Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, а именно к способам получения нуклеиновых кислот и может быть использовано в пищевой, химической и медицинской промышленностях. The invention relates to microbiology and biotechnology, and in particular to methods for producing nucleic acids and can be used in the food, chemical and medical industries.
Известен способ извлечения нуклеиновых кислот из водородокислящих бактерий типа Alcaligenes eutrophus Z-1, заключающийся в том, что суспензию клеток бактерий Alcaligenes eutrophus Z-1 обрабатывают смесью бензилового или изобутилового спирта (20-30:5-30% по объему), или бензилового спирта и хлороформа (30-40: 10-20% по объему), перемешивают, оставляют при комнатной температуре на 40 мин 4 ч, затем разбавляют в 3-10 раз 5% раствором NaCl и 0,4% Na-цитратом, центрифугируют и нуклеиновые кислоты из супернатанта осаждают этанолом [1]
Данный способ отличается простотой, но не обеспечивает комплексного использования сырья, так как бактерии после обработки в значительной степени загрязнены органическими веществами, что делает невозможным их дальнейшее использование. Вторым недостатком данного способа является то, что конечным продуктом является смесь нуклеиновых кислот, для разделения которых необходимы дополнительные затраты.A known method of extracting nucleic acids from hydrogen-oxidizing bacteria such as Alcaligenes eutrophus Z-1, which consists in the fact that the suspension of bacterial cells Alcaligenes eutrophus Z-1 is treated with a mixture of benzyl or isobutyl alcohol (20-30: 5-30% by volume), or benzyl alcohol and chloroform (30-40: 10-20% by volume), stirred, left at room temperature for 40 minutes 4 hours, then diluted 3-10 times with 5% NaCl solution and 0.4% Na-citrate, centrifuged and nucleic acids from the supernatant precipitated with ethanol [1]
This method is simple, but does not provide a comprehensive use of raw materials, since the bacteria after processing are largely contaminated with organic substances, which makes their further use impossible. The second disadvantage of this method is that the final product is a mixture of nucleic acids, for the separation of which additional costs are required.
Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа получения нуклеиновых кислот без применения органических веществ из бактериальной биомассы, позволяющего получить чистую рибонуклеиновую кислоту (РНК) и смесь дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) и РНК. The objective of the invention is to develop a method for producing nucleic acids without the use of organic substances from bacterial biomass, which allows to obtain pure ribonucleic acid (RNA) and a mixture of deoxyribonucleic acid (DNA) and RNA.
Поставленная задача решается тем, что в способе получения нуклеиновых кислот из бактерий в качестве бактерий используют биомассу нативных клеток метанутилизирующих бактерий Methylococcus capsulatus, и процесс экстракции нуклеиновых кислот проводят водно-щелочным или водно-солевым растворами последовательно, на первой стадии отделяют РНК при pH не выше 7,5 и t=85-90oC, на второй стадии отделяют смесь РНК и ДНК при pH=8,6-9,0 и t=85-90oC, с разделением ее известными способами.The problem is solved in that in the method for producing nucleic acids from bacteria, the biomass of native cells of methanutilizing bacteria Methylococcus capsulatus is used as bacteria, and the process of nucleic acid extraction is carried out sequentially with aqueous-alkaline or aqueous-salt solutions, at the first stage, RNA is separated at pH not higher than 7.5 and t = 85-90 o C, in the second stage a mixture of RNA and DNA is separated at pH = 8.6-9.0 and t = 85-90 o C, with its separation by known methods.
