RU2742054C1

RU2742054C1 - Method of producing sodium nucleinate from biomass of chlorella vulgaris beijerink microalgae

Info

Publication number: RU2742054C1
Application number: RU2020100823A
Authority: RU
Inventors: Богдан Олегович Роик; Михаил Михайлович Наумов; Вячеслав Анатольевич Лукьянов; Николай Михайлович Наумов
Priority date: 2020-01-09
Filing date: 2020-01-09
Publication date: 2021-02-02

Abstract

FIELD: biotechnology.

SUBSTANCE: invention relates to biotechnology and biochemistry, particularly to methods of producing biologically active substances based on nucleic acids, specifically to production of a sodium salt of DNA recovered from Chlorella vulgaris microalgae. Method of producing sodium nucleinate from microalga comprises mechanical lysing of cell membrane of microalgae, purification of biomaterial from lipids, pigment complex, polysaccharides, proteins, and so forth, hydrolysis in citrate-salt solution, disposal of cell slime and denatured proteins, precipitation of nucleic acids in form of sodium salts with ethanol, isopropanol or acetone, centrifugation, washing of the residue with ethyl alcohol, drying.

EFFECT: obtained product can be used as an immune stimulator in treating animals, as well as use in chemical-pharmaceutical, veterinary and food industry for producing preparations and products based on nucleic acids.

1 cl, 1 ex

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и биохимии, в частности к способам получения биологически активных веществ на основе нуклеиновых кислот, а именно к получению натриевой соли ДНК, выделенной из микроводоросли Chlorella vulgaris, которая может быть использована в качестве иммуностимулятора на основе нуклеиновых кислот для ветеринарного использования при лечении животных, а также найти применение в химико-фармацевтической, микробиологической, биотехнологической, ветеринарной и пищевой промышленности для получения препаратов и продуктов на основе нуклеиновых кислот.The invention relates to the field of biotechnology and biochemistry, in particular to methods for producing biologically active substances based on nucleic acids, namely, to obtain sodium salt of DNA isolated from the microalga Chlorella vulgaris, which can be used as an immunostimulant based on nucleic acids for veterinary use in treatment of animals, as well as find application in the chemical-pharmaceutical, microbiological, biotechnological, veterinary and food industries for the production of drugs and products based on nucleic acids.

Микроводоросли рода Chlorella vulgaris Bejerink были обнаружены в 1890 году голландским ученым микробиологом и ботаником Мартином Биллем (Уиллем) Бейеринком. Данные микроводоросли являются наиболее распространенным видом из рода хлорелловых. По палеонтологическим исследованиям ископаемых образцов докембрийского периода, микроводоросль Chlorella vulgaris насчитывает достаточно большой генетический возраст, около 2 млрд. лет, что ставит данную микроводоросль по генетической выживаемости и сохранении в первоначальном виде до наших времен на ступень выше, чем генетический возраст дрожжей, осетровых и лососевых рыб. Можно сделать вывод, что ДНК микроводорослей является весьма предрасположенной к выживанию, а значит, может иметь и отличительные стороны в фармакологических эффектах при действии на организм [1-2].Microalgae of the genus Chlorella vulgaris Bejerink were discovered in 1890 by the Dutch microbiologist and botanist Martin Bill (Willem) Beijerink. These microalgae are the most common species of the Chlorella genus. According to paleontological studies of fossil specimens of the Precambrian period, the microalgae Chlorella vulgaris has a rather long genetic age, about 2 billion years, which puts this microalga in terms of genetic survival and preservation in its original form to our times a step higher than the genetic age of yeast, sturgeon and salmon fish. It can be concluded that the DNA of microalgae is highly predisposed to survival, which means that it can also have distinctive aspects in pharmacological effects when acting on the body [1-2].

