RU2111001C1

RU2111001C1 - Method of immunoglobulin preparation preparing

Info

Publication number: RU2111001C1
Application number: RU95111459A
Authority: RU
Inventors: А.В. Волков; В.А. Алешкин
Original assignee: Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского
Priority date: 1995-07-03
Filing date: 1995-07-03
Publication date: 1998-05-20

Abstract

FIELD: medicine, veterinary science. SUBSTANCE: method involves coagulation of cattle blood serum nonimmunoglobulin proteins and lipids with caprylic acid. Method can be used for prophylaxis and treatment of human and different animals with infections of enteric groups and other different groups of bacteria and viruses. EFFECT: improved method of preparing.

Description

Изобретение относится к медицине и ветеринарии и может быть использовано для профилактики и лечения инфекционных заболеваний кишечной группы человека и различных сельскохозяйственных и домашних животных, а также инфекций крупного рогатого скота, вызываемых другими различными группами бактерий и вирусов. The invention relates to medicine and veterinary medicine and can be used for the prevention and treatment of infectious diseases of the human intestinal group and various agricultural and domestic animals, as well as cattle infections caused by various other groups of bacteria and viruses.

Известно, что основными средствами борьбы с инфекционными заболеваниями бактериальной природы являются антибиотики широкого спектра действия и подобные им препараты. It is known that the main means of combating infectious diseases of a bacterial nature are broad-spectrum antibiotics and similar drugs.

Однако лечение ими кишечных и других инфекций приводит к нарушению биоценоза кишечника, возникновению дисбактериоза, аллергизации организма и увеличению числа резистентных к ним патогенных штаммов микроорганизмов. However, their treatment of intestinal and other infections leads to a violation of the intestinal biocenosis, the occurrence of dysbiosis, allergization of the body and an increase in the number of pathogenic microorganisms resistant to them.

В связи с вышеизложенным важной практической задачей является разработка безвредных для макроорганизма, физиологичных и высокоэффективных препаратов для профилактики и лечения инфекционных заболеваний человека, особенно детей младшего возраста, и животных, прежде всего молодняка. In connection with the foregoing, an important practical task is the development of harmless to the macroorganism, physiological and highly effective drugs for the prevention and treatment of infectious diseases of humans, especially young children, and animals, especially young animals.

В последнее время в клинической практике наметилось новое направление: пассивная энтеральная иммунизация с помощью иммуноглобулиновых препаратов, содержащих специфические антитела к определенному виду возбудителя. Эти препараты не дают побочных эффектов и не угнетают нормальную микрофлору кишечника. Для производства этих препаратов необходимо иметь достаточно простой и высокоэффективный метод выделения иммуноглобулинов. Recently, a new direction has emerged in clinical practice: passive enteral immunization with the help of immunoglobulin preparations containing specific antibodies to a specific type of pathogen. These drugs do not give side effects and do not inhibit the normal intestinal microflora. For the production of these drugs, it is necessary to have a fairly simple and highly effective method for the isolation of immunoglobulins.

Известен способ получения гамма-глобулина путем его фракционирования по методу Кона спиртовым осаждением на холоду [1]. A known method of producing gamma globulin by fractionation by the method of Cohn by alcohol deposition in the cold [1].

Спиртовой метод Кона имеет ряд недостатков: трудоемкость, длительность процедуры, необходимость наличия большого количества холодильного оборудования и значительное расходование спирта. Cohn's alcohol method has several disadvantages: the complexity, the duration of the procedure, the need for a large number of refrigeration equipment and significant consumption of alcohol.

Описан способ получения комплексного иммуноглобулинового препарата из сыворотки крови человека для орального применения, содержащий три класса иммуноглобулинов. Способ предусматривает экстракцию осадка В (III фракция Кона), обработку экстракта хлороформом и декстрансульфатом с целью удаления липопротеидов, осаждение фракции иммуноглобулинов полиэтиленгликолем в концентрации 5% (авт.свид. СССР N 836683). A method for producing a complex immunoglobulin preparation from human serum for oral administration is described, comprising three classes of immunoglobulins. The method involves the extraction of sediment B (Kona III fraction), treatment of the extract with chloroform and dextransulfate in order to remove lipoproteins, precipitation of the immunoglobulin fraction with polyethylene glycol at a concentration of 5% (ed. Certificate of USSR N 836683).

Однако данный метод отличается использованием значительного количества дорогостоящих химических реагентов, большой длительностью и сложностью технологического процесса, дороговизной и дефицитностью используемого сырья, а также неприемлемостью использования препаратов крови человека для нужд ветеринарии. However, this method is characterized by the use of a significant amount of expensive chemicals, the long duration and complexity of the process, the high cost and scarcity of the raw materials used, as well as the unacceptability of using human blood products for veterinary use.

