RU2113479C1 - Strain of bacterium pseudoalteromonas species - a producer of alpha-galactosidase - Google Patents
Strain of bacterium pseudoalteromonas species - a producer of alpha-galactosidase Download PDFInfo
- Publication number
- RU2113479C1 RU2113479C1 RU97107819A RU97107819A RU2113479C1 RU 2113479 C1 RU2113479 C1 RU 2113479C1 RU 97107819 A RU97107819 A RU 97107819A RU 97107819 A RU97107819 A RU 97107819A RU 2113479 C1 RU2113479 C1 RU 2113479C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- galactosidase
- enzyme
- strain
- group
- producer
- Prior art date
Links
- 102000005840 alpha-Galactosidase Human genes 0.000 title claims abstract description 29
- 108010030291 alpha-Galactosidase Proteins 0.000 title claims abstract description 29
- 241000519590 Pseudoalteromonas Species 0.000 title claims description 4
- 241000894007 species Species 0.000 title 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 31
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 31
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 abstract description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 17
- 239000008280 blood Substances 0.000 abstract description 13
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 8
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 abstract description 6
- 241000519582 Pseudoalteromonas sp. Species 0.000 abstract description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 abstract description 6
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 5
- 239000013535 sea water Substances 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 abstract description 4
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 abstract description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 abstract description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 abstract description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 abstract description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 abstract description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 abstract description 3
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 abstract description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 abstract description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 abstract description 2
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 abstract 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 abstract 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 abstract 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 abstract 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 abstract 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000009471 action Effects 0.000 description 5
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 2
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000533293 Sesbania emerus Species 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IFBHRQDFSNCLOZ-IIRVCBMXSA-N 4-nitrophenyl-α-d-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 IFBHRQDFSNCLOZ-IIRVCBMXSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 235000011437 Amygdalus communis Nutrition 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 244000017020 Ipomoea batatas Species 0.000 description 1
- 235000002678 Ipomoea batatas Nutrition 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- 241000187180 Streptomyces sp. Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241001058196 Tritrichomonas foetus Species 0.000 description 1
- 241000180122 Umbelopsis vinacea Species 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 108010061314 alpha-L-Fucosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000012086 alpha-L-Fucosidase Human genes 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 108010026195 glycanase Proteins 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001446247 uncultured actinomycete Species 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству ферментов, имеющих значение в решении проблемы универсального донорства, и может быть использовано для, 1 получения высокоактивной α -галактозидазы, применяемой в медицине, генной инженерии, молекулярной биологии. The invention relates to biotechnology, in particular to the production of enzymes that are important in solving the problem of universal donation, and can be used to obtain highly active α -galactosidase used in medicine, genetic engineering, molecular biology.
Разработка эффективного способа получения на местах универсальных по групповым свойствам эритроцитов для неотложной трансфузиологической помощи пострадавшим продолжает в нашей стране быть весьма актуальной. The development of an effective way to obtain red blood cells that are universal in their group properties for emergency transfusiological care for victims continues to be very relevant in our country.
Большой практический интерес представляют α -галактозидазы, способные удалять α -1,3 -связанные остатки галактозы из гликопротеинов групповых веществ В крови с превращением последних в вещества группы 0 (Н). Такие α -галактозидазы довольно редки. Из литературных данных известно всего шесть α -галактозидаз, способных катализировать трансформацию эритроцитов 0 группы крови B человека в группу крови 0. К ним относятся α -галактозидазы актиномицета Streptomyces sp. (99178) [1] , зигомицета Mortierella vinacea[2], простейших Trichomonas foetus [3], зерен кофе 14,5], сладкого миндаля [6] и сладкого картофеля Colocacia esculenta [7]. Of great practical interest are α -galactosidases capable of removing α-1,3-linked galactose residues from glycoproteins of group substances in the blood with the conversion of the latter into substances of group 0 (H). Such α-galactosidases are quite rare. From the literature data, only six α-galactosidases are known that can catalyze the transformation of erythrocytes from human blood group B to
В литературе приводились сведения об успешном переливании людям (добровольцам) энзиматически ( α -галактозидазой из зерен кофе) трансформированных эритроцитов [8-11] . Однако для широкого практического применения таких эритроцитов необходимы высокоочищенные специфические ферменты, которые можно получать из доступного и легко воспроизводимого сырья. In the literature, information was provided on successful transfusion of transformed red blood cells (α-galactosidase from coffee beans) to humans (volunteers) [8-11]. However, for the wide practical application of such red blood cells, highly purified specific enzymes are necessary, which can be obtained from accessible and easily reproducible raw materials.