В литературных источниках малоизвестно о получении нуклеината натрия из зеленых микроводорослей и в основном большее внимание направлено на получение рибонуклеината натрия из хлебопекарных дрожжей (препараты РНК) или получение дезоксирибонуклеината натрия из молок лососевых и осетровых рыб (препараты ДНК). В данном случае, для получения нуклеината натрия используются зеленые микроводоросли рода Chlorella vulgaris Beyerink, которые содержат в себе достаточное количество как РНК, так и ДНК компонентов, что было определено исследованиями [1]. Поэтому в качестве аналогов изобретения используются только те, которые по своей сущности и технологии получения нуклеината натрия являются наиболее близкими к заявленному изобретению.In the literature, little is known about the production of sodium nucleinate from green microalgae, and most of the attention is focused on obtaining sodium ribonucleinate from baker's yeast (RNA preparations) or obtaining sodium deoxyribonucleinate from salmon and sturgeon milk (DNA preparations). In this case, green microalgae of the genus Chlorella vulgaris Beyerink are used to obtain sodium nucleinate, which contain a sufficient amount of both RNA and DNA components, which was determined by research [1]. Therefore, as analogs of the invention, only those are used that in their essence and technology for producing sodium nucleinate are the closest to the claimed invention.

Известен способ получения нуклеината натрия из дрожжей в водной среде при 100-110°С, включающий сам гидролиз, отделение раствора рибонуклеиновой кислоты от дрожжевого клеточного шлама путем фильтрации, осаждение РНК соляной кислотой, промывку, очистку от пигментов и белков, растворение РНК в воде с добавлением гидроксида натрия и затем осаждение рибонуклеината натрия из полученного раствора этиловым спиртом [3].A known method of obtaining sodium nucleinate from yeast in an aqueous medium at 100-110 ° C, including the hydrolysis itself, the separation of a solution of ribonucleic acid from yeast cell sludge by filtration, precipitation of RNA with hydrochloric acid, washing, purification of pigments and proteins, dissolution of RNA in water with adding sodium hydroxide and then precipitation of sodium ribonucleinate from the resulting solution with ethyl alcohol [3].

К недостаткам данного способа следует отнести сложность в технологии процесса выделения и использование вредных веществ при промывке, например, диэтилового эфира, к тому же образование осадка серовато-желтого цвета свидетельствует о присутствии достаточно большого количества белков, что мало допустимо.The disadvantages of this method include the complexity in the technology of the isolation process and the use of harmful substances during washing, for example, diethyl ether, besides, the formation of a grayish-yellow precipitate indicates the presence of a sufficiently large amount of proteins, which is not acceptable.

Известен способ получения рибонуклеината натрия, заключающийся в экстракции РНК из дрожжей гидролизом при помощи 10-12% раствора хлористого натрия при 100-110°С с последующим отделением раствора РНК от клеточного шлама и осаждение РНК соляной кислотой, промывку выпавшего осадка этиловым спиртом и сушку. Избавление от пигментов и белков в данном изобретении осуществляется при растворении РНК в воде, доведении раствора до рН=8.0-8.2 гидроксидом натрия, выдерживании в течение часа при 37-40°С с добавлением панкреатина. Осаждение рибонуклеината осуществляется подкисленным соляной кислотой до рН=1-2 этиловым спиртом. Полученный осадок фильтруют, промывают этиловым спиртом, растворяют в воде с добавлением едкого натра, затем осаждают этанолом, осадок фильтруют, снова промывают этиловым спиртом и сушат [4].A known method of obtaining sodium ribonucleinate, which consists in the extraction of RNA from yeast by hydrolysis using a 10-12% solution of sodium chloride at 100-110 ° C, followed by the separation of the RNA solution from the cell sludge and the precipitation of RNA with hydrochloric acid, washing the precipitated sediment with ethyl alcohol and drying. Disposal of pigments and proteins in this invention is carried out by dissolving RNA in water, bringing the solution to pH = 8.0-8.2 with sodium hydroxide, holding for an hour at 37-40 ° C with the addition of pancreatin. The precipitation of ribonucleinate is carried out with ethyl alcohol acidified with hydrochloric acid to pH = 1-2. The resulting precipitate is filtered, washed with ethyl alcohol, dissolved in water with the addition of sodium hydroxide, then precipitated with ethanol, the precipitate is filtered, washed again with ethyl alcohol and dried [4].