Цель изобретения - способ получения иммуноглобулинового препарата из сыворотки крови крупного рогатого скота, упрощение технологии производства и снижение себестоимости. \\2 Указанная цель достигается тем, что в качестве сырья для получения иммуноглобулинового препарата используется сыворотка крови крупного рогатого скота, а осаждение балластных белков и липидов проводят каприловой кислотой. The purpose of the invention is a method for producing an immunoglobulin preparation from blood serum of cattle, simplification of production technology and cost reduction. \\ 2 This goal is achieved by the use of cattle blood serum as the raw material for the production of the immunoglobulin preparation, and the deposition of ballast proteins and lipids is carried out with caprylic acid.

Предварительно в сыворотке крови определяют титры антител к возбудителям кишечных заболеваний человека: энтеробактериям (сальмонеллы, эшерихии, шигеллы, клебсиеллы, протей и др.), синегнойной палочке, ротовирусу и т.д., а затем к микроорганизмам, вызывающим кишечные заболевания сельскохозяйственных и домашних животных. Параллельно с целью получения внутримышечных и внутривенных препаратов определяют активность сыворотки в отношении различных групп бактерий и вирусов, являющихся возбудителями инфекционных заболеваний у крупного рогатого скота. Титры антител определяют методами РТГА и РПГА. Previously, the titers of antibodies to human intestinal pathogens are determined in blood serum: enterobacteria (Salmonella, Escherichia, Shigella, Klebsiella, Proteus, etc.), Pseudomonas aeruginosa, Rotovirus, etc., and then to microorganisms that cause intestinal diseases of agricultural and domestic animals. In parallel, in order to obtain intramuscular and intravenous preparations, the activity of serum against various groups of bacteria and viruses that cause infectious diseases in cattle is determined. Antibody titers are determined by RTGA and RPGA.

С целью получения препарата в сыворотку крови крупного рогатого скота добавляют 1 М уксусную кислоту и доводят рН до 4,0-5,0. Затем медленно через шприц или делительную воронку при постоянном интенсивном перемешивании и температуре 18-30^oБС добавляют каприловую кислоту из расчета 2,0-9,0 мл на 100 мл сыворотки. После прекращения добавления реагента продолжают перемешивание в течение 1-2 ч. Далее проводят центрифугирование при 3000 об/мин в течение 50-60 мин, после чего осадок удаляют, а иммуноглобулины остаются в растворе. Затем доводят рН до 7,0 1 М едким натрием при интенсивном перемешивании, концентрируют и диализуют полученный препарат против физиологического раствора хлорида натрия.In order to obtain the drug, 1 M acetic acid is added to the blood serum of cattle and the pH is adjusted to 4.0-5.0. Then slowly through a syringe or a separatory funnel with constant vigorous stirring and a temperature of 18-30 ^o BS add caprylic acid at the rate of 2.0-9.0 ml per 100 ml of serum. After stopping the addition of the reagent, stirring is continued for 1-2 hours. Then, centrifugation is carried out at 3000 rpm for 50-60 minutes, after which the precipitate is removed and the immunoglobulins remain in solution. Then the pH was adjusted to 7.0 with 1 M sodium hydroxide with vigorous stirring, the resulting preparation was concentrated and dialyzed against physiological sodium chloride solution.

Каприловая кислота, потребляемая людьми ежедневно вместе с пищей, входит в состав триглицеридов молочных жиров и составляет 4-8% (по данным разных авторов) от общей массы жирных кислот. Между тем она обладает антибактериальным действием, что в некоторых случаях немаловажно при обработке сыворотки крови. При доведении рН до нейтральной большая часть образующегося из оставшейся каприловой кислоты каприлата натрия выходит из раствора при диализе. Как стабилизатор белка каприлат натрия добавляется в препараты крови [2]. Caprylic acid, consumed by people daily with food, is part of the triglycerides of milk fats and accounts for 4-8% (according to various authors) of the total mass of fatty acids. Meanwhile, it has an antibacterial effect, which in some cases is important when processing blood serum. When the pH is adjusted to neutral, most of the sodium caprylate formed from the remaining caprylic acid leaves the solution during dialysis. As a protein stabilizer, sodium caprylate is added to blood products [2].

После определения титров антител к возбудителям инфекционных заболеваний в сыворотку крови крупного рогатого скота добавляют 1 М уксусную кислоту и доводят рН до 4,0-5,0. Затем медленно при постоянном интенсивном перемешивании и температуре 18-30^oС добавляют каприловую кислоту из расчета 2,0-9,0 мл на 100 мл сыворотки. После прекращения добавления реагента перемешивание продолжается в течение 1-2 ч. Далее проводят центрифугирование при 3000 об/мин в течение 50-60 мин, после чего осадок удаляют, а иммуноглобулины остаются в растворе. При обработке больших объемов сырья работа производится на сепараторной центрифуге. После фильтрования раствора доводят рН до 7,0 1 М едким натрием при интенсивном перемешивании. Затем проводят концентрирование и диализ на модуле с полыми волокнами против физиологического раствора хлорида натрия.After determining the titers of antibodies to infectious agents, 1 M acetic acid is added to the blood serum of cattle and the pH is adjusted to 4.0-5.0. Then slowly with constant vigorous stirring and a temperature of 18-30 ^o With add caprylic acid at the rate of 2.0-9.0 ml per 100 ml of serum. After stopping the addition of the reagent, stirring continues for 1-2 hours. Then, centrifugation is carried out at 3000 rpm for 50-60 minutes, after which the precipitate is removed and the immunoglobulins remain in solution. When processing large volumes of raw materials, work is done in a separator centrifuge. After filtering the solution, the pH was adjusted to 7.0 with 1 M sodium hydroxide with vigorous stirring. Then, concentration and dialysis are carried out on a module with hollow fibers against a physiological solution of sodium chloride.

