virus vaccine against BM from the strain "ARRIAH / N110" VGI in the conditions of the poultry farm "Friendship" in the Baranavichy district of the Brest region of the Republic of Belarus was evaluated. The experiment was conducted on daily broiler chickens during the fattening period for 47.5 days. The test was carried out in the house No. 29 of
Приведенные в таблице 4 данные свидетельствуют о положительном влиянии проведенной вакцинации суточных цыплят-бройлеров на производственные показатели. The data presented in table 4 indicate the positive impact of the vaccination of broiler chickens on production indicators.
Пример 4
Проведена оценка эффективности применения сухой вирусвакцины против БМ из штамма "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ в условиях птицефабрики "Васильевская" в Пензенской области. Опыт проведен на суточных цыплятах-бройлерах в период откорма. Результаты испытаний представлены в таблице 5.Example 4
The effectiveness of the use of dry virus vaccine against BM from the strain "ARRIAH / N110" VGI in the conditions of the Vasilievskaya poultry farm in the Penza region was assessed. The experiment was carried out on daily broiler chickens during the fattening period. The test results are presented in table 5.
Согласно приведенным в таблице 5 данным сохранность поголовья в опытных партиях повысилась по сравнению с контрольными в среднем на 5,5%. According to the data in table 5, the safety of livestock in the experimental batches increased compared with the control by an average of 5.5%.
Пример 5
Проведена оценка эффективности применения сухой вирусвакцины против БМ из штамма "ВНИИЗЖ/N110" ВГИ в условиях ОАО "Тольяттинская птицефабрика". Было провакцинировано 87 000 голов суточных цыплят-бройлеров сухой культуральной вакциной против БМ из штамма "ВНИИЗЖ/N110" (2 напольных корпуса и 1 клеточный). В качестве контроля было взято также 2 напольных корпуса и 1 клеточный корпус в количестве 88770 голов.Example 5
The effectiveness of the use of dry virus vaccine against BM from the strain "ARRIAH / N110" VGI in the conditions of OJSC "Togliatti poultry factory" was evaluated. 87,000 heads of daily broiler chickens were vaccinated with a dry culture vaccine against BM from the strain "ARRIAH / N110" (2 floor cases and 1 cage). As control was also taken 2 floor cases and 1 cage case in the amount of 88770 heads.
Результаты испытаний приведены в таблице 6. The test results are shown in table 6.
Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании группы предлагаемых изобретений следующей совокупности условий:
- сухая вирусвакцина против БМ на основе штамма "ВНИИЗЖ/N110" и способ ее изготовления, воплощающие предлагаемые изобретения, предназначены для использования в сельском хозяйстве, в именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;
- для группы предлагаемых изобретений в том виде, как они охарактеризованы в независимых пунктах формулы изобретения, подтверждена возможность их осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- при использовании предлагаемых сухой вирусвакцины и способа ее изготовления достигается технический результат, предусмотренный задачей создания изобретения. Следовательно, предлагаемая группа изобретений соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".Thus, the above information indicates the fulfillment of the following set of conditions when using the group of proposed inventions:
- dry anti-BM virus vaccine based on the strain "ARRIAH / N110" and the method of its manufacture embodying the present invention are intended for use in agriculture, in particular in veterinary virology and biotechnology;
- for the group of proposed inventions in the form as described in the independent claims, the possibility of their implementation using the means and methods described in the application or known prior to the priority date is confirmed;
- when using the proposed dry virus vaccines and methods for its manufacture, a technical result is achieved, provided for by the task of creating the invention. Therefore, the proposed group of inventions meets the condition of patentability "industrial applicability".
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания на группу изобретений к заявке на выдачу патента РФ на "Сухую вирусвакцину против БМ и способа ее изготовления"
1. Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП, 1998, с. 689-721.Sources of information taken into account when compiling a description of a group of inventions to the application for the grant of a patent of the Russian Federation for "Dry virus vaccine against BM and its manufacturing method"
1. Syurin V.N. and other viral diseases of animals. - M.: VNITIBP, 1998, p. 689-721.
2. Пат. ГДР N 209738, А 61 К 39/255, С 12 N 7/00, 23.05.84. 2. Pat. GDR N 209738, A 61 K 39/255, C 12
3. Пат. PCT N 93/18790, А 61 К 39/12, 39/15, 39/255, 30.09.93. 3. Pat. PCT N 93/18790, A 61 K 39/12, 39/15, 39/255, 09/30/93.
4. Пат. ЕПВ N 0496135, А 61 К 39/255, 27.07.94. 4. Pat. EPO N 0496135, A 61 K 39/255, 07.27.94.
