RU2094117C1

RU2094117C1 - Sorbent and method for its production

Info

Publication number: RU2094117C1
Application number: RU96113900A
Authority: RU
Inventors: В.А. Постников; В.И. Сергиенко; Н.Н. Якушенкова; С.С. Маркин
Original assignee: Акционерное общество закрытого типа "Фосфосорб"
Priority date: 1996-07-23
Filing date: 1996-07-23
Publication date: 1997-10-27

Abstract

FIELD: methods for production of affine sorbents. SUBSTANCE: sorbent represents polyvinyl alcohol which is cross-linked by grutaric aldehyde and which is immobilized by aminophenyl boric acid at pH 7.4 ± 0.5 till content of bound boron is 0.37-0.45 mass %. Conditions for production of said sorbent are proposed here. EFFECT: improved quality of desired product, improved efficiency. 6 cl

Description

Изобретение относится к области химии, в частности к способам получения аффинных сорбентов и их использованию в хроматографии. The invention relates to the field of chemistry, in particular to methods for producing affinity sorbents and their use in chromatography.

Известен способ получения носителя для хроматографии на основе поливинилового спирта, путем окисления последнего перйодатом натрия, выдержки при pH 1, t= 37^oC в течение 48 ч до получения геля в форме блока с последующей его гомогенизацией и обработкой при pH 1, t=37^oC в течение 48 ч 5%-ным раствором глутарового альдегида (авт. св. СССР N 1789532, 1993).A known method of obtaining a carrier for chromatography based on polyvinyl alcohol, by oxidation of the latter with sodium periodate, exposure at pH 1, t = 37 ^o C for 48 hours to obtain a gel in the form of a block with subsequent homogenization and processing at pH 1, t = 37 ^o C for 48 hours with a 5% solution of glutaraldehyde (ed. St. USSR N 1789532, 1993).

Недостатком известного способа является его двухстадийность и невысокая степень сшивки полученного носителя. The disadvantage of this method is its two-stage and a low degree of crosslinking of the resulting carrier.

Известен способ получения сорбентов для иммобилизации ферментов путем сшивания поливинилового спирта глутаровым диальдегидом с последующей модификацией полученного геля этилендиамином (Журнал "Биоорганическая химия", т. 5, N 5, 1979). Известен также способ получения сорбента для иммобилизации ферментов путем сшивания поливинилового спирта глутаровым диальдегидом с одновременным введением комплексообразующих остатков триэтилентетрамина (Журнал "Биоорганическая химия", том 7, N 1, 1981)
Однако полученные сорбенты не эффективны для определения гликозилированного гемоглобина.A known method of producing sorbents for immobilizing enzymes by crosslinking polyvinyl alcohol with glutaraldehyde followed by modification of the obtained gel with ethylene diamine (Journal of Bioorganic Chemistry, v. 5, No. 5, 1979). There is also a method of producing a sorbent for immobilizing enzymes by crosslinking polyvinyl alcohol with glutaraldehyde with the simultaneous introduction of complexing residues of triethylenetetramine (Journal of Bioorganic Chemistry, Volume 7, N 1, 1981)
However, the obtained sorbents are not effective for determining glycosylated hemoglobin.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является сорбент на основе поливинилового спирта, стабилизированного глутаровым альдегидом с иммобилизованной аминофенилборной кислотой при содержании бора 0,05 0,12 мас. и используемый для определения гликозилированного гемоглобина. Известен также способ его получения, заключающийся в окислении поливинилового спирта перйодатом натрия, добавлении соляной кислоты до pH 1, выдержки в течение 48 ч, стабилизации равным объемом 5% раствора глутарового альдегида, отмывки водой, затем карбонатным буфером, иммобилизации полученного носителя аминофенилборной кислотой в растворе карбонатного буфера с pH 9,0-9,5, добавления β-аланина, выдержки, добавления порошка боргидрида натрия, промывки вначале кислым (pH 4), затем щелочными (pH 8) растворами. После отделения сорбента его рекомендовано заливать 50%-ным глицерином и хранить при t= -20^oC. (Гарипова М.И. Автореферат диссертации на соискание степени кандидата биохим. наук "Разработка носителя для аффинной хроматографии и создание сорбента для очистки интерферона", М. 1994 г. с. 10-17).The closest in technical essence and the achieved result is a sorbent based on polyvinyl alcohol stabilized with glutaraldehyde with immobilized aminophenylboronic acid at a boron content of 0.05 0.12 wt. and used to determine glycosylated hemoglobin. There is also known a method for its preparation, which consists in oxidizing polyvinyl alcohol with sodium periodate, adding hydrochloric acid to pH 1, holding for 48 hours, stabilizing with an equal volume of 5% glutaraldehyde solution, washing with water, then with a carbonate buffer, immobilizing the resulting support with aminophenylboronic acid in solution carbonate buffer with a pH of 9.0-9.5, addition of β-alanine, aging, addition of sodium borohydride powder, washing first with acidic (pH 4), then alkaline (pH 8) solutions. After separation of the sorbent, it is recommended to fill it with 50% glycerol and store at t = -20 ^o C. (Garipova M.I. M. 1994, p. 10-17).

