RU2631925C2 - Strain "shevchenko-2014" of rabbit hemorrhagic disease virus for preparing vaccines, diagnostic and therapeutic preparations - Google Patents
Strain "shevchenko-2014" of rabbit hemorrhagic disease virus for preparing vaccines, diagnostic and therapeutic preparations Download PDFInfo
- Publication number
- RU2631925C2 RU2631925C2 RU2015133685A RU2015133685A RU2631925C2 RU 2631925 C2 RU2631925 C2 RU 2631925C2 RU 2015133685 A RU2015133685 A RU 2015133685A RU 2015133685 A RU2015133685 A RU 2015133685A RU 2631925 C2 RU2631925 C2 RU 2631925C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- strain
- rabbits
- virus
- shevchenko
- hemorrhagic disease
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, биотехнологии и может быть использовано для изготовления вакцинных, диагностических и лечебных препаратов.The invention relates to the field of veterinary virology, biotechnology and can be used for the manufacture of vaccine, diagnostic and therapeutic drugs.
Вирусная геморрагическая болезнь кроликов - ВГБК (геморрагическая пневмония кроликов, некротический гепатит) - высококонтагиозная, остропротекающая инфекционная болезнь, характеризующаяся явлениями геморрагического синдрома во всех органах, в особенности в легких и печени, вызываемая вирусом семейства Caliciviridae, род Lagovirus, наносящая значительный экономический ущерб кролиководству. Болеют ВГБК кролики разных возрастных групп, но чаще старше 1,5-месячного возраста. Другие виды животных и человек не болеют. При ВГБК заболеваемость достигает 70-80%, а летальность - 90-100%. Болезнь широко распространена в мире среди европейских кроликов (Oryctolagus cuniculus), могут болеть и зайцы.Rabbit viral hemorrhagic disease - HBVC (rabbit hemorrhagic pneumonia, necrotic hepatitis) is a highly contagious, acute leaking infectious disease characterized by hemorrhagic syndrome in all organs, especially in the lungs and liver, caused by the virus of the family Caliciviridae, a genus of Lagovirus, causing significant economic damage to rabbits. Rabbits of different age groups are affected by HBV, but more often older than 1.5 months of age. Other types of animals and humans do not get sick. With HBV, the incidence reaches 70-80%, and mortality - 90-100%. The disease is widespread in the world among European rabbits (Oryctolagus cuniculus), and hares can also get sick.
Экономический ущерб от ВГБК значительный, который складывается из-за массовой заболеваемости и гибели кроликов всех возрастных групп.The economic damage from HBVC is significant, which is due to the mass incidence and death of rabbits of all age groups.
Самой надежной защитой кроликов против ВГБК является профилактическая вакцинация, которая занимает основное место при выполнении противоэпизоотических мероприятий. Для специфической профилактики вирусной геморрагической болезни кроликов применяют инактивированные моно- и ассоциированные вакцины, ранее разработанные нами [1, 2]. Рекомбинантные вакцины против ВГБК в настоящее время коммерческого применения пока не нашли.The most reliable protection of rabbits against HBV is prophylactic vaccination, which takes the main place when performing anti-epizootic measures. For specific prophylaxis of rabbit viral hemorrhagic disease, inactivated mono- and associated vaccines, previously developed by us, are used [1, 2]. Recombinant vaccines against HBV have not yet been found commercial use.
Исследованиями зарубежных и отечественных ученых за последнее десятилетие установлено, что все выделенные изоляты вируса ВГБК в период эпизоотии принадлежат к одному серотипу. При секвенировании выделенных изолятов вируса ВГБК установлено, что в консервативных областях генома они имеют отличия по аминокислотному составу в пределах от 2 до 7%. Зарубежные исследователи установили, что выделенные в последние годы температурозависимые изоляты вируса ВГБК в Германии, Италии значительно отличаются по гемагглютинирующим свойствам при более низкой температуре +4°C и по аминокислотному составу от ранее известных вирусов ВГБК в области Е генома, где у представителей семейства Caliciviridae представлены основные антигенные детерминанты [3, 4].Studies of foreign and domestic scientists over the past decade have established that all isolated isolates of the HBVC virus during the epizootic period belong to the same serotype. When sequencing the selected isolates of HBVV virus, it was found that in the conservative regions of the genome they have differences in amino acid composition in the range from 2 to 7%. Foreign researchers have found that the temperature-dependent isolates of HBV virus isolated in recent years in Germany and Italy differ significantly in hemagglutinating properties at a lower temperature of + 4 ° C and in amino acid composition from previously known HBV viruses in region E of the genome, where representatives of the family Caliciviridae have main antigenic determinants [3, 4].
Известны штаммы «Воронежский-87», «Белгородский-03» и «Манихино-09», официально депонированные в коллекциях ФГУ «ВГНКИ» и ГНУ ВНИИВВИМ для изготовления инактивированных вакцин против ВГБК [5, 6, 7].Known strains "Voronezh-87", "Belgorod-03" and "Manikhino-09", officially deposited in the collections of the Federal State Institution "VGNKI" and GNU VNIIVVIM for the manufacture of inactivated vaccines against VGBK [5, 6, 7].
