RU2096038C1

RU2096038C1 - Method of preparing proteoglycan aggregate from animal connective tissue (variants)

Info

Publication number: RU2096038C1
Application number: RU94015444A
Authority: RU
Inventors: С.А. Кузьмина; С.М. Бычков; И.А. Маклакова; С.Н. Багров
Original assignee: Малое государственное предприятие "Научно-экспериментальное производство" МНТК "Микрохирургия глаза"
Priority date: 1994-04-26
Filing date: 1994-04-26
Publication date: 1997-11-20

Abstract

FIELD: medicine, medicinal industry. SUBSTANCE: dialysis is carried out up to complete removing salts and soluble collagen and unaggregated proteoglycans were removed by their precipitation with citric acid. Then dialysis is carried out up to complete acid removing. The obtained solution is treated with cationite in H⁺-form to obtain acid form of proteoglycan aggregates and then - with salt form of cationite to obtain acid salt form that is treated at least twofold volume of 96.6% ethanol saturated with metal acetate in order to precipitate basic form of proteoglycan aggregates followed by washing and drying precipitate with ethanol and ether. Both forms of proteoglycan aggregates (acid - salt and basic - salt) can be lyophilized. Aggregates were obtained as solid dry form and can be used for treatment skin damages (diathesis, allergy, psoriasis and others) and cornea traumas. EFFECT: improved method of preparing. 4 cl

Description

Изобретение относится к медицине и медицинской промышленности, а именно к способам получения агрегатов протеогликанов из соединительной ткани, применяемых в качестве лекарственного средства. The invention relates to medicine and the medical industry, and in particular to methods for producing proteoglycan aggregates from connective tissue, used as a medicine.

Известен способ получения агрегатов протеогликанов из различных видов хрящевой ткани путем экстракции из измельченной ткани концентрированными растворами гуанидин гидрохлорида, магний- и кальций-хлоридов, диализа с неполным удалением солей и центрифугированием слабых солевых растворов в градиенте плотности для получения агрегатов протеогликанов только в растворенном виде (HascuLR V. C. Sajdera S.W. Y.Biol. Chem. 1969, У.244, N 9, p.2384-2396). A known method for producing proteoglycan aggregates from various types of cartilage by extraction from ground tissue with concentrated solutions of guanidine hydrochloride, magnesium and calcium chlorides, dialysis with incomplete removal of salts and centrifugation of weak salt solutions in a density gradient to obtain proteoglycan aggregates only in dissolved form (HascuLR VC Sajdera SWYBiol. Chem. 1969, U.244, No. 9, p. 2384-2396).

В предлагаемом способе в отличие от известных способов техническим результатом является то, что солевой экстракт из измельченной хрящевой ткани последовательно диализируют против дистиллированной воды. Из освобожденного от солей раствора удаляют центрифугированием осадок солерастворимого коллагена и неагрегированных протеогликанов в присутствии лимонной кислоты. Очищенный раствор замораживают, обрабатывают двукратным объемом охлажденного до (-10) и (-15)^oС этилового спирта в присутствии ацетатов металлов. Образующийся осадок агрегатов протеогликанов отделяют центрифугированием при 2-4^oС.In the proposed method, in contrast to the known methods, the technical result is that the salt extract from the crushed cartilage tissue is subsequently dialyzed against distilled water. The precipitate of salt-soluble collagen and non-aggregated proteoglycans in the presence of citric acid is removed from the salt-free solution by centrifugation. The purified solution is frozen, treated with a double volume of ethyl alcohol cooled to (-10) and (-15) ^o C in the presence of metal acetates. The resulting precipitate of proteoglycan aggregates is separated by centrifugation at 2-4 ^o C.

Техническим результатом является новый способ получения агрегатов протеогликанов в твердом сухом виде, высокой степени очистки, исключающий их денатурацию и деполимеризацию. The technical result is a new method for producing aggregates of proteoglycans in solid dry form, with a high degree of purification, excluding their denaturation and depolymerization.

Предложенный способ осуществляется следующим образом. The proposed method is as follows.

