RU2091489C1

RU2091489C1 - Strain of recombinant small pox virus expressing structural proteins of the horse venezuelan encephalomyelitis virus and useful for immunobiological preparations production and a method of its preparing

Info

Publication number: RU2091489C1
Application number: RU93018105A
Authority: RU
Inventors: И.В. Фролов; И.Х. Урманов; А.А. Колыхалов; С.В. Нетесов; Е.В. Агапов; О.И. Серпинский; В.А. Святченко
Original assignee: Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"
Priority date: 1993-04-08
Filing date: 1993-04-08
Publication date: 1997-09-27

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: strain is obtained by insertion of the sequence encoding only structural proteins of the horse Venezuelan encephalomyelitis virus (full-size DNA-copy of total 26 S RNA) in thymidine kinase gene of commercial small pox virus strain under control of small pox virus protein 7.5 K promoter. The obtained strain provides full-value immune response with respect to the horse Venezuelan encephalomyelitis virus. In cells infected with the obtained strain glycoproteins of supercapsid envelope of this virus were expressed on their surface. Strain can be used for diagnosis and prophylaxis of the horse Venezuelan encephalomyelitis virus. EFFECT: preparing the strain indicated above. 2 cl, 2 dwg, 2 tbl

Description

Изобретение относится к биотехнологии и, в частности к генетической инженерии, представляет собой штамм рекомбинантного вируса осповакцины, обуславливающий синтез структурных белков вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) в инфицированных клетках, и протективный иммунитет против ВЭЛ у вакцинированных им лабораторных животных, а также способ конструирования данного штамма. The invention relates to biotechnology and, in particular, to genetic engineering, is a strain of the recombinant vaccinia virus, which causes the synthesis of structural proteins of the Venezuelan encephalomyelitis virus of horses (VEL) in infected cells, and protective immunity against VEL in laboratory animals vaccinated with it, as well as a method for constructing this strain.

Вирус ВЭЛ представляет собой один из наиболее патогенных для животных представителей рода Альфавирусов семейства Тогавирусов, вызывающий наиболее серьезные заболевания человека, грызунов и лошадей и приводящий, для целого ряда видов животных, к летальному исходу. Данный вирус переносится в природе несколькими видами москитов и вызывает широкомасштабные эпизоотии в Южной, Центральной и Северной Америке. The VEL virus is one of the most pathogenic for animals of the genus Alphaviruses of the Togavirus family, causing the most serious diseases of humans, rodents and horses and leading to death for a number of animal species. This virus is transmitted in nature by several species of mosquitoes and causes large-scale epizootics in South, Central and North America.

Для профилактики заболевания, вызванного вирусом ВЭЛ, в настоящее время применяется вакцинация людей и сельскохозяйственных животных живой вакциной на основе аттенуированных штаммов ТС-83 и 230, а также инактивированной вакциной, изготавливаемой на основе обработанного формалином вируса ВЭЛ, однако существует вероятность реверсии этих штаммов к вирулентному варианту [1] и включению ревертантов в природную циркуляцию [2] Кроме того, штаммы ТС-83 и 230 реактогенны (в 80% случаев), возможно обладают тератогенным потенциалом вируса ВЭЛ [3] и у 30% вакцинированных вызывают симптомы, сходные с симптомами заболевания ВЭЛ [4] Иммунизация же инактивированным вирусом предполагает использование больших количеств материала, что ведет к крупномасштабным наработкам патогена и высокой себестоимости такого рода вакцин. To prevent the disease caused by the VEL virus, vaccination of people and farm animals with a live vaccine based on attenuated strains TS-83 and 230, as well as an inactivated vaccine made on the basis of formalin-treated VEL virus, is currently used, however, there is a possibility of reversing these strains to virulent variant [1] and the inclusion of revertants in the natural circulation [2] In addition, strains TS-83 and 230 are reactogenic (in 80% of cases), possibly possess teratogenic potential of the VEL virus [3] and in 30% of vaccines the induced ones cause symptoms similar to symptoms of VEL disease [4] Immunization with an inactivated virus involves the use of large quantities of material, which leads to large-scale developments of the pathogen and the high cost of such vaccines.

В современной литературе описано несколько векторов, позволяющих экспрессировать чужеродные гены в эукариотических клетках. Созданные к настоящему времени вектора на основе ретровирусов, аденовирусов, папилломавирусов и паповавирусов обладают целым рядом существенных недостатков: малой скоростью размножения на культуре клеток, небольшой емкостью относительно встраиваемых генетических последовательностей, неспособностью размножаться в организме животных и др. [5] Определенные успехи по созданию рекомбинантных вакцин были достигнуты при использовании вируса осповакцины. В геном этого вируса были встроены последовательности генов гемагглютинина вируса гриппа [6] N- и G-белков вируса везикулярного стоматита [7] гликопротеина вируса бешенства [8] антигена малярийного плазмодия [9] и др. Во всех случаях наблюдалась эффективная экспрессия чужеродных для осповакцины белков в культуре клеток. В ряде случаев в организме вакцинированных животных были обнаружены антитела, специфичные к данным белкам и способные защищать от летальной инфекции, вызываемой вирусом, чьи гены были встроены в геном рекомбинантного вируса осповакцины. Потенциальная возможность экспрессии структурных белков альфавирусов в составе генома рекомбинантного вируса осповакцины была продемонстрирована на примере вируса Синдбис [10] В качестве прототипа выбран известный способ конструирования штаммов рекомбинантной осповакцины VACC/TRD и VACC/TC-83, экспрессирующих структурные белки американского варианта штамма Тринидад данки вируса ВЭЛ и полученного из него вакцинного штамма ТС-83 [11] который заключается в следующем:
1. Конструируется плазмида, содержащая последовательность генов структурных белков под контролем 7.5К промотора вируса осповакцины, фланкированную с двух сторон последовательностями гена тимидинкиназы (ТК) вируса осповакцины.Several vectors have been described in the current literature that allow the expression of foreign genes in eukaryotic cells. The vectors created to date based on retroviruses, adenoviruses, papillomaviruses, and papovaviruses have a number of significant drawbacks: the low rate of reproduction in cell culture, the low capacity relative to the inserted genetic sequences, the inability to reproduce in animals, and others. [5] Certain successes in creating recombinant vaccines were achieved using vaccinia virus. In the genome of this virus, the sequences of the hemagglutinin genes of the influenza virus [6] N- and G-proteins of the vesicular stomatitis virus [7] rabies virus glycoprotein [8] malaria plasmodium antigen [9] and others were integrated. In all cases, an efficient expression of foreign for smallpox vaccine was observed proteins in cell culture. In a number of cases, antibodies specific to these proteins and capable of protecting against a lethal infection caused by a virus whose genes were integrated into the genome of the recombinant vaccinia virus were found in the body of vaccinated animals. The potential expression of structural alphavirus proteins in the genome of the recombinant vaccinia virus was demonstrated by the example of the Sindbis virus [10]. As a prototype, the known method of constructing the recombinant vaccinia vaccines VACC / TRD and VACC / TC-83, expressing the structural proteins of the American variant of the Trinidane dunky virus VEL and the vaccine strain TS-83 obtained from it [11] which consists in the following:
1. A plasmid is constructed containing the gene sequence of structural proteins under the control of the 7.5K promoter of the vaccinia virus virus, flanked on both sides by the gene sequences of the thymidine kinase (TC) vaccinia virus.

2. Проводится рекомбинация между "ТК-плечами" полученной плазмиды и ДНК генома ОВ в клетках, зараженных вирусом осповакцины. 2. Recombination is carried out between the "TK arms" of the obtained plasmid and the DNA of the OB genome in cells infected with the vaccinia virus.

3. Проводится отбор клонов рекомбинантного вируса осповакцины с фенотипом ТК^- на селективной среде, содержащей бромдезоксиуридин.3. The recombinant clones were selected with the phenotype of vaccinia TK ^- on selective medium containing bromodeoxyuridine.

4. Проводится отбор методами гибридизации клонов осповакцины, имеющих фенотип ТК^-, содержащих в геноме последовательность встраиваемого гена.4. Selection is made by hybridization methods of smallpox vaccine clones having the TK ^- phenotype, containing the sequence of the inserted gene in the genome.

5. Полученные клоны анализируются на культуре клеток для определения уровня экспрессии встроенных последовательностей. 5. The resulting clones are analyzed on cell culture to determine the expression level of the inserted sequences.

Однако в каждом конкретном случае, в зависимости от последовательности, вводимой в геном осповакцины, и промотора, который выбирается для осуществления экспрессии, описанные этапы этой методики настолько сильно различаются, что она не может выступать в качестве универсальной. Наиболее близкой по структуре из всех встроенных последовательностей является область генов структурных белков американского варианта вируса ВЭЛ Тринидад данки. Однако, как показано нами ранее [12] нуклеотидные последовательности 26 S РНК используемого в прототипе американского и используемого нами отечественного варианта патогенного штамма вируса ВЭЛ Тринидад данки имеют ряд различий, приводящих к аминокислотным заменам в кодируемых 26 S РНК белках. В белке C 62-ой Ser на Pro; в белке 6К 48-ой Met на Val, 53-ий Ala на Gly, 54-ый Pro на Ala, 55-ый Ala на Gly и дополнительный Ala в положении 56; в белке Е2 (основной иммуноген) 85-ый His на Tyr, 147-ой Val на Ala, 187-ой Thr на Jle, 192-ой Val на Ala и 408-ой Jle на Met. Для введения генов структурных белков ВЭЛ в геном вируса осповакцины в прототипе предлагается использовать рестриктазу Tth III I, что приводит к удалению из встраиваемой ДНК-копии 26 S РНК 3'-нетранслируемой области вместе с поли-A трактом. Кроме этого, при использовании этой рестриктазы на 5'-конце встраиваемой ДНК-копии остается часть последовательности, кодирующей неструктурный белок nsp 4, способная помешать эффективной транскрипции последовательности, кодирующей структурные белки вируса ВЭЛ. В литературе отсутствует анализ защитных свойств рекомбинантного вируса VACC/TRD, несущего встройку 26 S РНК американского варианта штамма Тринидад данки вируса ВЭЛ. However, in each case, depending on the sequence that is introduced into the genome of smallpox vaccine and the promoter that is selected for expression, the described steps of this technique are so different that it cannot act as universal. The closest in structure of all the built-in sequences is the gene region of structural proteins of the American variant of the VEL virus Trinidad dunky. However, as we have shown previously [12], the nucleotide sequences of 26 S RNA used in the prototype of the American and used domestic variant of the pathogenic strain of the VEL virus Trinidad dunks have a number of differences leading to amino acid substitutions in the 26 S RNA encoded proteins. In protein C, 62nd Ser on Pro; in 6K protein, the 48th Met on Val, the 53rd Ala on Gly, the 54th Pro on Ala, the 55th Ala on Gly and the additional Ala at position 56; in E2 protein (the main immunogen), 85th His on Tyr, 147th Val on Ala, 187th Thr on Jle, 192th Val on Ala and 408th Jle on Met. To introduce the genes of structural VAL proteins into the genome of the vaccinia virus, the prototype proposes to use the restriction enzyme Tth III I, which leads to the removal of the 3 S-untranslated region from the inserted DNA copy of the 26 S RNA along with the poly-A tract. In addition, when using this restriction enzyme, at the 5'-end of the inserted DNA copy, a part of the sequence encoding the non-structural protein nsp 4 remains, which can interfere with the efficient transcription of the sequence encoding the structural proteins of the VEL virus. There is no analysis of the protective properties of the recombinant VACC / TRD virus carrying the 26S RNA insert of the American variant of the Trinidad strain of the VEL virus.

