RU2779448C2 - Cryoprotective agent containing exopolysaccharide from pseudoalteromonas sp. cy01 - Google Patents
Cryoprotective agent containing exopolysaccharide from pseudoalteromonas sp. cy01 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2779448C2 RU2779448C2 RU2019114407A RU2019114407A RU2779448C2 RU 2779448 C2 RU2779448 C2 RU 2779448C2 RU 2019114407 A RU2019114407 A RU 2019114407A RU 2019114407 A RU2019114407 A RU 2019114407A RU 2779448 C2 RU2779448 C2 RU 2779448C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- exopolysaccharide
- pseudoalteromonas
- strain
- erythrocytes
- glycerol
- Prior art date
Links
- 229920002444 Exopolysaccharide Polymers 0.000 title claims abstract description 121
- 241000519582 Pseudoalteromonas sp. Species 0.000 title claims abstract description 26
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 title abstract description 21
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims abstract description 32
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 23
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N α-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 230000000959 cryoprotective Effects 0.000 claims abstract description 19
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 17
- GZCGUPFRVQAUEE-KCDKBNATSA-N D-(+)-Galactose Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O GZCGUPFRVQAUEE-KCDKBNATSA-N 0.000 claims abstract description 15
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 9
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims abstract description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 139
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 75
- 210000003743 Erythrocytes Anatomy 0.000 claims description 72
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 claims description 34
- 210000003097 Mucus Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001772 Blood Platelets Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000003301 hydrolyzing Effects 0.000 claims description 3
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003915 Spermatocytes Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 claims 1
- 230000002538 fungal Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 21
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 abstract description 5
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 74
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 46
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 34
- 230000002949 hemolytic Effects 0.000 description 34
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 22
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 22
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 20
- 229960003082 Galactose Drugs 0.000 description 15
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 description 12
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 11
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 9
- XOHUEYCVLUUEJJ-UHFFFAOYSA-N 2,3-DPG Chemical compound OP(=O)(O)OC(C(=O)O)COP(O)(O)=O XOHUEYCVLUUEJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 8
- 210000003324 RBC Anatomy 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 6
- 230000001965 increased Effects 0.000 description 6
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 6
- 238000001953 recrystallisation Methods 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004940 Nucleus Anatomy 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 230000003247 decreasing Effects 0.000 description 5
- 238000002290 gas chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 5
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000001082 cryoprotectant Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 108020004465 16S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000005084 2D-nuclear magnetic resonance Methods 0.000 description 3
- 230000002528 anti-freeze Effects 0.000 description 3
- 238000002856 computational phylogenetic analysis Methods 0.000 description 3
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 3
- 238000005100 correlation spectroscopy Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 3
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 3
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 3
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 3
- 210000000170 Cell Membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000003617 Erythrocyte Membrane Anatomy 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-YOLKTULGSA-N Maltose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@H]1CO)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GUBGYTABKSRVRQ-YOLKTULGSA-N 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- 241000750264 Pseudoalteromonas agarivorans Species 0.000 description 2
- 241001135311 Pseudoalteromonas nigrifaciens Species 0.000 description 2
- 241000396463 Pseudoalteromonas paragorgicola Species 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000184 acid digestion Methods 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000003919 heteronuclear multiple bond coherence Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000000399 optical microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic Effects 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 2
- 238000004104 two-dimensional total correlation spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 241001535291 Analges Species 0.000 description 1
- RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N Anthrone Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 RJGDLRCDCYRQOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000601 Blood Cells Anatomy 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 102000033147 ERVK-25 Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 229920000663 Hydroxyethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108091005771 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000880118 Pseudoalteromonas arctica Species 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N Raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N Trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000009632 agar plate Methods 0.000 description 1
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001460 carbon-13 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing Effects 0.000 description 1
- 150000002337 glycosamines Chemical class 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 150000002402 hexoses Chemical class 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 1
- 239000002609 media Substances 0.000 description 1
- 229920001894 non-coding RNA Polymers 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N oxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036961 partial Effects 0.000 description 1
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged Effects 0.000 description 1
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000004781 supercooling Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic Effects 0.000 description 1
- 238000001551 total correlation spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
В соответствии с настоящим изобретением предложен экзополисахарид, происходящий из штамма Pseudoalteromonas sp. CY01, который представляет собой новый штамм, обитающий в полярных областях, и более конкретно экзополисахарид, происходящий из штамма Pseudoalteromonas sp. CY01, и композиция для криозащиты клеток, которая содержит указанный экзополисахарид.The present invention provides an exopolysaccharide derived from a strain of Pseudoalteromonas sp. CY01, which is a novel strain found in the polar regions, and more particularly an exopolysaccharide derived from a strain of Pseudoalteromonas sp. CY01, and a composition for cryoprotection of cells, which contains the specified exopolysaccharide.
Уровень техникиState of the art
Многие типы бактерий, которые живут в морской окружающей среде, секретируют вязкие внеклеточные углеводородные полимеры, известные как экзополисахариды (ЭПС). Большинство ЭПС, продуцируемых морскими бактериями, представляют собой гетерополисахариды, состоящие из 3 или 4 различных моносахаридов, которые могут представлять собой пентозы, гексозы, аминосахара или уроновые кислоты, и объединены в группы по 10 или более с образованием повторяющихся звеньев. ЭПС функционируют, защищая микроорганизмы от холодных условий окружающей среды, и ЭПС, секретируемые бактериями в холодных полярных условиях окружающей среды, во многих случаях обладают новыми структурами и способностями обеспечивать криозащиту.Many types of bacteria that live in the marine environment secrete viscous extracellular hydrocarbon polymers known as exopolysaccharides (EPS). Most EPS produced by marine bacteria are heteropolysaccharides composed of 3 or 4 different monosaccharides, which can be pentoses, hexoses, amino sugars, or uronic acids, and are grouped in groups of 10 or more to form repeating units. EPS function to protect microorganisms from cold environmental conditions, and EPS secreted by bacteria in cold polar environmental conditions in many cases have new structures and abilities to provide cryoprotection.
Обнаружено, что ЭПС, секретируемые Pseudoalteromonas sp. SM20310 (бактерии Арктики) и Pseudoalteromonas arctica KOPRI 21653 (бактерии Антарктики), усиливают жизнеспособность Е. coli (бактерии неполярных областей) на фоне циклов замораживания и оттаивания. Таким образом, была предложена возможность применения ЭПС из данных бактерий в качестве криозащитных агентов (КЗА) (Liu, S.В. et al. Applied and Environmental Microbiology, 79:224, 2013; Kim, S.J. & Yim, J.H., J. Microbiology, 45:510, 2007).It was found that EPS secreted by Pseudoalteromonas sp. SM20310 (bacteria of the Arctic) and Pseudoalteromonas arctica KOPRI 21653 (bacteria of the Antarctic) enhance the viability of E. coli (bacteria of non-polar regions) during freeze and thaw cycles. Thus, the possibility of using EPS from these bacteria as cryoprotective agents (CPAs) has been proposed (Liu, S.B. et al. Applied and Environmental Microbiology, 79:224, 2013; Kim, S.J. & Yim, J.H., J. Microbiology 45:510, 2007).
Образование и рост льда приводит к физическому повреждению на клеточном уровне и также уменьшает объем воды в растворе, вызывая осмотический шок из-за повышенной концентрации внеклеточного раствора. Это становится проблемой при хранении биологических веществ при температурах ниже, чем температуры замерзания.The formation and growth of ice leads to physical damage at the cellular level and also reduces the volume of water in the solution, causing osmotic shock due to the increased concentration of the extracellular solution. This becomes a problem when storing biological substances at temperatures lower than freezing temperatures.
Так как регенеративная медицина и трансплантация органов быстро развиваются, увеличивается потребность в криоконсервации клеток, тканей, органов и эритроцитов (ККТ - красных кровяных телец) доноров. Обычно запакованную кровь хранят в добавляемом растворе, таком как ADSOL, при 4°С в течение 42 суток без криоконсервации, и при этом показатель гемолиза указанной крови является высоким. Данная проблема может быть решена путем применения глицерина в качестве криозащитного агента. Однако, возможность сохранения высокого процента эритроцитов может сохраняться только тогда, когда к клеткам добавляют высокую концентрацию (40 масс./об. % или более) глицерина, и клетки охлаждают с очень низкой скоростью охлаждения 1°С/мин и хранят при -80°С.As regenerative medicine and organ transplantation develop rapidly, the need for cryopreservation of cells, tissues, organs and erythrocytes (RBCs) from donors is increasing. Typically, packaged blood is stored in an addition solution such as ADSOL at 4° C. for 42 days without cryopreservation, and the hemolysis rate of said blood is high. This problem can be solved by using glycerol as a cryoprotective agent. However, the ability to maintain a high percentage of erythrocytes can only be maintained when a high concentration (40 w/v% or more) of glycerol is added to the cells and the cells are cooled at a very low cooling rate of 1°C/min and stored at -80°C. FROM.
Однако цитотоксичность глицерина устраняется только при разбавлении глицерина до 1% или менее путем промывки после оттаивания. Для преодоления данного недостатка глицерина осуществляли непрерывные попытки применения других криозащитных агентов, включая низкомолекулярные сахара, такие как трегалоза, сахароза, глюкоза, раффиноза, мальтоза и подобные им. Однако данный способ может влиять на финальное замораживание эритроцитов из-за таких проблем как осмотическое давление или окисление. Для упрощения сложного способа промывки после оттаивания осуществляли попытки применить непроникающие добавки, такие как ГЭК (гидроксиэтилкрахмал), поливинилпирролидон и декстран, вместо глицерина (Scott, K.L. et al., Transfus. Med. Rev., 19:127, 2005; Stolzing, A. et al., Transfusion Apheresis Sci., 46:137, 2012; E.P. Horn et al., Anesth. Analg., 85:739,1997). Такие полимеры не проникают в клеточную мембрану и находятся только снаружи от клеточной мембраны, и, таким образом, не требуют применения сложного способа промывки во время оттаивания после замораживания эритроцитов. Однако, для криоконсервации эритроцитов требуется высокая концентрация (20 масс./об. % или более) раствора ГЭК, и данная высокая концентрация приводит к высокой вязкости, что затрудняет осуществление процесса замораживания.However, the cytotoxicity of glycerol is only eliminated when the glycerol is diluted to 1% or less by washing after thawing. To overcome this lack of glycerol, continuous attempts have been made to use other cryoprotective agents, including low molecular weight sugars such as trehalose, sucrose, glucose, raffinose, maltose, and the like. However, this method may affect the final freezing of red blood cells due to problems such as osmotic pressure or oxidation. To simplify the complex process of washing after thawing, attempts have been made to use non-penetrating additives such as HES (hydroxyethyl starch), polyvinylpyrrolidone and dextran, instead of glycerin (Scott, K. L. et al., Transfus. Med. Rev., 19:127, 2005; Stolzing, A et al., Transfusion Apheresis Sci., 46:137, 2012; E. P. Horn et al., Anesth Analg., 85:739, 1997). Such polymers do not penetrate the cell membrane and are only outside the cell membrane, and thus do not require the use of a complex washing method during thawing after freezing of red blood cells. However, the cryopreservation of erythrocytes requires a high concentration (20% w/v or more) of the HES solution, and this high concentration results in a high viscosity, making the freezing process difficult.
