RU2105981C1

RU2105981C1 - Method for predicting acute myocardial infarction

Info

Publication number: RU2105981C1
Application number: RU95110742A
Authority: RU
Inventors: Н.Е. Чалык
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1995-06-30
Publication date: 1998-02-27
Also published as: RU95110742A

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves examining neutrophils with caps luminescence of cell membranes to be determined in dynamic mode (at the first, seventh, fourteenth and twenty first day). Comparison to the corresponding values in healthy people (0.015-0.020 conventional units) is carried out. Caps luminescence at the twenty first day being incremented by more than 0.009 conventional units and approaching the values characteristic of healthy people, favorable myocardial infarction course is to be predicted. No changes in luminescence is observed relative to its value at the first day, aggravation of the disease course and recidivation occurrence is to be predicted. EFFECT: enhanced accuracy of prediction. 1 tbl

Description

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и предназначено для прогнозирования течения инфаркта миокарда. The invention relates to medicine, namely to immunology, and is intended to predict the course of myocardial infarction.

Индикаторные тесты, основанные на высокой реактивности нейтрофила, широко используются в клинической медицине и по чувствительности нередко превосходят другие лабораторные показатели. Высокая скорость обмена нейтрофилов крови придает таким исследованиям особую информативность, позволяя прицельно наблюдать за динамикой патологического процесса. Indicator tests based on the high reactivity of neutrophil are widely used in clinical medicine and are often superior in sensitivity to other laboratory parameters. The high exchange rate of blood neutrophils gives such studies a special information content, making it possible to closely monitor the dynamics of the pathological process.

Известны методы диагностики различных форм ИБС с помощью изучения кислородзависимого метаболизма нейтрофилов: полярография (Klebanoff S.J. Clark R.X. 1978), восстановление цитохрома C (Ozahi J. at al. 1986), восстановление нитросинего тетразолия (Маянский А.Н. Галиуллин А.Н. 1984), прямая хемилюминесценция (Маянский А.Н. и др. 1987) и другие. Known methods for diagnosing various forms of coronary heart disease by studying the oxygen-dependent metabolism of neutrophils: polarography (Klebanoff SJ Clark RX 1978), restoration of cytochrome C (Ozahi J. at al. 1986), restoration of nitro-blue tetrazolium (Mayansky A.N. Galiullin A.N. 1984 ), direct chemiluminescence (Mayansky A.N. et al. 1987) and others.

Для получения критериев дифференциальной диагностики ранних, поздних рецидивов инфаркта миокарда, а также прогнозирования и оценки тяжести течения рецидивов инфаркта миокарда используют цитохимические (щелочная фосфата, миелопероксидаза) и морфометрические (площадь клеток и их ядер) показатели нейтрофилов (Гмурман В.У. 1972 и др; Лецков В.Б. 1978; Qracham J, 1964), а также показатели фагоцитарной активности (Маянский А.Н. Маянский Д.Н. 1989). To obtain criteria for the differential diagnosis of early, late recurrences of myocardial infarction, as well as for predicting and assessing the severity of recurrence of myocardial infarction, cytochemical (alkaline phosphate, myeloperoxidase) and morphometric (area of cells and their nuclei) neutrophil counts are used (Gurman V.U. 1972 and others ; Letskov V.B. 1978; Qracham J, 1964), as well as indicators of phagocytic activity (Mayansky A.N. Mayansky D.N. 1989).

Однако указанные методы не позволяют судить о состоянии рецепторного аппарата полиморфно-ядерных лейкоцитов крови (ПМЯЛ), т.е. о степени десенситизации, коррелирующей с тяжестью повреждения этих клеток. However, these methods do not allow to judge the state of the receptor apparatus of polymorphic nuclear blood leukocytes (PMNL), i.e. the degree of desensitization correlating with the severity of damage to these cells.