Наиболее технологичными источниками ферментов являются микроорганизмы, так как они обладают огромной скоростью размножения и осуществляют синтез биологически активных веществ в контролируемых человеком условиях. The most technologically advanced sources of enzymes are microorganisms, since they have an enormous reproduction rate and synthesize biologically active substances under human-controlled conditions.
Среди известных бактерий наземного происхождения продуцента фермента с требуемой специфичностью не обнаружено. Among known bacteria of terrestrial origin, an enzyme producer with the required specificity was not found.
Кроме узкой субстратной специфичности огромное значение имеет pH- оптимум фермента. Так, все описанные выше эффективные на эритроцитах ферменты имеют оптимум в кислой области pH, что крайне нежелательно для эритроцитов. In addition to narrow substrate specificity, the pH optimum of the enzyme is of great importance. So, all the enzymes that are effective on red blood cells described above have an optimum in the acidic pH region, which is extremely undesirable for red blood cells.
Анализ многочисленных литературных данных показал, что именно бактерии содержат ферменты, одно из свойств которых (оптимум действия при pH 7,0) удовлетворяет технологическим требованиям, предъявляемым к модификации эритроцитов в физиологических условиях. The analysis of numerous literature data showed that it is bacteria that contain enzymes, one of the properties of which (optimum action at pH 7.0) satisfies the technological requirements for the modification of red blood cells in physiological conditions.
Морские бактерии как источники ферментов с уникальной специфичностью привлекают все большее внимание исследователей. Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН является обладателем обширной коллекции морских бактерий, собранной в различных районах Мирового океана во время экспедиций научно-исследовательского судна "Академик Опарин". Скрининг среди почти двух тысяч штаммов морских бактерий различных родов и акваторий обитания [12] позволил выявить несколько перспективных штаммов-продуцентов α -галактозидаз, инактивирующих групповую специфичность эритроцитов человека группы крови В. Marine bacteria as sources of enzymes with unique specificity are attracting increasing attention of researchers. The Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, Far Eastern Branch of the Russian Academy of Sciences is the owner of an extensive collection of marine bacteria collected in various regions of the World Ocean during the expeditions of the academic vessel Akademik Oparin. Screening among almost two thousand strains of marine bacteria of various genera and habitats [12] revealed several promising strains producing α -galactosidases that inactivate the group specificity of human erythrocytes of blood group B.
Задача изобретения - выявление нового штамма, продуцирующего α -галактозидазу с указанными выше свойствами (узкая субстратная специфичность, оптимум действия при pH 7,0 - 7,5), необходимыми для биотехнологии. The objective of the invention is the identification of a new strain producing α -galactosidase with the above properties (narrow substrate specificity, optimum action at pH 7.0 - 7.5), necessary for biotechnology.
Поставленная задача решена тем, что из морской воды выделен штамм бактерий Pseudoalteromonas sp., отобранный по признаку высокой исходной α -галактозидазной активности по п-нитро-фенил- α - D -галактопиранозиду. The problem is solved in that a bacterial strain Pseudoalteromonas sp. Was selected from seawater, selected according to the high initial α-galactosidase activity for p-nitro-phenyl-α - D-galactopyranoside.
Штамму бактерий Pseudoalteromonas sp. присвоен номер КММ 701, он депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером ВКМ В-2135 Д. The bacterial strain Pseudoalteromonas sp. assigned number KMM 701, it is deposited in the All-Russian collection of microorganisms under the number VKM V-2135 D.
Штамм выделен методом прямого высева на агаризованную среду следующего состава (г/л): пептон - 5, дрожжевой экстракт -2,5, глюкоза - 1, MgSO4 - 0,5, K2HPO4 - 0,2; морская вода - 750 мл, дистиллированная вода - 250 мл, pH - 7,5.The strain was isolated by direct seeding on an agar medium of the following composition (g / l): peptone - 5, yeast extract -2.5, glucose - 1, MgSO 4 - 0.5, K 2 HPO 4 - 0.2; seawater - 750 ml, distilled water - 250 ml, pH - 7.5.
Культуру хранят в пробирках под слоем минерального масла на полужидкой среде приведенного выше состава, при температуре 10oC.The culture is stored in test tubes under a layer of mineral oil in a semi-liquid medium of the above composition, at a temperature of 10 o C.
Штамм имеет следующие характеристики. The strain has the following characteristics.
Культурально-морфологические признаки. Cultural and morphological characters.