Для проведения первой стадии готовят водно-щелочную суспензию бактериальной биомассы с содержанием сухих веществ (СВ) 5% и pH7,5 (pH суспензии доводят аммиачной водой) или водно-солевую суспензию аммонийной соли ортофосфорной кислоты с концентрацией фосфата 1,5-1,75 моль/л и pH7,5, суспензию прогревают при t= 85-90oC в течение 1 ч, отделяют экстракт РНК от биомассы центрифугированием (10 мин, 6000 об/мин). Из полученного экстракта выделяют препарат РНК известными способами с содержанием основного вещества > 80%
На второй стадии отделяют смесь ДНК и РНК из полученной после центрифугирования биомассы, для чего полученный осадок биомассы разводят водно-щелочным или водно-солевым растворами с pH8,6-9,0 и прогревают суспензию при 85-90oC в течение 2 ч. Денуклеинизированную биомассу отделяют от экстракта центрифугированием (10 мин, 6000 об/мин). Из экстракта известными способами выделяют очищенную смесь ДНК и РНК с содержанием ДНК>50% и РНК>30%
Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1.For the first stage, an aqueous-alkaline suspension of bacterial biomass with a solids content of 5% and pH7.5 is prepared (pH of the suspension is adjusted with ammonia water) or an aqueous-salt suspension of ammonium salt of orthophosphoric acid with a phosphate concentration of 1.5-1.75 mol / L and pH7.5, the suspension is heated at t = 85-90 o C for 1 h, RNA extract is separated from the biomass by centrifugation (10 min, 6000 rpm). From the obtained extract, an RNA preparation is isolated by known methods with a basic substance content> 80%
In the second stage, a mixture of DNA and RNA is separated from the biomass obtained by centrifugation, for which the resulting biomass sediment is diluted with aqueous-alkaline or water-salt solutions with a pH of 8.6-9.0 and the suspension is heated at 85-90 ° C for 2 hours. Denucleinated biomass is separated from the extract by centrifugation (10 min, 6000 rpm). A purified mixture of DNA and RNA with a DNA content of> 50% and RNA> 30% is isolated from the extract by known methods.
The invention is illustrated by the following examples:
Example 1
К 2040 г биомассы метанутилизирующих бактерий Methylococcus capsulatus с содержанием СВ 10% и содержанием нуклеиновых кислот 8,7% в пересчете на сухое вещество, в том числе РНК 7,3% и ДНК 1,2% приливают 3000 мл водно-солевого раствора аммонийной соли ортофосфорной кислоты с содержанием фосфата 3,3 моль/л и pH7,5, перемешивают. Полученную суспензию прогревают до 90oC, выдерживают при этой температуре, умеренно перемешивая, в течение 1 ч. По окончании процесса экстракции суспензию охлаждают до комнатной температуры и удаляют бактериальную биомассу центрифугированием. Получают 3865 мл экстракта с содержанием нуклеиновых кислот 2,5 г/л и 1267 г сгущенной биомассы бактерий. Из полученного экстракта известными способами получают 3,82 г препарата РНК со следующими характеристиками: сод.суммарных НК 80% ДНК - 1,03% белка 4,2% влаги 10%
Выход РНК от суммарного содержания НК в клетках составляет 21%
К 1267 г полученного водно-солевого осадка бактериальной биомассы добавляют 3400 мл раствора аммонийной соли ортофосфорной кислоты с содержанием фосфата 1,75 моль/л и pH 8,6, перемешивают. Полученную водно-солевую суспензию прогревают до 90oC и выдерживают при этой температуре и умеренном перемешивании в течение 2 ч. После окончания процесса суспензию охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют. Получают 3350 мл водно-солевого экстракта с содержанием НК 1,3 г/л. Из полученного экстракта известными способами выделяют 400 мг ДНК-концентрата со следующими характеристиками: сод. суммарных НК 80% ДНК 50% белка 4,5% влаги 10%
Выход ДНК-концентрата от суммарного содержания НК в клетках составляет 1,5%
Пример 2
К 3140 г биомассы метанутилизирующих бактерий Methylococcus capsulatus с содержанием СВ 20% и содержанием нуклеиновых кислот пересчете на сухое вещество 8,5% в том числе РНК 7,2% и ДНК 1,3% приливают 5020 мл дистиллированной воды и перемешивают. Полученную суспензию титруют аммиачной водой до pH 7,5, нагревают до 90oC, выдерживают при этой температуре и умеренном перемешивании в течение 1 ч. По окончании процесса экстракции суспензию охлаждают до комнатной температуры и удаляют бактериальную биомассу центрифугированием. Получают 4750 мл экстракта с содержанием НК 2,2 г/л и 3400 г сгущенной биомассы бактерий. Из полученного экстракта известными способами получают 3 г очищенного препарата РНК со следующими характеристиками: сод.суммарных НК 80% ДНК 3,5% белка 2,07% влаги 10%
Выход РНК от суммарного содержания НК в клетках составляет 11,5%