Соответственно, авторы настоящего изобретения предприняли масштабные попытки обнаружить криозащитный агент, который являлся бы непроникающим, являлся бы менее цитотоксичным и имел бы превосходные криозащитные свойства. В результате авторы настоящего изобретения обнаружили, что при добавлении экзополисахарида (ЭПС), продуцируемого штаммом Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867ВР), который является новым штаммом, обнаруженным в Антарктическом океане, во время криоконсервации эритроцитов, указанный экзополисахарид проявляет превосходные криозащитные свойства при относительно низкой концентрации, по сравнению с другими криозащитными агентами (КЗА), и не проявляет цитотоксичность, что и лежит в основе настоящего изобретения.Accordingly, the present inventors have made extensive efforts to find a cryoprotective agent that is non-penetrating, less cytotoxic, and has excellent cryoprotective properties. As a result, the present inventors found that by adding an exopolysaccharide (EPS) produced by a strain of Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867BP), which is a new strain found in the Antarctic Ocean, during erythrocyte cryopreservation, said exopolysaccharide exhibits excellent cryoprotective properties at a relatively low concentration compared to other cryoprotective agents (CPAs), and does not exhibit cytotoxicity, which lies the basis of the present invention.
Краткое описание изобретенияBrief description of the invention
Объектом настоящего изобретения является обеспечение экзополисахарид а (р-CY01), происходящего из штамма Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867ВР), имеющего способность обеспечивать криозащиту клеток, и способа его получения.The object of the present invention is to provide an exopolysaccharide a (p-CY01) derived from a strain of Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867ВР), which has the ability to provide cryoprotection of cells, and a method for its production.
Другим объектом настоящего изобретения является обеспечение экзополисахарида, имеющего молекулярную массу от 1,0×105 до 4,3×105 Да, который получен посредством гидролиза экзополисахарида, происходящего из штамма CY01, и способа его получения.Another object of the present invention is to provide an exopolysaccharide having a molecular weight of 1.0×10 5 to 4.3×10 5 Da, which is obtained by hydrolysis of an exopolysaccharide originating from strain CY01, and a method for producing the same.
Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение композиции для криоконсервации клеток, которая содержит описанный выше экзополисахарид (р-CY01 или p-CY01_LM).Another object of the present invention is to provide a composition for cryopreservation of cells, which contains the above-described exopolysaccharide (p-CY01 or p-CY01_LM).
Еще одним объектом настоящего изобретения является обеспечение способа криоконсервации клеток с применением описанного выше экзополисахарида (р-CY01 или p-CY01_LM).Another object of the present invention is to provide a method for cryopreservation of cells using the exopolysaccharide described above (p-CY01 or p-CY01_LM).
Другим объектом настоящего изобретения является обеспечение штамма Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867ВР), который обитает в полярных областях и обладает способностью продуцировать экзополисахарид.Another object of the present invention is to provide a strain of Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867BP), which lives in the polar regions and has the ability to produce exopolysaccharide.
Для достижения указанной выше цели согласно настоящему изобретению предложен экзополисахарид (р-CY01), который продуцируется штаммом Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867ВР) и состоит из глюкозы и галактозы.To achieve the above object, according to the present invention, an exopolysaccharide (p-CY01) is provided, which is produced by a strain of Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867BP) and consists of glucose and galactose.
Согласно настоящему изобретению также предложен экзополисахарид (р-CY01_LM), имеющий молекулярную массу от 1,0×105 до 4,3×105 Да, который получают посредством гидролиза описанного выше экзополисахарида (p-CY01).The present invention also provides an exopolysaccharide (p-CY01_LM) having a molecular weight of 1.0×10 5 to 4.3×10 5 Da, which is obtained by hydrolysis of the exopolysaccharide (p-CY01) described above.
Согласно настоящему изобретению также предложена композиция для криозащиты клеток, которая содержит описанный выше экзополисахарид (р-CY01 или p-CY01_LM).The present invention also provides a composition for cryoprotecting cells, which contains the exopolysaccharide described above (p-CY01 or p-CY01_LM).
Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения экзополисахарида (р-CY01), который продуцируется штаммом Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867ВР) и состоит из глюкозы и галактозы, причем указанный способ включает следующие стадии: (а) культивирование штамма Pseudoalteromonas sp CY01 (KCTC 12867ВР) с получением экзополисахарида (р-CY01); и (b) выделение полученного экзополисахарида (p-CY01).The present invention also provides a method for producing exopolysaccharide (p-CY01) which is produced by Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867BP) and consists of glucose and galactose, and this method includes the following steps: (a) cultivating a strain of Pseudoalteromonas sp CY01 (KCTC 12867BP) to obtain exopolysaccharide (p-CY01); and (b) isolating the resulting exopolysaccharide (p-CY01).
Согласно настоящему изобретению также предложен способ получения экзополисахарида (p-CY01_LM), имеющего молекулярную массу от 1,0×105 до 4,3×105 Да, причем указанный способ включает стадию гидролиза экзополисахарида (p-CY01), который продуцируется штаммом Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867ВР) и который состоит из глюкозы и галактозы.The present invention also provides a method for producing an exopolysaccharide (p-CY01_LM) having a molecular weight of 1.0×105 up to 4.3×105 Yes, and said method includes the step of hydrolyzing the exopolysaccharide (p-CY01), which is produced by Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867BP) and which consists of glucose and galactose.
Согласно настоящему изобретению также предложен способ криоконсервации клеток с применением описанного выше экзополисахарида (р-CY01 или p-CY01_LM).The present invention also provides a method for cryopreserving cells using the exopolysaccharide described above (p-CY01 or p-CY01_LM).
Согласно настоящему изобретению также предложен штамм Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867ВР), который обладает способностью продуцировать экзополисахарид слизи.The present invention also provides a strain of Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867BP), which has the ability to produce mucus exopolysaccharide.
Краткое описание графических материаловBrief description of graphic materials
На Фиг. 1 показана продукция ЭПС и криозащитные эффекты (свойства) 10 выделенных штаммов. На Фиг. 1 белые столбцы обозначают продуцируемый ЭПС, а черные столбцы обозначают криозащитный эффект (%) ЭПС в отношении Е. coli. Стандартное отклонение (±SD) рассчитывали на основании трех независимых экспериментов.On FIG. 1 shows EPS production and cryoprotective effects (properties) of 10 isolated strains. On FIG. 1, white bars indicate EPS produced and black bars indicate the cryoprotective effect (%) of EPS on E. coli. Standard deviation (±SD) was calculated from three independent experiments.
На Фиг. 2 показаны результаты проведения филогенетического анализа с применением последовательности 16S рРНК (рибосомальная РНК) штамма CY01.On FIG. 2 shows the results of a phylogenetic analysis using the 16S rRNA (ribosomal RNA) sequence of strain CY01.
На Фиг. 3 показаны хроматографические пики ЭПС, происходящего из CY01. В частности, на Фиг. 3А показаны результаты анионной хроматографии, и на Фиг. 3В показаны результаты гель-фильтрационной хроматографии.On FIG. 3 shows the chromatographic peaks of EPS derived from CY01. In particular, in FIG. 3A shows the results of anion chromatography, and FIG. 3B shows the results of size exclusion chromatography.
На Фиг. 4 показаны результаты ВЭЖХ (Высокоэффективная жидкостная хроматография), проводимой для анализа чистоты фракции ЭПС, происходящего из CY01, полученной посредством гель-фильтрационной хроматографии.On FIG. 4 shows the results of HPLC (High Performance Liquid Chromatography) carried out to analyze the purity of the EPS fraction originating from CY01 obtained by size exclusion chromatography.
На Фиг. 5А показаны результаты анализа сахаров-составных частей ЭПС посредством ГХ/МС (газовая хроматография/масс-спектрометрия), и на Фиг. 5В показаны результаты анализа паттерна образования связей сахаров-составных частей ЭПС посредством ГХ/МС.On FIG. 5A shows the results of the analysis of the sugar constituents of EPS by GC/MS (gas chromatography/mass spectrometry), and FIG. 5B shows the results of GC/MS analysis of the bonding pattern of sugar-EPS constituents.
На Фиг. 6А и 6В показаны 1Н и 13С ЯМР (ядерный магнитный резонанс) спектры р-CY01_LM, полученного посредством низкой молекуляризации p-CY01.On FIG. 6A and 6B show 1 H and 13 C NMR (nuclear magnetic resonance) spectra of p-CY01_LM obtained by low molecularization of p-CY01.
На Фиг. 7А и 7В показан спектр 2D-HSQC (гетероядерная одноквантовая корреляция) p-CY01_LM, полученного посредством низкой молекуляризации, и показаны результаты экспериментов по корреляции углеродов с протонами, и на Фиг. 7С, 7D, 7Е и 7F показаны спектры 2D-TOCSY (полная корреляционная спектроскопия), 2D-COSY (корреляционная спектроскопия), 2D-HMBC (гетероядерная многосвязная корреляционная спектроскопия) и 2D-ЯМР (600 МГц).On FIG. 7A and 7B show the 2D-HSQC (Heteronuclear Single Quantum Correlation) spectrum of p-CY01_LM obtained by low molecularization and show the results of carbon proton correlation experiments, and FIG. 7C, 7D, 7E and 7F show 2D-TOCSY (total correlation spectroscopy), 2D-COSY (correlation spectroscopy), 2D-HMBC (heteronuclear multiply coupled correlation spectroscopy), and 2D-NMR (600 MHz) spectra.
На Фиг. 8 показаны результаты анализа главных структур р-CY01 на основе результатов анализа ГХ/МС и ЯМР.On FIG. 8 shows the results of analysis of the main structures of p-CY01 based on the results of GC/MS and NMR analysis.
На Фиг. 9А показаны результаты эксклюзионной хроматографии р-CY01 и р-CY01_LM, полученные в результате обработки на основе кислотного раасщепления, и на Фиг. 9В показаны изменения в реологических свойствах раствора p-CY01_LM. # обозначает р-CY01, и * обозначает p-CY01_LM.On FIG. 9A shows the results of size exclusion chromatography of p-CY01 and p-CY01_LM obtained from the acid digestion treatment, and FIG. 9B shows changes in the rheological properties of the p-CY01_LM solution. # denotes p-CY01, and * denotes p-CY01_LM.
На Фиг. 10А показан гемолиз (%) эритроцитов в зависимости от концентрации р-CY01_LM в среде для криоконсервации; на Фиг. 10В показаны результаты наблюдения под микроскопом, проводимого для подтверждения целостности эритроцитов, оттаявших после криоконсервации в 2,5% растворе p-CY01_LM; на Фиг. 10С показаны результаты анализа целостности эритроцитов, оттаявших после криоконсервации в растворе ФБР (фосфатно-солевой буферный раствор); и на Фиг. 10D показан гемолиз (%) эритроцитов, оттаявших после длительной криоконсервации в растворе p-CY01_LM. На Фиг. 10 черные столбцы обозначают гемолиз (%) эритроцитов, оттаявших после криоконсервации в 2,5% растворе p-CY01_LM, и белые столбцы обозначают гемолиз (%) эритроцитов, оттаявших после криоконсервации в растворе ФБР.On FIG. 10A shows hemolysis (%) of erythrocytes as a function of the concentration of p-CY01_LM in the cryopreservation medium; in FIG. 10B shows the results of microscopic observation to confirm the integrity of erythrocytes thawed after cryopreservation in 2.5% p-CY01_LM; in FIG. 10C shows the results of analysis of the integrity of erythrocytes thawed after cryopreservation in PBS (phosphate-buffered saline); and in FIG. 10D shows hemolysis (%) of erythrocytes thawed after prolonged cryopreservation in p-CY01_LM solution. On FIG. 10, black bars indicate hemolysis (%) of erythrocytes thawed after cryopreservation in 2.5% p-CY01_LM solution, and white bars indicate hemolysis (%) of erythrocytes thawed after cryopreservation in PBS solution.
На Фиг. 11 показаны результаты измерения активностей АТФ и 2,3-ДФГ (2,3-дифосфоглицерат) после гемолиза эритроцитов, криоконсервированных в растворе р-CY01_LM.On FIG. 11 shows the results of measuring the activities of ATP and 2,3-DPG (2,3-diphosphoglycerate) after hemolysis of erythrocytes cryopreserved in p-CY01_LM solution.