Недостатком данного способа является сложность технологического процесса и многостадийность осаждений РНК, причем не исключены потенциальные потери конечного продукта при стадиях переосаждения.The disadvantage of this method is the complexity of the technological process and the multistage precipitation of RNA, and the potential loss of the final product during the stages of reprecipitation is not excluded.

Известен также ряд способов получения натриевой соли ДНК из молок лососевых и осетровых рыб.There are also known a number of methods for obtaining sodium salt of DNA from the milk of salmon and sturgeon fish.

Практически все способы используют схему выделения нуклеината натрия гидролизом в цитратно-солевом растворе, осаждение ДНК в виде натриевой соли при помощи этилового спирта или изопропанола и отмывку 70% этиловым спиртом, сушку и растворение в буфере в случае хранения. Недостатком всех этих способов является использование животного сырья, а именно молок рыб, что приводит к уничтожению большого количества невосполнимого источника биоресурса.Almost all methods use the scheme for the isolation of sodium nucleinate by hydrolysis in citrate-saline solution, precipitation of DNA in the form of sodium salt using ethyl alcohol or isopropanol and washing with 70% ethyl alcohol, drying and dissolving in buffer if stored. The disadvantage of all these methods is the use of animal raw materials, namely fish milk, which leads to the destruction of a large amount of irreplaceable source of biological resources.

Известен способ выделения ДНК из микроводоросли Haematococcus pluvialis (патент РФ 2573944, 2016 - Штамм микроводоросли haematococcus pluvialis - продуцент натурального астаксантина, авторы Лобакова Е.С. и др.) [5].A known method for isolating DNA from the microalga Haematococcus pluvialis (RF patent 2573944, 2016 - A strain of the microalga haematococcus pluvialis - producer of natural astaxanthin, authors Lobakova ES and others) [5].

Данный способ заключается в выделении ДНК из микроводорослей методом фенол-хлороформной экстракции. Подготовка биомассы представляет собой разрушение прочных клеточных стенок с применением трехкратного замораживания образцов при -4°С с последующим оттаиванием, инкубацию в течение часа в ТЕ буфере и лизоциме при 37°С, затем инкубацию с интенсивным перемешиванием в течение часа при 40°С с додецилсульфатом натрия, высаливание белков при добавлении 1М раствора хлорида натрия на холоду, затем экстракцию фенол-хлороформом.This method consists in the isolation of DNA from microalgae by phenol-chloroform extraction. Biomass preparation is the destruction of strong cell walls using three times freezing of samples at -4 ° C followed by thawing, incubation for an hour in TE buffer and lysozyme at 37 ° C, then incubation with vigorous stirring for an hour at 40 ° C with dodecyl sulfate sodium, salting out proteins by adding 1M sodium chloride solution in the cold, then extraction with phenol-chloroform.

Недостатком данного способа считается использование фенол-хлороформной экстракции ДНК. Полученная ДНК лишь после многократной промывки в этиловом спирте может быть использована в качестве препарата, в ином случае полученная ДНК пригодна для молекулярной биологии и ПЦР анализа. Тем не менее данный способ не предполагает получение нуклеината натрия как ветеринарно-медицинского препарата.The disadvantage of this method is the use of phenol-chloroform DNA extraction. The obtained DNA only after repeated washing in ethyl alcohol can be used as a preparation, otherwise the obtained DNA is suitable for molecular biology and PCR analysis. However, this method does not involve the production of sodium nucleinate as a veterinary medicine.

