RU2126685C1

RU2126685C1 - Method of preparing pig spleen xenocells suspension for using in patient treatment with pathological change of immune status

Info

Publication number: RU2126685C1
Application number: RU96114525A
Authority: RU
Inventors: Ю.И. Бородин; М.С. Любарский; А.А. Смагин; В.В. Морозов; А.И. Шевела; Г.Г. Апарович
Original assignee: Институт клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН
Priority date: 1996-07-17
Filing date: 1996-07-17
Publication date: 1999-02-27

Abstract

FIELD: medicine, immunology. SUBSTANCE: method involves a perfusion of pig spleen transverse slices with a sterile physiological solution, centrifugation, supernatant discarding and dilution of a precipitate with physiological solution at ratio 1:10. Obtained suspension of xenocells from pig spleen administrated in patient body effects on both humoral and cellular component of human immunity and decreases frequency of adverse and allergic response reactions in patients to whom xenoperfusate is administrated. Method can be used for immunocorrection and immunostimulation. EFFECT: enhanced effectiveness of method. 3 dwg

Description

Изобретение относится к медицине. The invention relates to medicine.

В медицинской практике предложены различные способы получения ксеноперфузата свиной селезенки путем перфузии цельного органа стерильными растворами для последующего включения ксеноперфузата в традиционные схемы лечения больных с нарушенным иммунным статусом с целью иммунокоррекции и иммунномодуляции. За прототип выбран способ, предложенный С.Д.Никоновым: "Применение перфузата ксеноселезенки в лечении больных с обширными гнойно-деструктивными заболеваниями легких и плевры с осложненным течением". Методические рекомендации, г. Новосибирск, 1992 год.). При указанной методике забранная на бойне мясокомбината свиная селезенка в стерильных условиях транспортируется в медицинское учреждение, где осуществляется катетеризация селезеночной артерии, другие мелкие артерии и вены перевязываются, затем отмывается кровь и сгустки из сосудистого русла селезенки путем нагнетания шприцом физиологического раствора с гепарином в артерию селезенки. Как только кровь начинает вытекать через селезеночную вену, последнюю фиксируют и канюлируют. Затем приступают к перфузии селезенки. Для этого систему для капельной инфузии подключают к флакону с физиологическим раствором, который устанавливается в штатив на высоте 120 см над уровнем расположения лотка с селезенкой, и затем подключают к артериальному катетеру. В процессе перфузии оттекающей из селезеночной вены перфузат собирают в стерильные флаконы. Для удаления "клеток-пассажиров" используют приемы отстоя, либо центрифугирования. При этом надосадочная жидкость с соблюдением условий асептики и антисептики перекачивается в стерильные емкости. Для приготовления ксеноперфузата могут быть использованы и другие растворы, например, реополиглюкин. Техническое обеспечение и способ приготовления такого ксеноперфузата представляются сложными, достаточно трудоемкими, требующими специальных навыков от персонала при катетеризировании и канюлировании сосудов. In medical practice, various methods have been proposed for obtaining porcine spleen xenoperfusate by perfusion of an entire organ with sterile solutions for the subsequent inclusion of xenoperfusate in traditional treatment regimens for patients with impaired immune status for the purpose of immunocorrection and immunomodulation. For the prototype, the method proposed by S. D. Nikonov was selected: "The use of xenospleen perfusate in the treatment of patients with extensive purulent-destructive diseases of the lungs and pleura with a complicated course." Methodical recommendations, Novosibirsk, 1992.). In this method, the pork spleen taken from the slaughterhouse under sterile conditions is transported to a medical institution where the splenic artery is catheterized, other small arteries and veins are ligated, then blood and clots are washed from the splenic vascular bed by injecting a saline solution with heparin into the spleen artery. As soon as blood begins to flow through the splenic vein, the latter is fixed and cannulated. Then proceed to perfusion of the spleen. For this, a system for drip infusion is connected to a bottle with physiological saline, which is installed in a tripod at a height of 120 cm above the location of the tray with the spleen, and then connected to an arterial catheter. During the perfusion of the flowing from the splenic vein, the perfusate is collected in sterile vials. To remove the "passenger cells" using methods of sludge, or centrifugation. At the same time, the supernatant is pumped into sterile containers under aseptic and antiseptic conditions. For the preparation of xenoperfusate, other solutions can also be used, for example, reopoliglyukin. The technical support and the method for preparing such xenoperfusate are complex, rather laborious, requiring special skills from personnel during catheterization and cannulation of blood vessels.