Однако кролики, привитые вакциной, изготовленной из ранее выделенных изолятов вируса, не имеют специфической защиты против выделяемых изолятов вируса ВГБК в последние годы. Поэтому необходимо вести эпизоотологический, вирусологический, генетический мониторинг и сравнение гемагглютинирующих и иммунологических свойств вновь выделяемых изолятов вируса ВГБК в очагах инфекции, иметь в музейных коллекциях штаммы вируса геморрагической болезни кроликов, что позволит изготавливать из них специфические диагностические, лечебные препараты и высокоэффективные вакцины для защиты кроликов против ВГБК.However, rabbits vaccinated with a vaccine made from previously isolated virus isolates do not have specific protection against isolated HBV virus isolates in recent years. Therefore, it is necessary to conduct epizootological, virological, genetic monitoring and comparison of the hemagglutinating and immunological properties of newly isolated HBV virus isolates in the foci of infection, to have the rabbit hemorrhagic disease virus strains in museum collections, which will make it possible to produce specific diagnostic, therapeutic drugs and highly effective vaccines for protecting rabbits from them against VGBK.
Целью настоящего изобретения явилось получение нового производственного штамма вируса геморрагической болезни кроликов, сохраняющего свои иммунологические свойства после инактивации и пригодного для изготовления высокоиммуногенных вакцин, диагностических и лечебных препаратов.The aim of the present invention was to obtain a new production strain of the virus of hemorrhagic disease of rabbits, retaining its immunological properties after inactivation and suitable for the manufacture of highly immunogenic vaccines, diagnostic and therapeutic drugs.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала штаммов вируса геморрагической болезни кроликов, отличающихся геномом и иммунологическими свойствами, обладающих высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, сохраняющих свои иммунобиологические свойства после инактивации, пригодных для изготовления высокоэффективных вакцин, диагностических и лечебных препаратов.The technical result from the use of the present invention is to expand the arsenal of strains of the virus of hemorrhagic disease of rabbits, differing in genome and immunological properties, with high biological, antigenic and immunogenic activity, retaining their immunobiological properties after inactivation, suitable for the manufacture of highly effective vaccines, diagnostic and therapeutic drugs.
Данный технический результат достигнут получением штамма «Шевченко-2014» вируса геморрагической болезни кроликов. Штамм «Шевченко-2014» является новым и ранее неизвестным.This technical result was achieved by obtaining the strain "Shevchenko-2014" virus of hemorrhagic disease of rabbits. The strain "Shevchenko 2014" is new and previously unknown.
Полученный штамм депонирован под номером 55 в Автономной некоммерческой организации «Научно-исследовательский институт диагностики и профилактики болезней человека и животных» г. Москва и хранится в ФГУП «Армавирская биофабрика». Штамм «Шевченко-2014» отличается от ранее депонированных штаммов ВГБК «Воронежский-87», «Белгородский-03» и «Манихино-09» на 5-7% по нуклеотидным последовательностям консервативной области гена VP-60. Штаммы, указанные выше, основываясь на результатах филогенетического анализа, относятся к разным геногруппам.The resulting strain was deposited at number 55 in the Autonomous non-profit organization "Research Institute for Diagnosis and Prevention of Human and Animal Diseases" in Moscow and is stored in the Armavir Biofactory Federal State Unitary Enterprise. The strain Shevchenko 2014 differs from the previously deposited strains of VGBK Voronezhsky-87, Belgorodsky-03, and Manikhino-09 by 5-7% in the nucleotide sequences of the conserved region of the VP-60 gene. The strains indicated above, based on the results of phylogenetic analysis, belong to different genogroups.
Штамм «Шевченко-2014» обеспечивает проведение серологической диагностики вирусной геморрагической болезни кроликов и производство высокоэффективной инактивированной вакцины против ВГБК, создающей надежную защиту диких и домашних европейских кроликов против ВГБК.Strain "Shevchenko-2014" provides a serological diagnosis of viral hemorrhagic disease of rabbits and the production of highly effective inactivated vaccine against HBV, which creates reliable protection for wild and domestic European rabbits against HBV.
Штамм «Шевченко-2014» вируса геморрагической болезни кроликов характеризуется следующими признаками и свойствами.The strain "Shevchenko-2014" virus of hemorrhagic disease of rabbits is characterized by the following signs and properties.
Таксономическая характеристика заключается в том, что штамм «Шевченко-2014» имеет форму и размеры, типичные для семейства Caliciviridae. В серологических реакциях (РЗГА, РСК, ИФА, РДП) выявляются антигены, общие для всех штаммов вируса геморрагической болезни кроликов. Основные маркерные характеристики штамма «Шевченко-2014» вируса геморрагической болезни кроликов приведены в таблице 1.The taxonomic characteristic is that the Shevchenko-2014 strain has the shape and dimensions typical of the Caliciviridae family. In serological reactions (RSHA, RSK, ELISA, RDP) antigens are detected that are common to all strains of the rabbit hemorrhagic disease virus. The main marker characteristics of the strain "Shevchenko-2014" virus of hemorrhagic disease of rabbits are shown in table 1.
Сущность предлагаемого изобретения поясняется примерами его исполнения.The essence of the invention is illustrated by examples of its implementation.
Пример 1Example 1
Для получения вируса геморрагической болезни кроликов штамм «Шевченко-2014» используют три ампулы с вирусом, на уровне первого пассажа на кроликах, павших от введения им 10% суспензии печени от кроликов, павших в фермерском хозяйстве Краснодарского края в январе 2014 года (инфекционная активность не ниже 104,0 ЛД50/см3). В каждую ампулу вносят стерильный растворитель (дистиллированная вода или физиологический раствор, рН 7,0-7,4) до объема, указанного на этикетке. Затем содержимое ампул объединяют и из общей пробы готовят разведение вируса на физиологическом растворе таким образом, чтобы в конечном разведении содержалось 100 ЛД50/см3. Указанное разведение вируса вводят внутримышечно 5 кроликам в объеме 1,0 см3. Инфицированных кроликов содержат в оборудованном инфекционном виварии в индивидуальных клетках.To obtain the virus of hemorrhagic disease of rabbits, the Shevchenko-2014 strain uses three ampoules with the virus, at the level of the first passage, on rabbits who died from the introduction of a 10% suspension of the liver from rabbits that fell on a farm in the Krasnodar Territory in January 2014 (infectious activity below 10 4.0 LD 50 / cm 3 ). A sterile solvent (distilled water or physiological saline, pH 7.0-7.4) is added to each ampoule to the volume indicated on the label. Then the contents of the ampoules are combined and the virus is diluted in physiological saline in such a way that 100 LD 50 / cm 3 is contained in the final dilution. The indicated dilution of the virus is administered intramuscularly to 5 rabbits in a volume of 1.0 cm 3 . Infected rabbits are kept in equipped infectious vivarium in individual cages.