На Фиг. 12А показаны результаты анализа способности каждого компонента, добавленного к среде для криоконсервации, к консервации эритроцитов. На Фиг. 12А ADSOL обозначает раствор ADSOL; «G+D» обозначает 1% (масс./об.) глицерин и ДМСО (диметилсульфоксид); «p-CY01_LM» обозначает 2,5% (масс./об.) раствор p-CY01_LM; и «G+D+p-CY01_LM» обозначает раствор, содержащий 1% (масс./об.) глицерин, 1% (масс./об.) ДМСО и 2,5% (масс./об.) p-CY01_LM. * обозначает раствор каждого компонента в ADSOL. На Фиг. 12В показаны результаты статистического анализа Плакетта-Бермана, проводимого для анализа главного эффекта каждого компонента, который добавляют к среде для криоконсервации, на криоконсервацию эритроцитов. * указывает на то, что статистически различные значения равны или меньше чем 0,05.On FIG. 12A shows the results of an analysis of the ability of each component added to the cryopreservation medium to preserve erythrocytes. On FIG. 12A ADSOL stands for ADSOL solution; "G+D" means 1% (w/v) glycerol and DMSO (dimethyl sulfoxide); "p-CY01_LM" refers to a 2.5% (w/v) solution of p-CY01_LM; and "G+D+p-CY01_LM" means a solution containing 1% (w/v) glycerol, 1% (w/v) DMSO and 2.5% (w/v) p-CY01_LM . * denotes the solution of each component in ADSOL. On FIG. 12B shows the results of a Plackett-Berman statistical analysis performed to analyze the main effect of each component added to the cryopreservation medium on erythrocyte cryopreservation. * indicates that statistically different values are equal to or less than 0.05.
На Фиг. 13 показаны результаты анализа ДСК (дифференциальная сканирующая калориметрия) раствора p-CY01_LM. В частности, на Фиг. 13А показаны результаты анализа ДСК для раствора, содержащего 1% глицерин и 1% ДМСО, который представляет собой отрицательный контроль; на Фиг. 13В показаны результаты анализа ДСК для раствора, содержащего 1% глицерин, 1% ДМСО и 0,5% p-CY01_LM; и на Фиг. 13С показаны результаты анализа ДСК для раствора, содержащего 1% глицерин, 1% ДМСО и 2,5% p-CY01_LM.On FIG. 13 shows the results of a DSC (differential scanning calorimetry) analysis of a p-CY01_LM solution. In particular, in FIG. 13A shows the results of DSC analysis for a solution containing 1% glycerol and 1% DMSO, which is a negative control; in FIG. 13B shows DSC results for a solution containing 1% glycerol, 1% DMSO, and 0.5% p-CY01_LM; and in FIG. 13C shows DSC results for a solution containing 1% glycerol, 1% DMSO and 2.5% p-CY01_LM.
На Фиг. 14 показаны результаты анализа способности раствора p-CY01_LM к предотвращению замерзания посредством анализа формы кристаллов льда. В частности, на Фиг. 14А показаны результаты анализа формы кристаллов льда в растворе, содержащем 1% глицерин и 1% ДМСО; на Фиг. 14В показаны результаты анализа формы кристаллов льда в растворе ADSOL (раствор p-CY01_LM), содержащем 1% глицерин, 1% ДМСО и 2,5% p-CY01_LM; и на Фиг. 14С показаны результаты анализа формы кристаллов льда в растворе ADSOL, содержащем 1% глицерин, ДМСО и 2,5% ГЭК. От 1 до 2 в каждой экспериментальной группе означает, что форма кристаллов льда становится больше при охлаждении зародышей кристаллов льда. Масштаб представляет собой 10 мкм.On FIG. 14 shows the results of analyzing the freezing prevention ability of the p-CY01_LM solution by analyzing the shape of the ice crystals. In particular, in FIG. 14A shows the results of the analysis of the shape of ice crystals in a solution containing 1% glycerol and 1% DMSO; in FIG. 14B shows the results of ice crystal shape analysis in an ADSOL solution (p-CY01_LM solution) containing 1% glycerol, 1% DMSO and 2.5% p-CY01_LM; and in FIG. 14C shows the results of an analysis of the shape of ice crystals in an ADSOL solution containing 1% glycerol, DMSO and 2.5% HES. 1 to 2 in each experimental group means that the shape of the ice crystals becomes larger when the ice crystal nuclei are cooled. The scale represents 10 µm.
На Фиг. 15 показаны результаты анализа способности p-CY01_LM к предотвращению замерзания посредством анализа остаточной формы эритроцитов и формы кристаллов льда при наблюдении под микроскопом процессов замерзания и оттаивания. В частности, на Фиг. 15А показана форма эритроцитов в ФБР; на Фиг. 15В показана форма эритроцитов в растворе p-CY01_LM; и на Фиг. 15С показана форма эритроцитов в растворе ADSOL, содержащем 1% глицерин, ДМСО и 2,5% ГЭК. Изображения гемолиза эритроцитов получали после 5 минут на каждой стадии, и масштаб представляет 20 мкм.On FIG. 15 shows the results of analyzing the freeze-prevention ability of p-CY01_LM by analyzing the residual shape of erythrocytes and the shape of ice crystals when observing the freezing and thawing processes under a microscope. In particular, in FIG. 15A shows the shape of erythrocytes in PBS; in FIG. 15B shows the shape of erythrocytes in p-CY01_LM solution; and in FIG. 15C shows the shape of erythrocytes in an ADSOL solution containing 1% glycerol, DMSO and 2.5% HES. Images of hemolysis of erythrocytes were obtained after 5 minutes at each stage, and the scale represents 20 μm.
На Фиг. 16 показаны результаты наблюдения за активностью p-CY01_LM в отношении ингибирования перекристаллизации льда (ИПЛ). В частности, на Фиг. 16А показаны результаты для ФБР; на Фиг. 16В показаны результаты для раствора р-CY01_LM; и на Фиг. 16С показаны результаты для раствора ADSOL, содержащего 1% глицерин, ДМСО и 2,5% ГЭК. Масштаб представляет собой 100 мкм.On FIG. 16 shows the results of monitoring the activity of p-CY01_LM against ice recrystallization inhibition (IRL). In particular, in FIG. 16A shows the results for the FBI; in FIG. 16B shows results for p-CY01_LM solution; and in FIG. 16C shows the results for an ADSOL solution containing 1% glycerol, DMSO and 2.5% HES. The scale represents 100 µm.
Подробное описание предпочтительного варианта реализацииDetailed Description of the Preferred Embodiment
Согласно настоящему изобретению новый штамм Pseudoalteromonas sp. CY01, который продуцирует экзополисахарид, выделяли из образцов антарктических морских вод. Было обнаружено, что экзополисахарид, продуцируемый штаммом CY01, оказывал сильный криозащитный эффект на E. coli во время исходного скрининга. На основе данного результата исследовали, будет ли экзополисахарид, продуцируемый штаммом CY01, пригодным к применению в качестве криозащитного агента во время криоконсервации клеток. Для обеспечения физических свойств, подходящих для применения в криоконсервации, экзополисахарид из CY01 частично расщепляли под действием кислоты с образованием низкомолекулярного экзополисахарида, и данный низкомолекулярный экзополисахарид добавляли во время криоконсервации эритроцитов. В результате было показано, что низкомолекулярный экзополисахарид демонстрировал высокую способность к предотвращению замерзания и не обладал цитотоксичностью.According to the present invention, a new strain of Pseudoalteromonas sp. CY01, which produces exopolysaccharide, was isolated from samples of Antarctic marine waters. The exopolysaccharide produced by strain CY01 was found to have a strong cryoprotective effect on E. coli during initial screening. Based on this result, it was investigated whether the exopolysaccharide produced by strain CY01 would be suitable for use as a cryoprotective agent during cell cryopreservation. To provide physical properties suitable for use in cryopreservation, the exopolysaccharide from CY01 was partially cleaved by acid to form a low molecular weight exopolysaccharide, and this low molecular weight exopolysaccharide was added during cryopreservation of erythrocytes. As a result, it was shown that the low molecular weight exopolysaccharide exhibited high antifreeze ability and no cytotoxicity.
Таким образом, согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к экзополисахариду, который продуцируется штаммом Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867ВР) и который состоит из глюкозы и галактозы.Thus, according to one aspect, the present invention relates to an exopolysaccharide that is produced by a strain of Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867BP) and which consists of glucose and galactose.
Согласно настоящему изобретению среди 2980 штаммов, выделенных из образцов антарктических морских вод, выделяли 73 штамма, которые продуцируют экзополисахариды слизи, и из них отбирали 10 штаммов, имеющих превосходную способность продуцировать экзополисахариды. Клетки Е. coli подвергали действию циклов замораживания и оттаивания в 0,2% (масс./масс.) неочищенном растворе экзополисахаридов, полученном из каждого штамма, и измеряли долю выживших клеток Е. coli. В результате неочищенный экзополисахарид, продуцируемый штаммом CY01 среди данных 10 штаммов, демонстрировал наибольший криозащитный эффект.According to the present invention, among 2980 strains isolated from Antarctic sea water samples, 73 strains that produce mucus exopolysaccharides were isolated, and 10 strains having excellent exopolysaccharide production were selected from them. E. coli cells were subjected to freeze and thaw cycles in 0.2% (w/w) crude exopolysaccharide solution prepared from each strain and the percentage of surviving E. coli cells was measured. As a result, the crude exopolysaccharide produced by strain CY01 among these 10 strains showed the greatest cryoprotective effect.
В примере настоящего изобретения доля выживших клеток Е. coli в растворе, содержащем 0,2% неочищенного экзополисахарида, происходящего из штамма CY01, составляла 88,16±2,92%, и доли выживших клеток Е. coli в растворах, содержащих 0,2% неочищенных экзополисахаридов, происходящих из других штаммов, составляли от 42,01±1,93% до 67,28±4,32%.In the example of the present invention, the proportion of surviving E. coli cells in a solution containing 0.2% crude exopolysaccharide derived from strain CY01 was 88.16±2.92%, and the proportion of surviving E. coli cells in solutions containing 0.2 The % of crude exopolysaccharides originating from other strains ranged from 42.01±1.93% to 67.28±4.32%.
Согласно настоящему изобретению молярное отношение глюкозы к галактозе в экзополисахариде из CY01 может составлять приблизительно 3,4:1.According to the present invention, the molar ratio of glucose to galactose in the exopolysaccharide from CY01 can be approximately 3.4:1.
Согласно настоящему изобретению анализ гликозильных связей и ЯМР анализ экзополисахарида из CY01 указывает на то, что экзополисахарид имеет повторяющуюся структуру, состоящую главным образом из 4-связанной глюкопиранозы и 6-связанной галактопиранозы, и данные компоненты могут представлять собой компоненты, образующие основную цепь.According to the present invention, the glycosyl linkage analysis and NMR analysis of the exopolysaccharide from CY01 indicates that the exopolysaccharide has a repeat structure consisting mainly of 4-linked glucopyranose and 6-linked galactopyranose, and these components may be components forming the backbone.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к экзополисахариду, имеющему молекулярную массу от 1,0×105 до 4,3×105 Да, который получают посредством гидролиза описанного выше экзополисахарида.According to another aspect, the present invention relates to an exopolysaccharide having a molecular weight of 1.0×10 5 to 4.3×10 5 Da, which is obtained by hydrolysis of the exopolysaccharide described above.
Согласно настоящему изобретению кислотное расщепление проводили для увеличения растворимости экзополисахарида и для уменьшения высокой вязкости экзополисахарида, которая вызывала сложность при обращении и промывке во время применения экзополисахарида в качестве криозащитного агента.According to the present invention, acid digestion was carried out to increase the solubility of the exopolysaccharide and to reduce the high viscosity of the exopolysaccharide, which caused difficulty in handling and washing during the use of the exopolysaccharide as a cryoprotective agent.