Недостатками известного технического решения являются двухстадийность получения носителя, а также малый процент бора в полученном сорбенте, что дает невысокую степень разделения при хроматографии. The disadvantages of the known technical solutions are the two-stage preparation of the carrier, as well as a small percentage of boron in the resulting sorbent, which gives a low degree of separation during chromatography.

Задачей изобретения является разработка сорбента на основе поливинилового спирта, сшитого глутаровым альдегидом с иммобилизованной аминофенилборной кислотой, характеризующегося высокой разделительной способностью, в частности при хроматографическом выделении гликозилированного гемоглобина, а также разработка простого и надежного способа его получения. The objective of the invention is the development of a sorbent based on polyvinyl alcohol crosslinked with glutaraldehyde with immobilized aminophenylboronic acid, characterized by high separation ability, in particular during chromatographic isolation of glycosylated hemoglobin, as well as the development of a simple and reliable method for its preparation.

Поставленная задача решается описываемым сорбентом на основе поливинилового спирта, стабилизированного глутаровым альдегидом с иммобилизиванной аминофенилборной кислотой при pH 7,4±0,5 до содержания связанного бора 0,37-0,45 мас. и используемого для определения гликозилированного гемоглобина. The problem is solved by the described sorbent based on polyvinyl alcohol stabilized with glutaraldehyde with immobilized aminophenylboronic acid at a pH of 7.4 ± 0.5 to a content of bound boron of 0.37-0.45 wt. and used to determine glycosylated hemoglobin.

Поставленная задача решается также описываемым способом получения сорбента, включающим смешение 8-12% раствора поливинилового спирта с 24-26% водным раствором глутарового диальдегида при их объемном соотношении (4,5-5,5): 1, добавление концентрированной соляной кислоты до pH 1,0±0,1, вызревание геля, промывку, обработку полученного носителя раствором аминофенилборной кислоты в фосфатном буфере pH 7,4±0,5, выдержку, предпочтительно, в течение 10-14 ч, добавление боргидрида натрия, преимущественно, в течение 4 ч в два приема равными порциями, промывку водой, добавление хлоридратгидроксиламина, выдержку в нем, предпочтительно, в течение 10-14 ч и отделение сорбента. Процесс проводят до получения сорбента, содержащего 0,37-0,45 мас. B. The problem is also solved by the described method of producing the sorbent, including mixing an 8-12% solution of polyvinyl alcohol with a 24-26% aqueous solution of glutaraldehyde at a volume ratio of 4.5-5.5: 1, adding concentrated hydrochloric acid to pH 1 , 0 ± 0.1, gel aging, washing, treatment of the obtained carrier with a solution of aminophenylboronic acid in phosphate buffer pH 7.4 ± 0.5, holding, preferably for 10-14 hours, adding sodium borohydride, mainly for 4 h in two doses in equal portions, rinsing with water, the addition of chlorohydroxylamine, soaking in it, preferably for 10-14 hours, and separating the sorbent. The process is carried out to obtain a sorbent containing 0.37-0.45 wt. B.