а) Бактерии образуют круглые с ровными краями, выпуклые колонии до 4 мм в диаметре, поверхность колоний - гладкая, консистенция слизистая. Пигмент не накапливается. a) Bacteria form round with smooth edges, convex colonies up to 4 mm in diameter, the surface of the colonies is smooth, the mucous consistency. The pigment does not accumulate.
б) Штамм ВКМ В-2135 Д представляет собой небольшие грамотрицательные палочки, подвижные с помощью одного полярного жгутика. Хемоорганотрофы с окислительным типом метаболизма. Оксидазо- и каталазоположительные, без NaCl в среде не растут, пигмента не накапливают. Люминесценция и флюоресценция отсутствуют. Растут при 4oC, при 41oC рост отсутствует.b) The strain VKM B-2135 D is a small gram-negative rods, mobile using a single polar flagellum. Chemorganotrophs with an oxidative type of metabolism. Oxidase- and catalase-positive, do not grow in the medium without NaCl, and do not accumulate pigment. Luminescence and fluorescence are absent. Grow at 4 o C, at 41 o C no growth.
Физиолого-биохимические признаки. Physiological and biochemical characteristics.
Штамм ВКМ В-2135 Д не гидролизует желатин, крахмал, твин-80. Аргининдегидролаза отсутствует, не денитрификатор. Индол и сероводород не образует. Мелибиозу, мальтозу, сахарозу, глицерин не утилизирует. Штаммы рода Pseudoalteromonas не патогенны и не токсичны для теплокровных животных. Strain VKM V-2135 D does not hydrolyze gelatin, starch, tween-80. Arginine dehydrolase is absent, not a denitrifier. Indole and hydrogen sulfide does not form. Melibiosis, maltose, sucrose, glycerin does not utilize. Strains of the genus Pseudoalteromonas are neither pathogenic nor toxic to warm-blooded animals.
Пример использования штамма морской бактерии Pseudoalteromonas sp. ВКМ В-2135 Д для получения фермента α - галактозидазы. An example of using a strain of marine bacteria Pseudoalteromonas sp. VKM B-2135 D for the production of the α-galactosidase enzyme.
Ферментацию проводят на модифицированной питательной среде Y-K следующего состава, г/л:
Бактопептон (Difco) - 5,0
Глюкоза - 1,0
K2HPO4 - 0,2
Дрожжевой экстракт (Difco) - 2,0
Дистиллированная вода - 500 мл
Морская вода - 500 мл
pH - 7,8
Посевной материал Pseudoalteromonas sp. ВКМ В-2135 Д выращивают в колбах емкостью 250 мл, содержащие 50 мл ферментационной среды, в течение 18-20 ч при 25oC на качалке со скоростью вращения 150 об/мин до получения плотности 109 клеток/мл.Fermentation is carried out on a modified nutrient medium YK of the following composition, g / l:
Bactopeptone (Difco) - 5.0
Glucose - 1.0
K 2 HPO 4 - 0.2
Yeast Extract (Difco) - 2.0
Distilled Water - 500 ml
Sea water - 500 ml
pH - 7.8
Seed Pseudoalteromonas sp. VKM B-2135 D is grown in 250 ml flasks containing 50 ml of fermentation medium for 18-20 hours at 25 ° C on a shaker at a rotation speed of 150 rpm to obtain a density of 10 9 cells / ml.
Полученным посевным материалом засевают колбы емкостью 1000 мл, содержащие 500 мл ферментационной среды того же состава. Ферментацию проводят в течение 24 ч при 25oC на качалке со скоростью вращения 120 об/мин.1000 ml flasks containing 500 ml of a fermentation medium of the same composition are seeded with the resulting seed. Fermentation is carried out for 24 hours at 25 o C on a rocking chair with a rotation speed of 120 rpm
Последовательность процедур выделения и очистки α -галактозидазы из биомассы бактерии и ее очистки традиционна. The sequence of procedures for the isolation and purification of α -galactosidase from the biomass of bacteria and its purification is traditional.