Процесс получения нуклеината натрия из микроводоросли совпадает лишь с некоторыми стадиями в технологии получения соли ДНК из молок лососевых и осетровых рыб. В работе применены некоторые принципы выделения нуклеиновых кислот, указанных в пособиях по биохимии [6].The process of obtaining sodium nucleinate from microalgae coincides only with some stages in the technology of obtaining DNA salt from the milk of salmon and sturgeon fish. Some principles of nucleic acid isolation indicated in textbooks on biochemistry were applied in the work [6].

Цель изобретения - получение чистого продукта нуклеината натрия, отвечающего всем нормам и характеристикам, а также обладающего выраженным фармакологическим эффектом и положительным действием на организм, используя зеленые микроводоросли Chlorella vulgaris Bejerink.The purpose of the invention is to obtain a pure sodium nucleinate product that meets all standards and characteristics, as well as has a pronounced pharmacological effect and a positive effect on the body, using green microalgae Chlorella vulgaris Bejerink.

Предложенный способ получения препарата нуклеината натрия в виде порошка белого цвета из предварительно подготовленной сухой биомассы микроводоросли Chlorella vulgaris Bejerink предусматривает механическое лизирование клеточной оболочки микроводоросли, очистку биоматериала от мешающих компонентов (липидов, пигментного комплекса, полисахаридов, белков и др.), гидролиз в цитратно-солевом растворе, избавление от клеточного шлама и денатурированных белков, осаждение нуклеиновых кислот в виде натриевых солей ацетоном или изопропанолом, центрифугирование, промывку осадка спиртом, сушку и измельчение препарата до мелкодисперсного порошкообразного состояния.The proposed method for obtaining a sodium nucleinate preparation in the form of a white powder from a previously prepared dry biomass of the microalga Chlorella vulgaris Bejerink provides for the mechanical lysis of the cell membrane of the microalga, purification of the biomaterial from interfering components (lipids, pigment complex, polysaccharides, proteins, etc.), hydrolysis in citrate- saline solution, disposal of cell sludge and denatured proteins, precipitation of nucleic acids in the form of sodium salts with acetone or isopropanol, centrifugation, washing the precipitate with alcohol, drying and grinding the preparation to a fine powdery state.

Новизной настоящего изобретения является то, что впервые был получен препарат нуклеинат натрия из зеленых микроводорослей Chlorella vulgaris, обладающий такими же биологическими и лечебными свойствами, как и эталонные образцы, при этом были подобраны технологические условия процесса выделения нуклеиновых кислот с использованием биотехнологической установки в виде биореактора, который состоит из круглодонной трехгорлой колбы, колбонагревателя, холодильника, градусника и перемешивающего устройства с лопастной мешалкой.The novelty of the present invention is that for the first time a sodium nucleinate preparation was obtained from the green microalgae Chlorella vulgaris, which has the same biological and medicinal properties as the reference samples, while the technological conditions of the nucleic acid isolation process were selected using a biotechnological installation in the form of a bioreactor, which consists of a round-bottom three-necked flask, a heating mantle, a refrigerator, a thermometer and a mixing device with a paddle stirrer.

Анализ на чистоту полученного препарата, его количество, содержание иных примесей осуществляется спектрофотометром, планшетным фотометром или сканером, фотоэлектроколориметром.The analysis for the purity of the obtained preparation, its amount, the content of other impurities is carried out with a spectrophotometer, flatbed photometer or scanner, photoelectric colorimeter.

Исследование токсичности полученного препарата обеспечивается выполнением всех норм и правил, указанных в ГОСТ 31674-2012 [7].The study of the toxicity of the resulting drug is ensured by compliance with all the rules and regulations specified in GOST 31674-2012 [7].

Для осаждения нуклеината натрия из раствора в качестве органического растворителя используют изопропанол (1:1), этиловый спирт (1:2), или ацетон (1:3) [8].To precipitate sodium nucleinate from solution, isopropanol (1: 1), ethyl alcohol (1: 2), or acetone (1: 3) are used as an organic solvent [8].