Наиболее близким техническим решением предлагаемого способа является определение состояния рецепторного аппарата нейтрофилов у больных инфарктом миокарда, основанного на методике определения гетерогенности рецепторного аппарата ПМЯЛ крови (Клебанов Г.И. и др. 1987). Авторы выделяли ПМЯЛ из периферической крови здоровых лиц, больных хроническими формами ишемической болезни сердца (ИБС) и инфарктом миокарда с последующей их окраской иммунными комплексами, меченными флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ), что позволяло им по изменению интенсивности флюоресценции суспензии нейтрофилов оценивать их лигаид-связывающую способность. The closest technical solution of the proposed method is to determine the status of the receptor apparatus of neutrophils in patients with myocardial infarction, based on the method for determining the heterogeneity of the receptor apparatus of the PMNL blood (Klebanov G.I. et al. 1987). The authors isolated PMNL from the peripheral blood of healthy individuals suffering from chronic forms of coronary heart disease (IHD) and myocardial infarction with their subsequent staining with immune complexes labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC), which allowed them to evaluate their ligid binding ability by changing the fluorescence intensity of a suspension of neutrophils.

Однако существенным недостатком этого метода является учет интенсивности флюоресценции всего объема исследуемой суспензии ПМЯЛ, т.е. клеток и среды, в которой они находятся, а не самих нейтрофилов в чистом виде, так как фоновое свечение могут давать оставшиеся обломки оболочек эритроцитов после их гемолиза и другие возможные артефакты. В связи с этим, данный метод не позволяет судить непосредственно об экспрессии рецепторов (Fc рецепторов), а тем более об их функциональной активности, что в конечном итоге приводит к понижению точной диагностики. However, a significant drawback of this method is the consideration of the fluorescence intensity of the entire volume of the studied suspension of PMNL, i.e. cells and the environment in which they are located, and not the neutrophils themselves in their pure form, as the background glow can give the remaining fragments of the membranes of red blood cells after their hemolysis and other possible artifacts. In this regard, this method does not directly judge the expression of receptors (Fc receptors), and even more so about their functional activity, which ultimately leads to a decrease in the exact diagnosis.

Данные недостатки устраняются тем, что ведется подсчет интенсивности флюоресценции (lum • 10^-3) единичной клетки и из этого значения вычитают свечение фона (свободного от нейтрофила участка), а также тем, что среди исследуемых клеток выделяют морфологические типы свечения мембран (кепы, пэтчи, ринги), что дает возможность более точно судить об активности рецепторного аппарата нейтрофилов и функционально связанных с ним метаболических процессов в клетке и на ее поверхности.These shortcomings are eliminated by the fact that the fluorescence intensity (lum • 10 ^-3 ) of a single cell is calculated and the background glow (of the neutrophil-free area) is subtracted from this value, as well as the morphological types of membrane glow (caps, patches) are distinguished from the studied cells. rings), which makes it possible to more accurately judge the activity of the receptor apparatus of neutrophils and the metabolic processes functionally associated with it in the cell and on its surface.

Способ заключается в следующем. The method is as follows.

1.Выделение нейтрофилов на грациенте плотности верографин-фиколла. 1. Isolation of neutrophils on the density gradient of verographin-ficoll.

2. Инкубация выделенных клеток с люминесцентными конъюгатами кроличьих иммуноглобулинов. 2. Incubation of isolated cells with luminescent conjugates of rabbit immunoglobulins.

3. Подсчет интенсивности свечения (lum • 10^-3) трех морфологических типов свечения мембран (условные единицы).3. Calculation of the intensity of luminescence (lum • 10 ^-3 ) of three morphological types of luminescence of membranes (arbitrary units).

Изобретение направлено на решение задач прогнозирования течения инфаркта миокарда, поэтому забор крови у больного осуществляется на 1,7,14,21 сутки от начала заболевания. The invention is aimed at solving the problems of predicting the course of myocardial infarction, therefore, blood sampling from a patient is carried out on 1,7,14,21 days from the onset of the disease.

Способ осуществляется следующим образом. The method is as follows.