α -Галактозидазная активность сосредоточена в биомассе бактерий, а не в культуральной среде. Навеску сырой биомассы суспендируют в 0,01 М фосфатном буфере, pH 6,8-7,0. Соотношение биомассы и буфера не превышает 0,5 мг на 1 мл. Суспензию озвучивают ультразвуком с частотой 22 кГц (при токе 0,4 А) 4-5 раз по 40 с с 10-20-секундным перерывом на ультразвуковом диспергаторе. Гомогенат центрифугируют 30-35 мин на центрифуге при 15 000 об/мин. α-galactosidase activity is concentrated in the biomass of bacteria, and not in the culture medium. A portion of the raw biomass is suspended in 0.01 M phosphate buffer, pH 6.8-7.0. The ratio of biomass and buffer does not exceed 0.5 mg per 1 ml. The suspension is voiced by ultrasound with a frequency of 22 kHz (at a current of 0.4 A) 4-5 times for 40 s with a 10-20-second break on the ultrasonic disperser. The homogenate is centrifuged for 30-35 minutes in a centrifuge at 15,000 rpm.
Супернатант подвергают ионообменной хроматографии на колонке DEAE-Toyoperl 650 М фирмы "Toya Soda", Япония (15,5х2), уравновешенной 0,01 М фосфатным буфером, pH 6,8-7,0. Элюцию проводят линейным градиентом NaCl (0 - 0,5 М) 300/300 мл со скоростью 22 мл/ч. The supernatant is subjected to ion exchange chromatography on a DEAE-Toyoperl 650 M column from Toya Soda, Japan (15.5 x 2), equilibrated with 0.01 M phosphate buffer, pH 6.8-7.0. Elution is carried out with a linear gradient of NaCl (0 - 0.5 M) 300/300 ml at a rate of 22 ml / h.
Фракции, содержащие α -галактозидазную активность объединяют, концентрируют ультрафильтрацией на мембране РМ-ЗО (Amicon, Англия) и наносят на колонку с сефарозой CL-4B фирмы "Pharmacia" (Швеция) (62х2,5см), уравновешенную тем же буфером. Элюируют со скоростью 28 мл/ч. Fractions containing α -galactosidase activity are combined, concentrated by ultrafiltration on a PM-ZO membrane (Amicon, England) and applied to a Pharmacia CL-4B Sepharose column (Sweden) (62x2.5 cm), equilibrated with the same buffer. Elute at a rate of 28 ml / h.
После гельфильтрации фракции, содержащие α -галактозидазную активность, рехроматографируют на DEAE-Toyoperl 650 М в условиях, указанных выше. After gel filtration, fractions containing α -galactosidase activity are rechromatographed on a DEAE-Toyoperl 650 M under the conditions indicated above.
Суммарная α -галактозидазная активность экстракта биомассы, приготовленного описанным выше способом, полностью сорбируется на анионообменнике, и 65% ее элюируется линейным градиентом NaCl при 0,14 М одним симметричным узким пиком. В результате фермент очищается в 5,5 раза (табл. 1). Последующее концентрирование ультрафильтрацией на мембране РМ-ЗО и дальнейшая гельфильтрация на сефарозе CL-6B фракций, содержащих α -галактозидазную активность, приводит к 65- кратной очистке препарата фермента почти без потери активности. Рехроматография на DEAE-Toyoperl 650 М помогает отделить ряд белковых примесей. Для дальнейших исследований берут фракции ферментного препарата, которые соответствуют центральной части пика активности при 0,19 М NaCl. Выход α -галактозидазной активности составляет 30% от активности экстракта, удельная активность увеличивается с 0,1 до 10 ед/мг (табл. 1). The total α -galactosidase activity of the biomass extract prepared as described above is completely adsorbed on the anion exchanger, and 65% of it is eluted with a linear NaCl gradient at 0.14 M with one symmetric narrow peak. As a result, the enzyme is purified 5.5 times (table. 1). Subsequent concentration by ultrafiltration on a PM-ZO membrane and further gel filtration on sepharose of CL-6B fractions containing α -galactosidase activity leads to a 65-fold purification of the enzyme preparation with almost no loss of activity. Rechromatography on a DEAE-Toyoperl 650 M helps separate a number of protein contaminants. For further studies, fractions of the enzyme preparation are taken that correspond to the central part of the peak of activity at 0.19 M NaCl. The yield of α -galactosidase activity is 30% of the activity of the extract, the specific activity increases from 0.1 to 10 units / mg (table. 1).
