RU2050858C1

RU2050858C1 - Method for producing immunoglobulin preparation having immunoglobulins of b-, m- and a-class

Info

Publication number: RU2050858C1
Application number: SU925046533A
Authority: RU
Inventors: В.А. Алешкин; И.В. Борисова; Л.И. Новикова; Л.В. Сидорова; Б.А. Шендеров; М.А. Манвелова; В.С. Сидоров
Original assignee: Алешкин Владимир Андрианович
Priority date: 1992-06-08
Filing date: 1992-06-08
Publication date: 1995-12-27

Abstract

FIELD: veterinary medicine. SUBSTANCE: method involves extracting lipides from mammalian and avian blood serum by using chloroform. Lipids are precipitated with 1-2% polyethylene glycol and withdrawn. The end products is selected by means of polyethylene glycol. EFFECT: enhanced effectiveness of treatment.

Description

Изобретение относится к ветеринарии и касается способа получения комплексного иммуноглобулинового препарата для профилактики и лечения инфекционных заболеваний млекопитающих и птиц бактериальной и вирусной природы. The invention relates to veterinary medicine and relates to a method for producing a complex immunoglobulin preparation for the prevention and treatment of infectious diseases of mammals and birds of bacterial and viral nature.

Одним из общепринятых приемов снижения заболеваемости и гибели животных и птиц в условиях из промышленного разведения является введение с первых дней жизни с кормами и питьем антибиотиков или других антимикробных препаратов. Помимо значительных экономических затрат этот прием приводит к накоплению в организме животных и птиц антимикробных соединений, что существенно снижает потребительские качества мяса, молока, яиц. One of the generally accepted methods of reducing the incidence and death of animals and birds in conditions of industrial breeding is the introduction of antibiotics or other antimicrobials from the first days of life with food and drink. In addition to significant economic costs, this technique leads to the accumulation of antimicrobial compounds in the body of animals and birds, which significantly reduces the consumer qualities of meat, milk, and eggs.

В связи с вышеизложенным разработка физиологических высокоэффективных препаратов для профилактики инфекционных заболеваний и снижения гибели домашних животных и птиц является актуальной задачей. In connection with the foregoing, the development of physiological highly effective drugs for the prevention of infectious diseases and reduce the death of domestic animals and birds is an urgent task.

Одним из способов решения этой задачи является использование иммуноглобулиновых препаратов. Известны способы получения иммуноглобулиновых препаратов для профилактики и лечения инфекционных заболеваний у млекопитающих и птиц (Sigma Immuno Chemicals, 1989 Сatalogue, No 14881). One way to solve this problem is to use immunoglobulin preparations. Known methods for producing immunoglobulin preparations for the prevention and treatment of infectious diseases in mammals and birds (Sigma Immuno Chemicals, 1989 Satalogue, No. 14881).

Наиболее широко используют спиртовый метод фракционирования сыворотки крови на холоду по Кону. Известны также достаточно трудоемкие, требующие специального оборудования методы получения иммуноглобулиновых препаратов путем ионообменной хроматографии и гельфильтрации. Общим недостатком всех перечисленных методов является то, что конечный продукт содержит иммуноглобулины только одного класса Ig G. в нем отсутствуют Ig классов М и А, например, антибактериальные IgМ антитела к грамотрицательным бактериям, антивирусные IgA антитела. The most widely used alcoholic method of fractionation of blood serum in the cold according to Cohn. Also quite laborious, requiring special equipment, methods for producing immunoglobulin preparations by ion exchange chromatography and gel filtration are also known. A common drawback of all these methods is that the final product contains immunoglobulins of only one class of Ig G. It does not have Ig classes M and A, for example, antibacterial IgM antibodies to gram-negative bacteria, antiviral IgA antibodies.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения комплексного иммуноглобулинового препарата, содержащего три класса иммуноглобулинов Ig G. А. M. для орального применения из сыворотки крови человека для орального применения (прототип). Способ предусматривает экстракцию балластного осадка В (III фракция Кона) обработку экстракта хлороформом и декстрансульфатом с целью удаления липопротеидов, осаждение фракции иммуноглобулинов полиэтиленгликолем в концентрации 12% (патент СССР N 836831 А 61 К 35/14 БИ 15, 1982). Closest to the claimed is a method of obtaining a complex immunoglobulin preparation containing three classes of Ig G. A. M. immunoglobulins for oral administration from human serum for oral administration (prototype). The method involves the extraction of ballast sediment B (Cohn III fraction), treatment of the extract with chloroform and dextran sulfate to remove lipoproteins, precipitation of the immunoglobulin fraction with polyethylene glycol at a concentration of 12% (USSR patent N 836831 A 61 K 35/14 BI 15, 1982).