К 3400 г полученного осадка бактериальной биомассы с содержанием СВ 20% добавляют 9900 мл дистиллированной воды и перемешивают. Полученную суспензию титруют аммиачной водой до pH 9,0, нагревают до 85oC и при перемешивании выдерживают данную суспензию 2 ч. После окончания процесса суспензию охлаждают до комнатной температуры и центрифугируют. Получают 9820 мл экстракта с концентрацией НК 1,3 г/л. Из полученного экстракта известными способами выделяют 340 мг ДНК концентрата со следующими характеристиками: содержание суммарных НК 80% ДНК 50% белка 4,8% влаги 10%
Выход ДНК-концентрата от суммарного содержания НК в клетках составляет 1%
Как видно из приведенных примеров, описанный выше способ получения НК из бактерий Methylococcus capsulatus позволяет получить очищенный препарат РНК с содержанием основного вещества более 80% примесью ДНК не выше 5 и белка - не выше 5 и ДНК-концентрат с содержанием ДНК более 50 и примесью РНК не выше 30 белка не выше 5% Данный способ исключает применение органических веществ на стадии экстракции как РНК, так и ДНК, что исключает загрязнение биомассы нежелательными примесями и позволяет использовать ее в дальнейшей переработке.By 2040 g of biomass of methanutilizing bacteria Methylococcus capsulatus with a content of 10% and a nucleic acid content of 8.7% in terms of dry matter, including 7.3% RNA and 1.2% DNA, 3,000 ml of aqueous saline solution of ammonium salt are added phosphoric acid with a phosphate content of 3.3 mol / l and a pH of 7.5, mix. The resulting suspension is heated to 90 o C, maintained at this temperature, moderately stirring, for 1 hour. At the end of the extraction process, the suspension is cooled to room temperature and the bacterial biomass is removed by centrifugation. Get 3865 ml of the extract with a nucleic acid content of 2.5 g / l and 1267 g of condensed bacterial biomass. 3.82 g of RNA preparation with the following characteristics are obtained from the obtained extract by known methods: soda total total NK 80% DNA - 1.03% protein 4.2% moisture 10%
The output of RNA from the total content of NK in the cells is 21%
To 1267 g of the obtained water-salt precipitate of bacterial biomass, 3400 ml of a solution of ammonium salt of phosphoric acid with a phosphate content of 1.75 mol / l and a pH of 8.6 are added, stirred. The resulting water-salt suspension is heated to 90 ° C. and maintained at this temperature with moderate stirring for 2 hours. After the end of the process, the suspension is cooled to room temperature and centrifuged. Obtain 3350 ml of water-salt extract with a NK content of 1.3 g / L. From the obtained extract by known methods, 400 mg of DNA concentrate with the following characteristics are isolated: soda. total NK 80% DNA 50% protein 4.5% moisture 10%
The yield of DNA concentrate from the total NK content in the cells is 1.5%
Example 2
To 3140 g of biomass of methanutilizing bacteria Methylococcus capsulatus with a content of CB of 20% and a content of nucleic acids in terms of dry matter of 8.5%, including RNA of 7.2% and DNA of 1.3%, are added 5020 ml of distilled water and mixed. The resulting suspension is titrated with ammonia water to a pH of 7.5, heated to 90 ° C, maintained at this temperature and moderate stirring for 1 hour. At the end of the extraction process, the suspension is cooled to room temperature and the bacterial biomass is removed by centrifugation. Obtain 4750 ml of extract with a content of NK 2.2 g / l and 3400 g of condensed biomass of bacteria. From the obtained extract by known methods, 3 g of purified RNA preparation is obtained with the following characteristics: total total NK 80% DNA 3.5% protein 2.07% moisture 10%
The output of RNA from the total content of NK in the cells is 11.5%
To 3400 g of the obtained bacterial biomass sediment with a content of CB of 20%, 9900 ml of distilled water is added and mixed. The resulting suspension is titrated with ammonia water to a pH of 9.0, heated to 85 ° C. and the suspension is kept under stirring for 2 hours. After the process is complete, the suspension is cooled to room temperature and centrifuged. Receive 9820 ml of an extract with a concentration of NK of 1.3 g / L. From the obtained extract by known methods, 340 mg of DNA concentrate is isolated with the following characteristics: total NK content of 80% DNA 50% protein 4.8% moisture 10%
The yield of DNA concentrate from the total content of NK in the cells is 1%
As can be seen from the above examples, the method described above for producing NK from Methylococcus capsulatus bacteria allows one to obtain a purified RNA preparation with a basic substance content of more than 80% DNA impurity not higher than 5 and protein not higher than 5 and a DNA concentrate with DNA content greater than 50 and RNA impurity no higher than 30 protein no higher than 5% This method eliminates the use of organic substances at the stage of extraction of both RNA and DNA, which eliminates contamination of biomass with undesirable impurities and allows its use in further processing.