Целью изобретения является создание штамма рекомбинантного вируса осповакцины, вызывающего синтез всех структурных белков вирулентного штамма TRD вируса ВЭЛ в инфицированных клетках и обеспечивающего эффективную защиту вакцинированных им лабораторных животных от летальной инфекции ВЭЛ. The aim of the invention is the creation of a strain of recombinant vaccinia virus that causes the synthesis of all structural proteins of the virulent strain TRD of the VEL virus in infected cells and provides effective protection for vaccinated laboratory animals from lethal VEL infection.

Эта цель достигается путем встройки в ген тимидинкиназы коммерческого штамма вируса осповакцины-ЛИВП под контролем промотора белка 7,5К вируса ОВ последовательности, кодирующей только структурные белки вируса ВЭЛ (полноразмерной ДНК-копии всей 26 S РНК), для извлечения которой из ДНК-копии геномной РНК отечественного варианта вирулентного штамма ТРД вируса ВЭЛ, используется рестриктаза Apal, сайт узнавания которой расположен непосредственно перед 5'-концом субгеномной 26 S РНК и является уникальным для этой последовательности. This goal is achieved by inserting into the thymidine kinase gene a commercial strain of smallpox vaccine-LIVP virus under the control of the 7.5K protein promoter of the OB virus sequence that encodes only structural proteins of the VEL virus (full-length DNA copy of the entire 26 S RNA), for extraction of which from the DNA copy of the genomic RNA of the domestic version of the virulent TRD strain of the VAL virus uses the Apal restrictase, the recognition site of which is located directly in front of the 5'-end of the subgenomic 26 S RNA and is unique to this sequence.

В результате полученный рекомбинантный штамм осповакцины содержит в геноме, по сравнению с исходным коммерческим осповакцинным штаммом (ЛИВП), дополнительную последовательность, состоящую: 1) из фрагмента длиной 300 н.п. включающего в себя район промотора гена белка 7,5К; 2) из фрагмента длиной около 4000 п.о. содержащего последовательность генов белков C, Е3, Е2, 6К и Е1 вируса ВЭЛ, отечественного варианта штамма Тринидад данки, в указанном порядке; встроенная ДНК-копия 26 S РНК не имеет на 5'-конце других последовательностей геномной РНК ВЭЛ, способной помешать транскрипции [12] Схема встроенного фрагмента приведена на фиг. 1. Необходимо отметить, что встройка полноразмерной ДНК-копии 26 S РНК вирулентного штамма вируса ВЭЛ ведет к формированию наиболее полноценного иммунного ответа против вируса ВЭЛ. As a result, the resulting recombinant smallpox vaccine strain contains in the genome, in comparison with the original commercial smallpox vaccine strain (LIVP), an additional sequence consisting of: 1) a fragment of 300 n.p. including a 7.5K protein gene promoter region; 2) from a fragment with a length of about 4000 bp containing the sequence of the C, E3, E2, 6K, and E1 protein genes of the VEL virus, a domestic variant of the Trinidad dunky strain, in that order; the inserted DNA copy of 26 S RNA does not have at the 5'-end of the other VAL genomic RNA sequences capable of interfering with transcription [12] The scheme of the inserted fragment is shown in FIG. 1. It should be noted that the insertion of a full-sized DNA copy of 26 S RNA of the virulent strain of the VEL virus leads to the formation of the most complete immune response against the VEL virus.

Указанная встройка проводится в два этапа. На первом этапе из фрагмента ДНК-копии геномной РНК вируса ВЭЛ удаляют последовательность генов неструктурных белков, которые могут помешать впоследствии правильной трансляции, после чего перечисленные выше фрагменты, содержащие последовательности промотора и генов структурных белков ВЭЛ, собирают в составе единой плазмиды внутри гена тимидинкиназы вируса осповакцины. Для этого используются следующие плазмиды: 1) плазмида на основе вектора pUC8 (pVE-4, pVET7-91, pVEI47), содержащая последовательность 5'-конца 26 S РНК вируса ВЭЛ длиной по крайней мере 4000 п. о. и COOH-концевую область гена белка Nsp4; 2) плазмида, содержащая клонированный между сайтами рестрикции SalGI и BamHI полилинкера SalGI-HinfI фрагмент ДНК вируса осповакцины, штамм WR, размером 253 п.н. соответствующий промотору гена белка 7,5К этого вируса [13] (обозначена как p7,5K); 3) плазмида pTK1285 [14] содержащая последовательность гена тимидинкиназы вируса осповакцины, штамм ЛИВП, со встроенным полилинкером. The specified installation is carried out in two stages. At the first stage, the sequence of non-structural protein genes that may interfere with proper translation is removed from the DNA copy of the VAL virus genomic RNA, after which the above fragments containing the sequences of the promoter and structural protein genes of the VEL are collected as a single plasmid within the thymidine kinase gene of the vaccinia virus . For this, the following plasmids are used: 1) a plasmid based on the pUC8 vector (pVE-4, pVET7-91, pVEI47) containing the sequence of the 5'-end of 26 S RNA of the VEL virus of at least 4000 bp length. and the COOH terminal region of the Nsp4 protein gene; 2) a plasmid containing the SalGI-HinfI polylinker cloned between the restriction sites SalGI and BamHI DNA fragment of the vaccinia virus, strain WR, size 253 bp corresponding to the promoter of the 7.5K protein gene of this virus [13] (designated p7.5K); 3) the plasmid pTK1285 [14] containing the sequence of the thymidine kinase gene of the smallpox vaccine virus, the LIVP strain, with an integrated polylinker.

Этот этап конструирования нового штамма заключается в удалении из любой из плазмид, упомянутых выше в пункте 1 (например pVE4, pVET7-91, либо pVE147) фрагмента кДНК, соответствующего области неструктурных белков вируса ВЭЛ. Для этого плазмиды разрезают по уникальному сайту рестрикции ApaI, прилегающему непосредственно к началу субгеномной 26 S РНК вируса ВЭЛ, и одному из сайтов рестрикции расположенных в полилинкере векторной плазмиды (SalGI, либо BamHI), после чего гидролизат обрабатывают ДНК-полимеразой фага Т4 согласно [15] с последующей циклизацией плазмиды с помощью ДНК-лигазы фага Т4. После трансформации клеток E.coli полученной лигазной смесью отбирают клоны, в плазмидах которых отсутствует SalGI-ApaI-фрагмент, соответствующий области неструктурных белков вируса ВЭЛ, размер которого может варьировать в зависимости от исходно выбранной из клонотеки плазмиды, и восстановлен сайт узнавания рестриктазы SalGI. Из отобранных клонов E.coli выделяют плазмиду, обозначенную как pVE5. This step of constructing a new strain is to remove from any of the plasmids mentioned in paragraph 1 above (for example pVE4, pVET7-91, or pVE147) a cDNA fragment corresponding to the region of non-structural proteins of the VEL virus. To do this, plasmids are cut using the unique ApaI restriction site adjacent directly to the beginning of the subgenomic 26 S RNA of the VEL virus, and one of the restriction sites of the vector plasmid located in the polylinker (SalGI or BamHI), after which the hydrolyzate is treated with T4 phage DNA polymerase according to [15 ] followed by cyclization of the plasmid using T4 phage DNA ligase. After the transformation of E. coli cells with the obtained ligase mixture, clones are selected that lack the SalGI-ApaI fragment corresponding to the region of non-structural proteins of the VEL virus, the size of which may vary depending on the plasmid originally selected from the clonothera, and the SalGI restriction enzyme recognition site is restored. A plasmid designated pVE5 is isolated from the selected E. coli clones.

Затем ДНК плазмиды рТК1285 гидролизуют эндонуклеазами рестрикции SalGI и EcoRI, после чего продукт гидролиза с помощью ДНК-лигазы фага Т4 соединяют с фрагментами SalGI-BamHI плазмиды р7,5К и BamHI-EcoRI плазмиды pVE5. После трансформации клеток E. coli из выросших клонов выделяют плазмиду, обозначенную как pVE5.1. Эта плазмида содержит ген тимидинкиназы вируса осповакцины, штамм ЛИВП, в кодирующей части которого встроена последовательность кДНК-копии 26 S РНК вируса ВЭЛ (с возможным сопутствующим фрагментом другой плазмиды на ее 3'-конце) под контролем промотора гена белка 7,5К вируса осповакцины. Then, the DNA of plasmid pTK1285 is hydrolyzed by SalGI and EcoRI restriction endonucleases, after which the hydrolysis product using T4 phage DNA ligase is connected to fragments of SalGI-BamHI of plasmid p7.5K and BamHI-EcoRI of plasmid pVE5. After transformation of E. coli cells, a plasmid designated pVE5.1 is isolated from the grown clones. This plasmid contains the vaccinia virus thymidine kinase gene, the LIVP strain, in the coding part of which is inserted the cDNA copy sequence of 26 S RNA of the VEL virus (with a possible concomitant fragment of another plasmid at its 3'-end) under the control of the protein gene gene promoter of the vaccinia virus 7.5K.