В примере настоящего изобретения экзополисахарид, происходящий из CY01 (р-CY01), нагревали вместе с 0,1 М ТФУ (трифторуксусная кислота) при 121°С в течение 1 часа с получением расщепленного под действием кислоты p-CY01 (p-CY01_LM). В результате средняя молекулярная масса р-CY01 составляла приблизительно 1,1×107 Да, тогда как молекулярная масса p-CY01_LM, частично расщепленного под действием кислоты, составляла от 1,0×105 до 4,3×105 Да. Подтверждали уменьшение вязкости и повышение растворимости экзополисахарида в зависимости от изменений в реологических свойствах раствора низкомолекулярного p-CY01_LM.In an example of the present invention, an exopolysaccharide derived from CY01 (p-CY01) was heated together with 0.1 M TFA (trifluoroacetic acid) at 121°C for 1 hour to obtain acid-cleaved p-CY01 (p-CY01_LM). As a result, the average molecular weight of p-CY01 was approximately 1.1×10 7 Da, while the molecular weight of p-CY01_LM, partially cleaved by acid, ranged from 1.0×10 5 to 4.3×10 5 Da. A decrease in viscosity and an increase in the solubility of the exopolysaccharide were confirmed depending on changes in the rheological properties of the low molecular weight p-CY01_LM solution.
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к композиции для криозащиты клеток, которая содержит экзополисахарид.According to another aspect, the present invention relates to a composition for cryoprotecting cells, which contains an exopolysaccharide.
В примере настоящего изобретения образец эритроцитов, содержащий p-CY01_LM и криозащитный агент, замораживали без контролирования скорости охлаждения (охлаждали сразу до -80°С) и консервировали при -80°С. Образец эритроцитов подвергали быстрому оттаиванию на водяной бане при 40°С. После оттаивания анализировали функцию p-CY01_LM в качестве криозащитного агента посредством анализа гемолиза эритроцитов и анализа на основе оптической микроскопии. Гемолиз (%) уменьшался при возрастании концентрации p-CY01_LM. При концентрации p-CY01_LM 2,5% - 4,0% наблюдался выраженный в процентах гемолиз от 9,08±0,37% до 5,64±0,96%, и применение 3,5% p-CY01_LM демонстрировало самый низкий уровень гемолиза (5,40%). Иными словами, было показано, что при концентрации p-CY01_LM 2,5% - 4,0% 90% ККТ после оттаивания обладали целостностью (Фиг. 7А).In the example of the present invention, a erythrocyte sample containing p-CY01_LM and a cryoprotectant was frozen without controlling the cooling rate (cooled immediately to -80°C) and preserved at -80°C. The erythrocyte sample was subjected to rapid thawing in a water bath at 40°C. After thawing, the function of p-CY01_LM as a cryoprotective agent was analyzed by erythrocyte hemolysis analysis and optical microscopy-based analysis. Hemolysis (%) decreased with increasing concentration of p-CY01_LM. At a p-CY01_LM concentration of 2.5% - 4.0%, percentage hemolysis was observed from 9.08±0.37% to 5.64±0.96%, and the use of 3.5% p-CY01_LM showed the lowest the level of hemolysis (5.40%). In other words, it was shown that at a concentration of p-CY01_LM 2.5% - 4.0% 90% CCP after thawing had integrity (Fig. 7A).
Согласно примеру настоящего изобретения материалы, подлежащие криоконсервации, могут представлять собой бактерии, грибы, клетки животных, клетки растений, эритроциты, тромбоциты, сперматоциты, ооциты, ткани, органы или тому подобное.According to an example of the present invention, the materials to be cryopreserved may be bacteria, fungi, animal cells, plant cells, erythrocytes, platelets, spermatocytes, oocytes, tissues, organs, or the like.
Композиция согласно настоящему изобретению может защищать клетки, образующие ткани и органы, от замораживания.The composition according to the present invention can protect cells forming tissues and organs from freezing.
Композиция для криозащиты клеток согласно настоящему изобретению может содержать глицерин и/или ДМСО.The composition for cryoprotecting cells according to the present invention may contain glycerol and/or DMSO.
Согласно другому примеру настоящего изобретения исследовали, заменит ли р-CY01_LM глицерин в качестве криозащитного агента при длительной криоконсервации, и выраженный в процентах гемолиз эритроцитов, которые быстро охлаждали до -80°С и консервировали в течение 1 часа в ADSOL, содержащем 2,5% (масс./об.) p-CY01_LM, 1% (об./об.) глицерин и 1% (об./об.) ДМСО (далее в настоящей заявке, называемый раствором p-CY01_LM), составлял 6,09±0,64%, и выраженный в процентах гемолиз после 5 месяцев консервации составлял 7,24±2,15%, указывая на то, что в течение 5 месяцев консервации происходило небольшое изменение или не происходило изменения в выраженном в процентах гемолизе (Фиг. 7D).According to another example of the present invention, whether p-CY01_LM would replace glycerol as a cryoprotectant in long-term cryopreservation and percent hemolysis of erythrocytes that were rapidly cooled to -80°C and preserved for 1 hour in ADSOL containing 2.5% (w/v) p-CY01_LM, 1% (v/v) glycerol and 1% (v/v) DMSO (hereinafter referred to as p-CY01_LM solution) was 6.09± 0.64%, and the percentage hemolysis after 5 months of preservation was 7.24±2.15%, indicating that there was little or no change in percentage hemolysis during 5 months of preservation (Fig. 7D ).
Согласно еще одному аспекту настоящее изобретение относится к способу получения экзополисахарида, который продуцируется штаммом Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867ВР) и который состоит из глюкозы и галактозы, причем способ включает следующие стадии: (а) культивирование штамма Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867ВР) с продуцированием экзополисахарида; и (b) выделение полученного экзополисахарида.According to another aspect, the present invention relates to a method for obtaining exopolysaccharide, which is produced by a strain of Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867BP) and which consists of glucose and galactose, the method comprising the following steps: (a) cultivating a strain of Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867BP) with exopolysaccharide production; and (b) isolating the resulting exopolysaccharide.
Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к способу получения экзополисахарида, имеющего молекулярную массу от 1,0×105 до 4,3×105 Да, причем способ включает стадию гидролиза экзополисахарида, который продуцируется штаммом Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867ВР) и который состоит из глюкозы и галактозы.According to another aspect, the present invention relates to a method for producing an exopolysaccharide having a molecular weight of 1.0×10 5 to 4.3×10 5 Da, the method comprising the step of hydrolyzing the exopolysaccharide which is produced by a strain of Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867BP) and which consists of glucose and galactose.
Согласно настоящему изобретению гидролиз может представлять собой расщепление под действием слабой кислоты.According to the present invention, the hydrolysis may be a weak acid cleavage.
Согласно настоящему изобретению стадия гидролиза может дополнительно включать проведение тепловой обработки.According to the present invention, the hydrolysis step may further include heat treatment.
Согласно еще одному другому аспекту настоящее изобретение также относится к способу криоконсервации клеток с применением описанного выше экзополисахарида.According to yet another aspect, the present invention also relates to a method for cryopreserving cells using the exopolysaccharide described above.
Согласно настоящему изобретению замораживание может представлять собой быстрое замораживание, которое имеет скорость замораживания, находящуюся в диапазоне от 10°С/мин до 196°С/мин.According to the present invention, the freezing may be quick freezing which has a freezing speed ranging from 10°C/min to 196°C/min.
Согласно еще одному другому аспекту настоящее изобретение также относится к штамму Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867ВР), который обладает способностью продуцировать экзополисахарид слизи. Штамм Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867ВР) может обитать в Антарктике.According to yet another aspect, the present invention also relates to a strain of Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867BP), which has the ability to produce mucus exopolysaccharide. The strain Pseudoalteromonas sp. CY01 (KCTC 12867BP) may be found in Antarctica.
В результате филогенетического анализа с применением последовательности 16S рРНК штамма CY01 штамм CY01 согласно настоящему изобретению относили к штамму Pseudoalteromonas sp., который распространен в Антарктике (Фиг. 2). Штамм CY01 демонстрировал высокую гомологию с Pseudoalteromonas paragorgicola KMM 3548Т (99,52%), P. nigrifaciens NCIIMB 8614Т (99,51%) и P. agarivorans KMM 255Т (99,38%).As a result of phylogenetic analysis using the 16S rRNA sequence of the CY01 strain, the CY01 strain according to the present invention was assigned to the strain of Pseudoalteromonas sp., which is distributed in Antarctica (Fig. 2). The CY01 strain showed high homology with
ПримерыExamples
Далее в настоящей заявке настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на примеры. Обычному специалисту в данной области техники будет понятно, что данные примеры служат только в иллюстративных целях и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.Hereinafter in the present application, the present invention will be described in more detail with reference to examples. One of ordinary skill in the art will appreciate that these examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the present invention.
Пример 1: Скрининг и идентификация штамма, продуцирующего экзополисахарид, обладающий криозащитной способностьюExample 1 Screening and Identification of a Strain Producing an Exopolysaccharide Having Cryoprotective Ability
2980 штаммов, выделенных из образцов антарктических морских вод, культивировали с применением чашек с агаризованной средой S-ZoBell (рН 7,0) (изготавливаемых авторами настоящего изобретения) при 15°С в течение 3 суток, и выделяли 73 штамма, продуцирующих экзополисахариды слизи. Для измерения количеств экзополисахаридов, продуцированных выделенными штаммами, штаммы культивировали с применением жидких сред S-ZoBell (рН 7,0) при 15°С в течение 3 суток, и экзополисахариды выделяли и лиофилизировали, и затем измеряли их сухие массы. Криозащитную способность измеряли путем подвергания клеток Е. coli действию циклов замораживания и оттаивания в 0,2% (масс./масс.) растворе неочищенного экзополисахарида, полученном из каждого штамма, и затем измерения доли выживших клеток Е. coli.2980 strains isolated from Antarctic seawater samples were cultured using S-ZoBell (pH 7.0) agar plates (manufactured by the present inventors) at 15°C for 3 days, and 73 strains producing mucus exopolysaccharides were isolated. To measure the amounts of exopolysaccharides produced by the isolated strains, the strains were cultured using S-ZoBell liquid media (pH 7.0) at 15° C. for 3 days, and the exopolysaccharides were isolated and lyophilized, and then their dry weights were measured. Cryoprotective capacity was measured by subjecting E. coli cells to freeze and thaw cycles in a 0.2% (w/w) solution of crude exopolysaccharide prepared from each strain and then measuring the percentage of surviving E. coli cells.
Среди выделенных штаммов 10 штаммов продуцировали 1 г/л или больше неочищенных экзополисахаридов (ЭПС), и количества неочищенных экзополисахаридов, продуцированных данными штаммами, находились в диапазоне от 1,04±0,18 г/л до 2,04±0,13 г/л. Среди данных 10 штаммов штамм RosPo13 демонстрировал наивысшую продукцию экзополисахарида (2,04 г/л), и неочищенный экзополисахарид, продуцируемый штаммом CY01, демонстрировал наивысшую криозащитную способность (Фиг. 1).Among the isolated strains, 10 strains produced 1 g/L or more of crude exopolysaccharides (EPS), and the amounts of crude exopolysaccharides produced by these strains ranged from 1.04±0.18 g/L to 2.04±0.13 g / l. Among these 10 strains, the RosPo13 strain showed the highest exopolysaccharide production (2.04 g/L), and the crude exopolysaccharide produced by the CY01 strain showed the highest cryoprotective capacity (FIG. 1).
Доля выживших клеток Е. coli в растворе, содержащем 0,2% неочищенного экзополисахарида, происходящего из штамма CY01, составляла 88,16±2,92%, и доли выживших клеток Е. coli в растворах, содержащих 0,2% неочищенного экзополисахарида, происходящего из других штаммов, составляли от 42,01±1,93% до 67,28±4,32%.The proportion of surviving E. coli cells in a solution containing 0.2% crude exopolysaccharide derived from strain CY01 was 88.16±2.92%, and the proportion of surviving E. coli cells in solutions containing 0.2% crude exopolysaccharide, originating from other strains ranged from 42.01±1.93% to 67.28±4.32%.