Стандартную гидролитическую активность α -галактозидазы (U) определяют следующим способом: к 50 мкл исследуемого раствора фермента добавляют 450 мкл раствора п-нитрофенил- α -D- α -галактопиранозида производства фирмы "Sigma", США (1 мг/мл) в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,0, инкубируют при температуре 20oC. Реакцию останавливают через 5-20 мин, в зависимости от быстроты развития желтой окраски, добавлением 2,5 мл 1 М Na2CO3, и измеряют оптическую плотность раствора при 412 нм на СФ-26 (СССР). Количество выделившегося п-нитрофенола определяют из расчета: 23 мкг /мл соответствует 0,5 ед оптической плотности раствора. За единицу активности принимают количество фермента, которое катализирует образование 1 мкмоля п-нитрофенола в 1 мин в условиях определения.The standard hydrolytic activity of α -galactosidase (U) is determined as follows: 450 μl of a solution of p-nitrophenyl-α-D-α-galactopyranoside manufactured by Sigma, USA (1 mg / ml) is added to 50 μl of the enzyme solution 1 M phosphate buffer, pH 7.0, incubated at a temperature of 20 o C. The reaction is stopped after 5-20 minutes, depending on the speed of development of the yellow color, adding 2.5 ml of 1 M Na 2 CO 3 and measure the optical density of the solution at 412 nm on SF-26 (USSR). The amount of p-nitrophenol released is determined from the calculation: 23 μg / ml corresponds to 0.5 units of the optical density of the solution. The unit of activity is the amount of enzyme that catalyzes the formation of 1 μmol of p-nitrophenol in 1 min under the conditions of determination.
Удельную активность α -галактозидазы считают как отношение ч стандартных единиц на мг белка в единице объема (U/мг белка). Белок определяют по методу Лоури. The specific activity of α -galactosidase is considered as the ratio of h standard units per mg protein per unit volume (U / mg protein). Protein is determined by the Lowry method.
В результате применяемой схемы очистки получают препарат фермента, очищенный в 98 раз и не содержащий других гликаназ и гликозидаз. As a result of the purification scheme used, an enzyme preparation is obtained that is 98 times purified and does not contain other glycanases and glycosidases.
Фермент имеет оптимум действия при pH 6,7-7,7, требуемый для проведения реакции трансформации эритроцитов человека группы крови B (III) в H (O) в щадящих эритроциты условиях. Это свойство дает существенное преимущество полученного фермента перед уже известными α -галактозидазами из других, указанных выше источников, имеющими оптимумы действия при pH<6. The enzyme has an optimum effect at a pH of 6.7-7.7, required for the reaction of the transformation of human blood group B (III) red blood cells into H (O) under sparing red blood cells. This property gives a significant advantage of the obtained enzyme over the already known α-galactosidases from other sources indicated above, having optimum action at pH <6.
Фермент не выдерживает замораживания, но неограниченное время сохраняет активность при 4oC и в течение недели при 20oC в присутствии 0,1% азида Na, хотя при 30oC за 10 мин теряет 50% активности.The enzyme does not withstand freezing, but remains unlimited at 4 ° C and during the week at 20 ° C in the presence of 0.1% Na azide, although at 30 ° C it loses 50% activity in 10 minutes.
Молекулярная масса фермента составляет 200 кДа по данным гельфильтрации на сефарозе CL-6B фирмы "Pharmacia" (Швеция). The molecular weight of the enzyme is 200 kDa according to gel filtration on Sepharose CL-6B company "Pharmacia" (Sweden).
α -Галактозидаза, полученная из штамма бактерии Pseudoalteromonas ВКМ В-2135 Д испытана в Гематологическом научном центре РАМН (Москва) на способность трансформировать эритроциты группы крови B (III) человека в эритроциты группы H (O). α-galactosidase obtained from the bacterial strain Pseudoalteromonas VKM B-2135 D was tested at the Hematology Research Center of the Russian Academy of Medical Sciences (Moscow) for the ability to transform human blood group B (III) red blood cells into H (O) red blood cells.
Нативные эритроциты, кровь и стандартные групповые сыворотки получены от станции переливания крови Гематологического научного центра РАМН. Моноклональные антитела (анти-A, анти-B, анти-H, анти-M, анти-N) - от фирмы "Гематолог" РАМН. Native red blood cells, blood, and standard group sera were obtained from the blood transfusion station of the Hematology Research Center of the Russian Academy of Medical Sciences. Monoclonal antibodies (anti-A, anti-B, anti-H, anti-M, anti-N) - from the company "Hematologist" RAMS.
В длительных опытах по трансформации, когда велика вероятность гемолиза, использовались эритроциты, зафиксированные глутаровым альдегидом. In long-term transformation experiments, when hemolysis is likely, erythrocytes fixed with glutaraldehyde were used.