Хрящевые кольца трахеи крупного рогатого скота очищают от всех прилегающих к ним тканей и измельчают на мясорубке до размера частиц 1-3 мм, последовательно дважды обрабатывают 0,15 М раствором NaCl при 2-4^oС в течение трех часов каждый раз для удаления растворимых неагрегированных протеогликанов, далее экстрагируют агрегаты протеогликанов одним из трех растворов (2М СаСl₂; М Сl₂, 4 М гуанидин гидрохлорид) в течение 36-40 ч при 2-4^oС в массовом соотношении ткань раствор 1 15, экстракт отделяют, насыщают хлороформом, диализируют против дистиллированной воды до полного освобождения от солей, остатки коллагена и растворимых неагрегированных протеогликанов осаждают добавлением лимонной кислоты, образовавшийся осадок удаляют центрифугированием при 2-4^oС, центрифугат насыщают хлороформом и освобождают от лимонной кислоты диализом против дистиллированной воды при 2-4^oС, далее (I) раствор агрегатов протеогликанов обрабатывают кислой формой ионнообменной смолы для перевода агрегатов протеогликанов в кислую форму, затем солевой формой ионнообменной смолы, получают кисло-солевую форму целевого продукта, который осаждают этанолом, насыщенным ацетатом металла, получают основную-солевую форму агрегатов протеогликанов; (II) раствор агрегатов протеогликанов обрабатывают кислой формой ионнообменной смолы, получают кислую форму агрегатов протеогликанов, раствор обрабатывают этиловым спиртом, насыщенным ацетатом металла и получают основную-солевую форму агрегатов протеогликанов. В I варианте кисло-солевую форму агрегатов протеогликанов лиофилизируют непосредственно из раствора. В I и во II вариантах образовавшийся осадок основной-солевой формы агрегатов протеогликанов собирают центрифугированием, промывают этанолом, эфиром, окончательное высушивание осуществляют над СаСl₂ и парафином. Основную-солевую форму агрегатов протеогликанов лиофилизируют, предварительно растворив его в воде.The cartilage rings of the trachea of cattle are cleaned of all adjacent tissues and ground in a meat grinder to a particle size of 1-3 mm, sequentially treated twice with a 0.15 M NaCl solution at 2-4 ^o C for three hours each time to remove soluble non-aggregated proteoglycans, then the proteoglycan aggregates are extracted with one of three solutions (2M CaCl ₂ ; M Cl ₂ , 4 M guanidine hydrochloride) for 36-40 hours at 2-4 ^o C in a mass ratio of tissue solution 1 to 15, the extract is separated, saturated with chloroform, dialyzed against distilled water until free of salts and soluble collagen residues unaggregated proteoglycans precipitated by adding citric acid, the resulting precipitate was removed by centrifugation at 2-4 ^o C, and the pellet was saturated with chloroform freed of citric acid by dialysis against distilled water at 2-4 ^o C, then ( I) a solution of proteoglycan aggregates is treated with an acidic form of an ion-exchange resin to convert proteoglycan aggregates to an acid form, then with a salt form of an ion-exchange resin, an acid-salt form of Vågå product which was precipitated with ethanol, saturated metal acetate to give the basic-salt form aggregates of proteoglycans; (II) the solution of proteoglycan aggregates is treated with the acidic form of an ion exchange resin, the acid form of proteoglycan aggregates is obtained, the solution is treated with ethanol saturated with metal acetate and the basic salt form of proteoglycan aggregates is obtained. In the I embodiment, the acid-salt form of proteoglycan aggregates is lyophilized directly from the solution. In I and II variants, the precipitate of the basic-salt form of proteoglycan aggregates is collected by centrifugation, washed with ethanol, ether, and the final drying is carried out over CaCl ₂ and paraffin. The main-salt form of proteoglycan aggregates is lyophilized after dissolving it in water.

Идентификацию агрегатов протеогликанов осуществляют аналитическими методами по содержанию в них гексуроновых кислот (26,20% ± 1,27) (T.Bitter, H.M. Muir.Anal.Biochem. V.4,1962, p.330), аминосахара (29,40% ± 1,45) (Бычков С. М. Колесникова М.Ф. Биохимия, 1966, т.31, c.533), сульфатных групп (11,22% ± 0,45) (Бычков С. М. Фомина В.А. Т.6, 1960, с.528), белкового компонента (16,50% ± 2,30) (по Лоури). The identification of proteoglycan aggregates is carried out by analytical methods according to the content of hexuronic acids (26.20% ± 1.27) in them (T. Bitter, HM Muir.Anal.Biochem. V.4.1962, p.330), amino sugar (29.40 % ± 1.45) (Bychkov S. M. Kolesnikova M.F. Biochemistry, 1966, v.31, p. 543), sulfate groups (11.22% ± 0.45) (Bychkov S. M. Fomina V .A. T.6, 1960, p. 528), protein component (16.50% ± 2.30) (according to Lowry).