У зараженных кроликов вирусом ВГБК через 14-24 ч отмечают характерные клинические признаки болезни: угнетение, отказ от корма, повышение температуры тела до 40,7°C, носовое кровотечение и гибель в течение 24-96 ч. Трупы животных во вскрывочной комнате инфекционного вивария подвешивают на вешалки, снимают шкурки, обрабатывают брюшную полость раствором марганцевокислого калия (1:10000), разрезают брюшные мышцы по белой линии, извлекают печень, отделяют желчный пузырь. Печень используют только от трупов, при вскрытии которых обнаружены специфические патологоморфологические изменения, характерные для ВГБК: кровоизлияния в трахее, под капсулой почек, селезенки, геморрагическая пневмония, печень дряблой консистенции, легко рвется и имеет желто-коричневый цвет, местами с красноватым оттенком. Отмечают некроз печени и увеличение селезенки. Наблюдают инфаркты почти во всех органах, почки имеют темно-коричневый цвет.In rabbits infected with HBV virus, characteristic clinical signs of the disease are noted after 14-24 hours: depression, refusal to feed, fever up to 40.7 ° C, nosebleeds and death within 24-96 hours. The corpses of animals in the opening room of the infectious vivarium suspended on hangers, removed the skins, treated the abdominal cavity with a solution of potassium permanganate (1: 10000), cut the abdominal muscles along the white line, remove the liver, and separate the gall bladder. The liver is used only from corpses, the autopsy of which revealed specific pathological and morphological changes characteristic of HBVC: hemorrhage in the trachea, under the capsule of the kidneys, spleen, hemorrhagic pneumonia, liver of loose texture, is easily torn and has a yellow-brown color, sometimes with a reddish tint. Liver necrosis and enlarged spleen are noted. Heart attacks are observed in almost all organs, the kidneys are dark brown in color.
Печень помещают в стерильные флаконы, плотно укупоривают, снаружи дезинфицируют 5%-ным раствором хлорамина, помещают в термос со льдом и доставляют в стерильный бокс.The liver is placed in sterile vials, sealed tightly, disinfected externally with a 5% solution of chloramine, placed in a thermos with ice and delivered to a sterile box.
Каждый образец печени готовят отдельно, используя отдельную стерильную посуду. Образец печени измельчают ножницами, добавляют стерильный ФСБ (соотношение 1:10 - вес/объем), гомогенизируют в блендере при охлаждении в течение 10 мин. Отбирают в отдельную стерильную пробирку типа «Eppendorf» для идентификации в ПЦР. Затем суспензию печени центрифугируют в течение 1 ч при 6000 g при 4°C. Супернатант ультрацентрифугируют при 80000 g в течение 2 ч при 4°C, через 20%-ный раствор сахарозы. Осадок ресуспендируют в ФСБ 1/100 от начального объема.Each liver sample is prepared separately using separate sterile dishes. A liver sample is ground with scissors, sterile FSB is added (ratio 1:10 - weight / volume), homogenized in a blender with cooling for 10 minutes. Selected into a separate sterile tube type "Eppendorf" for identification in PCR. Then the liver suspension is centrifuged for 1 h at 6000 g at 4 ° C. The supernatant is ultracentrifuged at 80,000 g for 2 hours at 4 ° C through a 20% sucrose solution. The precipitate was resuspended in FSB 1/100 of the initial volume.
Для получения результатов молекулярно-генетической характеристики штамма «Шевченко-2014» вируса геморрагической болезни кроликов было проведено нуклеотидное секвенирование консервативной области гена VP-60, длиной 510 пар нуклеотидов.To obtain the results of the molecular genetic characteristics of the Shevchenko 2014 strain of the rabbit hemorrhagic disease virus, nucleotide sequencing of the conserved region of the VP-60 gene, 510 nucleotides long, was performed.
РНК из образца выделяли с использованием сорбента (Silica). Полученная РНК была использована для проведения обратной транскрипции-амплификации (ОТ-ПЦР). Обратная транскрипция проводилась совместно в одной пробирке. Реакционная смесь содержала: 16 mM TrisHCl, 82 mM KCl, 2,4 mM MgCl2, Triton ×100 1%, праймеры - по 10 пмоль каждого, по 0,25 mMdNTPs, 5 ед. taq-полимеразы, 25 ед. M-MLV Reverse Transcriptase.RNA from the sample was isolated using a sorbent (Silica). The resulting RNA was used for reverse transcription amplification (RT-PCR). Reverse transcription was performed together in one tube. The reaction mixture contained: 16 mM TrisHCl, 82 mM KCl, 2.4 mM MgCl2, Triton × 100 1%, primers 10 pmol each, 0.25 mMdNTPs, 5 units. taq polymerase, 25 units M-MLV Reverse Transcriptase.