Второй этап работы заключается в осуществлении рекомбинации между ДНК коммерческого штамма ЛИВП вируса осповакцины и ТК-плечами плазмиды pVE5.1, что достигается путем контрансфекции ими монослоя клеток CV-1, инфицированного этим же вирусом, с последующей селекцией рекомбинантных клонов осповакцины по приобретаемому ими ТК^- -фенотипу на культуре клеток Human 143 (ТК^-) в присутствии 5-бром-2'-дезоксиуридина и способности гибридизирования с радиоактивным зондом, комплементарным встроенным чужеродным генам, приготавливаемым на основе плазмиды pVE4. Дальнейшая характеризация клонов осповакцины проводится путем излучения продуктов экспрессии ее генов в культуре зараженных клеток с помощью сывороток, специфичных к поверхностным белкам ВЭЛ, а также путем изучения защитного эффекта против инфекции вирусом ВЭЛ, возникающего при иммунизации животных рекомбинантным вирусом осповакцины.The second stage of the work consists in the recombination between the DNA of a commercial strain of LIVP of the vaccinia virus and the TK arms of the plasmid pVE5.1, which is achieved by transfection of a monolayer of CV-1 cells infected with the same virus, followed by selection of recombinant vaccinia clones according to the TK acquired by them ^- -phenotype on Human 143 cell culture (TK ^- ) in the presence of 5-bromo-2'-deoxyuridine and the ability to hybridize with a radioactive probe complementary to the inserted foreign genes prepared on the basis of plasmid pVE4. Further characterization of smallpox vaccine clones is carried out by radiation of the products of expression of its genes in the culture of infected cells using sera specific for surface VEL proteins, as well as by studying the protective effect against infection with VEL virus resulting from immunization of animals with recombinant vaccinia virus.

Полученный в результате рекомбинантный штамм вируса осповакцины принадлежит к семейству Poxviridae роду Orthopoxvirus и обладает свойствами типичного представителя рода ортопоксвирусов. Имеет криптограмму: Т/2:160/5: X/^*:Y/0.The resulting recombinant strain of vaccinia virus belongs to the family Poxviridae of the genus Orthopoxvirus and has the properties of a typical representative of the genus orthopoxviruses. Has a cryptogram: T / 2: 160/5: X / ^* : Y / 0.

Вирионы имеют характерную форму брикета с размером 200х300 нм и по данным электронной микроскопии не отличаются от исходного штамма вируса осповакцины ЛИВП, то есть имеют нуклеопротеиновую сердцевину двояковогнутой формы, в углублениях которой расположены так называемые боковые тельца. Различают два типа варионов: внутриклеточный, покрытый одной липопротеиновой оболочкой, и внеклеточный, имеющий дополнительную оболочку, образующуюся в результате почкования вируса из клетки. Virions have a characteristic briquette shape with a size of 200x300 nm and, according to electron microscopy, do not differ from the original strain of the LIVP vaccinia virus, that is, they have a biconcave nucleoprotein core, in the recesses of which are the so-called side bodies. There are two types of varions: intracellular, coated with a single lipoprotein membrane, and extracellular, having an additional membrane resulting from budding of the virus from the cell.

Физико-биохимическая характеристика и культуральные свойства штамма. Physico-biochemical characteristics and cultural properties of the strain.

Основными компонентами вириона являются: белки (≈ 90%), липиды (≈ 5%) и ДНК (≈ 4% ). Геном рекомбинантного штамма вируса осповакцины представлен двухцепочечной ДНК размером ≈190000 п.н. которая в кодирующей части гена тимидинкиназы содержит ДНК-копию субгеномной 26 S РНК отечественного варианта вируса ВЭЛ Тринидад данки под контролем промотора белка 7,5К вируса осповакцины. В Hind III гидролизате изолированной вирусной ДНК рекомбинантного штамма вместо Hind III-K-фрагмента ДНК исходного штамма ЛИВП присутствуют два фрагмента, имеющих размеры около 800 и 9000 п.н. последний из которых по данным ДНК-ДНК блот-гибридизации содержит гены, кодированные в субгеномной 26 S РНК вируса ВЭЛ. The main components of the virion are: proteins (≈ 90%), lipids (≈ 5%) and DNA (≈ 4%). The genome of the recombinant strain of vaccinia virus is represented by double-stranded DNA with a size of ≈190000 bp which in the coding part of the thymidine kinase gene contains a DNA copy of the subgenomic 26 S RNA of the domestic variant of the VEL virus Trinidad dunky under the control of the protein promoter of 7.5K vaccinia virus. In the Hind III hydrolyzate of an isolated viral DNA of a recombinant strain, instead of the Hind III-K DNA fragment of the original LIVP strain, there are two fragments having sizes of about 800 and 9000 bp the last of which, according to DNA-DNA blot hybridization, contains genes encoded in the subgenomic 26 S RNA of the VEL virus.

При размножении рекомбинантного штамма на куриных эмбрионах характер поражений на хорионаллантоисной оболочке аналогичен поражениям, образуемым штаммом ЛИВП, и через 48 ч инкубации при 37^oC дает сливные поражения при дозе 10⁵ о.о.е. на эмбрион. Кроме того, полученный рекомбинантный штамм достоверно не отличается от штамма ЛИВП по продуктивности в монослое перевиваемых линий клеток CV-1, Human 143 (ТК^-), Rat 2 и суспензионной культуре ВНК21, давая конечные титры, аналогичные титрам исходного вируса осповакцины. В отличие от штамма ЛИВП полученный рекомбинантный штамм обладает ТК^--фенотипом и способен репродуцироваться на перевиваемых линиях клеток Human 143 (TK^-) и Rat 2 в присутствии 25 мкг/мл 5-бром-2'-дезоксиуридина.When the recombinant strain is propagated on chicken embryos, the nature of the lesions on the chorionallantoic membrane is similar to the lesions formed by the LIVP strain, and after 48 hours of incubation at 37 ^° C it produces confluent lesions at a dose of 10 ⁵ p.o.e. to the embryo. In addition, the resulting recombinant strain does not significantly differ from the LIVP strain in productivity in the monolayer of transplantable cell lines CV-1, Human 143 (TK ^- ), Rat 2 and suspension culture of BHK21, giving final titers similar to the titers of the original vaccinia virus. In contrast to the LIVP strain, the resulting recombinant strain has a TK ^- phenotype and is able to reproduce on transplantable Human 143 (TK ^- ) and Rat 2 cell lines in the presence of 25 μg / ml 5-bromo-2'-deoxyuridine.

Патогенность для животных. Pathogenicity for animals.

Исследование свойств полученного рекомбинантного штамма вируса осповакцины при внутрибрюшинном, подкожном и интраплантарном введении различных доз белым беспородным мышам, а также при внутрикожном введении кроликам показало, что по токсичности и некротической активности рекомбинантный штамм не отличается от исходного штамма ЛИВП. The study of the properties of the obtained recombinant strain of vaccinia virus with intraperitoneal, subcutaneous and intraplantary administration of various doses to white outbred mice, as well as with intradermal administration to rabbits, showed that the toxicity and necrotic activity of the recombinant strain does not differ from the original strain of LIVP.

Основным существенным отличием рекомбинантного штамма от штамма ЛИВП является способность экспрессировать на плазматической мембране инфицированных полученным штаммом клеток гликопротеины суперкапсидной оболочки вируса ВЭЛ. The main significant difference between the recombinant strain and the LIVP strain is the ability to express on the plasma membrane of the cells infected with the obtained strain glycoproteins of the supercapsid coat of the VEL virus.

Штамм рекомбинантного вируса осповакцины VR26S с встроенной ДНК-копией 26 S РНК отечественного варианта вируса ВЭЛ Тринидад данки в литературе не описан и обладает существенными отличиями от известных штаммов рекомбинантных вирусов. Данный штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов. Штамму присвоен номер депонента ГКВ N 944. The strain of recombinant smallpox vaccine virus VR26S with an integrated DNA copy of 26 S RNA of the domestic variant of the VEL virus Trinidad Dunks is not described in the literature and has significant differences from known strains of recombinant viruses. This strain was deposited in the State collection of viruses. The strain was assigned the number of the State Treasury bills depositor N 944.

Существенные отличия предлагаемого способа получения рекомбинантного вируса осповакцины заключаются в следующем: для встройки вирионных белков генов ВЭЛ в геном отечественного коммерческого штамма осповакцины ЛИВП может быть использована любая исходная плазмида, содержащая вставку ДНК, комплементарной COOH-концевой области гена белка NS4, начала субгеномной 26 S РНК ВЭЛ и последовательности, кодирующей структурные белки, включающей в себя гены белка С, Е3 и Е2; добавление к этой последовательности генов белков 6К и Е1 приводит к появлению более полноценного иммунного ответа к ВЭЛ у лабораторных животных после вакцинации таким вирусом рекомбинантной осповакцины. Вторым существенным отличием предлагаемого метода является использование в процессе конструирования рестриктазы ApaI. Сайт узнавания данной рестриктазы находится в последовательности гена белка NS4 непосредственно перед началом 26 S РНК и ее использование позволяет отщепить мешающие эффективной трансляции последовательности гена неструктурного белка без использования трудоемких процедур, таких как, например, гидролиз нуклеазой Bal 31. Significant differences of the proposed method for the production of recombinant vaccinia virus are as follows: for the insertion of virion proteins of the VEL genes into the genome of a domestic commercial strain of vaccine vaccine LIVP, any source plasmid containing an insert of DNA complementary to the COOH terminal region of the NS4 protein gene beginning of the subgenomic 26 S P gene can be used VAL and the sequence encoding structural proteins, including the genes of protein C, E3 and E2; the addition of 6K and E1 proteins to this sequence of genes leads to the appearance of a more complete immune response to VEL in laboratory animals after vaccination with such a virus of recombinant smallpox vaccine. The second significant difference of the proposed method is the use of ApaI restriction enzyme in the construction process. The recognition site for this restrictase is located in the NS4 protein gene sequence immediately before the start of 26 S RNA, and its use allows one to cleave interfering efficient translation of the non-structural protein gene sequence without the use of laborious procedures, such as, for example, Bal 31 nuclease hydrolysis.