Эффективность фермента при действии на эритроциты устанавливают следующими процедурами. Хорошо отмытые зафиксированные эритроциты смешивают с раствором фермента и после 24 ч инкубации с перемешиванием при 26oC 3 раза отмывают забуференным физраствором рН 7,3 и смешивают затем с соответствующими сыворотками. После 1 ч инкубации при комнатной температуре с легким перемешиванием производят определение агглютинирующей способности таких абсорбированных сывороток. Агглютинационные тесты осуществляют на 96- круглолуночных планшетах в серии двойных разведений нормальной и/или абсорбированной ("истощенной") сыворотки (растворов антител) с помощью нативных эритроцитов, предварительно отобранных из нескольких образцов донорской крови.The effectiveness of the enzyme when acting on red blood cells is established by the following procedures. Well-washed fixed red blood cells are mixed with the enzyme solution and, after 24 hours of incubation with stirring at 26 ° C, they are washed 3 times with buffered saline pH 7.3 and then mixed with the corresponding sera. After 1 h of incubation at room temperature with gentle stirring, the agglutinating ability of such absorbed sera is determined. Agglutination tests are carried out on 96-well plates in a series of double dilutions of normal and / or absorbed ("depleted") serum (antibody solutions) using native red blood cells pre-collected from several samples of donated blood.
Фиксированные глутаровым альдегидом эритроциты полностью сохраняют структуру АВО-групповых антигенов и соответственно способны специфически адсорбировать антитела [13]. Поэтому, если фермент эффективно инактивирует В антиген, т. е. переводит его в Н(0)- антиген, характеризующий первую (нулевую) группу крови, то адсорбции анти-B антител не происходит (сыворотка не "истощается"), и титр агглютинации нативных эритроцитов соответствующей группы крови не будет отличаться от титра свежей (не "истощенной") сыворотки. Соответственно можно оценивать различную степень инактивации антигенов по изменению титра "истощенных" сывороток. В табл. 2 показаны титры "истощенной" сыворотки после обработки B (III) фиксированных эритроцитов α -галактозидазой из Pseudoalteromonas sp. ВКМ В-2135 Д, которые свидетельствуют об эффективности действия этого препарата фермента на трансформацию эритроцитов группы крови В человека. Red blood cells fixed with glutaraldehyde completely retain the structure of ABO-group antigens and, accordingly, are capable of specifically adsorbing antibodies [13]. Therefore, if the enzyme effectively inactivates the B antigen, that is, converts it to H (0), the antigen that characterizes the first (zero) blood group, then anti-B antibodies do not adsorb (the serum does not "deplete"), and the agglutination titer native red blood cells of the corresponding blood group will not differ from the titer of fresh (not "depleted") serum. Accordingly, it is possible to evaluate the different degree of inactivation of antigens by changing the titer of "depleted" sera. In the table. 2 shows titers of "depleted" serum after treatment of B (III) fixed red blood cells with α -galactosidase from Pseudoalteromonas sp. VKM B-2135 D, which testify to the effectiveness of the action of this enzyme preparation on the transformation of human blood erythrocytes.
В табл. 3 показаны результаты иммунологического изучения нативных незафиксированных эритроцитов, обработанных α -галактозидазой, показавшей свою эффективность на зафиксированных эритроцитах (табл. 2). Видно, что B (III)-антигены трансформированы в O(I)-антиген, т. к. нет агглютинации с анти-B сывороткой. Титр агглютинации с анти-H сывороткой закономерно немного увеличен за счет появления новых H-антигенов (0(I)-антигенов) вместо бывших до того B- антигенов. Такая картина свидетельствует также об отсутствии в образцах фукозидазы, иначе H-антиген был бы инактивирован. Ферментативная обработка не меняет также титр агглютинации с анти-M или анти-N сыворотками, что может свидетельствовать об отсутствии сиалидаз в изученных образцах ферментов. Это очень важно с точки зрения приживляемости трансформированных эритроцитов при введении их г в кровяное русло. α -Галактозидаза, прошедшая процедуру очистки, приведенной в табл. 1, не вызывает также неспецифической агрегации эритроцитов и их гемолиза, что говорит о достаточно высокой чистоте ферментного препарата. In the table. Figure 3 shows the results of an immunological study of native uncommitted erythrocytes treated with α -galactosidase, which has been shown to be effective on fixed erythrocytes (Table 2). It can be seen that B (III) antigens are transformed into O (I) antigen, since there is no agglutination with anti-B serum. The titer of agglutination with anti-H serum is naturally slightly increased due to the appearance of new H antigens (0 (I) antigens) instead of the previously B antigens. This picture also indicates the absence of fucosidase in the samples, otherwise the H antigen would be inactivated. Enzymatic treatment also does not change the titer of agglutination with anti-M or anti-N serum, which may indicate the absence of sialidases in the studied enzyme samples. This is very important from the point of view of engraftment of transformed red blood cells with the introduction of their g into the bloodstream. α-galactosidase, past the purification procedure shown in table. 1 also does not cause non-specific aggregation of red blood cells and their hemolysis, which indicates a fairly high purity of the enzyme preparation.