Однако препарат, полученный этим способом, малопригоден для массовой профилактики и лечения инфекционных заболеваний млекопитающих и птиц в условиях промышленного животноводства и птицеводства из-за высокой стоимости препарата (использование в качестве одного из основных реагентов дорогостоящего декстрансульфата и дефицитной сыворотки крови человека) и недостаточно высокой эффективности в связи с использованием гетерологичной для животных и птиц сыворотки крови человека. However, the preparation obtained by this method is unsuitable for mass prophylaxis and treatment of infectious diseases of mammals and birds in the conditions of industrial animal husbandry and poultry farming due to the high cost of the preparation (using expensive dextransulfate and deficient human serum as one of the main reagents) and insufficiently high efficiency in connection with the use of human blood serum heterologous to animals and birds.

Целью настоящего изобретения является повышение эффективности комплексного иммуноглобулинового препарата для профилактики и лечения инфекционных заболеваний млекопитающих и птиц и снижение его себестоимости. The aim of the present invention is to increase the effectiveness of a comprehensive immunoglobulin preparation for the prevention and treatment of infectious diseases of mammals and birds and reduce its cost.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе получения комплексного иммуноглобулинового препарата в качестве исходного сырья используют сыворотку крови млекопитающих или птиц, а осаждение липидов проводят 1-2% полиэтиленгликолем (ПЭГ, м.м.6т.). Замена декстрансульфата на полиэтиленгликоль наряду с заменой исходного сырья значительно снижает стоимость препарата и не влияет на его качество. This goal is achieved by the fact that in the known method for producing a complex immunoglobulin preparation, the blood serum of mammals or birds is used as a feedstock, and lipid deposition is carried out with 1-2% polyethylene glycol (PEG, m.m.6t.). Replacing dextran sulfate with polyethylene glycol along with replacing the feedstock significantly reduces the cost of the drug and does not affect its quality.

Способ поясняют следующим образом:
Обработка сыворотки крови млекопитающих и птиц с целью удаления липротеидов.The method is explained as follows:
Treatment of serum from mammals and birds to remove liproteids.

К 10 л сыворотки добавляют 1 л хлороформа (10% по объему). Смесь перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре, затем при постоянном перемешивании добавляют 50%-ный раствор полиэтиленгликоля (м.м.6 т.) до концентрации 2% Добавление ПЭГ к сыворотке в концентрации 1-2% позволяет сформировать комплекс (липопротеины + ПЭГ), легко удаляемый их сыворотки. При этом в надосадочной жидкости полностью сохраняются иммуноглобулины IgM и IgA. После центрифугирования в течение 30 мин при 3000 об/мин осадок удаляют. Объем очищенной от липопротеидов фракции равен 8 л. To 10 L of serum add 1 L of chloroform (10% by volume). The mixture is stirred for 2 hours at room temperature, then 50% polyethylene glycol solution (m.m.6 t) is added with constant stirring to a concentration of 2%. Addition of PEG to serum at a concentration of 1-2% allows the formation of a complex (lipoproteins + PEG), easily removable serum. At the same time, IgM and IgA immunoglobulins are completely preserved in the supernatant. After centrifugation for 30 min at 3000 rpm, the precipitate is removed. The volume of the fraction purified from lipoproteins is 8 l.