Описанная методика получения ксеноперфузата позволяет приготавливать смесь растворимых биологически активных веществ селезенки, однако, клеточные элементы, представленные преимущественно лимфоцитами, играющие определенную роль в реализации иммунокоррегирующего и иммуномодулирующего эффекта, при этом удаляются искусственно или разрушаются, лизируются. The described method for producing xenoperfusate allows you to prepare a mixture of soluble biologically active substances of the spleen, however, the cellular elements, represented mainly by lymphocytes, which play a role in the implementation of the immunocorrection and immunomodulating effect, are then removed artificially or destroyed, lysed.

Существуют и другие методики: Бурдина Г.В.Мануйлов Б.М."Роль факторов, выделяемых селезенкой, в активации фагоцитов." Трансплантация и искусственные органы, М.М., 1986, С. 48-52. Шелобод А.Л., Бекчинтаев Т.Н. "Модифицированная методика использования ксеногенной селезенки при гнойно-септических заболеваниях". Вестник хирургии им. И.И.Грекова, 1991, N 2, С. 96-100. Витязев Г.А. "Использование экстракорпоральной ксеноспленоперфузии и перфузата ксеноселезенки в комплексном лечении больных перитонитом." М3 Рос. Федерации. НИИ трансплантологии и искусств. органов канд. мед. наук. М.1993. С. 24. Никонов С. Д. "Эффективность перфузатов ксеноселезенки при лечении гнойно-септических заболеваний в легочной хирургии." Новосиб. мед. ин-т, канд. мед. наук, Новосибирск. 1992. С. 22. Ситников В.А., Стяжкина С.Н., Тихонова В.В., Дерябина А.Г. "Экспериментальное обоснование и клинический эффект применения спленосорбции и внутривенной инфузии селезеночного перфузата для лечения гнойно-септических осложнений в хирургии. "Нижегородский мед. журн 1991. N 2. С. 3-6. There are other methods: Burdina G.V. Manuylov B. M. "The role of factors secreted by the spleen in the activation of phagocytes." Transplantation and artificial organs, M.M., 1986, S. 48-52. Shelobod A.L., Bekchintaev T.N. "A modified technique for the use of xenogenic spleen in purulent-septic diseases." Bulletin of Surgery. I.I. Grekova, 1991, N 2, S. 96-100. Vityazev G.A. "The use of extracorporeal xenosplenoperfusion and xenospleen perfusate in the complex treatment of patients with peritonitis." M3 ROS. Federation. Research Institute of Transplantology and Arts. bodies of candidates. honey. sciences. M.1993. P. 24. Nikonov S. D. "Efficiency of xenospleen perfusates in the treatment of purulent-septic diseases in pulmonary surgery." Novosib. honey. Institute, Cand. honey. Sciences, Novosibirsk. 1992. S. 22. Sitnikov V.A., Styazhkina S.N., Tikhonova V.V., Deryabin A.G. "Experimental justification and clinical effect of splenosorption and intravenous infusion of splenic perfusate for the treatment of purulent-septic complications in surgery." Nizhny Novgorod honey. Journal 1991. N 2. S. 3-6.