В результате филогенетического анализа с применением последовательности 16S рРНК штамма CY01, штамм CY01 относили к штамму Pseudoalteromonas sp., который в большом количестве присутствует в Антарктике (Фиг. 2). Штамм CY01 демонстрировал высокую гомологию с Pseudoalteromonas paragorgicola KMM 3548Т (99,52%), Р. nigrifaciens NCIIMB 8614Т (99,51%) и Р. agarivorans KMM 255Т (99,38%).As a result of phylogenetic analysis using the 16S rRNA sequence of strain CY01, strain CY01 was assigned to a strain of Pseudoalteromonas sp., which is abundant in Antarctica (Fig. 2). The CY01 strain showed high homology with
Пример 2: Очистка экзополисахарида, происходящего из штамма CY01, и характеристика очищенного экзополисахаридаExample 2 Purification of Exopolysaccharide Derived from Strain CY01 and Characterization of the Purified Exopolysaccharide
Экзополисахарид отделяли от культуры штамма CY01 посредством осаждения этанолом и обрабатывали протеазой для удаления белка. Полученный неочищенный экзополисахарид подвергали анионной хроматографии с применением колонки DEAE-Sepharose, получая, таким образом, фракции, содержащие экзополисахарид (Фиг. ЗА). Полученные фракции, содержащие экзополисахарид, очищали посредством колонки для гель-фильтрационной хроматографии Sepharose 4В (Фиг. 3В) с получением единственной фракции. Концентрацию экзополисахарида в данной фракции измеряли при OD630 (оптическая плотность) с помощью анализа с антроном и серной кислотой.The exopolysaccharide was separated from the culture of strain CY01 by ethanol precipitation and treated with a protease to remove the protein. The resulting crude exopolysaccharide was subjected to anion chromatography using a DEAE-Sepharose column, thus obtaining fractions containing exopolysaccharide (FIG. 3A). The resulting exopolysaccharide-containing fractions were purified by a Sepharose 4B size exclusion chromatography column (FIG. 3B) to obtain a single fraction. The concentration of exopolysaccharide in this fraction was measured at OD 630 (optical density) using analysis with anthrone and sulfuric acid.
Полученную фракцию подвергали ВЭЖХ (Agilent, США). ВЭЖХ проводили с применением 5 мкл раствора фракции экзополисахарида в дистиллированной воде (0,1% масс./масс.) при скорости потока 0,4 мл/мин, и выявление проводили с применением RI детектора (рефрактометрический детектор) (Индекс рефракции, Agilent, США).The resulting fraction was subjected to HPLC (Agilent, USA). HPLC was performed using 5 μl of a solution of the exopolysaccharide fraction in distilled water (0.1% w/w) at a flow rate of 0.4 ml/min, and detection was performed using an RI detector (refractive detector) (Refractive Index, Agilent, USA).
В результате, как показано на Фиг. 4, выявляли единственный пик. Молекулярную массу экзополисахарида, очищенного посредством эксклюзионной хроматографии, измеряли, применяя RI, и в результате было показано, что экзополисахарид имел среднюю молекулярную массу приблизительно 1,1×107 Да. Очищенный ЭПС из штамма CY01 называли «p-CY01».As a result, as shown in FIG. 4 revealed a single peak. The molecular weight of the exopolysaccharide purified by size exclusion chromatography was measured using RI, and as a result, the exopolysaccharide was shown to have an average molecular weight of approximately 1.1×10 7 Da. Purified EPS from strain CY01 was called "p-CY01".
Применяя ГХ/МС, анализировали сахара-составные части экзополисахарида. Анализ проводили в режиме ионизации электронным ударом с применением Claras 500 (Perkin-Elmer, США) и масс-селективного детектора.Using GC/MS, the sugar constituents of the exopolysaccharide were analyzed. The analysis was performed in the electron impact ionization mode using Claras 500 (Perkin-Elmer, USA) and a mass selective detector.
В результате, как показано на Фиг. 5А, р-CY01 состоял из глюкозы и галактозы, и глюкоза представляла собой преобладающий сахар в составе р-CY01. Кроме того, молярное соотношение глюкоза : галактоза в р-CY01 составляло приблизительно 3,4:1.As a result, as shown in FIG. 5A, p-CY01 consisted of glucose and galactose, and glucose was the predominant sugar in p-CY01. In addition, the molar ratio of glucose:galactose in p-CY01 was approximately 3.4:1.
Как показано на Фиг. 5В и ниже в Таблице 1, результаты анализа гликозильных связей р-CY01 указывали на то, что р-CY01 главным образом состоял из 4-связанной глюкопиранозы и 6-связанной галактопиранозы. В виде минорных пиков выявляли соединенную через концевые группы галактопиранозу, соединенную через концевые группы глюкопиранозу, 3,4-связанную глюкопиранозу и 4,6-связанную галактопиранозу.As shown in FIG. 5B and below in Table 1, the results of the analysis of p-CY01 glycosyl linkages indicated that p-CY01 mainly consisted of 4-linked glucopyranose and 6-linked galactopyranose. As minor peaks, end-capped galactopyranose, end-capped glucopyranose, 3,4-linked glucopyranose, and 4,6-linked galactopyranose were detected.
Для р-CY01, ID и 2D ЯМР эксперименты для определения структур проводили, применяя спектрометр Bruker AVANCE (600 МГц). Образцы измеряли при 25°С, 1Н ЯМР измеряли при 600 МГц, и 13С ЯМР измеряли при 150 МГц.For p-CY01, ID and 2D NMR, structure determination experiments were performed using a Bruker AVANCE spectrometer (600 MHz). Samples were measured at 25° C., 1 H NMR was measured at 600 MHz, and 13 C NMR was measured at 150 MHz.
В результате ЯМР анализа типичные картины пиков полиглюкопиранозы и полигалактопиранозы можно было наблюдать из 1Н и 13С ЯМР спектров р-CY01 (Фиг. 6А и 6В). В частности, наблюдали, что р-CY01 главным образом состоял из повторяющихся звеньев →4)-β-D-Glcp-(1→ и →6)-α-D-Galp-(1→, и пики других боковых цепей были относительно небольшими и перекрывались с пиками главных повторяющихся звеньев. Кроме того, из спектров 2D-HSQC (Фиг. 7А и В) наблюдали корреляцию углеродов с протонами, а из 2D-TOCSY, 2D-COSY, 2D-HMBC и 2D-ЯМР (600 МГц) едва могли наблюдать необычную информацию, отличную от корреляции глюкопиранозы и галактопиранозы, которые являются главными компонентами (Фиг. 7С-7F). По совокупности результатов анализа гликозильных связей и результатов анализа ЯМР-спектра определяли главные структуры р-CY01 (Фиг. 8). Как видно из результатов анализа, р-CY01 имеет повторяющуюся структуру, состоящую главным образом из 4-связанной глюкопиранозы и 6-связанной галактопиранозы, и связывающая структура [→4)-β-D-Glcp-(1→4)-β-D-Glcp-(1→]n III и связывающая структура [→6)-α-D-Galp-(1→6)-α-D-Galp-(1→]n II повторно соединены друг с другом с образованием основной цепи. Кроме того, было показано, что р-CY01 имеет небольшое количество связывающей структуры T-α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1,4→ I в виде структуры боковой цепи основной цепи.As a result of NMR analysis, typical patterns of polyglucopyranose and polygalactopyranose peaks could be observed from 1 H and 13 C NMR spectra of p-CY01 (FIGS. 6A and 6B). In particular, it was observed that p-CY01 mainly consisted of →4)-β-D-Glcp-(1→ and →6)-α-D-Galp-(1→) repeating units, and the peaks of other side chains were relatively small and overlapped with the peaks of the main repeat units.In addition, from the spectra of 2D-HSQC (Fig. 7A and B) observed the correlation of carbons with protons, and from 2D-TOCSY, 2D-COSY, 2D-HMBC and 2D-NMR (600 MHz ) could hardly observe unusual information other than the correlation of glucopyranose and galactopyranose, which are the main components (Fig. 7C-7F).The main structures of p-CY01 were determined from the combined results of the analysis of glycosyl bonds and the results of the NMR spectrum analysis (Fig. 8). As can be seen from the analysis results, p-CY01 has a repetitive structure consisting mainly of 4-linked glucopyranose and 6-linked galactopyranose, and the linking structure [→4)-β-D-Glcp-(1→4)-β-D -Glcp-(1→]n III and the linking structure [→6)-α-D-Galp-(1→6)-α-D-Galp-(1→]n II are reconnected to each other to form a base oh chain. In addition, p-CY01 has been shown to have a small amount of the T-α-D-Glcp-(1→6)-α-D-Glcp-(1,4→I) linking structure as a backbone side chain structure.
Пример 3: Анализ изменений в молекулярной массе и реологических свойствах экзополисахарида после гидролизаExample 3 Analysis of Changes in Molecular Weight and Rheological Properties of Exopolysaccharide After Hydrolysis
Поскольку высокая вязкость и низкая растворимость экзополисахарида могут мешать применению экзополисахарида в биологической промышленности, уменьшение средней молекулярной массы полимера в результате расщепления может понижать вязкость и повышать растворимость. В недавних экспериментах, когда ооциты и эритроциты криоконсервировали с применением высокой концентрации ПВС (поливиниловый спирт), недостатки заключались в том, что осуществление методики не является простым вследствие высокой вязкости раствора, и необходимо осуществлять промывку (Deller, RC et al., Nat. Commun., 5:3244, doi: 10.1038/ncomms4244, 2014).Since the high viscosity and low solubility of the exopolysaccharide can interfere with the use of the exopolysaccharide in the biological industry, the decrease in the average molecular weight of the polymer as a result of cleavage can lower the viscosity and increase the solubility. In recent experiments where oocytes and erythrocytes were cryopreserved using a high concentration of PVA (polyvinyl alcohol), the disadvantages were that the procedure was not easy to carry out due to the high viscosity of the solution, and washing was necessary (Deller, RC et al., Nat. Commun ., 5:3244, doi: 10.1038/ncomms4244, 2014).
В данном примере для преодоления таких недостатков полимера молекулярную массу р-CY01 согласно настоящему изобретению регулировали посредством кислотного расщепления. р-CY01 нагревали с 0,1 М ТФУ (трифторуксусная кислота) при 121°С в течение 1 часа с получением расщепленного под действие кислоты р-CY01, и осуществляли гель-проникающую хроматографию (ГПХ). В результате р-CY01, не обработанный ТФУ, элюировали ТФУ из колонки для ГПХ между 19 мин и 25 мин, и в случае р-CY01, подверженного тепловой обработке с ТФУ, главный пик элюировали на 33 мин и 37 мин и также элюировали на 51 мин (Фиг. 9А). Высокомолекулярные пики на 33 мин и 37 мин представляли собой фракции, полученные в результате частичного расщепления р-CY01, и пик, появляющийся на 51 мин, представлял собой моносахарид, полученный в результате расщепления р-CY01. Средняя молекулярная масса p-CY01 составляла приблизительно 1,1×107 Да, тогда как молекулярная масса p-CY01_LM, частично расщепленного под действием кислоты, составляла от 1,0×105 до 4,3×105 Да.In this example, to overcome such shortcomings of the polymer, the molecular weight of p-CY01 according to the present invention was controlled by acid cleavage. p-CY01 was heated with 0.1 M TFA (trifluoroacetic acid) at 121° C. for 1 hour to obtain acid-cleaved p-CY01, and gel permeation chromatography (GPC) was performed. As a result, p-CY01 not treated with TFA eluted TFA from the GPC column between 19 min and 25 min, and in the case of p-CY01 heat treated with TFA, the main peak was eluted at 33 min and 37 min and also eluted at 51 min (Fig. 9A). The high molecular weight peaks at 33 min and 37 min were fractions resulting from partial cleavage of p-CY01 and the peak appearing at 51 min was the monosaccharide resulting from cleavage of p-CY01. The average molecular weight of p-CY01 was approximately 1.1×10 7 Da, while the molecular weight of p-CY01_LM partially cleaved by acid ranged from 1.0×10 5 to 4.3×10 5 Da.