Обратная транскрипция проводилась 50 мин. при 50°C. ПЦР включала 35 циклов (94°C × 20 с, 50°C × 20 с, 72°C × 30 с). Использовавшиеся праймеры, амплифицируют участок гена, кодирующего структурный белок VP60 ВГБК длиной 510 пар оснований (позиции 5182-5692 в геноме вируса). Амплифицируемый фрагмент гена кодирует N-концевой регион белка. Праймеры имеют следующий состав:Reverse transcription was performed for 50 minutes. at 50 ° C. PCR included 35 cycles (94 ° C × 20 s, 50 ° C × 20 s, 72 ° C × 30 s). The primers used amplify a portion of the gene encoding the VP60 HBVA structural protein with a length of 510 base pairs (positions 5182-5692 in the virus genome). The amplified gene fragment encodes the N-terminal region of the protein. Primers have the following composition:
Электрофорез полученного в ходе ПЦР амплификата показал наличие фрагмента специфического размера. ПЦР-фрагмент, после очистки из агарозного геля с помощью коммерческого набора Silica Bead DNA Gel Extraction kit (Fermentas, Латвия), использовали для секвенирования. Использовался 4-канальный капиллярный секвенатор Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (США). Полученная последовательность далее была проанализирована с использованием программы BLAST (http://blast.bemd.ncbi.nlm.nih.gov). Результаты позволяют однозначно говорить о соответствии исследовавшегося фрагмента нуклеотидной последовательности гена VP60 ВГБК. Наиболее близкими оказались соответствующие участки геномов следующих штаммов ВГБК: изолят HYD (JF412629), изолят NJ-2009 (НМ623309), штамм Erfurt (EF558581)Electrophoresis obtained during PCR amplification showed the presence of a fragment of a specific size. The PCR fragment, after purification from agarose gel using a commercial Silica Bead DNA Gel Extraction kit (Fermentas, Latvia), was used for sequencing. A 4-channel capillary sequencer Applied Biosystems 3130 Genetic Analyzer (USA) was used. The resulting sequence was further analyzed using the BLAST program (http://blast.bemd.ncbi.nlm.nih.gov). The results allow us to unequivocally talk about the correspondence of the studied fragment of the nucleotide sequence of the VP60 gene of HBBC. The closest were the corresponding regions of the genomes of the following HBVC strains: HYD isolate (JF412629), NJ-2009 isolate (NM623309), Erfurt strain (EF558581)
Последовательность гена, кодирующего структурный белок VP60 ВГБКThe sequence of the gene encoding the structural protein VP60 HBBC
Вируссодержащий материал исследуют в соответствии с рекомендациями МЭБ по стандартным диагностическим методам и вакцинам (2004) на отсутствие контаминации микоплазмами, бактериями и грибами путем посева на чувствительные питательные среды. Отсутствие контаминации посторонними вирусами и идентификацию вируса геморрагической болезни кроликов определяют методом негативного контрастирования электронной микроскопией. Определяют инфекционную активность на кроликах, гемагглютинирующую активность в РГА, антигенную активность в ТФ ИФА, специфичность в ТФ ИФА и РЗГА и на уровне 2 пассажа на кроликах вирус был расфасован, лиофилизирован и запаян в ампулы под вакуумом и заложен на хранение при температуре не выше минус 40°C в качестве Master seed (M.s.) с титром инфекционной активности не ниже 5,0 lg LD50/см3. Полученному штамму вируса геморрагической болезни кроликов присвоено авторское название «Шевченко-2014».Virus-containing material is examined in accordance with the recommendations of the OIE for standard diagnostic methods and vaccines (2004) for the absence of contamination with mycoplasmas, bacteria and fungi by plating on sensitive nutrient media. The absence of contamination with extraneous viruses and the identification of the rabbit hemorrhagic disease virus are determined by negative contrast electron microscopy. Infectious activity in rabbits, hemagglutinating activity in RGA, antigenic activity in TF ELISA, specificity in TF ELISA and RHA and at the level of passage 2 on rabbits are determined, the virus was packaged, lyophilized and sealed in ampoules under vacuum and stored at a temperature not exceeding minus 40 ° C as a Master seed (Ms) with a titer of infectious activity of at least 5.0 lg LD 50 / cm 3 . The resulting strain of the virus of hemorrhagic disease of rabbits is assigned the copyright name "Shevchenko-2014".
Пример 2Example 2
С целью определения биологической, антигенной и иммуногенной активности вируса геморрагической болезни кроликов штамма «Шевченко-2014» проводят гипериммунизацию клинически здоровых кроликов из благополучных по инфекционным и инвазионным болезням хозяйств, живой массой не менее 2,0 кг, согласно 2-ой схеме получения специфической сыворотки для лечения, диагностики и профилактики ВГБК (патент №2077340 от 06.08.93 г., авторы: Шевченко А.А. и др.). Для гипериммунизации кроликов используют тканевую инактивированную вакцину, изготовленную из штамма «Шевченко-2014» вируса геморрагической болезни кроликов в дозе 0,5 мл на голову путем внутримышечного двукратного введения с интервалом 14 дней. Через 14 дней после второй иммунизации от гипериммунизированных кроликов получают сыворотку крови. Специфическую сыворотку проверяют на активность и специфичность в реакции задержки гемагглютинации. Результаты исследований приведены в таблице 2.In order to determine the biological, antigenic and immunogenic activity of the virus of hemorrhagic disease of rabbits of the Shevchenko 2014 strain, hyperimmunization of clinically healthy rabbits from farms that are safe for infectious and invasive diseases is carried out, with a live weight of at least 2.0 kg, according to the 2nd scheme for obtaining specific serum for the treatment, diagnosis and prevention of HBVC (patent No. 2077340 from 08/06/93, authors: Shevchenko A.A. et al.). For hyperimmunization of rabbits, a tissue inactivated vaccine made from the Shevchenko 2014 strain of rabbit hemorrhagic disease virus is used at a dose of 0.5 ml per head by intramuscular injection twice with an interval of 14 days. 14 days after the second immunization, blood serum is obtained from hyperimmunized rabbits. Specific serum is tested for activity and specificity in the hemagglutination inhibition reaction. The research results are shown in table 2.