Пример 1. Хрящевые кольца трахеи крупного рогатого скота тщательно очищают от всех прилегающих к ним тканей и измельчают на мясорубке до размера частиц 1-3 мм. Измельченную ткань (25-50 г) для удаления из нее растворимых неагрегированных протеогликанов последовательно дважды каждый раз по три часа обрабатывают 0,15 М раствором NaCl при 2-4^oС в массовом соотношении ткань раствор 115. Далее раствор над тканью отделяют декантированием или центрифугированием (3000 об/мин) при 2-4^oС. Для извлечения из хряща агрегатов протеогликанов ткань обрабатывают при 2-4^oС в течение 36-40 ч 4 М гуанидин гидрохлоридом в массовом соотношении ткань раствор 1 15. Экстракт агрегатов протеогликанов отделяют от ткани центрифугированием (3000 об/мин) при 2-4^oС. Далее к отделенному центрифугированием раствору добавляют хлороформ до насыщения и раствор диализируют против дистиллированной воды до полного освобождения от соли. Из отдеализированного раствора коллаген и остатки растворимых неарегированных протеогликанов удаляют добавлением лимонной кислоты до концентрации 0,01 М, рН 4,0-5,0. Образовавшийся после добавления лимонной кислоты в растворе осадок удаляют центрифугированием при 3500-4000 об/мин в течение одного часа при 2-4^oС. Очищенный раствор агрегатов протеогликанов насыщают хлороформом и освобождают от лимонной кислоты диализом против дистиллированной воды в течение 24 ч при 2-4^oС. Далее раствор агрегатов протеогликанов обрабатывают ионнообменной смолой Н⁺-формой (рН 2,0-3,0) для перевода агрегатов протеогликанов в кислую форму. После этого раствор, содержащий кислую форму агрегатов протеогликанов, обрабатывают Na⁺-формой ионнообменной смолы, получают кисло-солевую форму целевого продукта. Целевой продукт осаждают из предварительно замороженного раствора 2-3 объемами 96,6^o этилового спирта, насыщенного ацетатом натрия, предварительно охлажденного до (-10)-(15)^oС и получают основную-солевую форму агрегатов протеогликанов. Смесь оставляют на 24-48 ч для концентрации осадка при 2-4^oС. Осадок собирают на центрифуге (3000 об/мин) при 2-4^oС, промывают один раз 80% и трижды 96,6^o этанолом, охлажденным до (-10) (-15)^oС, и три раза наркозным эфиром. Окончательное высушивание осуществляют над СаСl₂ и парафином в вакууме. Выход агрегатов протеогликанов в виде твердого сухого препарата натриевой соли составляет 8-12% сырой массы исходной ткани. При необходимости кисло-солевую форму агрегатов протеогликанов лиофилизируют непосредственно из раствора, а основную-солевую форму агрегатов протеогликанов лиофилизируют предварительно растворив в воде сухой продукт.Example 1. The cartilage rings of the trachea of cattle are thoroughly cleaned from all adjacent tissues and crushed in a meat grinder to a particle size of 1-3 mm. The crushed tissue (25-50 g) to remove soluble non-aggregated proteoglycans from it is successively treated with a 0.15 M NaCl solution at 2-4 ^° C in a weight ratio of tissue solution 115 twice every three hours. The solution is then separated over the tissue by decantation or centrifugation (3000 rpm) at 2-4 ^o C. To extract proteoglycan aggregates from the cartilage, the tissue is treated at 2-4 ^o C for 36-40 hours with 4 M guanidine hydrochloride in a weight ratio of tissue solution 1 15. The extract of proteoglycan aggregates is separated from centrifugation fabrics m (3000 rev / min) at 2-4 ^o C. Further to the separated solution by centrifugation, chloroform is added to saturation and the solution was dialyzed against distilled water until free of salt. From the separated solution, collagen and the remains of soluble unreacted proteoglycans are removed by the addition of citric acid to a concentration of 0.01 M, pH 4.0-5.0. The precipitate formed after the addition of citric acid in the solution is removed by centrifugation at 3500-4000 rpm for one hour at 2-4 ^° C. The purified proteoglycan aggregate solution is saturated with chloroform and it is freed from citric acid by dialysis against distilled water for 24 hours at 2- 4 ^o C. Next, the solution of proteoglycan aggregates is treated with an ion exchange resin H ⁺ form (pH 2.0-3.0) to convert proteoglycan aggregates into acidic form. After that, the solution containing the acid form of proteoglycan aggregates is treated with the Na ⁺ form of the ion exchange resin, and the acid-salt form of the target product is obtained. The target product is precipitated from a pre-frozen solution with 2-3 volumes of 96.6 ^o ethyl alcohol saturated with sodium acetate, pre-cooled to (-10) - (15) ^o C and get the basic salt form of proteoglycan aggregates. The mixture was left for 24-48 hours to concentrate the precipitate at 2-4 ^° C. The precipitate was collected in a centrifuge (3000 rpm) at 2-4 ^{° C.} , washed once with 80% and three times with 96.6 ^° ethanol, cooled to ( -10) (-15) ^o С, and three times with anesthetic ether. The final drying is carried out over CaCl ₂ and paraffin in vacuum. The yield of proteoglycan aggregates in the form of a solid dry preparation of sodium salt is 8-12% of the wet weight of the starting tissue. If necessary, the acid-salt form of proteoglycan aggregates is lyophilized directly from the solution, and the basic-salt form of proteoglycan aggregates is lyophilized before dissolving the dry product in water.