Существенные признаки полученного штамма рекомбинантной осповакцины состоят в следующем:
во-первых, штамм получен на основе отечественного коммерческого вакцинного штамма вируса осповакцины ЛИВП;
во-вторых, на плазматической мембране клеток, инфицированных рекомбинантным вирусом, экспрессируются гликопротеины суперкапсидной оболочки вируса ВЭЛ;
в-третьих, двукратная иммунизация животных полученным штаммом вируса осповакцины приводит к появлению в их крови высокого титра антител, специфичных к вирусу ВЭЛ, и защите от летальной инфекции, вызываемой последующим введением больших доз вируса ВЭЛ.The essential features of the obtained strain of recombinant smallpox vaccine are as follows:
firstly, the strain was obtained on the basis of a domestic commercial vaccine strain of the vaccine virus LIVP;
secondly, glycoproteins of the supercapsid membrane of the VEL virus are expressed on the plasma membrane of cells infected with a recombinant virus;
thirdly, double immunization of animals with the obtained vaccinia virus strain leads to the appearance of a high titer of antibodies specific for the VEL virus in their blood and protection against lethal infection caused by the subsequent administration of large doses of the VEL virus.

Существенным признаком способа получения штамма рекомбинантного вируса осповакцины является то, что в геном отечественного коммерческого штамма ЛИВП вируса осповакцины встраивается чужеродный генетический материал, состоящий из генов структурных белков вируса ВЭЛ, штамм Тринидад данки (Сов), под контролем промотора гена белка 7,5К ОВ. Отбор клонов рекомбинантного штамма проводится по наличию эффекта защиты иммунизированных им лабораторных животных от летальной инфекции, вызываемой введением больших доз патогенного вируса ВЭЛ. An essential feature of the method for producing the recombinant vaccinia virus strain is that foreign genetic material consisting of structural proteins of the VEL virus strain Trinidad strain (Owls) is inserted into the genome of the domestic commercial vaccine strain of the vaccinia virus virus, the Trinidad danki (Owl) strain, under the control of the 7.5K OB protein gene promoter. The selection of clones of the recombinant strain is carried out by the presence of the effect of protecting the laboratory animals immunized by them against a lethal infection caused by the introduction of large doses of the pathogenic VEL virus.

На фиг. 1 показана схема конструирования генома штамма рекомбинантного вируса осповакцины, содержащего ДНК-копию 26 S РНК вируса ВЭЛ в составе гена тимидинкиназы под контролем промотора гена белка 7,5К. In FIG. 1 shows a design scheme for the genome of a recombinant vaccinia virus strain containing a DNA copy of 26 S RNA of the VEL virus as part of the thymidine kinase gene under the control of a 7.5K protein gene promoter.

Буквами обозначены сайты узнавания следующих рестриктаз: E EcoRI, B - BamHI, S SalGI, P PstI, A ApaI, C ClaI, X XmaI, H Hind III
В последней строке приведена схематическая карта рестрикции рестриктазой Hind III генома вируса осповакцины.The letters denote recognition sites of the following restriction enzymes: E EcoRI, B - BamHI, S SalGI, P PstI, A ApaI, C ClaI, X XmaI, H Hind III
The last line shows a schematic map of the restriction restriction enzyme Hind III of the vaccinia virus genome.

На фиг. 2 радиоиммунологический анализ проб с использованием: А) кроличьей антисыворотки против вируса ВЭЛ и Б) моноклонального антитела В5, специфичного к белку Е2 вируса ВЭЛ. In FIG. 2 radioimmunological analysis of samples using: A) a rabbit antiserum against the VEL virus and B) a monoclonal antibody B5 specific for the E2 protein of the VEL virus.

1,8 исходные клетки Human 143;
2,3 клетки Human 143, взятые через 4 и 8 ч после заражения исходным штаммом ЛИВП вируса осповакцины;
4,5 клетки Human 143, взятые через 4 ч после заражения рекомбинантными клонами 159 и 3110 соответственно;
6,7 то же самое, но через 8 ч после заражения;
9 то же, что и 3, но с использованием моноклонального антитела;
10,11 то же, что и 6, 7, но с использованием моноклонального антитела.1.8 human 143 parent cells;
2.3 Human 143 cells taken 4 and 8 hours after infection with the original strain of vaccine vaccinia virus;
4.5 Human 143 cells taken 4 hours after infection with recombinant clones 159 and 3110, respectively;
6.7 the same, but 8 hours after infection;
9 the same as 3, but using a monoclonal antibody;
10.11 the same as 6, 7, but using a monoclonal antibody.

Способ получения штамма рекомбинантного вируса осповакцины, экспрессирующего гены структурных белков ВЭЛ, его наработки, хранения и исследования иммуногенных свойств иллюстрируется следующими примерами:
Пример 1.A method of obtaining a strain of recombinant vaccinia virus expressing the genes of structural proteins VEL, its production, storage and study of immunogenic properties is illustrated by the following examples:
Example 1

Клетки бактерий Escherichia coli, содержащие плазмидную ДНК pVE4 (см. фиг. 1), наращивают в 100 мл бульона до насыщения. Плазмидную ДНК выделяют согласно общепринятой методике. Проводят совместный гидролиз 1 мкг плазмидной ДНК рестриктазами ApaI (10 ед. акт.) и SalGI в течение 3 ч при 37^oC; после завершения инкубации следует фенольная депротеинизация с последующим спиртовым осаждением.Escherichia coli bacterial cells containing pVE4 plasmid DNA (see FIG. 1) are grown in 100 ml of broth to saturation. Plasmid DNA is isolated according to a conventional technique. Conduct a joint hydrolysis of 1 μg of plasmid DNA with restriction enzymes ApaI (10 units act.) And SalGI for 3 hours at 37 ^o C; after incubation, phenolic deproteinization follows, followed by alcohol precipitation.

Далее ведут достройку концов плазмидной ДНК до тупых, проводят в буфере В (0,033 М трис-ацетат pH 7,9; 0,66 М ацетат калия; 0,01 М ацетат магния; 0,001 М 2-меркаптоэтанол) ДНК-полимеразой фага Т4 (1 ед. акт.) (при комнатной температуре в течение 10 мин). Первые 2 мин инкубация проводится в отсутствии нуклеозидтрифосфатов, затем их добавляют до концентрации 0,1 мМ. После фенольной депротеинизации и спиртового осаждения плазмиду циклизуют с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (0,1 ед. акт.) в буфере C (0,05 М трис-HCl pH 7,5; 0,025 М MgCl₂; 0,01 М NaCl; 0,005 М 2-меркаптоэтанол; 0,1 мМ АТФ) в течение 1 ч при 12^oC.Next, the ends of the plasmid DNA are completed to blunt ones, carried out in buffer B (0.033 M tris-acetate pH 7.9; 0.66 M potassium acetate; 0.01 M magnesium acetate; 0.001 M 2-mercaptoethanol) T4 DNA polymerase ( 1 unit act.) (At room temperature for 10 minutes). The first 2 min incubation is carried out in the absence of nucleoside triphosphates, then they are added to a concentration of 0.1 mm. After phenol deproteinization and alcohol precipitation, the plasmid is cyclized using T4 phage DNA ligase (0.1 unit act.) In buffer C (0.05 M Tris-HCl pH 7.5; 0.025 M MgCl ₂ ; 0.01 M NaCl ; 0.005 M 2-mercaptoethanol; 0.1 mM ATP) for 1 h at 12 ^o C.

Трансформацию клеток проводят следующим образом: 0,1 мл суспензии клеток E. coli jM 103 вносят в 20 мл питательного бульона LB и выращивают до титра 5•10⁸ клеток/мл. Клетки из 3 мл среды собирают центрифугированием (3000 об/мин, 10 мин, 0^oC), ресуспендируют в 1 мл буфера I (0,01 М MOPS pH 7,0; 0,01 М RbCl), осаждают центрифугированием, суспендируют в 1 мл буфера B (0,1 М MOPS pH 6,5; 0,05 М CaCl₂; 0,01 М RbCl) и оставляют на 15 мин во льду. После этого клетки снова собирают центрифугированием, суспендируют в 200 мкл буфера I, добавляют 3 мкл ДМСО, плазмидную ДНК в объеме 10 мкл и оставляют во льду на 30 мин. После завершения инкубации клеточную суспензию прогревают в течение 30 с при 44^oC, разбавляют в 25 раз бульоном LB, выдерживают 30 мин при 37^oC и высевают на агаризованную среду LB, содержащую ампициллин в концентрации 25 мкл/мл. Из клеток, выросших через 18 ч клонов, выделяют ДНК плазмиды, обозначенной нами как pVE5, по описанной выше методике. Данная плазмида содержит последовательность только ДНК-копии 26 S РНК вируса ВЭЛ без лишней 5'-концевой последовательности.Cell transformation is carried out as follows: 0.1 ml of a suspension of E. coli jM 103 cells is added to 20 ml of LB nutrient broth and grown to a titer of 5 • 10 ⁸ cells / ml. Cells from 3 ml of medium are harvested by centrifugation (3000 rpm, 10 min, 0 ^° C), resuspended in 1 ml of buffer I (0.01 M MOPS pH 7.0; 0.01 M RbCl), precipitated by centrifugation, suspended in 1 ml of buffer B (0.1 M MOPS pH 6.5; 0.05 M CaCl ₂ ; 0.01 M RbCl) and left for 15 minutes in ice. After that, the cells are again collected by centrifugation, suspended in 200 μl of buffer I, 3 μl of DMSO, plasmid DNA in a volume of 10 μl are added and left on ice for 30 minutes. After completion of the incubation, the cell suspension is heated for 30 s at 44 ^° C, diluted 25 times with LB broth, incubated for 30 minutes at 37 ^° C and plated on LB agar medium containing ampicillin at a concentration of 25 μl / ml. From cells grown after 18 h of clones, the plasmid DNA designated by us as pVE5 is isolated according to the method described above. This plasmid contains the sequence of only DNA copies of 26 S RNA of the VAL virus without an extra 5'-terminal sequence.