Поставленная задача решена тем, что получен препарат фермента, способный удовлетворить технологическим требованиям: оптимум действия pH 7,0, эффективно действует на эритроциты группы крови B (III). The problem is solved in that an enzyme preparation is obtained that is able to meet technological requirements: the optimum action is pH 7.0, it effectively acts on red blood cells of blood group B (III).
Источники информации
l. Oishi K., Aida K. //Agric. Biol. Chem. 1972. Vol. 35. P. 578.Sources of information
l. Oishi K., Aida K. // Agric. Biol. Chem. 1972. Vol. 35. P. 578.
2. Улезло И. В., Запрометова О.М. //Прикладная биохим. микробиол. 1982. Т. 18. С. 5. 2. Ulezlo I. V., Zaprometova O. M. // Applied biochem. microbiol. 1982, vol. 18, p. 5.
3. Yates A.D., Morgan W.T.J., Watkins W.M. //FEBS Letts. 1975. Vol. 60. P. 281. 3. Yates A.D., Morgan W.T.J., Watkins W.M. // FEBS Letts. 1975. Vol. 60.P. 281.
4. Zamitz M. L. , Kabat L. A. // J. Am. Chem. Soc. 1960. Vol. 82. P. 3953. 4. Zamitz M. L., Kabat L. A. // J. Am. Chem. Soc. 1960. Vol. 82. P. 3953.
5. Dey P. M., Pridham J. B. // Adv. Enzymol. 1972. Vol. 36 P. 91. 5. Dey P. M., Pridham J. B. // Adv. Enzymol. 1972. Vol. 36 P. 91.
6. Malhotra O. P., Dey P.M. // Biochem. J. 1967. Vol. 103. P. 508. 6. Malhotra O. P., Dey P.M. // Biochem. J. 1967. Vol. 103. P. 508.
7. Chien S.-F., Lin-Chu M. // Carbohydr. Res. 1991. Vol. 217. P. 508. 7. Chien S.-F., Lin-Chu M. // Carbohydr. Res. 1991. Vol. 217. P. 508.
8. GoldsteinJ., Lenny L. a.a. // Science. 1982. Vol.215. P.164- 170. 8. Goldstein J., Lenny L. a.a. // Science. 1982. Vol. 215. P.164-170.
9. Goldstein J., in The Red Cell. 1984. P. 130-157. 9. Goldstein J., in The Red Cell. 1984. P. 130-157.
10. Lenny L., Goldstein J. a.a. // Blood. 1991. Vol.77. P.1383- 1388. 10. Lenny L., Goldstein J. a.a. // Blood. 1991. Vol. 77. P.1383-1388.
11. Lenny L., Goldstein J. a.a.// Blood. 1994. Vol.84. P.469. 11. Lenny L., Goldstein J. a.a.// Blood. 1994. Vol. 84. P.469.
12. Бакунина И.Ю., Иванова Е.П., Недашковская О.М., Горшкова Н.M., Михайлов В.В., Елякова Л.А. // Биология моря. 1997,
13. Ковнер В. Я. , Кульман Р.А. и др. // Гематология и трнсфузиология. 1986. Т.31. С. 21-25.12. Bakunina I.Yu., Ivanova EP, Nedashkovskaya O.M., Gorshkova N.M., Mikhailov V.V., Elyakova L.A. // Biology of the sea. 1997,