Измеряли изменения в реологических свойствах раствора низкомолекулярного р-CY01 (p-CY01_LM).The changes in the rheological properties of the solution of low molecular weight p-CY01 (p-CY01_LM) were measured.
Реологические свойства измеряли посредством вискозиметра Брукфильда с применением оси S18, и измеряли напряжения сдвига растворов р-CY01, ФБР и р-CY01_LM (0,2%, 2,5% и 5,0%, масс./об.) при разных скоростях сдвига.The rheological properties were measured with a Brookfield viscometer using the S18 axis, and the shear stresses of p-CY01, PBS and p-CY01_LM solutions (0.2%, 2.5% and 5.0%, w/v) were measured at different speeds shift.
В результате, как показано на Фиг. 9В, в случае 0,2% раствора р-CY01, скорость сдвига повышалась при повышении скорости сдвига, а в случае раствора p-CY01_LM напряжение сдвига не повышалось при высокой скорости сдвига. Это указывает на то, что вязкость p-CY01_LM значимо уменьшалась. Данное уменьшение вязкости объясняется изменением молекулярной массы р-CY01. Когда экзополисахарид разлагается и деполимеризуется, вязкость уменьшается и растворимость повышается.As a result, as shown in FIG. 9B, in the case of the 0.2% p-CY01 solution, the shear rate increased with increasing shear rate, while in the case of the p-CY01_LM solution, the shear stress did not increase with high shear rate. This indicates that the viscosity of p-CY01_LM decreased significantly. This decrease in viscosity is explained by the change in the molecular weight of p-CY01. As the exopolysaccharide degrades and depolymerizes, the viscosity decreases and the solubility increases.
Пример 4: Криоконсервация человеческих эритроцитов (ККТ) в p-CY01_LMExample 4: Cryopreservation of human erythrocytes (HRCs) in p-CY01_LM
Эритроциты можно консервировать в ADSOL при 4°С в течение 32 суток. Когда эритроциты подвергают деглицеролизации в Haemonetics АСР215 и консервируют в ADSOL, данные клетки можно консервировать при 4°С в течение 3 суток, при этом имея степень гемолиза меньше чем 1%. Глицерин представляет собой внутриклеточный криозащитный агент, и для предотвращения гемолиза эритроцитов конечная концентрация глицерина должна быть уменьшена до 1% посредством промывки после оттаивания.Erythrocytes can be preserved in ADSOL at 4°C for 32 days. When erythrocytes are deglycerolized in Haemonetics ACP215 and preserved in ADSOL, these cells can be preserved at 4° C. for 3 days while still having a hemolysis rate of less than 1%. Glycerol is an intracellular cryoprotective agent, and to prevent hemolysis of erythrocytes, the final concentration of glycerol should be reduced to 1% by washing after thawing.
ДМСО был одобрен FDA (Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов) для применения в качестве криозащитного агента в отношении тромбоцитов и эритроцитов человека. Таким образом, в следующем эксперименте по криоконсервации с применением p-CY01_LM, глицерин и ДМСО применяли вместе, и ADSOL применяли в качестве криоконсервирующего буфера вместо ФБР.DMSO has been approved by the FDA (Food and Drug Administration) for use as a cryoprotective agent for human platelets and erythrocytes. Thus, in the following cryopreservation experiment using p-CY01_LM, glycerol and DMSO were used together and ADSOL was used as a cryopreservation buffer instead of PBS.
В клинической практике при охлаждении эритроцитов с высокой концентрацией (40%) глицерина с низкой скоростью охлаждения (1°С/мин) и консервации при -80°С или в жидком азоте, может быть достигнут высокий уровень восстановления эритроцитов. Кроме того, криозащитные агенты - экзополисахариды (ПВП (поливинилпирролидон), ГЭК) требуют физического замораживания и консервации в жидком азоте.In clinical practice, by cooling erythrocytes with a high concentration (40%) of glycerol at a low cooling rate (1°C/min) and preservation at -80°C or in liquid nitrogen, a high level of erythrocyte recovery can be achieved. In addition, cryoprotective agents - exopolysaccharides (PVP (polyvinylpyrrolidone), HES) require physical freezing and preservation in liquid nitrogen.
В данном Примере образец эритроцитов замораживали без контроля скорости охлаждения (охлаждали сразу же до -80°С) и консервировали при -80°С. Образец эритроцитов подвергали быстрому оттаиванию на водяной бане при 40°С. После оттаивания гемолиз образца количественно оценивали посредством анализа Драбкина.In this Example, the erythrocyte sample was frozen without cooling rate control (cooled immediately to -80°C) and preserved at -80°C. The erythrocyte sample was subjected to rapid thawing in a water bath at 40°C. After thawing, hemolysis of the sample was quantified by Drabkin analysis.
Функцию p-CY01_LM в качестве криозащитного агента анализировали посредством анализа гемолиза эритроцитов и анализа на основе оптической микроскопии.The function of p-CY01_LM as a cryoprotective agent was analyzed by erythrocyte hemolysis assay and optical microscopy-based analysis.
Как можно видеть на Фиг. 10А, гемолиз (%) уменьшался при возрастании концентрации p-CY01_LM. При концентрации p-CY01_LM от 2,5% до 4,0% наблюдали выраженный в процентах гемолиз от 9,08±0,37% до 5,64±0,96%, и применение 3,5% р-CY01_LM демонстрировало самый низкий уровень гемолиза (5,40%). Иными словами, было показано, что при концентрации p-CY01_LM от 2,5% до 4,0% 90% ККТ после оттаивания демонстрировали целостность. Согласно стандартам Американской ассоциации банков крови требуется непосредственный показатель выживаемости 80% (гемолиз меньше чем 20%) и требуется, чтобы 70% клеток крови оставались живыми в течение 24 часов.As can be seen in FIG. 10A, hemolysis (%) decreased with increasing concentration of p-CY01_LM. At a p-CY01_LM concentration of 2.5% to 4.0%, a percentage hemolysis of 9.08±0.37% to 5.64±0.96% was observed, and the use of 3.5% p-CY01_LM showed the most low level of hemolysis (5.40%). In other words, it was shown that at a concentration of p-CY01_LM from 2.5% to 4.0%, 90% CCP after thawing showed integrity. The American Blood Bank Association standards require an immediate survival rate of 80% (less than 20% hemolysis) and require 70% of blood cells to remain alive for 24 hours.
Раствор ADSOL, содержащий 2,5% (масс./об.) p-CY01_LM, 1% (об./об.) глицерин и 1% (об./об.) ДМСО, демонстрировал выраженный в процентах гемолиз 9,08±0,37% (целостность эритроцитов после оттаивания 90,92%) (Фиг. 10А и 10В), и ФБР демонстрировал выраженный в процентах гемолиз 92,48±6,49% (целостность эритроцитов после оттаивания 7,52%) (Фиг. 10А и 10С).ADSOL solution containing 2.5% (w/v) p-CY01_LM, 1% (v/v) glycerol, and 1% (v/v) DMSO exhibited percent hemolysis 9.08± 0.37% (erythrocyte integrity after thawing 90.92%) (Fig. 10A and 10B), and PBS showed a percentage hemolysis of 92.48±6.49% (erythrocyte integrity after thawing 7.52%) (Fig. 10A and 10C).
Таким образом, 2,5% p-CY01_LM отбирали в качестве оптимальной концентрации для криоконсервации эритроцитов.Thus, 2.5% p-CY01_LM was selected as the optimal concentration for erythrocyte cryopreservation.
Исследовали, заменит ли p-CY01_LM глицерин в качестве криозащитного агента для длительной криоконсервации. Как показано на Фиг. 10D, выраженный в процентах гемолиз эритроцитов, которых быстро охлаждали до -80°С и консервировали в течение 1 часа в ADSOL, содержащем 2,5% (масс./об.) p-CY01_LM, 1% (об./об.) глицерин и 1% (об./об.) ДМСО (далее в настоящей заявке называемый раствором p-CY01_LM), составлял 6,09±0,64%, и выраженный в процентах гемолиз после 5 месяцев консервации составлял 7,24±2,15%, указывая на то, что имелось небольшое изменение или отсутствовало изменение в выраженном в процентах гемолизе за 5 месяцев консервации.Whether p-CY01_LM would replace glycerol as a cryoprotectant for long-term cryopreservation was investigated. As shown in FIG. 10D, percentage hemolysis of erythrocytes that were rapidly cooled to -80°C and preserved for 1 hour in ADSOL containing 2.5% (w/v) p-CY01_LM, 1% (v/v) glycerol and 1% (v/v) DMSO (hereinafter referred to as p-CY01_LM solution) was 6.09±0.64%, and the percentage hemolysis after 5 months of preservation was 7.24±2, 15%, indicating that there was little or no change in percent hemolysis over 5 months of conservation.
Кроме того, выраженный в процентах гемолиз эритроцитов, консервируемых в растворе p-CY01_LM при комнатной температуре в течение 1 часа, сохранялся на уровне меньше чем 2% (целостность эритроцитов больше чем 98%), указывая на то, что во время криоконсервации не имела место цитотоксичность или гемолиз.In addition, the percentage hemolysis of erythrocytes preserved in p-CY01_LM solution at room temperature for 1 hour was maintained at less than 2% (erythrocyte integrity greater than 98%), indicating that there was no cytotoxicity or hemolysis.
Пример 5: Измерение биохимических свойств эритроцитов, замороженных с р-CY01_LMExample 5 Measurement of Biochemical Properties of RBCs Frozen with p-CY01_LM
Уровень АТФ в эритроцитах позволяет определять, будет ли сохраняться вогнутая форма мембраны эритроцитов и будет ли возрастать динамика мембраны эритроцитов. Измеряли уровень АТФ и 2,3-ДФГ (2,3-дифосфоглицерат), который контролирует аффинность гемоглобина к кислороду, для определения клеточной функции и терапевтической применимости эритроцитов.The level of ATP in erythrocytes allows you to determine whether the concave shape of the erythrocyte membrane will be maintained and whether the dynamics of the erythrocyte membrane will increase. The level of ATP and 2,3-DPG (2,3-diphosphoglycerate), which controls the affinity of hemoglobin for oxygen, was measured to determine the cellular function and therapeutic applicability of red blood cells.
В качестве группы положительного контроля измеряли активности АТФ и 2,3-ДФГ гемолизата свежих эритроцитов, и в качестве опытной группы измеряли активности АТР и 2,3-ДФГ гемолизата эритроцитов, криоконсервированных в растворе p-CY01_LM при -80°С в течение 1 часа.As a positive control group, the activities of ATP and 2,3-DPG hemolysate of fresh erythrocytes were measured, and as an experimental group, the activities of ATP and 2,3-DPG of erythrocyte hemolysate cryopreserved in p-CY01_LM solution at -80°C for 1 hour were measured .