Гидролиз ДНК плазмид: pVE5 (10 мкг) рестриктазами BamHI и EcoRI, р7,5К (10 мкг) рестриктазами SalGI и BamHI, рТК1285 (10 мкг) рестриктазами SalGI и EcoRI, проводят, используя по 20 ед. акт. каждой из рестриктаз, в течение 8 ч при 37^oC. После фенольной депротеинизации фрагменты плазмид pVE5 и p7,5K были выделены путем разделения гидролизованной ДНК в 4% полиакриламидном геле с последующей электроэлюцией на бумагу DE-81.Hydrolysis of plasmid DNA: pVE5 (10 μg) with restriction enzymes BamHI and EcoRI, p7.5K (10 μg) with restriction enzymes SalGI and BamHI, pTK1285 (10 μg) with restriction enzymes SalGI and EcoRI, carried out using 20 units. Act. each of the restriction enzymes for 8 hours at 37 ^° C. After phenol deproteinization, fragments of plasmids pVE5 and p7.5K were isolated by separation of hydrolyzed DNA in a 4% polyacrylamide gel followed by electroelution onto DE-81 paper.

Соединение фрагментов плазмид pVE5 и p7,5K в составе плазмиды рТК1285 проводят в 10 мкл буфера С в вышеописанных условиях. Векторная линеаризованная плазмида и рестрикционные фрагменты подобраны таким образом, что возможен единственный вариант их взаимной сшивки. The connection of fragments of plasmids pVE5 and p7.5K in the plasmid pTK1285 is carried out in 10 μl of buffer C under the above conditions. The linearized vector plasmid and restriction fragments are selected in such a way that a single variant of their crosslinking is possible.

Полученную лигазную смесь используют для трансформации клеток E.coli, штамм jM 108. Условия трансформации описаны выше. Из клеток, выросших через 18 ч клонов, выделяют плазмидную ДНК в аналитических количествах и проводят анализ вставок с помощью рестриктаз EcoRI, PstI, SalGI и BamHI. Около 80% клонов содержат плазмиды с необходимыми последовательностями. Из этих клонов выделяют плазмиду, обозначенную нами как pVE5.1, которую после очистки щелочным методом и равновестным ультрацентрифугированием используют для проведения рекомбинации с геном вируса осповакцины. The resulting ligase mixture is used to transform E. coli cells, strain jM 108. The transformation conditions are described above. Analytical amounts of plasmid DNA were isolated from cells grown after 18 h of clones, and insert analysis was performed using restriction enzymes EcoRI, PstI, SalGI and BamHI. About 80% of the clones contain plasmids with the necessary sequences. A plasmid designated by us as pVE5.1 is isolated from these clones, which, after purification by the alkaline method and equilibrium ultracentrifugation, is used to carry out recombination with the vaccinia virus gene.

Для получения рекомбинантного варианта вируса осповакцины, экспрессирующего структурные белки вируса ВЭЛ, монослой культуры клеток CV-1 инфицируют вирусом осповакцины штамм ЛИВП (0,04-0,05 о.о.е./клетку) и инкубируют на среде MEM, содержащей 2% эмбриональной телячьей сыворотки (ТС). Через 2 ч после начала инфекции на монослой клеток (25 см²) наносят по 0,8 мл кальцийфосфатного преципитата ДНК pVE5.1.To obtain a recombinant variant of the vaccinia virus expressing the structural proteins of the VEL virus, the monolayer of the cell culture CV-1 is infected with the vaccinia virus strain LIVP (0.04-0.05 pu / cell) and incubated in MEM medium containing 2% fetal calf serum (TS). 2 hours after the onset of infection, 0.8 ml of calcium phosphate precipitate pVE5.1 was applied to the cell monolayer (25 cm ² ).

Монослой с нанесенным копреципитатом инкубируют 30 мин при 37^oC, заливают 7,2 мл среды МКМ, содержащей 8% ТС, инкубируют при 37^oC еще 4 ч, после чего меняют среду на 5 мл свежей и продолжают инкубацию при 37^oC еще в течение 48 ч. Затем клетки дважды замораживают оттаивают, ресуспендируют в среде и полученное таким образом вирусное потомство используют для селекции рекомбинантных вариантов вируса ОВ.The coprecipitate coated monolayer was incubated for 30 min at 37 ^° C, filled with 7.2 ml of MKM medium containing 8% TC, incubated at 37 ^° C for another 4 hours, after which the medium was changed to 5 ml fresh and incubation continued at 37 ^° C. within 48 hours. Then the cells are frozen twice thawed, resuspended in the medium, and the viral progeny thus obtained are used to select recombinant variants of the OB virus.

Селекцию проводят в несколько этапов согласно методике, описанной в [5]
Первый этап селекции заключается в клонировании вирусного потомства на монослое клеток Human 143 (TK^- в присутствии 5-бром-2'-дезоксиуридина. При этом отбираются клоны вируса ОВ, имеющие фенотип (ТК^-). Второй этап селекции состоит в анализе (TK^-) клонов ОВ методом дот-гибридизации на наличие в вирусном геноме встроенных генов. [³²P]-меченый зонд приготавливается на основе вставки плазмиды pVE4 методом никтрансляции согласно методике, описанной в [15]
В результате проведенного анализа было отобрано 2 клона рекомбинатного вируса ОВ: v713-31 и v713-15 со встроенными в геном последовательностями генов структурных белков ВЭЛ. После повторного клонирования вируса из этих клонов и гибридизации ДНК по аналогичной схеме с таким же зондом для дальнейшей работы были использованы клоны v713-159 и v 713-3110. После того, для постановки дополнительного контроля из рекомбинатного вируса путем фенольной экстракции согласно [5] была выделена геномная ДНК, которую гидролизовали рекстриктазой Hind III с последующим анализом фрагментов гидролиза электрофорезом в 0,8% агарозном геле согласно [15] при этом был обнаружен дополнительный фрагмент размером около 9000 п.о. содержащий последовательности части гена тимидинкиназы, 26 S РНК и РstI-EcoRI-фрагмента плазмиды pBR322. Вновь появившийся фрагмент гибридизуется с радиоактивным зондом, комплементарным генам структурных белков вируса.Selection is carried out in several stages according to the method described in [5]
The first selection step is the cloning of viral progeny in monolayer cells Human 143 (TK ^- in the presence of 5-bromo-2'-deoxyuridine Thus clones are selected OB virus having a phenotype (TK ^-..) The second step consists in the selection assay (TK ^- ) OB clones by dot-hybridization method for the presence of the inserted genes in the viral genome. [ ³² P] -labeled probe is prepared on the basis of the insertion of plasmid pVE4 by the method of no-translation according to the procedure described in [15]
As a result of the analysis, 2 clones of the recombinant OB virus were selected: v713-31 and v713-15 with the gene sequences of the VEL structural proteins genes integrated into the gene. After repeated cloning of the virus from these clones and DNA hybridization according to a similar scheme with the same probe, clones v713-159 and v 713-3110 were used for further work. After that, to establish additional control from the recombinant virus by phenol extraction according to [5], genomic DNA was isolated, which was hydrolyzed with Hind III rextectase followed by analysis of hydrolysis fragments by electrophoresis in 0.8% agarose gel according to [15], an additional fragment was found about 9000 bp containing sequences of a portion of the thymidine kinase gene, 26 S RNA, and PstI-EcoRI fragment of plasmid pBR322. The newly emerged fragment hybridizes with a radioactive probe, complementary to the genes of the structural proteins of the virus.

Клоны полученного рекомбинантного вируса ОВ были наработаны на культуре клеток ВНК-21 и очищены по [11] Эти вирусные препараты были использованы для заражения монослоя клеток Human 143 с множественностью 10-20 00E/клетку. Уже через четыре часа после заражения на поверхностной мембране клеток с помощью твердофазного радиоиммунного анализа, описанного в [10] были выявлены структурные белки ВЭЛ. В этих экспериментах были использованы гипериммунные кроличьи сыворотки, специфичные к вирионным белкам ВЭЛ. Результаты этих экспериментов приведены на фиг. 2. Clones of the obtained recombinant OB virus were obtained on a BHK-21 cell culture and purified according to [11]. These viral preparations were used to infect a monolayer of Human 143 cells with a multiplicity of 10–20 00E / cell. Four hours after infection, on the surface membrane of cells using solid-phase radioimmunoassay described in [10], structural proteins of VEL were detected. In these experiments, hyperimmune rabbit sera specific for VEL virion proteins were used. The results of these experiments are shown in FIG. 2.