Заявляемый способ приготовления имеет своей задачей получение взвеси живых ксеноклеток свиной селезенки в высокой концентрации 15 • 10⁵ (мл) в растворе биологически активных веществ селезенки при сниженном количестве в растворе тканевого детрита и клеточных обломков, что достигается за счет центрифугирования ксеноперфузата и сохранения придонных порций, содержащих указанные клеточные элементы, при этом тканевой детрит и клеточные обломки (как более легкие) будут находиться в надосадочной жидкости. Полученная взвесь ксеноклеток при введении ее в организм больного будет воздействовать как на гуморальное, так и на клеточные звенья иммунитета человека. Уменьшенное количество тканевого детрита и клеточных обломков в растворе снизит количество побочных и аллергических реакций пациента на введение взвеси ксеноклеток.The inventive method of preparation has the task of obtaining a suspension of live pork spleen xenocytes in a high concentration of 15 • 10 ⁵ (ml) in a solution of biologically active substances of the spleen with a reduced amount of tissue detritus and cell debris in the solution, which is achieved by centrifuging xenoperfusate and preserving bottom portions, containing these cellular elements, while tissue detritus and cell debris (as lighter) will be in the supernatant. The resulting suspension of xenocytes, when introduced into the patient's body, will affect both the humoral and cellular links of human immunity. A reduced amount of tissue detritus and cell debris in the solution will reduce the number of adverse and allergic reactions of the patient to the introduction of suspension of xenocytes.

На фиг. 1 показана система для отымания измельченной селезенки (схематично обозначена собранная система для отмывания селезенки, указаны ее основные компоненты, ток жидкости в системе при ее работе;
на фиг.2 - система для получения ксеноперфузата ( схематично обозначена система для получения ксеноперфузата, последовательность и порядок соединения основных компонентов системы, правильный ток жидкости при перфузии селезенки);
на фиг. 3 - удаление надосадочной жидкости из флакона с отцентрифугированным ксеноперфузатом ( схематично обозначено правильное расположение приспособлений для удаления надосадочной жидкости из флакона с ксеноперфузатом после центрифугирования).In FIG. 1 shows a system for washing the crushed spleen (the assembled system for washing the spleen is schematically indicated, its main components are indicated, the fluid flow in the system during its operation;
figure 2 - system for producing xenoperfusate (schematically indicated system for producing xenoperfusate, the sequence and order of connection of the main components of the system, the correct fluid flow during perfusion of the spleen);
in FIG. 3 - removal of the supernatant from the vial with centrifuged xenoperfusate (the correct arrangement of devices for removing the supernatant from the vial with xenoperfusate after centrifugation is schematically indicated.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом. The proposed method is as follows.

Первым этапом является забор свиной селезенки, осуществляемый на мясокомбинате в убойном цехе на поточной линии. Забор проводится специальной бригадой с соблюдением условий стерильности. Извлеченная селезенка в стерильном контейнере (термосе) транспортируется в медицинское учреждение, где будет приготавливаться взвесь ксеноклеток свиной селезенки. Длительность транспортировки не должна превышать полутора часов с момента ее заброса. Приготовление селезенки осуществляется в специально приспособленном для этого помещении (чистая перевязочная, процедурная, отделение детоксикации и т.п.) в стерильных условиях. На стерильном лотке селезенка измельчается ножницами или скальпелем. Толщина кусочков не должна превышать 1 см, вес - 2-3 г, селезенка нарезается поперечно продольной оси. Измельченная селезенка помещается в простерилизованные стеклянные банки с горлышком, снабженным резьбой, емкостью 400 мл. Банки заполняются кусочками селезенки примерно на 2/3, заливаются стерильным раствором (для этого можно использовать изотонический раствор NaCl, лактосоль, дисоль), энергично встряхиваются, раствор выливается. The first step is the collection of pork spleen, carried out at a meat factory in a slaughterhouse on the production line. The fence is carried out by a special team in compliance with sterility conditions. The extracted spleen in a sterile container (thermos) is transported to a medical facility where a suspension of pork spleen xenocytes will be prepared. The duration of transportation should not exceed one and a half hours from the moment of its casting. The preparation of the spleen is carried out in a room specially adapted for this (clean dressing room, treatment room, detoxification department, etc.) under sterile conditions. On a sterile tray, the spleen is crushed with scissors or a scalpel. The thickness of the pieces should not exceed 1 cm, weight - 2-3 g, the spleen is cut transversely to the longitudinal axis. The crushed spleen is placed in sterilized glass jars with a threaded neck with a capacity of 400 ml. The jars are filled with slices of the spleen by about 2/3, filled with a sterile solution (for this you can use an isotonic solution of NaCl, lactosol, disol), shake vigorously, the solution is poured out.