Из венозной крови в количестве 5-10 мл выделяют нейтрофилы на градиенте плотности верографин-фиколла. Для этого кровь, отобранную с Na-солью этилендиаминтетрауксусной кислоты, разводят в 4 раза 0,9%-ным раствором NaCl и наслаивают на раствор верографин-фиколла (d 1,077-1,078 г/см³ по 7 мл в каждую пробирку и центрифугируют 40 мин при 400 q. После центрифугирования образуется осадок эритроцитов и гранулоцитов. Нейтрофилы располагаются пленкой на поверхности осадка.From venous blood in an amount of 5-10 ml, neutrophils are isolated on a density gradient of verographin-ficoll. To do this, blood sampled with ethylenediaminetetraacetic acid Na-salt is diluted 4 times with 0.9% NaCl solution and layered on a verographin-ficoll solution (d 1.077-1.078 g / cm ³ , 7 ml each) and centrifuged for 40 minutes at 400 q. After centrifugation, a sediment of erythrocytes and granulocytes forms, and neutrophils are located on the surface of the sediment.

Для получения взвеси гранулоцитов удаляют верофиколл, а осадок, содержащий эритроциты и гранулоциты, разводят в 1 мл физиологического раствора. Содержимое пробирок объединяют и переносят в силиконированные пробирки, где осаждают эритроциты 10%-ным раствором желатина (конечная концентрация желатина 1%). В течение 45-60 мин при 37^oC эритроциты лизируют 0,83%-ным раствором NH₄Cl. После перемешивания осадка фракции, содержащей гранулоциты с десятикратным объемом раствора NH₄Cl, центрифугируют ее 5-10 мин при 400q. Процедуру повторяют несколько раз до полного освобождения гранулоцитов от эритроцитов. Проверяют жизнеспособность клеток по трипановому синему и подсчитывают в камере Горяева.To obtain a suspension of granulocytes, verophycall is removed, and the sediment containing red blood cells and granulocytes is diluted in 1 ml of physiological saline. The contents of the tubes are combined and transferred to silicone tubes, where red blood cells are precipitated with 10% gelatin solution (final concentration of gelatin is 1%). For 45-60 minutes at 37 ^° C, red blood cells are lysed with a 0.83% solution of NH ₄ Cl. After mixing the precipitate of the fraction containing granulocytes with a ten-fold volume of NH ₄ Cl solution, centrifuged it for 5-10 min at 400q. The procedure is repeated several times until the granulocytes are completely free of red blood cells. The cell viability is checked by trypan blue and counted in the Goryaev chamber.

Выделенные клетки доводят до рабочей концентрации 2,0-2,5•10⁶кл/мл и инкубируют с люминесцентными коньюгатами кроличьих иммуноглобинов против иммуноглобулинов человека в течение 15 мин при 37^oC. Отмывают двукратно в среде 199 и делают препараты, которые просматривают с помощью люминесцентного микроскопа ЛМ-И2 с использованием объектива •60 (водная иммерсия) и окуляра • 8.The isolated cells were brought to a working concentration of 2.0-2.5 • 10 ⁶ cells / ml and incubated with luminescent conjugates of rabbit immunoglobins against human immunoglobulins for 15 min at 37 ^o C. Wash twice in medium 199 and make preparations that are viewed with using a luminescent microscope LM-I2 using a lens • 60 (water immersion) and an eyepiece • 8.

Подсчитывают на мазке 50 нейтрофилов и среди них выделяют следующие морфологические варианты или типы свечения: ринг (ring) кольцо флюоресценции, видимое в ультрафиолетовом свете, демонстрируют равномерность распределения меченых комплексов на клеточной поверхности, пэтч (patch) нарушается равномерность свечения клеточной поверхности, образуется разрывы кольца с появлением зон с усиленным или ослабленным свечением; кэп (cap) или шапочка процесс перераспределения в плоскости мембраны заканчивается объединением мелких комплексов в массивный агрегат, который принято называть колпачком. 50 neutrophils are counted on the smear and the following morphological variants or types of luminescence are distinguished: the ring (ring) of the fluorescence ring visible in ultraviolet light, demonstrate the uniform distribution of labeled complexes on the cell surface, the patch (patch) breaks the uniformity of the glow of the cell surface, ring breaks form with the appearance of zones with enhanced or weakened glow; cap (cap) or cap, the process of redistribution in the plane of the membrane ends with the union of small complexes into a massive aggregate, which is usually called a cap.

Из перечисленных трех морфологических форм выбирают для анализа только клетки с кэпами как наиболее демонстративные по типу свечения мембраны. Of the three morphological forms listed, only cells with caps are selected for analysis as the most demonstrative type of membrane glow.