Способ получения нуклеината натрия из микроводоросли Chlorella vulgaris Bejerink реализуется следующим образом.The method for obtaining sodium nucleinate from the microalga Chlorella vulgaris Bejerink is implemented as follows.

Пример. Пример описывает способ получения нуклеината натрия из сухой биомассы зеленых микроводорослей рода Chlorella vulgaris Bejerink (штамм ИФР № C-111).Example. The example describes a method for obtaining sodium nucleinate from dry biomass of green microalgae of the genus Chlorella vulgaris Bejerink (IGF strain No. C-111).

Перед выделением нуклеиновых кислот 50 г сухой биомассы микроводоросли Chlorella vulgaris помещают в ступку и растирают в течение 10 минут. Далее к полученной гомогенной массе приливают 150 мл 0,5 н. охлажденной до 0°С хлорной кислоты и продолжают промывать клеточный материал в течение 5 минут, затем центрифугируют в течение 10 мин при 3500 об/мин. Надосадочную жидкость, содержащую кислоторастворимые вещества, отбрасывают. Далее к полученной гомогенной массе приливают смесь этилового спирта с этилацетатом (1:1) и продолжают перетирать еще в течение 5 минут. Этиловый спирт и этилацетат, экстрагировавшие пигменты и липиды, отделяют центрифугированием в течение 10 минут при 3500 об/мин. Процедуру промывки чистым спиртом проводят до полного отсутствия запаха этилацетата и максимального осветления клеточной массы от пигментов. Подготовленный таким образом биоматериал, готов к экстракции нуклеиновых кислот.Before isolating nucleic acids, 50 g of dry biomass of the microalgae Chlorella vulgaris is placed in a mortar and ground for 10 minutes. Next, 150 ml of 0.5 N hydrochloric acid is added to the resulting homogeneous mass. cooled to 0 ° C perchloric acid and continue to wash the cell material for 5 minutes, then centrifuged for 10 minutes at 3500 rpm. The supernatant liquid containing acid-soluble substances is discarded. Next, a mixture of ethyl alcohol with ethyl acetate (1: 1) is poured into the resulting homogeneous mass and grind is continued for another 5 minutes. Ethyl alcohol and ethyl acetate, which have extracted pigments and lipids, are separated by centrifugation for 10 minutes at 3500 rpm. The procedure for washing with pure alcohol is carried out until the smell of ethyl acetate is completely absent and the maximum clarification of the cell mass from pigments. The biomaterial prepared in this way is ready for nucleic acid extraction.

Для этого подготовленную биомассу Chlorella vulgaris, количественно помещают в трехгорлую круглодонную колбу биореактора, смывая осадок 360 мл цитратно-солевого раствора, состоящего из 20% раствора натрия хлорида и 1% натрия цитрата, смешанных в пропорции 1:1 по объему, рН=7. Добавляют к смеси 40 мл детергента (SDS, натрия додецилсульфата) с концентрацией 100 мл/дм³ для дополнительного лизиса клеточных стенок и ядра. Нагревают смесь до 100°С, медленно, в течение 40-60 минут. Затем в течение 2-3 часов выдерживают при температуре кипения с постоянным перемешиванием. При этом клеточная стенка хлореллы и оболочка ядра разрушается, под действием высокой для нее температуры и внесенного детергента. Основная часть белка под действием высокой температуры денатурирует и образуется в осадке с клеточным шламом.For this, the prepared biomass of Chlorella vulgaris is quantitatively placed in a three-necked round-bottom flask of the bioreactor, washing off the sediment with 360 ml of citrate-saline solution, consisting of 20% sodium chloride solution and 1% sodium citrate, mixed in a ratio of 1: 1 by volume, pH = 7. Add to the mixture 40 ml of detergent (SDS, sodium dodecyl sulfate) with a concentration of 100 ml / dm ³ for additional lysis of the cell walls and nucleus. The mixture is heated to 100 ° C, slowly over 40-60 minutes. Then it is kept for 2-3 hours at the boiling point with constant stirring. In this case, the cell wall of chlorella and the membrane of the nucleus are destroyed under the influence of a high temperature for it and an introduced detergent. The main part of the protein under the action of high temperature denatures and is formed in the sediment with cell sludge.