Пример 2. Example 2

Клетки бактерий E.coli, содержащие плазмидную ДНК pVET7-91 с полноразмерной ДНК-копией генома вируса ВЭЛ, имеющую на 3'-конце сайт узнавания рестриктазы Hind III, наращивают в 100 мл бульона до насыщения. Плазмидную ДНК выделяют согласно общепринятой методике. Далее 10 мкг плазмиды гидролизуют рестриктазой ApaI (10 ед. активности, 3 ч, 37^oC) и после фенольной депротеинизации и спиртового осаждения достраивают концы линеаризованной плазмидной ДНК до тупых, как и в примере 1. После фенольной обработки и спиртового осаждения плазмидную ДНК дорезают рестриктазой Hind III и с помощью гель-электрофореза и электроэлюции на бумагу DE-81 выделяют фрагмент ≈ 4000 п.о. согласно методике [15] Векторную плазмиду pUC8 линеарезуют рестриктазой SalGI и достраивают ее концы до тупых фрагментом Кленова ДНК-полимеразы из E. coli, согласно [15] затем проводят дополнительный гидролиз рестриктазой EcoRI. Полученный вектор циклизуют с помощью ДНК-лигазы фага Т4, согласно описанной в примере 1 методике, в присутствии выделенного при помощи рестриктазы ApaI фрагмента ≈ 4000 п.о. плазмиды pVET7-91 и дополнительного EcoRI-Hind III полилинкерного фрагмента из плазмиды pUC18, имеющего размер 55 п. о. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli, выросшие в присутствии ампициллина на LB-агаре колоний, нарабатывают в аналитических количествах в LB-бульоне и выделяют из них плазмидные ДНК, которые анализируют на наличие и правильную ориентацию встройки при помощи рестриктаз BamHI и EcoRI.E.coli bacterial cells containing plasmid DNA pVET7-91 with a full-length DNA copy of the VEL genome having the Hind III restriction enzyme recognition site at the 3'-end are grown in 100 ml of broth to saturation. Plasmid DNA is isolated according to a conventional technique. Next, 10 μg of the plasmid is hydrolyzed with ApaI restriction enzyme (10 units of activity, 3 h, 37 ^° C) and, after phenol deproteinization and alcohol precipitation, the ends of the linearized plasmid DNA are extruded to blunt ones, as in Example 1. After phenol treatment and alcohol precipitation, the plasmid DNA is cut restriction enzyme Hind III and using gel electrophoresis and electroelution on a DE-81 paper, a fragment of ≈ 4000 bp is isolated. according to the technique of [15], the vector plasmid pUC8 is linearized with SalGI restrictase and the ends thereof are blunted with a maple fragment of E. coli DNA polymerase; according to [15], additional hydrolysis with restriction enzyme EcoRI is carried out. The resulting vector is cyclized using T4 phage DNA ligase, according to the procedure described in Example 1, in the presence of a fragment of ≈ 4000 bp isolated with ApaI restriction enzyme. plasmids pVET7-91 and an additional EcoRI-Hind III polylinker fragment from plasmid pUC18 having a size of 55 bp The E. coli cells grown in the presence of ampicillin on the LB agar of the colonies are transformed with the obtained ligase mixture, they are produced in analytical quantities in the LB broth and plasmid DNA is isolated from them, which are analyzed for the presence and correct orientation of the insert using BamHI and EcoRI restriction enzymes.

Полученная в результате этих генно-инженерных манипуляций плазмида содержит последовательность только ДНК-копии 26 S РНК вируса ВЭЛ без лишней 5'-концевой последовательности и полностью эквивалентна плазмиде pVE5 по расположению сайтов узнавания используемых далее рестриктаз (см. схему конструирования рекомбинантного вирусного генома на фиг. 1). ДНК сконструированной плазмиды используют далее для получения инсерционной плазмиды pVE5.1, как описано в примере 1. The plasmid obtained as a result of these genetic engineering manipulations contains only a DNA copy of 26 S RNA of the VEL virus without an extra 5'-terminal sequence and is completely equivalent to plasmid pVE5 at the location of the recognition sites of the restriction enzymes used below (see the design scheme for the recombinant viral genome in FIG. 1). The DNA of the constructed plasmid is further used to obtain the insertion plasmid pVE5.1, as described in example 1.

Пример 3. Example 3

Клетки бактерий E. coli, содержащие плазмидную ДНК pVE-147, несущую встройку 9800 3'-концевых оснований ДНК-копии генома вируса ВЭЛ и имеющую на 3'-конце этой встройки сайт узнавания рестриктазы Hind III, наращивают в 100 мл бульона до насыщения. Плазмидную ДНК выделяют согласно общепринятой методике. Далее 10 мкг плазмиды гидролизуют рестриктазой ApaI (10 ед. активности, 3 ч, 37^oC) и после фенольной депротеинизации и спиртового осаждения достраивают концы линеаризованной плазмидной ДНК до тупых как и в примере 1. После фенольной обработки и спиртового осаждения плазмидную ДНК дорезают рестриктазой Hind III и с помощью гель-электрофореза и электроэлюции на бумагу DE-81 выделяют фрагмент ≈ 4000 п.о. согласно методике [15] Векторную плазмиду pUC8 линеаризуют рестриктазой SalGI и достраивают ее концы до тупых фрагментом Кленова ДНК-полимеразы из E.coli, согласно [15] затем проводят дополнительный гидролиз рестриктазой EcoRI. Полученный вектор циклизуют с помощью ДНК-лигазы фага Т4, согласно описанной в примере 1 методике, в присутствии выделенного при помощи рестриктазы ApaI фрагмента ≈ 4000 п.о. плазмиды pVE-147 и дополнительного EcoRI-Hind III полилинкерного фрагмента из плазмиды pUC18, имеющего размер 55 п.о. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli, выросшие в присутствии ампициллина на LB-агаре колоний, нарабатывают в аналитических количествах в LB-бульоне и выделяют из них плазмидные ДНК, которые анализируют на наличие и правильную ориентацию встройки при помощи рестриктаз BamHI и EcoRI.E. coli bacteria cells containing pVE-147 plasmid DNA carrying the 9800 3'-terminal base of the DNA copy of the VEL genome and having the Hind III restriction enzyme recognition site at the 3'-end of this insert are expanded in 100 ml of broth until saturation. Plasmid DNA is isolated according to a conventional technique. Next, 10 μg of the plasmid is hydrolyzed with restriction enzyme ApaI (10 units of activity, 3 h, 37 ^° C) and after phenol deproteinization and alcohol deposition the ends of the linearized plasmid DNA are extruded to blunt as in Example 1. After phenol treatment and alcohol deposition, the plasmid DNA is cut with restriction enzyme Hind III and using gel electrophoresis and electroelution on a DE-81 paper, a fragment of ≈ 4000 bp is isolated. according to the procedure [15], the vector plasmid pUC8 is linearized with the SalGI restrictase and extends its ends to the blunt Klenow fragment of E. coli DNA polymerase; according to [15], additional hydrolysis with the restriction enzyme EcoRI is carried out. The resulting vector is cyclized using T4 phage DNA ligase, according to the procedure described in Example 1, in the presence of a fragment of ≈ 4000 bp isolated with ApaI restriction enzyme. plasmid pVE-147 and an additional EcoRI-Hind III polylinker fragment from plasmid pUC18 having a size of 55 bp The E. coli cells grown in the presence of ampicillin on the LB agar of the colonies are transformed with the obtained ligase mixture, they are produced in analytical quantities in the LB broth and plasmid DNA is isolated from them, which are analyzed for the presence and correct orientation of the insert using BamHI and EcoRI restriction enzymes.

Пример 4. Example 4

100-300 шт 11-дневных куриных эмбрионов инфицируют маточным материалом рекомбинантного вируса осповакцины VR26S, вводя внутрь воздушного мешка на хорионаллантоисную оболочку (ХАО) эмбриона по 0,1-0,2 мл вируссодержащей суспензии, имеющей титр 10⁵ 10⁶ о.о.е./мл. Зараженные эмбрионы инкубируют 48 ч при 37^oC, затем стерильно вскрывают и отделяют участки ХАО со сливным поражением. Собранный материал отмывают от посторонних включений в стерильном растворе Хенкса, добавляют к нему 2 объема стерильного 0,01 М буферного раствора трис-HCl pH 9,0 и гомогенизируют 5 мин в механическом гомогенизаторе, охлаждая смесь на ледяной бане. Полученную суспензию осветляют центрифугированием (10 мин, 750 g, 4^oC), полученный в результате супернатант наслаивают на 1/5 от объема супернатанта часть 36% раствора сахарозы в 0,01 М трис-HCl pH 9,0 и центрифугируют (30 мин, 23000 g, 4^oC). Все супернатанты осторожно удаляют, а осадок ресуспендируют в 40 мл 0,01 М раствора трис-HCl pH 9,0 гомогенизируют 1 мин и 30 с обрабатывают ультразвуком, а затем повторяют этап центрифугирования через "подушку" 36% раствора сахарозы. Полученный осадок молочнобелого цвета суспендируют в стерильном растворе Хенкса из расчета 1 мл на 5 инфицированных эмбрионов, обрабатывают 30 с ультразвуком, расфасовывают по 1 мл в стерильные микропробирки, замораживают и хранят до использования при -40^oC. Для определения титра вируса в полученном материале, обычно имеющего значения ≈ 4•10⁸ о.о.е./мл. размораживают одну из аликвот. Все операции по инфицированию, обработке куриных эмбрионов и очистке вируса проводят в стерильных условиях.100-300 pcs of 11-day-old chicken embryos are infected with the mother material of the recombinant vaccinia virus VR26S, introducing 0.1-0.2 ml of a virus-containing suspension with a titer of 10 ⁵ 10 ⁶ o.o. into the chorionallantoic membrane (CAO) of the embryo. e. / ml. Infected embryos are incubated for 48 hours at 37 ^° C, then sterilely opened and sections of the CAO with drainage lesion are separated. The collected material is washed from foreign matter in a Hanks sterile solution, 2 volumes of a sterile 0.01 M Tris-HCl pH 9.0 buffer solution are added to it and homogenized for 5 min in a mechanical homogenizer, cooling the mixture in an ice bath. The resulting suspension is clarified by centrifugation (10 min, 750 g, 4 ^° C), the resulting supernatant is layered on 1/5 of the volume of the supernatant part of a 36% sucrose solution in 0.01 M Tris-HCl pH 9.0 and centrifuged (30 min , 23000 g, 4 ^° C). All supernatants were carefully removed, and the pellet was resuspended in 40 ml of a 0.01 M Tris-HCl solution, pH 9.0, homogenized for 1 min and sonicated for 30 s, and then the centrifugation step was repeated through a “pad” of a 36% sucrose solution. The resulting milky-white precipitate was suspended in a Hanks sterile solution at a rate of 1 ml per 5 infected embryos, treated with 30 ultrasound, packaged in sterile microtubes 1 ml, frozen and stored until use at -40 ^o C. To determine the titer of the virus in the obtained material, usually having values ≈ 4 • 10 ⁸ p.u./ml thaw one of the aliquots. All operations on infection, processing of chicken embryos and purification of the virus are carried out under sterile conditions.