Подобная процедура повторяется дважды с целью удаления крови и тканевого детрита. Затем приготовленная селезенка заливается раствором антибиотика с целью элиминации попавших в емкость при приготовлении и заборе селезенки микроорганизмов. Можно использовать метронидазол (100 мл на 1 банку) или антибиотики цефалоспоринового ряда (средняя доза 1 г на 1 банку). Время экспозиции селезенки с антибиотиками - от 4-х до 24-х часов, в зависимости от того, к какому времени потребуется взвесь ксеноклеток свиной селезенки. На время экспозиции с антибиотиком селезенка помещается в холодильник, температура хранения 0 - -4^oC.A similar procedure is repeated twice in order to remove blood and tissue detritus. Then, the prepared spleen is poured with an antibiotic solution in order to eliminate microorganisms that have fallen into the container during the preparation and collection of the spleen. You can use metronidazole (100 ml per 1 jar) or cephalosporin antibiotics (average dose of 1 g per 1 jar). The exposure time of the spleen with antibiotics is from 4 to 24 hours, depending on how long it takes to suspend a suspension of pork spleen xenocytes. At the time of exposure with the antibiotic, the spleen is placed in the refrigerator, storage temperature 0 - -4 ^o C.

Взвесь ксеноклеток свиной селезенки приготавливается непосредственно пред введением ее больному. Для этого требуется роликовый насос 1, щелевидная насадка 2, одна капельница (предпочтительно отечественного производства)3, система для переливания крови 4, 30-ти сантиметровая резиновая трубка 5 с внутренним диаметром 0,6-0,8 см, стерильные растворы (физиологический раствор NaCl, 4 флакона по 400 мл) 6. Начальным этапом приготовления взвеси ксеноклеток свиной селезенки является получение ксеноперфузатов. Во флакон с измельченной селезенкой 70 и раствором антибиотика помещается собранная щелевидная насадка, собирается система как для гемосорбции, где емкость с сорбентом заменена флаконом с измельченной селезенкой, (см. фиг. 1) и проводится отмывание колонки стерильным физраствором. Чистый физраствор при этом подключается к системе для забора крови и роликовым насосом прогоняется через колонку со скоростью 60 - 80 мл/мин. Объем промывного раствора составляет в среднем 1200 мл. После этого к 400-миллилитровому флакону со стерильным физиологическим раствором поваренной соли, подсоединенному к системе для переливания крови ("забор"), подключается капельница, по которой возвращается жидкость, прошедшая через колонку с измельченной селезенкой ("возврат"). Таким образом роликовый насос будет "гонять" физраствор по замкнутому контуру (см. фиг. 2). Ксеноперфузат для последующего приготовления взвеси ксеноклеток свиной селезенки получается путем циркуляции физраствора со скоростью 40 - 60 мл/мин по замкнутому контуру в течении 15-20 мин. По окончании этого времени физраствор во флаконе приобретает светло-желтую окраску, становится слегка мутноватым. Концентрация клеток в нем составляет в среднем 3,5-5,0 • 10⁵ в мл, жизнеспособность клеток 70 - 79%. Клетки, находящиеся в растворе биологически активных веществ селезенки - цитокины - растворимые факторы иммунокомпетентных клеток, интерлейкины 1 и 2, интерферон, в основном представлены лимфоцитами - ок. 95% всех клеток) - это так называемый ксеноперфузат.A suspension of pork spleen xenocytes is prepared immediately before its introduction to the patient. This requires a roller pump 1, a slit nozzle 2, one dropper (preferably domestic) 3, a blood transfusion system 4, a 30-cm rubber tube 5 with an inner diameter of 0.6-0.8 cm, sterile solutions (physiological saline NaCl, 4 vials of 400 ml each) 6. The initial step in preparing a suspension of pork spleen xenocells is to obtain xenoperfusates. The collected slit-like nozzle is placed in a bottle with a crushed spleen 70 and an antibiotic solution, a system is assembled for hemosorption, where the container with a sorbent is replaced with a bottle with a crushed spleen (see Fig. 1) and the column is washed with sterile saline. At the same time, pure saline solution is connected to the system for blood sampling and is pumped through a column at a speed of 60 - 80 ml / min using a roller pump. The volume of the wash solution averages 1200 ml. After that, a dropper is connected to a 400-ml bottle with sterile physiological saline solution connected to the blood transfusion system ("fence"), through which the fluid returned through the column with the crushed spleen ("return") is returned. Thus, the roller pump will “drive” saline in a closed loop (see Fig. 2). Xenoperfusate for the subsequent preparation of a suspension of pork spleen xenocytes is obtained by circulating saline at a speed of 40-60 ml / min in a closed loop for 15-20 minutes. At the end of this time, the saline solution in the bottle acquires a light yellow color, becomes slightly unclear. The concentration of cells in it is on average 3.5-5.0 • 10 ⁵ per ml, cell viability of 70 - 79%. Cells in a solution of biologically active substances of the spleen - cytokines - soluble factors of immunocompetent cells, interleukins 1 and 2, interferon, are mainly represented by lymphocytes - approx. 95% of all cells) is the so-called xenoperfusate.