По окончании процесса смеси дают остыть до комнатной температуры, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют и надосадочную жидкость, содержащую нуклеиновые кислоты, переносят количественно в высокую емкость, а денатурированный белок с клеточным шламом отделяют центрифугированием, высушивают, растирают и взвешивают.At the end of the process, the mixture is allowed to cool to room temperature, sonicated, centrifuged, and the supernatant containing nucleic acids is transferred quantitatively into a high container, and the denatured protein with cell sludge is separated by centrifugation, dried, triturated and weighed.

Клеточный шлам отбрасывают, он может быть использован как добавка в рацион животных после дополнительной отмывки, сушки и перетирания в порошок.Cell sludge is discarded, it can be used as an additive to the diet of animals after additional washing, drying and grinding into powder.

Замеряют объем гидролизата и осаждают из него нуклеиновые кислоты добавлением при помешивании к охлажденному до 1-3°С ацетону (1:2, 2 - ацетон) или изопропанолу (1:1).The volume of the hydrolyzate is measured and nucleic acids are precipitated from it by adding with stirring to acetone (1: 2, 2 - acetone) cooled to 1-3 ° C or isopropanol (1: 1).

Далее помещают емкость с гидролизатом и осадителем в морозильную камеру на 3 часа.Next, place the container with the hydrolyzate and the precipitant in the freezer for 3 hours.

Образовавшиеся в осадке хлопья нуклеиновых кислот собирают центрифугированием. Промывают осадок 70% этиловым спиртом, центрифугируют, а затем высушивают в токе инертного газа (воздух, азот) в лабораторном концентраторе. Растирают в порошок до мелкодисперсного состояния и проводят качественные и количественные испытания. При длительном хранении, порошок нуклеината натрия разбавляют в буферном растворе и хранят при низкой температуре.The nucleic acid flocs formed in the precipitate are collected by centrifugation. The precipitate is washed with 70% ethyl alcohol, centrifuged, and then dried in a stream of inert gas (air, nitrogen) in a laboratory concentrator. Grind into powder to a finely dispersed state and carry out qualitative and quantitative tests. For long-term storage, sodium nucleinate powder is diluted in a buffer solution and stored at low temperature.

Выход порошка нуклеината натрия составил около 6,02 г из навески биомассы микроводорослей 50,0 г (по сухой массе). Порошок получается белого цвета. Содержание белка не более 1.5%.The yield of sodium nucleinate powder was about 6.02 g from a sample of microalgae biomass 50.0 g (by dry weight). The powder is white. Protein content no more than 1.5%.

Чистота полученного препарата соответствует нормам.The purity of the product obtained meets the standards.

Проверка общей токсичности препарата по ГОСТ 31674-2012 показала отрицательный результат воздействия на одноклеточные микроорганизмы Infusoria рода Stylonychia mytilus в сравнении с эталонным образцом нуклеината натрия фармакопейной чистоты [9].Testing the general toxicity of the drug in accordance with GOST 31674-2012 showed a negative effect on unicellular microorganisms Infusoria of the genus Stylonychia mytilus in comparison with a reference sample of sodium nucleinate of pharmacopoeial purity [9].