5. Пат. ЕПВ N 0703294, C 12 N 7/00, A 61 K 39/255, 27.03.96. 5. Pat. EPO N 0703294, C 12
6. Пат. PCT N93/23078, A 61 К 39/255, 25.11.93 (прототип). 6. Pat. PCT N93 / 23078, A 61 K 39/255, 11.25.93 (prototype).
7. Коровин Р.Н. Особенности эпизоотологии БМ и организации мер борьбы с ней в птицеводческих хозяйствах промышленного типа: Автореф. дис. д-ра вет. наук. - Л., 1989, 34 с. 7. Korovin R.N. Features of the epizootology of BM and the organization of measures to combat it in industrial poultry farms: Abstract. dis. Dr. Vet. sciences. - L., 1989, 34 p.
8. Лукина В.А., Коровин Р.Н., Деревлева Т.А. Стабильность штаммов вируса герпеса индеек по некоторым показателям эффективности вакцины против БМ. Передовой научно-производ. опыт в биол. пром. - М., 1987, 24 с. 8. Lukina V.A., Korovin R.N., Derevleva T.A. The stability of turkey herpes virus strains according to some indicators of the effectiveness of the vaccine against BM. Advanced scientific production. experience in biol. prom - M., 1987, 24 p.
9. Авт.свид. СССР N 792643, А 61 К 39/255, 1979. 9. Autosvid. USSR N 792643, A 61 K 39/255, 1979.
10. Никитин Е. Е. , Токарик Э.Ф., Слепенко Т.Б. и др. Получение сухой вакцины против болезни Марека. - Ветеринария, 1973, 12, с. 45-47. 10. Nikitin E.E., Tokarik E.F., Slepenko T.B. et al. Obtaining a dry vaccine against Marek’s disease. - Veterinary medicine, 1973, 12, p. 45-47.
11. Слепенко Т. Б., Лукина В.А., Адамушкин В.Е. Размножение вакцинного вируса в организме цыплят, привитых вакциной против болезни Марека. Передовой научно-производ. опыт в биол. пром. - М., 1980, 5. 11. Slepenko T. B., Lukina V. A., Adamushkin V. E. Propagation of the vaccine virus in chickens vaccinated with the Marek disease vaccine. Advanced scientific production. experience in biol. prom - M., 1980, 5.
12. Слепенко Т.Б. и др. Получение и титрование свободного от клеток ВГИ. Труды ВГНКИ, 1975, 21, с. 49-54. 12. Slepenko T.B. and others. Obtaining and titration of cell-free VGI. Proceedings of VGNKI, 1975, 21, p. 49-54.
13. Calnak B.W. et al. Lyophilization of cell free Marek's disease herpesvirus and a herpesvirus from turkeys. - Appl. Microbiol, 1970. P. 20. 13. Calnak B.W. et al. Lyophilization of cell free Marek's disease herpesvirus and a herpesvirus from turkeys. - Appl. Microbiol, 1970. P. 20.
14. Witter R.L Protection by attenuated and polyvalent vaccines against highly virulent strains of Marek's disease virus. - Avian Pathol., 1989, 11, 1. 14. Witter R. L Protection by attenuated and polyvalent vaccines against highly virulent strains of Marek's disease virus. - Avian Pathol., 1989, 11, 1.
Claims (7)
3. Сухая вирусвакцина по п.1, отличающаяся тем, что в качестве защитной среды вакцина содержит 8%-ный раствор сахарозы в фосфатном буфере.2. The dry virus vaccine according to claim 1, characterized in that the vaccine contains a strain of VGNKI "ARRIAH / 110-DEPT" of turkey herpes virus with a biological activity of at least 2 • 10 5 FOU / cm 3 ,
3. The dry virus vaccine according to claim 1, characterized in that, as a protective medium, the vaccine contains an 8% solution of sucrose in phosphate buffer.