13. Kovner V. Ya., Kulman R.A. and others // Hematology and transfusiology. 1986.V.31. S. 21-25.
Claims (1)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU97107819A RU2113479C1 (en) | 1997-04-23 | 1997-04-23 | Strain of bacterium pseudoalteromonas species - a producer of alpha-galactosidase |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU97107819A RU2113479C1 (en) | 1997-04-23 | 1997-04-23 | Strain of bacterium pseudoalteromonas species - a producer of alpha-galactosidase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2113479C1 true RU2113479C1 (en) | 1998-06-20 |
| RU97107819A RU97107819A (en) | 1998-12-10 |
Family
ID=20192903
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU97107819A RU2113479C1 (en) | 1997-04-23 | 1997-04-23 | Strain of bacterium pseudoalteromonas species - a producer of alpha-galactosidase |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2113479C1 (en) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2385931C1 (en) * | 2005-12-20 | 2010-04-10 | Класадо Инк. | Product and method |
| RU2504583C1 (en) * | 2012-10-03 | 2014-01-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН) | PLASMID 40Gal DETERMINING SYNTHESIS OF α-GALACTOSIDASE α-PsGal, STRAIN Ecoli Rosetta(DE3)/40Gal - PRODUCER OF CHIMERIC PROTEIN CONTAINING AMINO-ACID SEQUENCE α-PsGal, AND METHOD FOR ITS PRODUCTION |
| RU2779448C2 (en) * | 2017-05-11 | 2022-09-08 | Кореан Инститьют оф Оушен Сайенс энд Текнолоджи | Cryoprotective agent containing exopolysaccharide from pseudoalteromonas sp. cy01 |
-
1997
- 1997-04-23 RU RU97107819A patent/RU2113479C1/en not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Oishi K., Aida K. Agric Biol. Chev, 1972, v. 35, p. 578. * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2385931C1 (en) * | 2005-12-20 | 2010-04-10 | Класадо Инк. | Product and method |
| RU2504583C1 (en) * | 2012-10-03 | 2014-01-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова Дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН) | PLASMID 40Gal DETERMINING SYNTHESIS OF α-GALACTOSIDASE α-PsGal, STRAIN Ecoli Rosetta(DE3)/40Gal - PRODUCER OF CHIMERIC PROTEIN CONTAINING AMINO-ACID SEQUENCE α-PsGal, AND METHOD FOR ITS PRODUCTION |
| RU2779448C2 (en) * | 2017-05-11 | 2022-09-08 | Кореан Инститьют оф Оушен Сайенс энд Текнолоджи | Cryoprotective agent containing exopolysaccharide from pseudoalteromonas sp. cy01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Müller et al. | Lectin, a possible basis for symbiosis between bacteria and sponges | |
| KR970009295B1 (en) | Method for preparing trehalulose and isomaltulose | |
| JPS59187792A (en) | Production of phospholipid saccharide derivative using enzymic method | |
| EA005580B1 (en) | Enzyme degrading endo-sulfated-fucose containing polysaccharide, process for producing thereof and composition containing same | |
| US5294546A (en) | Method for production of a growth factor for Bifidobacterium sp. | |
| WO1996034004A1 (en) | Sugar compounds | |
| CN109679864A (en) | A method of it producing the bacterial strain for turning glycosyl active p-galactosidase and produces galactooligosaccharide with the enzyme | |
| Dobrynina et al. | Disruption of bacterial biofilms using recombinant dispersin B | |
| Davis et al. | Properties of extracellular neuraminidase produced by group A streptococcus | |
| RU2113479C1 (en) | Strain of bacterium pseudoalteromonas species - a producer of alpha-galactosidase | |
| Bakunina et al. | α-N-acetylgalactosaminidase from marine bacterium Arenibacter latericius KMM 426T removing blood type specificity of A-erythrocytes | |
| RU2141526C1 (en) | STRAIN OF BACTERIUM FLAVOBACTERIUM SPECIES - PRODUCER OF α-N-ACETYLGALACTOSE AMINIDASE | |
| Alekseeva et al. | Intracellular alginolytic enzymes of the marine bacterium Pseudoalteromonas citrea KMM 3297 | |
| Reese et al. | Factors influencing the adsorption of bacteriophage 2 to cells of Pseudomonas aeruginosa | |
| Griffiths et al. | Characterization of Aeromonas salmonicida variants with altered cell surfaces and their use in studying surface protein assembly | |
| JP3635133B2 (en) | Trehalose phosphorylase and preparation method thereof | |
| FR2573091A1 (en) | NOVEL BACTERIOLYTIC ENZYME AND PROCESS FOR PREPARING THE SAME | |
| JP2688854B2 (en) | Method for producing α-galactosidase with strong transglycosylation activity | |
| JP2970932B2 (en) | Novel heat-stable β-galactosyltransferase, its production method and its use | |
| CA1334741C (en) | Method for production of a growth factor for bifidobacterium sp | |
| JP3026312B2 (en) | Production method of chitin degradation products | |
| Gilmore et al. | An aerobic soil microorganism which decomposes blood group substances II: effect of cell-free extracts on blood group substances | |
| JP2006223268A (en) | Method for producing galactosyl disaccharide | |
| NZ221455A (en) | Microbial production of cellulose | |
| JPH0568239B2 (en) |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20150424 |