Сущность процесса заключается в том, что в результате сшивки поливинилового спирта

с глутаровым альдегидом CHO (CH₂)₃ CHO получают следующую структуру фрагмента матрицы носителя:

После этого на носитель иммобилируют аминофентилборную кислоту. Происходит связывание по -CHO-группам с последующим восстановлением боргидрида Na:

При заявленных условиях получают сорбент, содержащий 0,37-0,45 мас. позволяющий обеспечить высокую разделительную способность при определении гликозилированного гемоглобина. Сорбент обладает высокой стабильностью, на одной пробе достоверно воспроизводится до 20 анализов капиллярной крови человека.The essence of the process is that as a result of crosslinking of polyvinyl alcohol

with glutaraldehyde CHO (CH ₂ ) ₃ CHO, the following structure of a support matrix fragment is obtained:

After that, aminopentylboronic acid is immobilized onto the carrier. Binding by -CHO groups occurs, followed by reduction of Na borohydride:

Under the stated conditions, a sorbent is obtained containing 0.37-0.45 wt. allowing to provide high separation ability in the determination of glycosylated hemoglobin. The sorbent is highly stable; up to 20 analyzes of human capillary blood are reliably reproduced in one sample.

Пример 1 (осуществление способа)
Сырье:
отечественный поливиниловый спирт (ПВС) с м.в.20 000 D (по вязкости). Степень дезацетилирования около 80%
25% водный p-p глутарового диальдегида (ГА).Example 1 (implementation of the method)
Raw Material:
domestic polyvinyl alcohol (PVA) with mv 20 000 D (viscosity). Deacetylation degree about 80%
25% aqueous pp of glutaraldehyde (HA).

Реагенты использовали без предварительной очистки. Reagents were used without preliminary purification.

Синтез матрицы. The synthesis of the matrix.

50 г ПВС растворяют в 5000 мл воды при 80^oC в течение 2 ч. Раствор охлаждают до комнатной температуры и добавляют 100 мл р-ра 25% ГА. Смесь перемешивают 30 мин, и медленным добавлением по каплям конц. HCl при перемешивании доводят pH до 1. С началом гелеобразования перемешивание прекращают. Блок геля инкубируют ночь при комнатной температуре. Блок геля измельчают механически, проливают через сито, промывают водой, отмучивают мелкую фракцию и хранят в набухшем состоянии в воде.50 g of PVA are dissolved in 5000 ml of water at 80 ^° C. for 2 hours. The solution is cooled to room temperature and 100 ml of a solution of 25% HA is added. The mixture was stirred for 30 minutes, and slowly adding dropwise conc. The HCl is adjusted to pH 1 with stirring. With the start of gelation, stirring is stopped. The gel block is incubated overnight at room temperature. The gel block is crushed mechanically, poured through a sieve, washed with water, the fine fraction is elutriated and stored in a swollen state in water.

Модификация аминофенилборной кислотой. Modification by aminophenylboronic acid.

91 мл сорбента + 150 мл 0.1 М фосфатного буфера pH 7.4, содержащего 3.7 г аминофенилборной кислоты, выдерживают 12 ч, добавляют 1.13 г x 2NaBH в течение 4 ч в два приема, отфильтровывают, промывают водой, заливают 0.1 М раствором хлоридрата гидроксиламина и выдерживают 12 ч. Отделяют сорбент, промывают водой и заливают физиологическим раствором. 91 ml of sorbent + 150 ml of 0.1 M phosphate buffer pH 7.4 containing 3.7 g of aminophenylboronic acid is held for 12 hours, 1.13 g x 2NaBH is added over 4 hours in two doses, filtered off, washed with water, filled with 0.1 M hydroxylamine chloride solution and kept for 12 hours Separate the sorbent, washed with water and fill with saline.