Клеточно-свободный штамм ВГНКИ "ВНИИЗЖ/ 110-ДЕП" - 40 - 60
Защитная среда - Остальное
5. Способ изготовления сухой вирусвакцины против болезни Марека, включающий инфицирование культуры клеток штаммом вируса герпеса индеек 3 серотипа, инкубирование зараженной культуры, сбор вируссодержащей клеточной массы, добавление защитной среды, обработку вируссодержащей суспензии ультразвуком, замораживание вируссодержащей суспензии и лиофилизацию целевого продукта, отличающийся тем, что из штаммов 3 серотипа используют штамм вируса герпеса индеек, сем. Herpesviridae, род Herpesvirus, ВГНКИ "ВНИИЗЖ/ 110-ДЕП" в эффективном количестве.4. Dry virus vaccine according to claim 1 or 3, characterized in that the cell-free strain VGNKI "ARRIAH / 110-DEPT" and the protective medium are taken in the ratio, wt.%:
Cell-free strain VGNKI "ARRIAH / 110-DEPT" - 40 - 60
Protective Environment - Else
5. A method of manufacturing a dry vaccine against Marek’s disease, including infection of a cell culture with a turkey herpes virus strain 3 serotypes, incubating the infected culture, collecting virus-containing cell mass, adding a protective medium, sonication of the virus-containing suspension, freezing of the virus-containing suspension, and lyophilization of the target product, characterized in that of strains 3 of the serotype, a turkey herpes virus strain is used, sem. Herpesviridae, genus Herpesvirus, VGNKI "ARRIAH / 110-DEPT" in an effective amount.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99113381A RU2144376C1 (en) | 1999-06-28 | 1999-06-28 | Dry virus-vaccine against mareck's disease and method of its preparing |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU99113381A RU2144376C1 (en) | 1999-06-28 | 1999-06-28 | Dry virus-vaccine against mareck's disease and method of its preparing |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2144376C1 true RU2144376C1 (en) | 2000-01-20 |
Family
ID=20221630
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU99113381A RU2144376C1 (en) | 1999-06-28 | 1999-06-28 | Dry virus-vaccine against mareck's disease and method of its preparing |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2144376C1 (en) |
-
1999
- 1999-06-28 RU RU99113381A patent/RU2144376C1/en not_active IP Right Cessation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110218706B (en) | Construction and application of recombinant turkey herpesvirus expressing HA protein of H7N9 subtype highly pathogenic avian influenza virus | |
| JP2017526737A (en) | Recombinant serotype 9 avian adenovirus vector vaccine | |
| CN113491767A (en) | Triple inactivated vaccine for duck circovirus disease, novel duck reovirus disease and duck viral hepatitis and preparation method thereof | |
| CN112341539B (en) | Yolk antibody for preventing and treating novel goose astrovirus with cross-species transmission capability and preparation method thereof | |
| CN113384692A (en) | Duck reovirus and duck circovirus bivalent inactivated vaccine and preparation method thereof | |
| RU2144376C1 (en) | Dry virus-vaccine against mareck's disease and method of its preparing | |
| JP2024501943A (en) | Multivalent HVT vector vaccine | |
| RU2410117C1 (en) | Viral vaccine against marek's disease | |
| RU2144378C1 (en) | Virus-vaccine against mareck's disease and method of its preparing | |
| RU2205660C2 (en) | Virus vaccine against marek's disease | |
| RU2144377C1 (en) | Bivalent vaccine against mareck's disease and method of its preparing | |
| RU2144562C1 (en) | Turkey herpes virus strain "vniizzh/n 110" for preparing vaccine against mareck's disease | |
| CN102764432A (en) | Chinese giant salamander viral hemorrhagic disease cell culture-based inactivated vaccine, its preparation method and application thereof | |
| RU2294760C2 (en) | Sorbed inactivated vaccine against foot-and-mouth disease of type a | |
| RU2209635C2 (en) | Method for preparing virus-vaccine against mareck's disease | |
| RU2332234C1 (en) | Method of virus vaccine production against classical swine fever | |
| RU2336303C1 (en) | Industrial strain "vladimir" of turkey herpesvirus for viral vaccine for marek's disease | |
| RU2199583C1 (en) | Mareck's disease virus strain 3004/ 109 for vaccine preparation preparing | |
| RU2297452C2 (en) | Asia-1-type foot-and-mouth disease virus strain for producing of diagnostic and/or vaccine preparations | |
| RU2631925C2 (en) | Strain "shevchenko-2014" of rabbit hemorrhagic disease virus for preparing vaccines, diagnostic and therapeutic preparations | |
| RU2526570C2 (en) | Inactivated sorbent type a foot-and-mouth disease vaccine | |
| RU2806164C1 (en) | Associated vaccine against canine distemper, parvovirus and coronavirus enteritis, adenovirus infection of dogs | |
| CN116731982B (en) | Duck plague herpesvirus gene deletion attenuated vaccine strain, construction method and application thereof | |
| CN113355293B (en) | Gosling plague virus vaccine strain, vaccine and egg yolk antibody based on vaccine | |
| RU2785113C1 (en) | Fmd vaccine (options) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20120629 |