Следующим этапом флакон с ксеноперфузатом центрифугируется в центрифуге со скоростью 1200 оборотов в минуту в течение 10-ти минут. Затем флакон извлекается из стакана центрифуги, открывается и надосадочная жидкость отсасывается по стенке тонкой стерильной стеклянной пипеткой (8), присоединенной к вакуум-отсосу (см. фиг. 3). На дне флакона должно оставаться около 3-х миллилитров осадочной жидкости. К ней добавляется 20-30 мл стерильного физраствора, содержимое флакона аккуратно встряхивается, перемешивается. Полученный объем жидкости представлен растворенными биологически активными веществами селезенки (цитокины - растворимые факторы иммунокомпетентных клеток, интерлейкины 1 и 2, интерферон) и взвесью в них ксеноклеток свиной селезенки (преимущественно лимфоцитами - ок.95% всех клеток). Концентрация клеток и их жизнеспособность в процентном отношении к погибшим клеткам определяется сразу по приготовлении взвеси и составляет по нашим данным 15 • 10⁵ и 79 - 85% соответственно. Полученная подобным методом взвесь ксеноклеток свиной селезенки при введении ее в организм человека воздействует как на гуморальное звено иммунитета (посредством биологически активных веществ), так и на клеточные (благодаря непосредственному, прямому взаимодействию иммунокомпетентных клеток свиного и человеческого организмов - когнантное взаимодействие), реализуя при этом в полной мере свой иммуномодулирующий и иммуностимулирующий эффект, что и позволяет направления ее использования в медицине.The next step, the xenoperfusate bottle is centrifuged in a centrifuge at a speed of 1200 rpm for 10 minutes. Then the vial is removed from the centrifuge glass, opened and the supernatant is aspirated along the wall with a thin sterile glass pipette (8) attached to a vacuum suction (see Fig. 3). About 3 milliliters of sediment should remain at the bottom of the vial. 20-30 ml of sterile saline solution is added to it, the contents of the vial are gently shaken, mixed. The obtained volume of liquid is represented by dissolved biologically active substances of the spleen (cytokines - soluble factors of immunocompetent cells, interleukins 1 and 2, interferon) and a suspension of porcine spleen xenocytes in them (mainly lymphocytes - about 95% of all cells). The concentration of cells and their viability as a percentage of dead cells is determined immediately by the preparation of suspension and, according to our data, is 15 • 10 ⁵ and 79 - 85%, respectively. A suspension of pork spleen xenocytes obtained by a similar method, when introduced into the human body, affects both the humoral immunity (via biologically active substances) and the cellular (thanks to the direct, direct interaction of immunocompetent cells of porcine and human organisms - a cognitive interaction), realizing at the same time fully its immunomodulating and immunostimulating effect, which allows the direction of its use in medicine.

Claims

A method of preparing a suspension of porcine spleen xenocytes for use in treating patients with pathological changes in the immune status, which consists in perfusion of a porcine spleen with sterile physiological saline, characterized in that the xenoperfusate is centrifuged by sterilizing cross-sections of a fresh porcine spleen, the supernatant is removed, and the supernatant is removed sterile saline in a ratio of 1: 10.