Осаждение фракции иммуноглобулинов. Precipitation of the immunoglobulin fraction.

К 8 л экстракта для осаждения иммуноглобулинов добавляют 50%-ный раствор полиэтиленгликоля до конечной концентрации 12% (1,6 л) при постоянном перемешивании. Осадок, содержащий иммуноглобулиновую фракцию, отделяют центрифугированием в течение 30 мин при 3000 об/мин. To 8 l of the extract for precipitation of immunoglobulins add a 50% solution of polyethylene glycol to a final concentration of 12% (1.6 l) with constant stirring. The precipitate containing the immunoglobulin fraction is separated by centrifugation for 30 minutes at 3000 rpm.

Растворение осадка иммуноглобулинов. Dissolution of immunoglobulin sediment.

Осадок иммуноглобулинов растворяют в 0,9%-ном растворе хлорида натрия до содержания белка (6,5 + 0,5)% рН 7,2. Определение проводят по ФС 42-344 ВС-90. Для стабилизации препарата добавляют лактозу в концентрации 2% После стерилизующей фильтрации препарат разливают по флаконам и лиофилизируют. Хранят препарат в темном месте при температуре (6+4)C. Срок хранения 3 года. The precipitate of immunoglobulins is dissolved in a 0.9% sodium chloride solution to a protein content of (6.5 + 0.5)% pH 7.2. The determination is carried out according to FS 42-344 BC-90. To stabilize the drug, lactose is added at a concentration of 2%. After sterilizing filtration, the drug is poured into vials and lyophilized. Store the drug in a dark place at a temperature of (6 + 4) C. Shelf life 3 years.

В готовом препарате определяют титры антител к одному из видов энтеробактерий (сальмонеллы, эшерихии), а также к вирусам (ротавирусу). Титры антител должны быть не ниже 1:160. Определение проводят методами РТПГА и РПГА. Состав препарата: InG 40% IgM 25% IgА 25% Определение проводят методом РИД с кроличьими моноспецифическими к белкам крови млекопитающих и птиц. In the finished preparation, titers of antibodies to one of the types of enterobacteria (salmonella, Escherichia), as well as to viruses (rotavirus) are determined. Antibody titers must be at least 1: 160. The determination is carried out by methods RTPHA and RPGA. Composition of the preparation: InG 40% IgM 25% IgA 25% Determination is carried out by the RID method with rabbit monospecific to the blood proteins of mammals and birds.

Количество иммунологически неактивных примесей составляет не более 10%
Определение проводят по ФС 42-344 ВС-90. Вещества, входящие в состав препарата: хлорид натрия в концентрации (0,85+0,5)% для создания изотонического раствора; лактоза в концентрации 2% стабилизатор; остаточный ПЭГ на более 1%
Предлагаемый способ, не усложняя технологию получения комплексного иммуноглобулинового препарата, позволяет получить высокоэффективный препарат для профилактики и лечения распространенных инфекционных заболеваний млекопитающих и птиц бактериальной и вирусной этиологии. Препарат недорог и может быть использован для массового применения животным и птицам.The amount of immunologically inactive impurities is not more than 10%
The determination is carried out according to FS 42-344 BC-90. Substances that make up the drug: sodium chloride in a concentration of (0.85 + 0.5)% to create an isotonic solution; lactose in a concentration of 2% stabilizer; residual PEG by more than 1%
The proposed method, without complicating the technology for producing a complex immunoglobulin preparation, allows to obtain a highly effective drug for the prevention and treatment of common infectious diseases of mammals and birds of bacterial and viral etiology. The drug is inexpensive and can be used for mass application to animals and birds.

Claims

METHOD FOR PRODUCING AN IMMUNOGLOBULIN PREPARATION CONTAINING IMMUNOGLOBULINS OF CLASSES G, M AND A, including extraction of lipids from a blood preparation with chloroform, precipitation of lipids from an extract, their removal and isolation of the target product with polyethylene glycol, which is different in blood, which is used in birds as blood and lipid precipitation is carried out with 1-2% polyethylene glycol.