Для длительного хранения препаратов рекомбинантного штамма применяют технологию хранения природных штаммов ортопоксвирусов. Осветленную суспензию гомогената ХАО инфицированных куриных эмбрионов лиофильно высушивают на коллекторной сушильной установке в течение 22-24 ч. Готовые препараты хранят в ампулах, запаянных под вакуумом, при температуре минус (20±2^o)C.For long-term storage of preparations of a recombinant strain, storage technology of natural strains of orthopoxviruses is used. The clarified suspension of the HAO homogenate of infected chicken embryos is freeze-dried on a collector-drying unit for 22-24 hours. The prepared preparations are stored in ampoules sealed under vacuum at a temperature of minus (20 ± 2 ^° C).

Пример 5. Example 5

Маточный материал рекомбинантного вируса осповакцины, прошедший контроль на стерильность и наличие посторонних гемагглютинирующих примесей, с определенным титром, вводят внутрикожно в 3-4 точки лопаточной области кроликам весом 3-4 кг. Таким же образом проводится повторная вакцинация через 28 дней. Инфицирующая доза рекомбинантного вируса ОВ в обоих случаях составляет 5•10⁷ 10⁹ 00E на каждого кролика. Через 7 дней после повторной иммунизации каждому животному вводится подкожно по 100 ЛД₅₀ вируса ВЭЛ. Наблюдение за кроликами проводится еще в течение 14 дней. Все кролики, прошедшие двукратную иммунизацию, остаются живы и не обнаруживают признаков заболевания, тогда как все не вакцинированные или вакцинированные теми же дозами исходного коммерческого штамма вируса осповакцины ЛИВП, погибают на 5-7 день.The mother material of the recombinant vaccinia virus, which has passed the sterility test and the presence of extraneous hemagglutinating impurities, with a certain titer, is injected intradermally into 3-4 points of the scapular region of rabbits weighing 3-4 kg. In the same way, re-vaccination is performed after 28 days. The infectious dose of the recombinant OB virus in both cases is 5 • 10 ⁷ 10 ⁹ 00E for each rabbit. 7 days after re-immunization, 100 LD ₅₀ of the VEL virus are subcutaneously administered to each animal. Observation of rabbits is carried out for another 14 days. All rabbits that underwent double immunization remain alive and show no signs of disease, while all those who are not vaccinated or vaccinated with the same doses of the initial commercial strain of vaccine, LIVP vaccine, die on day 5-7.

Тот же маточный материал рекомбинантного вируса вводят внутрибрюшинно беспородным белым мышам самцам весом 7-10 г в дозе 10⁷ о.о.е. на мышь. Повторную иммунизацию такой же дозой проводят на 21 день, а еще через 7 дней мышам вводят подкожно по 100 ЛД₅₀ вируса ВЭЛ. В этом эксперименте в качестве контрольных были использованы группы чистых мышей и мышей, прошедших двух- и однократную иммунизацию такими же дозами исходного штамма вируса ОВ ЛИВП.The same uterine material of the recombinant virus is administered intraperitoneally to outbred white mice males weighing 7-10 g at a dose of 10 ⁷ p.u. on the mouse. Re-immunization with the same dose is carried out on day 21, and after another 7 days, mice are injected subcutaneously with 100 LD ₅₀ of the VEL virus. In this experiment, groups of pure mice and mice that underwent two- and single-shot immunization with the same doses of the initial strain of the LIVP OB virus were used as controls.

Результаты эксперимента приведены в табл. 1. The results of the experiment are given in table. one.

У вакцинированных животных в разные сроки после иммунизации вирусом рекомбинантной ОВ берут кровь для определения концентрации антител, специфичных к ВЭЛ. Для этого используют следующий вариант твердофазного радиоиммунного анализа: 300 нг вируса ВЭЛ в 10 мкл буфера TBS (0,01 М трис-HCl pH 7,5; 0,1 М NaCl), содержащего 1% додецилсульфата натрия, наносят в лунки полистирольных плат и высушивают при 37^oC, лунки промывают этанолом и инкубируют с 20 мл буфера РИА (0,05 М трис-HCl pH 7,5; 0,5 М LiCl; 0,15 М NaCl; 0,1% тритон X 100), содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина, а затем с 20 мкл буфера РИА, содержащего 5-кратные разведения сыворотки (по 1 ч при 37^oC); после завершения инкубации лунки промывают и вносят по 20 мкл раствора [¹²⁵I] меченого белка A (в каждую лунку по 2•10⁵ имп/мин), инкубируют 1 ч при 37^oC и отмывают от несвязавшейся радиоактивности буфером РИА. Связавшийся радиоактивный белок А смывают М NaOH, определение радиоактивности проводят на радиоспектрометре. В случае анализа мышиных сывороток перед связыванием [¹²⁵I]-меченого белка А необходима дополнительная инкубация с кроличьей сывороткой против мышиных IgG. Под титром сыворотки понимается максимальное ее разведение, при котором количество связавшегося белка А в 2 раза превышает фоновые значения.In vaccinated animals, blood is taken at different times after immunization with the recombinant OB virus to determine the concentration of antibodies specific for VEL. To do this, use the following variant of solid-phase radioimmunoassay: 300 ng of VEL virus in 10 μl of TBS buffer (0.01 M Tris-HCl pH 7.5; 0.1 M NaCl) containing 1% sodium dodecyl sulfate is applied to the wells of polystyrene plates and dried at 37 ^o C, the wells are washed with ethanol and incubated with 20 ml of RIA buffer (0.05 M Tris-HCl pH 7.5; 0.5 M LiCl; 0.15 M NaCl; 0.1% Triton X 100), containing 1% bovine serum albumin, and then with 20 μl of RIA buffer containing 5-fold dilutions of serum (1 h at 37 ^o C); after the incubation is complete, the wells are washed and 20 μl of a solution of [ ¹²⁵ I] labeled protein A are added (2 x 10 ⁵ cpm per minute), incubated for 1 h at 37 ^° C and washed from unbound radioactivity with RIA buffer. The bound radioactive protein A is washed off with M NaOH, the radioactivity is determined on a radio spectrometer. In the case of analysis of murine sera, before binding of the [ ¹²⁵ I] -labeled protein A, additional incubation with rabbit serum against mouse IgG is required. Serum titer refers to its maximum dilution, in which the amount of bound protein A is 2 times higher than background values.

Результаты приведены в табл. 2. The results are shown in table. 2.

Из этих данных следует, что двукратная иммунизация лабораторных животных получаемым штаммом рекомбинантного вируса осповакцины приводит к появлению у них в крови высокой концентрации антител, специфично связывающихся со структурными белками ВЭЛ. From these data it follows that two-fold immunization of laboratory animals with the obtained strain of recombinant vaccinia virus leads to the appearance in their blood of a high concentration of antibodies that specifically bind to the structural proteins of VEL.

Предлагаемое изобретение позволяет получить штамм рекомбинантного вируса осповакцины, вызывающего синтез всех структурных белков ВЭЛ в инфицированных клетках, наработку в высокой концентрации антител к вирусу ВЭЛ в организме вакцинированных рекомбинантной вакциной животных, а также защиту животных от летальной инфекции ВЭЛ. The present invention allows to obtain a strain of recombinant vaccinia virus, which causes the synthesis of all structural VEL proteins in infected cells, the production of high concentration of antibodies to the VEL virus in the body of animals vaccinated with the recombinant vaccine, as well as the protection of animals from lethal VEL infection.

Титр антител, специфичных к белкам ВЭЛ, в сыворотке крови дважды вакцинированных таким же штаммом животных составляет 1: 3000 1: 4000 для кроликов и 1: 625 1: 2000 для мышей. The titer of antibodies specific for VEL proteins in blood serum of animals twice vaccinated with the same strain is 1: 3000 1: 4000 for rabbits and 1: 625 1: 2000 for mice.

Такая концентрация специфических иммуноглобулинов сравнима с концентрацией аналогичных антител, появляющихся в крови после иммунизации животных вакцинными штаммами ВЭЛ и в десятки раз превышает концентрацию антител в крови животных, иммунизированных убитыми цельновирионными вакцинами. This concentration of specific immunoglobulins is comparable to the concentration of similar antibodies that appear in the blood after immunization of animals with vaccine strains of VEL and is ten times higher than the concentration of antibodies in the blood of animals immunized with killed whole virus vaccines.

Такой рекомбинантный вирус осповакцины может быть основой для разработки нового поколения вакцин против ВЭЛ и приготовления иммунологических диагностикумов. По сравнению с аттенуированными штаммами рекомбинантный вирус ОВ не может обладать способностью реверсии к патогенному штамму ВЭЛ, не реактогенен, легко нарабатывается и не требует при работе с ним специальных мер предосторожности. По сравнению с убитыми цельновирионными вакцинами такой штамм имеет следующие преимущества: во-первых, не нужны крупномасштабные наработки с последующим выделением вируса, что может значительно снизить себестоимость вакцин; во-вторых, для убитых вакцин не исключена возможность неполной инактивации активного материала, что приводит к развитию заболевания, живая вакцина на основе рекомбинантной ОВ такими недостатками обладать не будет. Such a recombinant vaccinia virus can be the basis for the development of a new generation of VAL vaccines and the preparation of immunological diagnostics. Compared with attenuated strains, the recombinant OB virus cannot be capable of reversing to a pathogenic strain of VEL, it is not reactogenic, it is easily developed, and it does not require special precautions when working with it. Compared to killed whole-virion vaccines, such a strain has the following advantages: firstly, large-scale developments with the subsequent isolation of the virus are not needed, which can significantly reduce the cost of vaccines; secondly, for killed vaccines, the possibility of incomplete inactivation of the active material is not excluded, which leads to the development of the disease, a live vaccine based on recombinant OM will not have such drawbacks.