Приготовление цитратно-солевого раствораPreparation of citrate-salt solution

Цитратно солевой раствор для экстракции нуклеината натрия готовится следующим образом. В колбу на 500 мл помещается навеска 100 г натрия хлорида (для 20%) и 5 г натрия цитрата (для 1%). Колба заполняется 200 мл дистиллированной воды и ставится на ультразвуковую баню до полного растворения соли и доводится до метки водой. Необходимо также обеспечить рН раствора от 6 до 7. Солевой раствор используется при гидролизе в необходимом количестве.Citrate saline solution for sodium nucleinate extraction is prepared as follows. In a 500 ml flask, a weighed portion of 100 g of sodium chloride (for 20%) and 5 g of sodium citrate (for 1%) are placed. The flask is filled with 200 ml of distilled water and placed in an ultrasonic bath until the salt is completely dissolved and brought to the mark with water. It is also necessary to ensure the pH of the solution is between 6 and 7. The saline solution is used for hydrolysis in the required amount.

Список литературыList of references

1. Роик Б.О. Определение количества ДНК в суспензионном препарате «АльгаВет» на основе микроводоросли Chlorella vulgaris / Б.О. Роик, М.М. Наумов // Современный агропромышленный комплекс глазами молодых ученых: Материалы научно-образовательной школы аспирантов Ассоциации аграрных вузов Центрального Федерального округа России. - Орел, 2017. - С. 97-101.1. Roik B.O. Determination of the amount of DNA in the suspension preparation "AlgaVet" based on the microalgae Chlorella vulgaris / B.O. Roick, M.M. Naumov // Modern agro-industrial complex through the eyes of young scientists: Materials of the scientific and educational school of graduate students of the Association of agricultural universities of the Central Federal District of Russia. - Orel, 2017 .-- S. 97-101.

2. Лечебно-профилактический препарат для животных на основе нуклеиновых кислот из микроводоросли Chlorella vulgaris/ Б.О. Роик, М.М. Наумов, В.А. Лукьянов, Н.М. Наумов // Механизмы и закономерности индивидуального развития человека и животных: материалы IV Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 80-летию заслуж. деятеля науки РФ Л.П. Тельцова, Саранск, 15-16 ноября 2017 г. / редкол.: В.С.Темлякова, А.С. Зенкин, Л.П. Тельцов. - Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2017. - 6,68 Мб.2. Therapeutic and prophylactic drug for animals based on nucleic acids from the microalga Chlorella vulgaris / B.O. Roick, M.M. Naumov, V.A. Lukyanov, N.M. Naumov // Mechanisms and patterns of individual development of man and animals: materials of the IV Intern. scientific-practical conf., dedicated. I deserve the 80th anniversary. scientist of the Russian Federation L.P. Teltsova, Saransk, November 15-16, 2017 / editorial board: V.S. Temlyakova, A.S. Zenkin, L.P. Taurus. - Saransk: Publishing house of Mordovs. University, 2017 .-- 6.68 Mb.

3. Пояснительная записка к фармакопейной статье ФС 42-1781-82/11.3. Explanatory note to the pharmacopoeial monograph FS 42-1781-82 / 11.

4. Земсков В.М. и др. Низкомолекулярная РНК. Получение, гидролиз и применение в медицине. - Рига: Зинатне, 1985. - С. 7-8.4. Zemskov V.M. and other Low molecular weight RNA. Obtaining, hydrolysis and use in medicine. - Riga: Zinatne, 1985 .-- S. 7-8.

5. Патент РФ 2573944, 2016 «Штамм микроводоросли haematococcus pluvialis - продуцент натурального астаксантина», авторы Лобакова Е.С. и др.5. RF patent 2573944, 2016 "Strain of microalgae haematococcus pluvialis - producer of natural astaxanthin", authors Lobakova E.S. and etc.

6. Выделение и очистка продуктов биотехнологии. Методическое пособие к лабораторным занятиям, задания для самостоятельной работы и контроля знаний студентов / авт.-сост.: Д.А. Новиков. - Минск: БГУ, 2014. - 70 с.6. Isolation and purification of biotechnology products. Methodological manual for laboratory studies, tasks for independent work and control of students' knowledge / author-comp .: D.A. Novikov. - Minsk: BSU, 2014 .-- 70 p.