В результате, как показано на Фиг. 11, эритроциты, криоконсервированные в растворе p-CY01_LM, демонстрировали небольшое различие или не демонстрировали различия в активности АТФ по сравнению с группой положительного контроля. Активность АТФ эритроцитов, криоконсервированных в растворе p-CY01_LM, составляла от 2,50±0,06 мкмоль/г Hb (гемоглобин) до 2,26±0,19 мкмоль/г Hb, и активность АТФ эритроцитов, криоконсервированных в ФБР в качестве группы отрицательного контроля, значительно уменьшалась до 0,18±0,02 мкмоль/г Hb. Концентрация 2,3-ДФГ составляла 4,26±0,24 мкмоль/г Hb в свежих эритроцитах, 3,98±0,47 мкмоль/г Hb в эритроцитах, криоконсервированных в растворе p-CY01_LM, и 0,78±0,92 мкмоль/г Hb в эритроцитах, криоконсервированных в ФБР.As a result, as shown in FIG. 11, erythrocytes cryopreserved in p-CY01_LM solution showed little or no difference in ATP activity compared to the positive control group. The ATP activity of erythrocytes cryopreserved in p-CY01_LM solution ranged from 2.50±0.06 µmol/g Hb (hemoglobin) to 2.26±0.19 µmol/g Hb, and the ATP activity of erythrocytes cryopreserved in PBS as negative control group, significantly decreased to 0.18±0.02 µmol/g Hb. The concentration of 2,3-DPG was 4.26±0.24 µmol/g Hb in fresh erythrocytes, 3.98±0.47 µmol/g Hb in erythrocytes cryopreserved in p-CY01_LM solution, and 0.78±0. 92 µmol/g Hb in erythrocytes cryopreserved in PBS.
Отсутствовало значимое различие в активности АТФ и концентрации 2,3-ДФГ у свежих эритроцитов и эритроцитов, криоконсервированных в растворе p-CY01_LM.There was no significant difference in ATP activity and 2,3-DPG concentration between fresh erythrocytes and erythrocytes cryopreserved in p-CY01_LM solution.
Пример 6: Исследование основных криозащитных добавок и анализ главных эффектов, оказываемых на криоконсервацию эритроцитовExample 6: Study of the main cryoprotective additives and analysis of the main effects on the cryopreservation of erythrocytes
Для анализа эффекта каждого криозащитного агента, оказываемого на криоконсервацию эритроцитов, способность к консервации эритроцитов каждого из следующих растворов: отдельно ADSOL, раствор, содержащий 1% (масс./об.) глицерин и 1% (масс./об.) ДМСО (G+D), 2,5% (масс./об.) раствор p-CY01_LM и раствор, содержащий 1% (масс./об.) глицерин, 1% (масс./об.) ДМСО и 2,5% (масс./об.) p-CY01_LM (G+D+p-CY01_LM), измеряли на основе выраженного в процентах гемолиза эритроцитов.To analyze the effect of each cryoprotectant agent on erythrocyte cryopreservation, the erythrocyte preservation ability of each of the following solutions: ADSOL alone, a solution containing 1% (w/v) glycerol and 1% (w/v) DMSO (G +D), a 2.5% (w/v) solution of p-CY01_LM and a solution containing 1% (w/v) glycerol, 1% (w/v) DMSO and 2.5% ( w/v) p-CY01_LM (G+D+p-CY01_LM) was measured on the basis of percent erythrocyte hemolysis.
В результате, как показано на Фиг. 12А, выраженный в процентах гемолиз эритроцитов в растворе, содержащем 1% (об./об.) глицерин и ДМСО, составлял 76,29±2,95%, который значительно не отличался от выраженного в процентах гемолиза в ФБР в качестве отрицательного контроля или ADSOL. Кроме того, раствор, содержащий только 2,5% (масс./об.) p-CY01_LM, демонстрировал значимо низкий уровень гемолиза эритроцитов 18,73±1,86%. Кроме того, раствор, содержащий 1% (масс./об.) глицерин, 1% (масс./об.) ДМСО и 2,5% (масс./об.) p-CY01_LM, демонстрировал выраженный в процентах гемолиз 9,43±2,16%, указывая на то, что данный раствор демонстрировал наилучший криозащитный эффект.As a result, as shown in FIG. 12A, the percentage hemolysis of erythrocytes in a solution containing 1% (v/v) glycerol and DMSO was 76.29±2.95%, which was not significantly different from the percentage hemolysis in PBS as a negative control or ADSOL. In addition, a solution containing only 2.5% (w/v) p-CY01_LM exhibited a significantly low erythrocyte hemolysis rate of 18.73±1.86%. In addition, a solution containing 1% (w/v) glycerol, 1% (w/v) DMSO, and 2.5% (w/v) p-CY01_LM showed
Применяя метод Плакетта-Бермана, рассчитывали значение главного эффекта каждого криозащитного компонента на криоконсервацию эритроцитов.Using the Plackett-Berman method, the value of the main effect of each cryoprotective component on the cryopreservation of erythrocytes was calculated.
Как показано на Фиг. 12В и ниже в Таблице 2, 1% глицерин, 1% ДМСО, ADSOL и 2,5% (масс./об.) p-CY01_LM демонстрировали положительные значения главного эффекта на криоконсервацию эритроцитов. Значения главного эффекта составляли 2,32 для глицерина, 2,62 для ДМСО, 5,82 для ADSOL и 51,69 для p-CY01_LM, указывая на то, что даже несмотря на то, что концентрация p-CY01_LM, применяемая для криоконсервации эритроцитов, была лишь в 2,5 раза больше концентрации глицерина или ДМСО, главный эффект p-CY01_LM на криоконсервацию эритроцитов был по меньшей мере в 19 раз больше главного эффекта глицерина или ДМСО. Р-значения ADSOL и p-CY01_LM составляли 0,05 или ниже, что было значимо по сравнению с р-значением глицерина или ДМСО.As shown in FIG. 12B and below in Table 2, 1% glycerol, 1% DMSO, ADSOL, and 2.5% (w/v) p-CY01_LM showed positive main effect values on erythrocyte cryopreservation. The main effect values were 2.32 for glycerol, 2.62 for DMSO, 5.82 for ADSOL, and 51.69 for p-CY01_LM, indicating that even though the concentration of p-CY01_LM used for RBC cryopreservation , was only 2.5 times the concentration of glycerol or DMSO, the main effect of p-CY01_LM on erythrocyte cryopreservation was at least 19 times the main effect of glycerol or DMSO. The p-values of ADSOL and p-CY01_LM were 0.05 or lower, which was significant compared to the p-value of glycerol or DMSO.
Пример 7: Анализ на основе дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) р-CY01_LMExample 7 Differential Scanning Calorimetry (DSC) Analysis of p-CY01_LM
Проводили ДСК анализ раствора p-CY01_LM при охлаждении и оттаивании (Фиг. 13). Каждый образец охлаждали от +5°С до -78°С со скоростью 40°С/мин и подвергали оттаиванию со скоростью 2°С/мин.A DSC analysis of the p-CY01_LM solution was performed on cooling and thawing (FIG. 13). Each sample was cooled from +5°C to -78°C at a rate of 40°C/min and thawed at a rate of 2°C/min.
ДСК анализ проводили для раствора, содержащего 1% глицерин и 1% ДМСО (Фиг. 13А), и растворов, содержащих 1% глицерин, 1% ДМСО и от 0,5 до 2,5% p-CY01_LM (Фиг. 13В и 13С). Когда применяли раствор, содержащий низкие концентрации (меньше чем 1%) глицерина и ДМСО, который представляет собой отрицательный контроль, изменение в энтальпии (ΔН(Дж/г)) составляло 212,0±3,8 (Дж/г), которое было значимо низким подобно криозащитному механизму, который наблюдался при применении высоких концентраций (от 10 до 40%) глицерина и ДМСО в предшествующем уровне техники, что указывало на то, что раствор не способствовал уменьшению количества льда, образованного во время замерзания (Таблица 3). Температура переохлаждения раствора, содержащего 1% глицерин и 1% ДМСО, составляла -14,2°С, и температура переохлаждения раствора, содержащего 1% глицерин, 1% ДМСО и 0,5% p-CY01_LM, составляла -13,9°С, и температура переохлаждения раствора, содержащего 1% глицерин, 1% ДМСО и 2,5% p-CY01_LM, составляла -32,1°С. Ниже в Таблице 3 показаны изменения в энтальпии каждой опытной группы в зависимости от температур замораживания и оттаивания. Температуры замораживания и оттаивания в случае раствора, содержащего 1% глицерин, 1% ДМСО и 2,5% p-CY01_LM, были значительно снижены, и изменение в энтальпии ΔН(Дж/г) значимо уменьшалось до 52,81±8,7 (Дж/г) (Таблица 3). Данное явление означает, что общее количество воды, которое может образовывать лед во время циклов замораживания и оттаивания, уменьшено. Кроме того, данное явление представляет собой механизм предотвращения замерзания, обеспечиваемый p-CY01_LM.DSC analysis was performed for a solution containing 1% glycerol and 1% DMSO (Fig. 13A) and solutions containing 1% glycerol, 1% DMSO and 0.5 to 2.5% p-CY01_LM (Fig. 13B and 13C ). When a solution containing low concentrations (less than 1%) of glycerol and DMSO, which is a negative control, was used, the change in enthalpy (ΔH(J/g)) was 212.0±3.8 (J/g), which was significantly low, similar to the cryoprotective mechanism that was observed with high concentrations (10 to 40%) of glycerol and DMSO in the prior art, indicating that the solution did not help reduce the amount of ice formed during freezing (Table 3). The subcooling temperature of the solution containing 1% glycerol and 1% DMSO was -14.2°C, and the subcooling temperature of the solution containing 1% glycerol, 1% DMSO and 0.5% p-CY01_LM was -13.9°C , and the supercooling temperature of the solution containing 1% glycerol, 1% DMSO and 2.5% p-CY01_LM was -32.1°C. Table 3 below shows the changes in the enthalpy of each experimental group depending on the freezing and thawing temperatures. The freezing and thawing temperatures in the case of a solution containing 1% glycerol, 1% DMSO and 2.5% p-CY01_LM were significantly reduced, and the change in enthalpy ΔH(J/g) was significantly reduced to 52.81±8.7 ( J/g) (Table 3). This phenomenon means that the total amount of water that ice can form during freeze and thaw cycles is reduced. In addition, this phenomenon is a freezing prevention mechanism provided by p-CY01_LM.
Пример 8: Ингибирование образования льда раствора p-CY01_LMExample 8 Inhibition of Ice Formation of p-CY01_LM Solution
Посредством анализа ингибирования роста кристаллов льда во время замораживания анализировали способность p-CY01_LM к предотвращению замерзания.By analyzing the inhibition of the growth of ice crystals during freezing, the ability of p-CY01_LM to prevent freezing was analyzed.
Как показано на Фиг. 14, рост зародышей кристаллов льда (Фиг. 14 В1) в растворе p-CY01_LM (ADSOL, содержащий 1% глицерин, ДМСО и 2,5% p-CY01_LM) ингибировался с уменьшением температур, и, таким образом, зародыши кристаллов льда росли в форме шестиконечных звезд (Фиг. 14 В2). Данное явление часто возникает в белках-антифризах (предотвращающих замерзание) и представляет собой механизм предотвращения замерзания, обеспечиваемый p-CY01_LM. Однако в контроле (ADSOL, содержащий 1% глицерин и ДМСО) и растворе ГЭК (ADSOL, содержащий 1% глицерин, ДМСО и 2,5% ГЭК) рост зародышей кристаллов льда не ингибировался, и, таким образом, зародыши кристаллов льда вырастали в округлые или плоские кристаллы льда (Фиг. 14 А1-А2 и С1-С2), указывая на то, что эффекта предотвращения замерзания за счет ингибирования роста кристаллов льда не наблюдали. Кроме того, температура переохлаждения воды в качестве отрицательного контроля составляет -15,9°С, тогда как температура переохлаждения раствора p-CY01_LM составляет -30,5°С, как показано выше в Таблице 3. Такие результаты указывают на то, что p-CY01_LM имеет эффект предотвращения замерзания.As shown in FIG. 14, the growth of ice crystal nuclei (FIG. 14B1) in p-CY01_LM solution (ADSOL containing 1% glycerol, DMSO and 2.5% p-CY01_LM) was inhibited with decreasing temperatures, and thus ice crystal nuclei grew in the shape of six-pointed stars (Fig. 14 B2). This phenomenon often occurs in antifreeze (antifreeze) proteins and is a freezing prevention mechanism provided by p-CY01_LM. However, in the control (ADSOL containing 1% glycerol and DMSO) and HES solution (ADSOL containing 1% glycerol, DMSO and 2.5% HES), the growth of ice crystal nuclei was not inhibited, and thus the ice crystal nuclei grew into rounded or flat ice crystals (FIGS. 14 A1-A2 and C1-C2), indicating that the effect of preventing freezing by inhibiting the growth of ice crystals was not observed. In addition, the subcooling temperature of water as a negative control is -15.9°C, while the subcooling temperature of the p-CY01_LM solution is -30.5°C, as shown above in Table 3. Such results indicate that p- CY01_LM has a frost prevention effect.