Интенсивность свечения выбранных клеток измеряют в условных единицах, показания снимаются с фотоэлектронного умножителя, установленного на микроскопе. The luminous intensity of the selected cells is measured in arbitrary units, the readings are taken from a photomultiplier tube mounted on a microscope.

Подсчитывают интенсивность свечения каждой клетки следующим образом: регистрируют показания ФУ единичной клетки и вычитают из него значение интенсивности свечения фона участка "чистого поля", расположенного рядом с этой клеткой. The luminescence intensity of each cell is calculated as follows: the FU readings of a single cell are recorded and the value of the luminescence intensity of the background of the “clean field” section located next to this cell is subtracted.

Рассчитывают среднее арифметическое значение интенсивности свечения анализируемых клеток. Забор крови у больных острым инфарктом миокарда осуществляется на 1,7,14,21 сутки от начала заболевания. В том случае, если величина рассчитываемого показателя изменяется в сторону увеличения относительно первого дня заболевания и приближается на 21 сутки течения заболевания к показателям здоровых лиц (0,015-0,020 усл.ед.) можно говорить о благоприятном течении инфаркта миокарда. Если же значения интенсивности свечения кепов не изменяются и остаются такими же как в первые сутки развития заболевания, можно ожидать осложненное течение заболевания и возрастает вероятность развития рецидива. Calculate the arithmetic mean value of the intensity of the glow of the analyzed cells. Blood sampling in patients with acute myocardial infarction is carried out on 1,7,14,21 days from the onset of the disease. In that case, if the value of the calculated indicator changes upwards relative to the first day of the disease and approaches 21 days of the course of the disease to indicators of healthy individuals (0.015-0.020 conv.ed), we can talk about a favorable course of myocardial infarction. If the values of the intensity of the luminescence of the caps are not changed and remain the same as on the first day of the development of the disease, one can expect a complicated course of the disease and the likelihood of relapse increases.

Сравнение заявляемого технического решения с прототипом позволило установить соответствие его критерию "новизна". Comparison of the claimed technical solution with the prototype made it possible to establish compliance with its criterion of "novelty."

При изучении других известных технических решений в данной области технические признаки, отличающие заявляемый способ от прототипа, не были выявлены и поэтому они обеспечивают заявляемому техническому решению соответствие критерию "существенные отличия". In the study of other known technical solutions in this field, technical features that distinguish the claimed method from the prototype were not identified and therefore they provide the claimed technical solution with the criterion of "significant differences".

По предлагаемому способу было обследовано 72 больных острым инфарктом миокарда. В этой группе у 64 больных был трансмуральный инфаркт миокарда, у 8 нетрансмуральный. Мужчин было 56 человек, женщин 16 в возрасте от 40 до 68 лет. According to the proposed method, 72 patients with acute myocardial infarction were examined. In this group, 64 patients had transmural myocardial infarction, and 8 non-transmural. There were 56 men, 16 women aged 40 to 68 years.

У 45 больных был первичный инфаркт миокарда, у остальных повторный. У 36 больных инфаркт миокарда локализовался в области передней стенки левого желудочка, у 29 в области задней стенки левого желудочка. В 76% случаев инфаркт протекал с различными осложнениями. Чаще сочетался с отеком легких, реже отмечались нарушения сердечного ритма. У женщин чаще, чем у мужчин, наблюдалось сочетание различных видов осложнений. Кардиогенный шок имел место у 16 больных. 45 patients had a primary myocardial infarction, the rest repeated. In 36 patients, myocardial infarction was localized in the region of the anterior wall of the left ventricle, in 29 in the region of the posterior wall of the left ventricle. In 76% of cases, a heart attack occurred with various complications. More often combined with pulmonary edema, less frequent heart rhythm disturbances. In women more often than in men, a combination of different types of complications was observed. Cardiogenic shock occurred in 16 patients.