Данные таблицы 2 показывают, что уже после первой вакцинации кроликов штаммом «Шевченко-2014» вируса ВГБК у кроликов образуются специфические задерживающие гемагглютинацию антитела в титре от 5 до 8 log2, в дальнейшем уровень антител увеличивается до 10-12 log2. Это подтверждает высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность штамма «Шевченко-2014» вируса.The data in Table 2 show that already after the first vaccination of rabbits with the Shevchenko-2014 strain of HBV virus in rabbits, specific hemagglutination-inhibiting antibodies are formed in the titer from 5 to 8 log 2 , in the future the antibody level increases to 10-12 log 2 . This confirms the high biological, antigenic and immunogenic activity of the Shevchenko-2014 virus strain.
Пример 3Example 3
Для изучения лечебного действия специфической иммунной сыворотки против ВГБК брали взрослых кроликов, свободных от антител к вирусу ВГБК, заражали вирулентным вирусом в дозе 1000 ЛД50/см3 и через 24-30 часов, в период развития первичных клинических признаков (угнетение, взъерошенность, отказ от корма, опускание ушей), вводили специфическую иммунную сыворотку по 0,5 см3 подкожно однократно, контрольным кроликам вводили нормальную кроличью сыворотку. Результаты представлены в таблице 3.To study the therapeutic effect of a specific immune serum against HBV, adult rabbits were taken free of antibodies to the HBV virus, they were infected with a virulent virus at a dose of 1000 LD 50 / cm 3 and after 24-30 hours, during the development of primary clinical signs (depression, disheveled, denial from feed, drooping ears), a specific immune serum of 0.5 cm 3 was administered subcutaneously once, the control rabbits were injected with normal rabbit serum. The results are presented in table 3.
Из данных таблицы 3 видно, что однократное введение кроликам нативной иммунной сыворотки с активностью в РЗГА от 6 до 8 log2 через 24-30 часов после заражения их вирулентным вирусом ВГБК позволяет вылечить всех кроликов при полной гибели животных в контроле.From the data in Table 3 it can be seen that a single administration of native immune serum to rabbits with activity in RHCA from 6 to 8 log 2 within 24-30 hours after infection with virulent virus of HBV allows treating all rabbits with complete death of animals in the control.
Для получения вируса, используемого при изготовлении тканевой инактивированной гидроокисьалюминиевой вакцины против ВГБК из штамма «Шевченко-2014», используют полученную и охарактеризованную матровую расплодку Master seed (M.s.) вируса геморрагической болезни кроликов из вышеуказанного штамма. Вначале приготавливают разведение вируса на физиологическом растворе таким образом, чтобы в конечном разведении содержалось 100 ЛД50/см3. Указанное разведение вируса вводят внутримышечно кроликам в объеме 1,0 см3. Предварительно сыворотку крови кроликов исследуют на наличие антител к вирусу ВГБК «Шевченко-2014» в РЗГА при +(4±2)°C и при +(20±2)°C с эритроцитами крови человека 0(I) группы. При наличии специфических антител к указанному вирусу в титре 1:4 и выше кроликов в опыт не берут. Инфицированных кроликов содержат в оборудованном инфекционном виварии в индивидуальных металлических клетках.To obtain the virus used in the manufacture of tissue inactivated aluminum hydroxide vaccine against HBVC from the Shevchenko-2014 strain, the obtained and characterized master seed seedling of rabbit hemorrhagic disease virus from the above strain is used. First, the virus is diluted in physiological saline so that the final dilution contains 100 LD 50 / cm 3 . The indicated dilution of the virus is administered intramuscularly to rabbits in a volume of 1.0 cm 3 . Previously, the blood serum of rabbits was examined for the presence of antibodies to the Shevchenko-2014 HBVC virus in RHCA at + (4 ± 2) ° C and at + (20 ± 2) ° C with human blood erythrocytes of group 0 (I). In the presence of specific antibodies to the specified virus in a titer of 1: 4 and higher, rabbits are not taken into the experiment. Infected rabbits are kept in equipped infectious vivarium in individual metal cells.
Из полученной от павших кроликов печени готовят 10%-ную вирусную суспензию на забуференном физрастворе (рН 7,0-7,4). Для осветления в приготовленную суспензию печени вносят хлороформ (конечная концентрация 2%) и помещают в холодильник при 4°C на 18 часов. Затем суспензию печени центрифугируют в течение 1 ч при 6000 g при 4°C. Вирусная суспензия, используемая для изготовления тканевой инактивированной вакцины, должна иметь активность в РГА при +(4±2)°C не менее 1:1280 ГАЕ.From a liver obtained from dead rabbits, a 10% viral suspension is prepared in buffered saline (pH 7.0-7.4). For clarification, chloroform (final concentration of 2%) is added to the prepared liver suspension and placed in a refrigerator at 4 ° C for 18 hours. Then the liver suspension is centrifuged for 1 h at 6000 g at 4 ° C. The viral suspension used to make the tissue inactivated vaccine should have an activity in the RGA at + (4 ± 2) ° C of at least 1: 1280 GAE.