Содержание B 0.37-0.45%
Пример 2 (использование полученного сорбента).Content B 0.37-0.45%
Example 2 (use of the obtained sorbent).

Сорбент, полученный по примеру 1, был использован в аффинной хроматографии для определения гликозилированного гемоглобина в капиллярной крови человека. The sorbent obtained in example 1 was used in affinity chromatography to determine glycosylated hemoglobin in human capillary blood.

В колонку, снабженную фильтром, загружают 1 мл полученного сорбента и уравновешивают 5 мл ацетатного буфера, вводят 20 мл стандартной пробы, содержащей 17.2% GHb и 12.7% HbA₁C, промывают 15 мл ацетатного буфера и определяют оптическую плотность раствора при 405 нм (фракция Ghb). Затем вводят 5 мл раствора сорбитола, собирают элюат и определяют оптическую плотность при 405 нм (фракция HbA₁C). По поглощению растворов при 405 нм определяют содержание GHb и HdA_cC, которая при пересчете оказалась равной начальной концентрации в стандартном исходном растворе. Колонку далее регенерируют 10 мл 1% уксусной кислоты и 10 мл H₂O, и она вновь готова к работе.In a column equipped with a filter, 1 ml of the obtained sorbent is loaded and 5 ml of acetate buffer are equilibrated, 20 ml of a standard sample containing 17.2% GHb and 12.7% HbA ₁ C are introduced, washed with 15 ml of acetate buffer and the optical density of the solution is determined at 405 nm (fraction Ghb). Then 5 ml of a solution of sorbitol are introduced, the eluate is collected and the absorbance is determined at 405 nm (HbA ₁ C fraction). The absorption of solutions at 405 nm determines the content of GHb and HdA _c C, which, when converted, turned out to be equal to the initial concentration in the standard initial solution. The column is then regenerated with 10 ml of 1% acetic acid and 10 ml of H ₂ O, and it is ready for use again.

На одной колонке проведено 20 определений. Получены воспроизводимые результаты с отклонениями + 5%
Таким образом, предложенный сорбент обладает высокой емкостью и стабильностью. Сорбент может быть с высокой степенью достоверности многократно использован для определения гликозилированного гемоглобина в капиллярной крови человека.On one column, 20 determinations were made. Reproducible results obtained with deviations of + 5%
Thus, the proposed sorbent has a high capacity and stability. The sorbent can be used with a high degree of reliability for the determination of glycosylated hemoglobin in human capillary blood.

Claims

1. Sorbent based on polyvinyl alcohol stabilized with glutaraldehyde with immobilized aminophenylboronic acid for the determination of glycosylated hemoglobin, characterized in that it is immobilized with aminophenylboronic acid at a pH of 7.4 ± 0.5, to the content of bound boron of 0.37 0.45 wt.

2. A method of producing a sorbent for the determination of glycosylated hemoglobin, including stabilization of polyvinyl alcohol with an aqueous solution of glutaraldehyde, gel aging, washing, treatment of the obtained carrier with aminophenylboronic acid, aging, adding sodium borohydride and separating the sorbent, characterized in that stabilization is first carried out by mixing 8 12% solution of polyvinyl alcohol with 24 26% solution of glutaraldehyde at a volume ratio of (4.5 5.5) 1, after which concentrated salt is added acid to a pH of 1.0 ± 0.1, the treatment with aminophenylboronic acid is carried out in a solution of phosphate buffer with a pH of 7.4 ± 0.5, the washing is carried out with water, then a solution of hydrochloride hydroxylamine is added and the sorbent is maintained, while the process lead to the content of bound boron in the sorbent 0.37 0.45 wt.

3. The method according to claim 2, characterized in that after processing the carrier with aminophenylboronic acid, the exposure is carried out for 10 to 14 hours

4. The method according to p. 2, characterized in that the addition of sodium borohydride is carried out for 4 hours in two doses in equal portions.

5. The method according to claim 2, characterized in that after adding a solution of hydrochloride hydroxylamine, the sorbent is incubated for 10 to 14 hours