Полученный положительный эффект достигается за счет встройки полноразмерной ДНК-копии 26 S РНК, кодирующей структурные белки ВЭЛ под контролем промотора гена белка 7,5К осповакцины в ген тимидинкиназы генома коммерческого штамма осповакцины ЛИВП. Эффективность экспрессии генов ВЭЛ этим штаммом обеспечивается за счет использования фрагмента ДНК, включающего в себя ДНК-копию области только генов структурных белков геноса ВЭЛ, что приводит к сохранению правильного места инициации синтеза белка-предшественника, порядка трансляции и транспорта структурных белков ВЭЛ на клеточную мембрану, где они с большой эффективностью представляются иммунной системе организма. Высокая эффективность транскрипции обеспечивается использованием природного сильного промотора гена белка 7,5К вируса осповакцины, это определяет высокую эффективность работы собранной конструкции. The obtained positive effect is achieved by embedding a full-sized DNA copy of 26 S RNA encoding the structural proteins of the VEL under the control of the 7.5K protein vaccine gene vaccinia vaccine into the thymidine kinase gene of the genome of the commercial vaccine vaccine strain LIVP. The efficiency of expression of VAL genes by this strain is ensured by the use of a DNA fragment that includes a DNA copy of the region of genes of structural proteins of the VEL genes only, which leads to the preservation of the correct place for the initiation of the synthesis of the precursor protein, the order of translation and transport of VEL structural proteins to the cell membrane, where they appear with great efficiency to the body’s immune system. High transcription efficiency is ensured by the use of the natural strong promoter of the vaccinia virus 7.5K protein gene gene; this determines the high efficiency of the assembled construct.

Таким образом, предлагаемый способ конструирования позволяет получить штамм рекомбинантного вируса осповакцины, обеспечивающий защиту лабораторных животных от летальной инфекции, называемой вирусом Венесуэльского энцефаломиелита лошадей. Thus, the proposed design method allows to obtain a strain of recombinant vaccinia virus virus that protects laboratory animals from a lethal infection called the Venezuelan encephalomyelitis virus in horses.

ЛИТЕРАТУРА
1. Berge T.O. Banks I.O. Tigertt W.D. Attenuation of Venezuelan equine encephalomyelitis virus by in vitro cultivation in guinea-pig heart cells. //American Journal of Higiene. 1961. V.73. P. 209-218.LITERATURE
1. Berge TO Banks IO Tigertt WD Attenuation of Venezuelan equine encephalomyelitis virus by in vitro cultivation in guinea-pig heart cells. // American Journal of Higiene. 1961. V.73. P. 209-218.

2. McKinney R.W. Inactivated and live VEE vaccines-a review. // In Venezuelan encephalitis. Scientific Publication: Washington, D.C. Pan American Health Organization. 1972. N 243. P. 369-384. 2. McKinney R.W. Inactivated and live VEE vaccines-a review. // In Venezuelan encephalitis. Scientific Publication: Washington, D.C. Pan American Health Organization. 1972. N 243. P. 369-384.

3. London W.T. Levitt N.H. Kent S.G. Wong V.G. Sever J.L. Corgenital cerebral and ocular malformations induced in Rhesus monkeys by Venezuelan equine encephalitis virus. // Teratology. 1977. V.16. P. 285-296. 3. London W.T. Levitt N.H. Kent S.G. Wong V.G. Sever J.L. Corgenital cerebral and ocular malformations induced in Rhesus monkeys by Venezuelan equine encephalitis virus. // Teratology. 1977. V.16. P. 285-296.

4. Edelman A. Asher M.S. Oster C.N. Evaluation in human of a new inactivated vaccine for Venezuelan equine encephalitis virus (C-84) // J. Inphect. Dis. 1979. V.140. N 5. P. 516-520. 4. Edelman A. Asher M.S. Oster C.N. Evaluation in human of a new inactivated vaccine for Venezuelan equine encephalitis virus (C-84) // J. Inphect. Dis. 1979.V.140. N 5. P. 516-520.

5. Мэкетт М. Смит Дж. Мосс Б. Создание рекомбинантных конструкций на основе вируса осповакцины для экспрессии чужеродных генов. // Клонирование ДНК. Методы. Мир: М. 1988 г. 538 с. 5. Mackett M. Smith, J. Moss B. Creation of recombinant constructs based on the vaccinia virus for the expression of foreign genes. // DNA cloning. Methods World: M. 1988 538 p.

6. Smith G.L. Murphy B.R. Moss B. Construction and characterization of an infectious vaccinia virus recombinant that expresses the influenza hemagglutinin gene and induces resistance to influenza virus infection in hamsters. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. V.80. N 3. P. 7155-7159. 6. Smith G.L. Murphy B.R. Moss B. Construction and characterization of an infectious vaccinia virus recombinant that expresses the influenza hemagglutinin gene and induces resistance to influenza virus infection in hamsters. // Proc. Natl. Acad Sci. USA 1983. V.80. N 3. P. 7155-7159.

7. Mackett M. Gilma T. Rose G.K. Moss B. Vaccinia virus recombinants: expression of VSV genes and protective immunization of mice and cattle. // Science. 1985. V.227. N 4552. P. 433-435. 7. Mackett M. Gilma T. Rose G.K. Moss B. Vaccinia virus recombinants: expression of VSV genes and protective immunization of mice and cattle. // Science. 1985. V.227. N 4552. P. 433-435.

8. Kieny M. P. Lathe R. Drillien R. et al. Expression of rabies virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus. // Nature. 1984. V.132. - P. 163-166. 8. Kieny M. P. Lathe R. Drillien R. et al. Expression of rabies virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus. // Nature. 1984. V.132. - P. 163-166.

9. Langfort C. G. Stirling G.E. Smith G.L. et al. Anchoring a secreted plasmodium antigen on the surface of recombinant vaccinia virus infected cells increased its immunogeneicity. // Mol. Cell. Biol. 1986. V.6. N 9. P. 3191-3199. 9. Langfort C. G. Stirling G.E. Smith G.L. et al. Anchoring a secreted plasmodium antigen on the surface of recombinant vaccinia virus infected cells increased its immunogeneicity. // Mol. Cell. Biol. 1986. V.6. N 9. P. 3191-3199.

10. Rice C.M. Franke C.A. Strauss J.H. Hruby D.E. Expression of Sindbis virus structural proteins via recombinant vaccinia virus: synthesis, processing, and incorporating into mature Sindbis virions. // J. Virol. - 1985. V. 56. N 1. P. 227-229. 10. Rice C.M. Franke C.A. Strauss J.H. Hruby D.E. Expression of Sindbis virus structural proteins via recombinant vaccinia virus: synthesis, processing, and incorporating into mature Sindbis virions. // J. Virol. - 1985. V. 56. N 1. P. 227-229.

11. Kinney R.M. Esposito J.J. Johnson B.L.B. Roehrig J.T. Matheus J.H. Barrett A.D.T. Trend D.W. (1988) Recombinant vaccinia/Venezuelan equine encephalitis (VEE) virus expresses VEE structural proteins. // J. gen. Virol. 1988. V.69. N 12. P. 3005-3013. 11. Kinney R.M. Esposito J.J. Johnson B.L.B. Roehrig J.T. Matheus J.H. Barrett A.D.T. Trend D.W. (1988) Recombinant vaccinia / Venezuelan equine encephalitis (VEE) virus expresses VEE structural proteins. // J. gen. Virol. 1988. V.69. N 12. P. 3005-3013.

12. Фролов И.В. Колыхалов А.А. Волчков В.Е. Нетесов С.В. Сандахчиев Л.С. Сравнение аминокислотных последовательностей структурных белков аттенуированных и патогенных штаммов вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей. // Доклады АН СССР. 1991. Т.318. N 6. С. 1488-1491. 12. Frolov I.V. Kolykhalov A.A. Volchkov V.E. Netesov S.V. Sandakhchiev L.S. Comparison of amino acid sequences of structural proteins of attenuated and pathogenic strains of the Venezuelan encephalomyelitis virus in horses. // Reports of the USSR Academy of Sciences. 1991.V. 318. N 6. S. 1488-1491.

13. Venkatesan S. Baroudy B.M. Moss B. Distinctive nucleotide sequences adjacent to multiple initiation and termination sites of an early vaccinia virus gene. // Cell. 1981. V.25. N 3. P. 805-813. 13. Venkatesan S. Baroudy B.M. Moss B. Distinctive nucleotide sequences adjacent to multiple initiation and termination sites of an early vaccinia virus gene. // Cell. 1981. V.25. N 3. P. 805-813.

14. Урманов И.Х. Приходько Г.Г. Серпинский О.И. Микрюков Н.Н. Чижиков В. Е. Плазмида pTK1285 для введения чужеродных генов в геном вируса осповакцины и метод ее конструирования. // Авторское свидетельство N 1640164. 8 декабря 1990 г. 14. Urmanov I.Kh. Prikhodko G.G. Sierpinsky O.I. Mikryukov N.N. Chizhikov V.E. Plasmid pTK1285 for the introduction of foreign genes into the genome of the vaccinia virus and its construction method. // Copyright certificate N 1640164. December 8, 1990

15. Маниатис Т. Фрич Э. Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии. Мир: М. 1984. 480 с. 15. Maniatis T. Fritsch E. Sambrook J. Molecular Cloning. Methods of genetic engineering. World: M. 1984. 480 p.

Claims

1. The strain of the recombinant vaccinia virus HBV vaccine N 944, expressing the structural proteins of the virus of Venezuelan encephalomyelitis in horses and suitable for the production of immunobiological preparations.

2. A method of obtaining a strain of recombinant vaccinia virus HBV vaccine N 944, which consists in the fact that from the original plasmid of the pUC8 series containing a DNA copy of 26S-RNA of the virus of Venezuelan encephalomyelitis in horses (VVEL) with a length of not less than 4000 bp having the EcoRI restriction enzyme recognition site at the 3'-end and the conjugated BamHI and SalGI sites at the 5'-end, the SalGI-ApaI fragment is removed, the plasmid is treated with T4 phage DNA polymerase to form blunt ends, recycled with T4 phage DNA ligase, transformed the Escherichia coli cell obtained with the plasmid and clones with a plasmid containing a DNA copy of only 26S-VVEL RNA without a 5'-terminal sequence are selected, then the BamHI-EcoRI fragment of this plasmid is connected using phage T4 DNA ligase with a fragment containing the protein gene promoter 7.5 K smallpox virus, and plasmid pTK 1285, guide Escherichia coli cells were transformed with SalGI and EcoRI digested with recombinant DNA obtained by recombinant DNA, clones with a plasmid containing a DNA copy of the 26V-RVEV DNA under the control of the 7.5 K promoter in the composition of the vaccinia virus thymidine kinase gene were isolated, this plasmid was used for recombination vaccinia virus genome, and a given strain is selected by selection.