Инактивацию вируса проводят с помощью 4%-ного раствора формалина. Исходя из концентрации формальдегида готовят 4%-ный раствор формалина (т.е. 1,1-1,4% раствор формальдегида) на стерильной дистиллированной воде. Раствор формалина готовят в стеклянных бутылях в день составления сырья для вакцины и вносят в вирусную суспензию до конечной концентрации не менее 0,1% формальдегида.Inactivation of the virus is carried out using a 4% formalin solution. Based on the concentration of formaldehyde, a 4% formalin solution (i.e., a 1.1-1.4% formaldehyde solution) is prepared in sterile distilled water. A formalin solution is prepared in glass bottles on the day the vaccine is prepared and introduced into the viral suspension to a final concentration of at least 0.1% formaldehyde.
Инактивируют вирус при температуре 37±1°C в течение 3-х суток с периодическим перемешиванием (1 раз в час в течение 5 мин).Inactivate the virus at a temperature of 37 ± 1 ° C for 3 days with periodic stirring (1 time per hour for 5 minutes).
Началом инактивации считают время после доведения температуры в емкости до 37±1°C и добавления формалина. Из инактивированного материала брали пробу для проверки стерильности, активности, полноты инактивации и безвредности. Для проверки полноты инактивации и безвредности двум кроликам массой не менее 2,0 кг, не имеющих специфических антител к вирусу ВГБК, вводят по 3,0 см3 внутримышечно инактивированный материал. Животные в течение 10 суток наблюдения оставались здоровыми.The start of inactivation is considered the time after bringing the temperature in the tank to 37 ± 1 ° C and adding formalin. A sample was taken from inactivated material to verify sterility, activity, completeness of inactivation and safety. To check the completeness of inactivation and harmlessness, two rabbits weighing at least 2.0 kg, which do not have specific antibodies to the HBV virus, are injected with 3.0 cm 3 intramuscularly inactivated material. Animals remained healthy for 10 days of observation.
После окончания инактивации вируссодержащей суспензии в емкость с вирусной суспензией добавляют гель гидрата окиси алюминия (ГОА) с 3% сухого остатка после размола из расчета на 1000 см3 суспензии 150 см3 ГОА (20%) при рН 7,2-7,4 и температуре 4-8°C (патент РФ №2039570 от 20.07.95 г., авторы: Шевченко А.А. и др.). Сорбцию проводят в течение 1-2 часов с периодическим перемешиванием. Вакцину хранят при 10±2°C до получения результатов контроля препарата. Затем вакцину перемешивают при температуре 10±2°C в течение 1 часа и фасуют в стерильные флаконы емкостью 20 или 50 см3.After the inactivation of the virus-containing suspension is completed, an alumina hydrate gel (GOA) with 3% solids is added to the container with the virus suspension after grinding based on 1000 cm 3 of a suspension of 150 cm 3 GOA (20%) at pH 7.2-7.4 and a temperature of 4-8 ° C (RF patent No. 2039570 from 07.20.95, authors: A. Shevchenko and others). Sorption is carried out for 1-2 hours with periodic stirring. The vaccine is stored at 10 ± 2 ° C until the results of the control of the drug. Then the vaccine is stirred at a temperature of 10 ± 2 ° C for 1 hour and Packed in sterile vials with a capacity of 20 or 50 cm 3 .
Содержание антигена при +(4±2)°C в дозе вакцины не менее 640 ГАЕ является его оптимальным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата.The antigen content at + (4 ± 2) ° C in the vaccine dose of at least 640 GAE is its optimal amount in the preparation, ensuring the achievement of a technical result.
Полученную вакцину проверяют на внешний вид, стерильность, уровень рН, полноту инактивации вируса, иммуногенность и безвредность.The resulting vaccine is checked for appearance, sterility, pH, completeness of virus inactivation, immunogenicity and harmlessness.
Вакцина представляет собой прозрачную жидкость серо-коричневого цвета с рыхлым осадком, образующимся при хранении, который при встряхивании легко разбивается в гомогенную взвесь.The vaccine is a clear, gray-brown liquid with a loose precipitate formed during storage, which, when shaken, easily breaks into a homogeneous suspension.
Стерильность вакцины определяют в соответствии с ГОСТ 28085-89. Безвредность препарата определяют путем его введения четырем кроликам внутримышечно по 3 см3. Вакцина считается безвредной, если она не вызывает гибель или заболевания кроликов, а также изменений некротического характера на месте введения в течение 14 суток наблюдения.Sterility of the vaccine is determined in accordance with GOST 28085-89. The safety of the drug is determined by its administration to four rabbits intramuscularly at 3 cm 3 . The vaccine is considered harmless if it does not cause death or disease of the rabbits, as well as changes in the necrotic nature at the injection site within 14 days of observation.
Полноту инактивации вируса в вакцине проверяют на 4 кроликах, которым вводят внутримышечно в область средней трети бедра по 3,0 см3. За кроликами ведут наблюдение в течение 10 дней. Вакцину считают не содержащей инфекционного вируса, если она не вызывает гибели кроликов от вирусной геморрагической болезни в течение 10 суток после введения препарата.The completeness of the inactivation of the virus in the vaccine is checked on 4 rabbits, which are injected intramuscularly in the region of the middle third of the thigh 3.0 cm 3 . Rabbits are monitored for 10 days. A vaccine is considered not containing an infectious virus if it does not cause the death of rabbits from viral hemorrhagic disease within 10 days after administration of the drug.