7. ГОСТ 31674-2012. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы определения общей токсичности. - Москва: ФГУП «Стандартинформ», 2014. -17 с.7.GOST 31674-2012. Feed, compound feed, compound feed raw materials. Methods for determining general toxicity. - Moscow: Federal State Unitary Enterprise "Standartinform", 2014. -17 p.

8. Патент BY 6691 С1.8. Patent BY 6691 C1.

9. Роик Б.О. Скрининговые исследования препарата нуклеиновых кислот на инфузориях рода Stylonychia mytilus / Б.О. Роик, М.М. Наумов // Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Заслуженного деятеля науки РСФСР, доктора ветеринарных наук, профессора Кабыша Андрея Александровича. - Троицк, 2017. С. 350-359.9. Roic B.O. Screening studies of nucleic acid preparation on ciliates of the genus Stylonychia mytilus / B.O. Roick, M.M. Naumov // Materials of the International Scientific and Practical Conference dedicated to the 100th anniversary of the birth of Honored Scientist of the RSFSR, Doctor of Veterinary Sciences, Professor Kabysh Andrei Aleksandrovich. - Troitsk, 2017.S. 350-359.

Claims

1. A method of obtaining sodium nucleinate from the biomass of the microalgae Chlorella vulgaris Bejerink, which consists in the fact that from the previously prepared dry biomass of green microalgae of the genus Chlorella vulgaris Bejerink in an amount of 50 g, sodium nucleinate is extracted, for which the prepared biomass is quantitatively placed in a three-necked round-bottomed flask, sediment 360 ml of citrate-saline solution, consisting of 20% sodium chloride solution and 1% sodium citrate, mixed in a ratio of 1: 1 by volume, with a pH of a solution of 7, is added to a mixture of 40 ml of sodium dodecyl sulfate detergent with a concentration of 100 mg / dm ³ for additional lysis of cell walls and nuclei, the mixture is heated slowly to 100 ° C for 40-60 minutes, then kept at boiling temperature for 2-3 hours with constant stirring, at the end of the process the mixture is allowed to cool to room temperature, treated with ultrasound , centrifuged and the supernatant containing nucleic acids, transfer yat quantitatively into a high container, measure the volume of the hydrolyzate and precipitate nucleic acids from it by adding, with stirring, to acetone cooled to 1-3 ° C in a ratio of 1: 2 or isopropanol 1: 1, then place the container with the hydrolyzate and precipitant in a freezer for 3 hours, the nucleic acid flakes formed in the sediment are collected by centrifugation, the sediment is washed with 70% ethyl alcohol, centrifuged, and then dried in a stream of inert gas (air, nitrogen) in a laboratory concentrator and ground into powder to a finely dispersed state.

2. A method of obtaining sodium nucleinate from the biomass of the microalga Chlorella vulgaris Bejerink according to claim 1, characterized in that the dry biomass of the microalga is preliminarily prepared, for which 50 g of the dry biomass of the microalga Chlorella vulgaris is placed in a mortar and ground for 10 minutes to obtain a homogeneous the mass is poured into 150 ml of 0.5 N. cooled to 0 ° C perchloric acid and continue to wash the cell material for 5 minutes, then centrifuged for 10 minutes at 3500 rpm, the supernatant containing acid-soluble substances is discarded, a mixture of ethyl alcohol with ethyl acetate 1 is added to the resulting homogeneous mass: 1 and continue to grind for another 5 minutes, ethyl alcohol and ethyl acetate, which extracted pigments and lipids, are separated by centrifugation for 10 minutes at 3500 rpm, then washed with pure alcohol until there is no ethyl acetate odor and maximum clarification of the cell mass from pigments.