Пример 2. Хрящевые кольца трахеи рогатого скота тщательно очищают от всех прилегающих к ним тканей и измельчают на мясорубке до размера частиц 1-3 мм. Измельченную ткань (25-30 г) для удаления из нее растворимых неагрегированных протеогликанов последовательно дважды каждый раз по три часа обрабатывают 0,15 М раствором NaCl при 2-4^oС в массовом соотношении ткань раствор 1 15. Далее раствор над тканью отделяют декантированием или центрифугированием (3000 об/мин) при 2-4^oС. Для извлечения из хряща агрегатов протеогликанов ткань обрабатывают при 2-4^oС в течение 36-40 ч 2 М СаСl₂ в массовом соотношении ткань раствор 1 15. Экстракт агрегатов протеогликанов отделяют от ткани центрифугированием (3000 об/мин) при 2-4^oС. Далее к отделенному центрифугированием раствору добавляют хлороформ до насыщения и раствор диализируют против дистиллированной воды до полного освобождения от соли. Из отдиализированного раствора коллаген и остатки растворимых неагрегированных протеогликанов удаляют добавлением лимонной кислоты до концентрации 0,01 М, рН 4,0-5,0. Образовавшийся после добавления лимонной кислоты в растворе осадок удаляют центрифугированием при 3500-4000 об/мин в течение одного часа при 2-4^oС. Очищенный раствор агрегатов протеогликанов насыщают хлороформом и освобождают от лимонной кислоты диализом против дистиллированной воды в течение 24 ч при температуре 2-4^oС. Далее раствор агрегатов протеогликанов обрабатывают ионнообменной смолой Н⁺-формой (рН 2,0-3,0) для перевода агрегатов протеогликанов в кислую форму. Целевой продукт осаждают из предварительно замороженного раствора агрегатов протеогликанов 2-3 объемами 96,6^o этилового спирта, насыщенного ацетатом калия, предварительно охлажденного до (-10)-(-15)^oС, и получают основную-солевую форму агрегатов протеогликанов. Смесь оставляют на 24-48 ч для концентрации осадка при 2-4^oС. Остаток собирают на центрифуге (3000 об/мин) при 2-4^oС, промывают один раз 80% и трижды 96,6^o, охлажденным до (-10)-(-15)^oС этанолом и три раза наркозным эфиром. Окончательное высушивание осуществляют над СаСl₂ и парафином в вакууме. При необходимости основную-солевую форму лиофилизируют из предварительно растворенного в воде сухого целевого продукта.Example 2. Cartilage rings of the trachea of cattle are thoroughly cleaned of all adjacent tissues and crushed in a meat grinder to a particle size of 1-3 mm. The crushed tissue (25-30 g) to remove soluble non-aggregated proteoglycans from it is successively treated with a 0.15 M NaCl solution at 2-4 ^° C in a mass ratio of tissue solution 1 to 15 twice every three hours. Next, the solution is separated over the tissue by decantation or by centrifugation (3000 rpm) at 2-4 ^o C. To extract proteoglycan aggregates from the cartilage, the tissue is treated at 2-4 ^o C for 36-40 hours with 2 M CaCl ₂ in a mass ratio of tissue solution 1 15. The extract of proteoglycan aggregates is separated from tissue by centrifugation (3000 rpm) at 2-4 ^o C. Then, chloroform is added to the solution separated by centrifugation until saturation, and the solution is dialyzed against distilled water until completely free of salt. From the dialyzed solution, collagen and residues of soluble non-aggregated proteoglycans are removed by the addition of citric acid to a concentration of 0.01 M, pH 4.0-5.0. The precipitate formed after adding citric acid in the solution is removed by centrifugation at 3500-4000 rpm for one hour at 2-4 ^o C. The purified solution of proteoglycan aggregates is saturated with chloroform and freed from citric acid by dialysis against distilled water for 24 hours at a temperature of 2 -4 ^o C. Next, the solution of proteoglycan aggregates is treated with an ion exchange resin H ⁺ -form (pH 2.0-3.0) to convert proteoglycan aggregates into acidic form. The target product is precipitated from a pre-frozen solution of proteoglycan aggregates with 2-3 volumes of 96.6 ^° ethanol saturated with potassium acetate, pre-cooled to (-10) - (-15) ^° C, and the basic salt form of proteoglycan aggregates is obtained. The mixture is left for 24-48 hours for a precipitate concentration at 2-4 ^° C. The residue is collected in a centrifuge (3000 rpm) at 2-4 ^{° C.} , washed once with 80% and three times with 96.6 ^° , cooled to (- 10) - (- 15) ^o With ethanol and three times anesthetic ether. The final drying is carried out over CaCl ₂ and paraffin in vacuum. If necessary, the basic salt form is lyophilized from the dry target product previously dissolved in water.