Диагноз основывался на жалобах пациента, данных клинического наблюдения, характерных изменений на ЭКГ (наличие патологического зубца Q или комплекса QS) и подъема активности ферментов: креатининфосфокиназы (КФК), лактатдегидрогеназы (ЛДГ). The diagnosis was based on patient complaints, clinical observation data, characteristic ECG changes (presence of a pathological Q wave or QS complex) and elevation of enzyme activity: creatinine phosphokinase (CPK), lactate dehydrogenase (LDH).

В качестве клинических критериев осложненного течения острого инфаркта учитывались: развитие рецидива острого инфаркта миокарда, острые нарушения ритма сердца, острая левожелудочковая недостаточность с сердечной астмой или отеком легких. The clinical criteria for the complicated course of acute myocardial infarction were taken into account: the development of recurrence of acute myocardial infarction, acute cardiac arrhythmias, acute left ventricular failure with cardiac asthma or pulmonary edema.

В исследования не включали больных старше 68 лет, лиц, имеющих выраженные аллергические состояния и заболевания, сопровождающиеся высокой температурной реакцией. Летальный исход составил 13%
В результате проведенных исследований нами было получены количественные критерии, характеризующие структурную и функциональную организацию рецепторного аппарата нейтрофилов, которые позволяли разделить всех больных инфарктом миокарда на две группы с осложненным течением заболевания и без осложнений) (см. таблицу).The study did not include patients older than 68 years, persons with severe allergic conditions and diseases, accompanied by a high temperature reaction. The fatal outcome was 13%.
As a result of our studies, we obtained quantitative criteria characterizing the structural and functional organization of the receptor apparatus of neutrophils, which made it possible to divide all patients with myocardial infarction into two groups with a complicated course of the disease and without complications) (see table).

Ранее (1992) нами была изучена структурная и функциональная организация рецепторного аппарата нейтрофилов у здоровых лиц. Показатели интенсивности свечения кэпов здоровых лиц всегда были выше 0,014 усл.ед. Результаты исследований у больных острым инфарктом миокарда показали возможность использования полученных количественных критериев с целью прогноза течения инфаркта миокарда. В случае увеличения интенсивности свечения кэпов к 21 дню заболевания, можно говорить о благоприятном исходе заболевания. И, наоборот, отсутствие изменений интенсивности свечения кэпов дает возможность прогнозирования поздних рецидивов и расценивается как неблагоприятный прогностический тест. Earlier (1992), we studied the structural and functional organization of the receptor apparatus of neutrophils in healthy individuals. Indicators of the intensity of the glow of the caps of healthy individuals have always been above 0.014 srvc. The results of studies in patients with acute myocardial infarction showed the possibility of using the obtained quantitative criteria to predict the course of myocardial infarction. In the case of an increase in the intensity of the glow of the caps by the 21st day of the disease, we can talk about a favorable outcome of the disease. Conversely, the absence of changes in the intensity of the luminescence of the caps makes it possible to predict late relapses and is regarded as an unfavorable prognostic test.

Динамическое исследование уровня этих критериев приобретает важное значение, особенно в тех случаях, когда по клиническим признакам и данным ЭКГ трудно установить наличие повреждения миокарда и следить за развитием или стабилизацией некроза. Способ повышает точность диагностики инфаркта миокарда, что, в свою очередь, позволяет предупредить возможные осложнения и летальные исходы на госпитальном этапе ведения больных. A dynamic study of the level of these criteria becomes important, especially in cases where it is difficult to establish the presence of myocardial damage by clinical signs and ECG data and monitor the development or stabilization of necrosis. The method improves the accuracy of diagnosis of myocardial infarction, which, in turn, helps to prevent possible complications and deaths at the hospital stage of patient management.

Claims

A method for predicting the course of acute myocardial infarction by emitting the functional state of polymorphic nuclear blood leukocytes, characterized in that the neutrophil receptor apparatus is examined by the immunofluorescence method, in which the intensity of the luminescence of “caps” and cell membranes is determined in dynamics (1, 7, 14, 21 days) compare them with indicators of healthy individuals (0.015-0.020 conventional units) and with an increase in the luminescence of "caps" by the 21st day of illness above 0.009 conventional. units and approaching the indicators of healthy individuals, a favorable course of myocardial infarction is predicted, in the absence of changes in the glow relative to the first day, the course of the disease worsens and the possibility of relapse develops.