В используемых флаконах с вакциной определяют рН, средняя величина показателей должна быть в пределах 7,2-7,4. Гемагглютинирующую активность антигена каждой серии вакцины определяют в реакции гемагглютинации (РГА) при +(4±2)°C, с эритроцитами человека 0(I) группы и выражают в гемагглютинирующих единицах. Гемагглютинирующий титр в вакцине должен быть не ниже 8,0 log2, что соответствует разведению 1:256 ГАЕ.In the used vaccine vials, the pH is determined, the average value of the indicators should be in the range of 7.2-7.4. The hemagglutinating activity of the antigen of each vaccine series is determined in the hemagglutination reaction (RGA) at + (4 ± 2) ° C, with human erythrocytes of group 0 (I) and expressed in hemagglutinating units. The hemagglutinating titer in the vaccine should not be lower than 8.0 log 2 , which corresponds to a dilution of 1: 256 GAE.
Данные таблицы 4 свидетельствуют о том, что тканевая инактивированная гидроокисьалюминиевая вакцина против ВГБК из штамма «Шевченко 2014» обладает высокой гемагглютинирующей активностью.The data in table 4 indicate that the tissue inactivated aluminum hydroxide vaccine against HBV from strain "Shevchenko 2014" has a high hemagglutinating activity.
При изучении иммуногенной активности тканевой инактивированной гидроокисьалюминиевой вакцины против ВГБК из штамма «Шевченко-2014» установлено, что у кроликов старше 1,5-2 мес. возраста, привитых однократно внутримышечно в дозе 0,5 см3, уже на 5 день после введения препарата формируется иммунный ответ, т.е. образуются специфические антитела, позволяющие обеспечить защиту вакцинированных кроликов против ВГБК. Экспериментально показано, что одна прививочная доза в объеме 0,5 см3 содержит не менее 640 ГАЕ. Результаты исследований иммуногенной активности представлены в таблице 5.When studying the immunogenic activity of tissue inactivated aluminum hydroxide vaccine against HBV from strain "Shevchenko-2014" it was found that in rabbits older than 1.5-2 months. age, vaccinated once intramuscularly at a dose of 0.5 cm 3 , already on day 5 after administration of the drug, an immune response is formed, i.e. specific antibodies are formed to protect vaccinated rabbits against HBV. It has been experimentally shown that one vaccination dose in a volume of 0.5 cm 3 contains at least 640 GAE. The results of studies of immunogenic activity are presented in table 5.
Данные таблицы 5 подтверждают высокую иммуногенную активность и эффективность инактивированной вакцины против ВГБК из штамма «Шевченко-2014».The data in table 5 confirm the high immunogenic activity and effectiveness of the inactivated vaccine against HBV from strain "Shevchenko-2014".
Таким образом, штамм «Шевченко-2014» вируса геморрагической болезни кроликов, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой инфекционной, антигенной и иммуногенной активностью и пригоден для изготовления вакцинных, диагностических и лечебных препаратов против ВГБК.Thus, the Shevchenko 2014 strain of the rabbit hemorrhagic disease virus obtained in accordance with the invention has high infectious, antigenic and immunogenic activity and is suitable for the manufacture of vaccines, diagnostic and therapeutic drugs against HBV.
Источники информацииInformation sources
1. Шевченко А.А. Специфическая профилактика инфекционных болезней кроликов: вирусной геморрагической болезни, миксоматоза и пастереллеза: дис. …д-ра. ветер. наук: 16.00.03 / Шевченко Александр Алексеевич. - Покров, 1995. - 233 с.1. Shevchenko A.A. Specific prevention of infectious diseases of rabbits: viral hemorrhagic disease, myxomatosis and pasteurellosis: dis. ... dr. wind. Sciences: 16.00.03 / Shevchenko Aleksandr Alekseevich. - Pokrov, 1995 .-- 233 p.
2. Шевченко А.А. Новая ассоциированная вакцина / А.А. Шевченко // Кролиководство и звероводство. - 1994. - №2.2. Shevchenko A.A. New associated vaccine / A.A. Shevchenko // Rabbit breeding and fur farming. - 1994. - No. 2.
3. Molecular epidemiology of Rabbit haemorrhagic disease virus. Moss S.R., Turner S.L., Trout R.C., White P.J., Hudson P.J., Desai A., Armesto M., Forrester N.L., Gould E.A.; J. Gen. Virol. - 2002. - Vol. 83. - P. 2461-2467.3. Molecular epidemiology of Rabbit haemorrhagic disease virus. Moss S.R., Turner S.L., Trout R.C., White P.J., Hudson P.J., Desai A., Armesto M., Forrester N.L., Gould E.A .; J. Gen. Virol. - 2002. - Vol. 83. - P. 2461-2467.
4. Manual of standards Diagnostic Tests and Vaccines 2004; PART 2; SECTION 2.8.; CHAPTER 2.8.3. RABBIT HAEMORRHAGIC DISEASE.4. Manual of standards Diagnostic Tests and Vaccines 2004; PART 2; SECTION 2.8 .; CHAPTER 2.8.3. RABBIT HAEMORRHAGIC DISEASE.
5. Бурмакина Г.С. Разработка средств молекулярно-генетической идентификации вируса геморрагической болезни кроликов: дисс. …канд. биол. наук: 03.01.06 / Бурмакина Галина Сергеевна. - Покров, 2012. - 150 с.5. Burmakina G.S. Development of molecular genetic identification tools for the rabbit hemorrhagic disease virus: Diss. ... cand. biol. Sciences: 03.01.06 / Burmakina Galina Sergeevna. - Pokrov, 2012 .-- 150 s.