Выход агрегатов протеогликанов в виде твердого сухого продукта составляет 8-12% сырой массы исходной ткани. The yield of proteoglycan aggregates in the form of a solid dry product is 8-12% of the wet weight of the starting tissue.

Данный способ позволяет получать агрегаты протеогликанов в твердом сухом виде и использовать их в составе лекарственных препаратов, применяемых для лечения заболеваний кожи (диатез, аллергия, псориаз и др.) и травм роговицы. This method allows to obtain aggregates of proteoglycans in solid dry form and use them as part of drugs used to treat skin diseases (diathesis, allergies, psoriasis, etc.) and corneal injuries.

Claims

1. The method of obtaining aggregates of proteoglycans from the connective tissue of an animal by grinding the tissue, extraction with a concentrated salt solution, dialysis of the extract, removal of soluble collagen followed by purification of the target product, characterized in that the dialysis is carried out until the salts are completely removed, citric acid is added to the dialysate to simultaneously remove soluble collagen and non-aggregated proteoglycans, re-dialysis, first treated with an acidic form of an ion-exchange resin, then saline my ion exchange resin, an acidic salt prepared form the desired product which is then treated with ethyl alcohol saturated with metal acetate to give the basic salt form aggregates of proteoglycans.

2. The method according to claim 1, characterized in that the acid-salt and basic salt forms of proteoglycan aggregates are lyophilized.

3. A method of obtaining aggregates of proteoglycans from the connective tissue of an animal by grinding the tissue, extraction with a concentrated salt solution, dialysis of the extract, removal of soluble collagen followed by purification of the target product, characterized in that the dialysis is carried out until the salts are completely removed, citric acid is added to the dialysate to simultaneously removal of soluble collagen and non-aggregated proteoglycans, repeat dialysis, the dialysate is treated with the acid form of an ion-exchange resin, a solution is obtained containing aschy acid form aggregates of proteoglycans, and the solution was treated with ethyl alcohol saturated with metal acetate to yield a basic salt form aggregates of proteoglycans.

4. The method according to claim 3, characterized in that the basic salt form is lyophilized.