Пример 9: Криомикроскопическое наблюдение в режиме реального времени за эритроцитами во время замораживания и оттаиванияExample 9 Real Time Cryomicroscopic Observation of RBCs During Freeze and Thawing
Применяя анализ ингибирования перекристаллизации льда (ИПЛ), анализировали размер кристаллов льда во время оттаивания. В присутствии ингибитора перекристаллизации льда размер кристаллов льда, которые перекристаллизуются во время оттаивания, не будет значительно расти. Таким образом, в данном Примере, получали изображения эритроцитов и кристаллов льда, применяя криомикроскоп, во время замораживания и оттаивания эритроцитов. В частности, эритроциты охлаждали до -40°С со скоростью 25°С/мин в каждом из следующих растворов: раствор ADSOL, содержащий 2,5% p-CY01_LM, и раствор ADSOL, содержащий 2,5% (об./об.) ГЭК. Температуру образцов повышали до -6°С со скоростью 25°С/мин, и затем образцы фотографировали, пока им давали постоять в течение 5 минут.Using an Ice Recrystallization Inhibition (ICL) assay, the size of the ice crystals during thawing was analyzed. In the presence of an ice recrystallization inhibitor, the size of ice crystals that recrystallize during thawing will not increase significantly. Thus, in this Example, images of erythrocytes and ice crystals were obtained using a cryomicroscope during freezing and thawing of erythrocytes. In particular, erythrocytes were cooled to -40°C at a rate of 25°C/min in each of the following solutions: an ADSOL solution containing 2.5% p-CY01_LM and an ADSOL solution containing 2.5% (v/v ) HEC. The temperature of the samples was raised to -6°C at a rate of 25°C/min, and then the samples were photographed while they were allowed to stand for 5 minutes.
На Фиг. 15 показаны изображения эритроцитов и кристаллов льда после перекристаллизации в присутствии или в отсутствии 2,5% p-CY01_LM. Было показано, что в присутствии 2,5% p-CY01_LM (Фиг. 15В) размер перекристаллизованных кристаллов льда был значимо меньше, чем в ФБР (Фиг. 15А) или 2,5% ГЭК-содержащем растворе (Фиг. 15С). В частности, после полного оттаивания эритроцитов наблюдали, что форма эритроцитов сохранялась интактной (Фиг. 15 А4, В4 и С4).On FIG. 15 shows images of erythrocytes and ice crystals after recrystallization in the presence or absence of 2.5% p-CY01_LM. It was shown that in the presence of 2.5% p-CY01_LM (Fig. 15B) the size of recrystallized ice crystals was significantly smaller than in PBS (Fig. 15A) or 2.5% HES-containing solution (Fig. 15C). In particular, after complete thawing of the erythrocytes, it was observed that the shape of the erythrocytes remained intact (Fig. 15 A4, B4 and C4).
Такие результаты опять же подтверждали измерением активности ИПЛ р-CY01_LM. В частности, многоядерные пластины льда, имеющие диаметр меньше чем 10 мкм, вырастали при -6°С за 30 минут, и затем размер кристаллов льда сравнивали с размером кристаллов льда в контроле (ФБР).These results were again confirmed by measuring p-CY01_LM IPL activity. In particular, multi-core ice sheets having a diameter of less than 10 μm grew at -6° C. in 30 minutes, and then the ice crystal size was compared with the control ice crystal size (FBI).
Как показано на Фиг. 16, результаты измерения для ФБР (Фиг. 16А), 2,5% (масс./об.) p-CY01_LM (Фиг. 16В) и 2,5% (об./об.) ГЭК (Фиг. 16С) указывали на то, что раствор, содержащий p-CY01_LM, демонстрировал четко выраженную активность ИПЛ при одной и той же концентрации и, таким образом, ингибировал перекристаллизацию льда, а ГЭК не демонстрировал особого ингибирующего эффекта на перекристаллизацию льда.As shown in FIG. 16, the measurement results for PBS (Fig. 16A), 2.5% (w/v) p-CY01_LM (Fig. 16B) and 2.5% (v/v) HES (Fig. 16C) indicated that the solution containing p-CY01_LM showed a pronounced IPL activity at the same concentration and thus inhibited ice recrystallization, while HES did not show a particular inhibitory effect on ice recrystallization.
Депонирование микроорганизмовDeposition of microorganisms
Учреждение-депозитарий: Корейский Научный Институт Бионауки и БиотехнологииDepositary institution: Korea Science Institute of Bioscience and Biotechnology
Учетный номер: KCTC 12867ВРAccount number: KCTC 12867VR
Дата депонирования: Июль 15, 2015 года.Deposit date: July 15, 2015.
Промышленная применимостьIndustrial Applicability
Экзополисахарид согласно настоящему изобретению обладает превосходной способностью к криозащите клеток во время криоконсервации и не демонстрирует цитотоксичности. Таким образом, экзополисахарид согласно настоящему изобретению может заменять общепринятые криозащитные агенты, которые демонстрируют цитотоксичность и требуют сложных способов оттаивания при применении в высоких концентрациях для криоконсервации эритроцитов. Соответственно, экзополисахарид согласно настоящему изобретению является эффективным для длительной криоконсервации крови.The exopolysaccharide of the present invention has an excellent ability to cryoprotect cells during cryopreservation and does not exhibit cytotoxicity. Thus, the exopolysaccharide of the present invention can replace conventional cryoprotective agents that exhibit cytotoxicity and require complex thawing techniques when used at high concentrations for cryopreservation of erythrocytes. Accordingly, the exopolysaccharide of the present invention is effective for long term blood cryopreservation.
Хотя настоящее изобретение и было подробно описано со ссылкой на конкретные признаки, специалистам в данной области техники будет понятно, что данное описание предназначено только для описания предпочтительного варианта реализации и не ограничивает объем настоящего изобретения. Таким образом, по существу объем настоящего изобретения будет определен прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.Although the present invention has been described in detail with reference to specific features, it will be understood by those skilled in the art that this description is only intended to describe the preferred embodiment and does not limit the scope of the present invention. Thus, essentially the scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (12)
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170058701A KR101816802B1 (en) | 2017-05-11 | 2017-05-11 | Cryoprotective Agent Containing Exopolysaccharide from Pseudoalteromonas sp. CY01 |
| KR10-2017-0058701 | 2017-05-11 | ||
| US15/836,138 US10993434B2 (en) | 2017-05-11 | 2017-12-08 | Cryoprotective agent containing exopolysaccharide from Pseudoalteromonas sp. CY01 |
| US15/836,138 | 2017-12-08 | ||
| PCT/KR2017/014909 WO2018207988A1 (en) | 2017-05-11 | 2017-12-18 | Cryoprotective agent containing exopolysaccharide from pseudoalteromonas sp. cy01 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2019114407A RU2019114407A (en) | 2020-11-13 |
| RU2019114407A3 RU2019114407A3 (en) | 2021-02-26 |
| RU2779448C2 true RU2779448C2 (en) | 2022-09-08 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2113479C1 (en) * | 1997-04-23 | 1998-06-20 | Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточное отделение РАН | Strain of bacterium pseudoalteromonas species - a producer of alpha-galactosidase |
| RU2207370C1 (en) * | 2002-01-23 | 2003-06-27 | Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН | Strain of bacterium pseudoalteromonas issachenkonii kmm 3549t as producer of fucoidane hydrolase and nutrient medium for its culturing |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2113479C1 (en) * | 1997-04-23 | 1998-06-20 | Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточное отделение РАН | Strain of bacterium pseudoalteromonas species - a producer of alpha-galactosidase |
| RU2207370C1 (en) * | 2002-01-23 | 2003-06-27 | Тихоокеанский институт биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН | Strain of bacterium pseudoalteromonas issachenkonii kmm 3549t as producer of fucoidane hydrolase and nutrient medium for its culturing |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| NICHOLS C.M. ET AL. Chemical Characterization of Exopolysaccharides from Antarctic Marine Bacteria. Microb Ecol 49, 578-589 (2005). https://doi.org/10.1007/s00248-004-0093-8 Найдено онлайн: https://link.springer.com/article/10.1007/s00248-004-0093-8 Дата обращения 23.07.2021. KIM S.J. ET AL. Cryoprotective properties and preliminary characterization of exopolysaccharide (P-Arcpo 15) produced by the Arctic bacterium Pseudoalteromonas elyakovii Arcpo 15. Preparative Biochemistry & Biotechnology, Volume 46, 2016 - Issue 3, Pages 261-266, Published online:14 Apr 2016. Найдено онлайн: https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/10826068.2015.1015568 Дата обращения 23.07.2021. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA3043814C (en) | Cryoprotective agent containing exopolysaccharide from pseudoalteromonas sp. cy01 | |
| Balcerzak et al. | Designing ice recrystallization inhibitors: from antifreeze (glyco) proteins to small molecules | |
| EP2305792A1 (en) | Cryopreservative composition for cell and tissue | |
| Chen et al. | Cryoprotective effect of antifreeze glycopeptide analogues obtained by nonenzymatic glycation on Streptococcus thermophilus and its possible action mechanism | |
| Li et al. | Investigation of the physiochemical properties, cryoprotective activity and possible action mechanisms of sericin peptides derived from membrane separation | |
| JP2024001207A (en) | Cryopreservation solution | |
| RU2779448C2 (en) | Cryoprotective agent containing exopolysaccharide from pseudoalteromonas sp. cy01 | |
| CN110563826B (en) | Recombinant embryonic development later-stage abundant protein and anti-freezing solution containing same | |
| JP2023091093A (en) | Cryopreservation liquid | |
| Kawahara | Characterizations of functions of biological materials having controlling-ability against ice crystal growth | |
| Kim et al. | Production of antifreeze proteins by cold-adapted yeasts | |
| Kim et al. | A novel exopolysaccharide (p-CY01) from the Antarctic bacterium Pseudoalteromonas sp. strain CY01 cryopreserves human red blood cells | |
| KR101501212B1 (en) | Cryoprotective Exopolysaccharide from Pseudoalteromonas tetraodonis | |
| KR101135649B1 (en) | Novel Cryoprotective Exopolysaccharide | |
| JP2017043551A (en) | Peptide for biomaterial protection | |
| KR101765843B1 (en) | Cryoprotective Exopolysaccharide from Pseudoalteromonas elyakovii | |
| JP7391528B2 (en) | Polymer aqueous solution for cryopreservation | |
| KR100901686B1 (en) | Antarctic microalgae Pyramimonas genus producing antifreezing molecules | |
| Kawahara et al. | Cryoprotection and cryosterilization effects of type I antifreeze protein on E. coli cells | |
| CN113621519B (en) | Composite yeast freeze-drying protective agent | |
| KR101126314B1 (en) | Novel Cryoprotective Exopolysaccharide | |
| Tornacı et al. | Investigating the cryoprotective efficacy of fructans in mammalian cell systems via a structure-functional perspective | |
| KR101766382B1 (en) | The composition comprising protein from Leucosporidium sp for cryopreservation and preventing cryoinjury method thereof | |
| KR101121159B1 (en) | Novel Cryoprotective Exopolysaccharide | |
| JP2022104329A (en) | Cryopreservation liquid |