6. Патент РФ №2077340 «Способ получения специфической сыворотки для лечения, диагностики и профилактики вирусной геморрагической болезни кроликов и набор для диагностики болезни», авторы: Шевченко А.А. и др. приоритет от 06.08.1993 г. заявка №93039551 зарегистрировано в государственном реестре изобретений 20.04.1997 г.6. RF patent No. 2077340 “A method for producing specific serum for the treatment, diagnosis and prevention of rabbit viral hemorrhagic disease and a kit for diagnosing the disease”, authors: A. Shevchenko and other priority of 08/06/1993, application No. 93039551 registered in the state register of inventions 04/20/1997
7. Патент РФ №2039570 «Способ изготовления инактивированной вакцины против вирусной геморрагической болезни», авторы: Шевченко А.А. и др., приоритет от 26.05.1992 г. заявка №5043431 зарегистрировано в государственном реестре изобретений 20 июля 1995 г.7. RF patent No. 2039570 "A method of manufacturing an inactivated vaccine against viral hemorrhagic disease", authors: A. Shevchenko et al., priority dated 05/26/1992, application No. 5043431 was registered in the state register of inventions on July 20, 1995.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015133685A RU2631925C2 (en) | 2015-08-11 | 2015-08-11 | Strain "shevchenko-2014" of rabbit hemorrhagic disease virus for preparing vaccines, diagnostic and therapeutic preparations |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2015133685A RU2631925C2 (en) | 2015-08-11 | 2015-08-11 | Strain "shevchenko-2014" of rabbit hemorrhagic disease virus for preparing vaccines, diagnostic and therapeutic preparations |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2015133685A RU2015133685A (en) | 2017-02-16 |
| RU2631925C2 true RU2631925C2 (en) | 2017-09-28 |
Family
ID=58454327
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2015133685A RU2631925C2 (en) | 2015-08-11 | 2015-08-11 | Strain "shevchenko-2014" of rabbit hemorrhagic disease virus for preparing vaccines, diagnostic and therapeutic preparations |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2631925C2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113215113A (en) * | 2021-05-28 | 2021-08-06 | 中牧实业股份有限公司 | Rabbit viral hemorrhagic disease virus type 2 and application thereof in preparation of inactivated vaccine |
-
2015
- 2015-08-11 RU RU2015133685A patent/RU2631925C2/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JOANA ABRANTES et al., Rabbit haemorrhagic disease (RHD) and rabbit haemorrhagic disease virus (RHDV): a review, Veterinary Research, 2012, Vol.43, No.12, pp.1-19. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2015133685A (en) | 2017-02-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106267195B (en) | Triple antigen-antibody complex for porcine viral diarrhea and preparation method thereof | |
| CN107287218B (en) | Avian infectious bronchitis virulent strain S1 gene and virulent strain and application thereof | |
| RU2603003C1 (en) | Inactivated sorptive vaccine to fmd types a, o, asia-1 | |
| CN106854647B (en) | Duck viral hepatitis bivalent yolk antibody and preparation method and application thereof | |
| CN108969492B (en) | Oral attenuated freeze-dried vaccine for swine fever and preparation method thereof | |
| RU2631925C2 (en) | Strain "shevchenko-2014" of rabbit hemorrhagic disease virus for preparing vaccines, diagnostic and therapeutic preparations | |
| CN104888213A (en) | Preparation method of classical swine fever spleen-lymph-sourced compound living vaccine | |
| CN112717128A (en) | Combined vaccine for preventing hand-foot-and-mouth disease and preparation method and application thereof | |
| CN109735504B (en) | Canine distemper virus attenuated vaccine strain and application thereof | |
| CN111840532A (en) | Live vaccine for preventing viral infectious diseases | |
| EP2187962A2 (en) | Adaptation of pitman moore strain of rabies virus to primary chick embryo fibroblast cell cultures | |
| RU2416642C1 (en) | Manichino-09 strain of rabbit hemorrhagic disease virus for preparing vaccines and diagnostic products | |
| US3470294A (en) | Vaccine for immunization of dogs and foxes against distemper,hepatitis contagiosa and leptospirosis and process for preparing it | |
| WO2005014803A1 (en) | West nile virus vaccine | |
| CN108703952B (en) | Freeze-drying protective agent for swine fever oral attenuated freeze-dried vaccine and application | |
| RU2417262C1 (en) | Belgorod-03 strain of rabbit hemorrhagic disease virus for preparing vaccines and diagnostic products | |
| RU2294760C2 (en) | Sorbed inactivated vaccine against foot-and-mouth disease of type a | |
| RU2607791C1 (en) | ATTENUATED STRAIN "MSC-2015 VNIIVViM" OF AFRICAN SWINE FEVER VIRUS SEROTYPE VIII FOR VIROLOGY AND MOLECULAR-GENETIC ANALYSIS | |
| CN112725288B (en) | Canine adenovirus type 2 attenuated vaccine strain and application thereof | |
| RU2806164C1 (en) | Associated vaccine against canine distemper, parvovirus and coronavirus enteritis, adenovirus infection of dogs | |
| RU2768749C1 (en) | Agent for specific prevention of covid-19 for carnivores | |
| RU2526570C2 (en) | Inactivated sorbent type a foot-and-mouth disease vaccine | |
| RU2221040C1 (en) | Cattle infectious rhinotracheitis virus strain "vniizzh" for preparing vaccine and diagnostic preparations | |
| KR20130130326A (en) | Novel canine influenza virus(h3n2), composition comprising thereof and diagnostic kits of the novel canine h3n2 influenza virus | |
| CN108704131B (en) | Vaccine diluent for swine fever oral attenuated freeze-dried vaccine and application thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170812 |