При концентрировании содержание белка доводится до 60±5 мг/мл. Определение проводят по биуретовому методу (ФС 42-344 ВС-90). When concentrated, the protein content is brought to 60 ± 5 mg / ml. The determination is carried out according to the biuret method (FS 42-344 BC-90).

Чистота препарата более 99%. Контроль чистоты проводится в иммуноэлектрофорезе и электрофорезе на ацетатцеллюлозных пленках (РД 42-15-6-12-90). The purity of the drug is more than 99%. Purity control is carried out in immunoelectrophoresis and electrophoresis on cellulose acetate films (RD 42-15-6-12-90).

Состав препарата: Ig G 80-90%, Ig A 0,5-2%, Ig M 5-15%. Composition of the preparation: Ig G 80-90%, Ig A 0.5-2%, Ig M 5-15%.

Определение проводят методом радиальной иммунодиффузии по Манчини с кроличьими моноспецифическими антисыворотками к иммуноглобулинам крови крупного рогатого скота. Значительные различия в составе иммуноглобулинов и в ряде случаев невысокое содержание Ig M и Ig A в крови у отдельных представителей данных животных является физиологической нормой [3]. Соотношение иммуноглобулинов между собой по классам в исходном сырье и готовом препарате должно оставаться примерно на одном уровне. Выход препарата по иммуноглобулинам составляет 90%. The determination is carried out by the method of radial immunodiffusion according to Mancini with rabbit monospecific antisera to immunoglobulins of blood of cattle. Significant differences in the composition of immunoglobulins and, in some cases, the low content of Ig M and Ig A in the blood of individual representatives of these animals is a physiological norm [3]. The ratio of immunoglobulins to each other in classes in the feedstock and the finished product should remain at approximately the same level. The output of the drug for immunoglobulins is 90%.

Титры антител к возбудителям инфекционных заболеваний человека и животных, определяемые методами РТГА и РПГА, зависят от специфической активности исходного сырья и в конечном препарате, в пересчете на концентрацию иммуноглобулинов остаются на прежнем уровне. Antibody titers to infectious agents of humans and animals, determined by methods of rtga and rpga, depend on the specific activity of the feedstock and in the final preparation, in terms of the concentration of immunoglobulins remain at the same level.

Предлагаемый способ получения высокоиммунохимически чистых иммуноглобулиновых препаратов прост, легко воспроизводим, технологичен, не требует дорогого специального оборудования и большого расхода химических реагентов, позволяет получить высокоэффективные пероральные препараты для профилактики и лечения кишечных инфекционных заболеваний человека и животных, а также внутримышечные и внутривенные препараты для лечения и профилактики инфекционных заболеваний крупного рогатого скота бактериальной и вирусной природы. Полученные данным способом препараты могут быть предложены для массового применения в медицине и ветеринарии. The proposed method for producing highly immunochemically pure immunoglobulin preparations is simple, easily reproducible, technologically advanced, does not require expensive special equipment and a large consumption of chemical reagents, allows to obtain highly effective oral preparations for the prevention and treatment of intestinal infectious diseases of humans and animals, as well as intramuscular and intravenous preparations for the treatment and prevention of infectious diseases of cattle of bacterial and viral nature. Obtained by this method, drugs can be offered for mass use in medicine and veterinary medicine.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Руководство по вакционному и сывороточному делу. Под ред. Бургасова П.Н. - М.: Медицина, 1978, с.315-321.SOURCES OF INFORMATION
1. A guide to vaccine and serum. Ed. Burgasova P.N. - M .: Medicine, 1978, p. 315-321.

2. Русанов В.М., Скобелев Л.И. Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови. - М.: Медицина, 1983. 2. Rusanov V.M., Skobelev L.I. Fractionation of plasma proteins in the production of blood products. - M .: Medicine, 1983.

3. Butler,J.E. Bovine immunoglobulines: an auqmented Revier. - Veterinary Immunology and Immunopathology, 4 (1983), 43-152. 3. Butler, J.E. Bovine immunoglobulines: an auqmented Revier. - Veterinary Immunology and Immunopathology, 4 (1983), 43-152.

Claims

A method of obtaining an immunoglobulin preparation containing immunoglobulins G, M and A, including coagulation and removal of non-immunoglobulin proteins and lipids from the feedstock, characterized in that the blood serum of cattle is used as feedstock, and coagulation is carried out by treatment with caprylic acid from calculation of 2.0 - 9.0 ml of acid per 100 ml of serum.