RU2588388C1 - Recombinant strain l-ivp 1421abjcn pox virus virulence genes with broken a56r, b8r, j2r, c3l, n1l for producing live culture of attenuated smallpox vaccine and other orthopoxviruses, pathogenic for humans - Google Patents
Recombinant strain l-ivp 1421abjcn pox virus virulence genes with broken a56r, b8r, j2r, c3l, n1l for producing live culture of attenuated smallpox vaccine and other orthopoxviruses, pathogenic for humans Download PDFInfo
- Publication number
- RU2588388C1 RU2588388C1 RU2015114861/10A RU2015114861A RU2588388C1 RU 2588388 C1 RU2588388 C1 RU 2588388C1 RU 2015114861/10 A RU2015114861/10 A RU 2015114861/10A RU 2015114861 A RU2015114861 A RU 2015114861A RU 2588388 C1 RU2588388 C1 RU 2588388C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- virus
- strain
- vaccine
- 1421abjcn
- vaccinia virus
- Prior art date
Links
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 title claims abstract description 30
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 230000001018 virulence Effects 0.000 title claims abstract description 28
- 230000002238 attenuated Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 241000700629 Orthopoxvirus Species 0.000 title claims abstract description 15
- 229940083538 Smallpox Vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 14
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 108050006987 Poxvirus Proteins 0.000 title 1
- 229960005486 vaccines Drugs 0.000 claims abstract description 67
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 claims abstract description 16
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 65
- 230000003612 virological Effects 0.000 claims description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 16
- 206010061495 Rickettsiosis Diseases 0.000 claims description 3
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 abstract description 62
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 39
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 27
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 27
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 22
- 101700005460 hemA Proteins 0.000 description 19
- 239000002609 media Substances 0.000 description 19
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 18
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 15
- 102220406507 DEFB108B A56R Human genes 0.000 description 14
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 14
- 101710017522 B8R Proteins 0.000 description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 12
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 11
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 11
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 10
- 101710030120 C3L Proteins 0.000 description 10
- 101710040661 DTYMK Proteins 0.000 description 10
- 101710024657 TK1 Proteins 0.000 description 10
- 101710042705 VACWR025 Proteins 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 210000000056 organs Anatomy 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 108020004440 Thymidine Kinase Proteins 0.000 description 7
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 7
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 7
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 7
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960000951 Mycophenolic Acid Drugs 0.000 description 6
- 108010061543 Neutralizing Antibodies Proteins 0.000 description 6
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N Xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000034994 death Effects 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N mycophenolic acid Chemical compound OC1=C(C\C=C(/C)CCC(O)=O)C(OC)=C(C)C2=C1C(=O)OC2 HPNSFSBZBAHARI-RUDMXATFSA-N 0.000 description 6
- 210000004556 Brain Anatomy 0.000 description 5
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 101710043164 Segment-4 Proteins 0.000 description 5
- 101700038759 VP1 Proteins 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 230000005591 charge neutralization Effects 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 5
- 230000002068 genetic Effects 0.000 description 5
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 5
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 5
- 230000003362 replicative Effects 0.000 description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 2-mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000725630 Ectromelia virus Species 0.000 description 4
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 4
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 4
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M Lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 208000007089 Vaccinia Diseases 0.000 description 4
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 230000001586 eradicative Effects 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 230000001681 protective Effects 0.000 description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 4
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 3
- 241000252254 Catostomidae Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 101700086956 IFNG Proteins 0.000 description 3
- 102100016020 IFNG Human genes 0.000 description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 3
- 102000000505 Ribonucleotide Reductases Human genes 0.000 description 3
- 108010041388 Ribonucleotide Reductases Proteins 0.000 description 3
- 210000003491 Skin Anatomy 0.000 description 3
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 3
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 108091007521 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 3
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 1-[(1S,2R,3R,4S,5R,6R)-3-carbamimidamido-6-{[(2R,3R,4R,5S)-3-{[(2S,3S,4S,5R,6S)-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-3-(methylamino)oxan-2-yl]oxy}-4-formyl-4-hydroxy-5-methyloxolan-2-yl]oxy}-2,4,5-trihydroxycyclohexyl]guanidine Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 5-fluoro-3-(3-oxo-1H-2-benzofuran-1-yl)-1H-pyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1C(F)=CNC(=O)N1C1C2=CC=CC=C2C(=O)O1 LHEJDBBHZGISGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N Ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 206010059512 Apoptosis Diseases 0.000 description 2
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 2
- JCAIWDXKLCEQEO-LXOWHHAPSA-N Copalyl diphosphate Natural products [P@@](=O)(OP(=O)(O)O)(OC/C=C(\CC[C@H]1C(=C)CC[C@H]2C(C)(C)CCC[C@@]12C)/C)O JCAIWDXKLCEQEO-LXOWHHAPSA-N 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 210000003811 Fingers Anatomy 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 230000036740 Metabolism Effects 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 241000700625 Poxviridae Species 0.000 description 2
- 102400000598 Protein N1 Human genes 0.000 description 2
- 101710014947 SERPINI2 Proteins 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 101710017891 VACWR028 Proteins 0.000 description 2
- 206010047461 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 210000002845 Virion Anatomy 0.000 description 2
- 208000001756 Virus Disease Diseases 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 230000004596 appetite loss Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 2
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 2
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 235000021266 loss of appetite Nutrition 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000035786 metabolism Effects 0.000 description 2
- 238000002941 microtiter virus yield reduction assay Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920005630 polypropylene random copolymer Polymers 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002633 protecting Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 101710005126 s003.1L Proteins 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710006746 7.5K Proteins 0.000 description 1
- 210000001015 Abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 206010000565 Acquired immunodeficiency syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 210000003719 B-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 1
- 101710039726 B29R Proteins 0.000 description 1
- 102100013894 BCL2 Human genes 0.000 description 1
- 108060000885 BCL2 Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 208000000409 Breast Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241001137864 Camelpox virus Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 241000700112 Chinchilla Species 0.000 description 1
- 210000001520 Comb Anatomy 0.000 description 1
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 210000004544 DC2 Anatomy 0.000 description 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 1
- 108010027570 EC 2.4.2.22 Proteins 0.000 description 1
- 208000005679 Eczema Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N Ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004209 Hair Anatomy 0.000 description 1
- 102100013275 IRF3 Human genes 0.000 description 1
- 101700001323 IRF3 Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 101000018815 Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108050006617 Interleukin-1 receptor family Proteins 0.000 description 1
- 102000019223 Interleukin-1 receptor family Human genes 0.000 description 1
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N Isoamyl alcohol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 Kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 Killer Cells, Natural Anatomy 0.000 description 1
- 210000004932 Little Fingers Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 description 1
- 101700012512 MIBP Proteins 0.000 description 1
- 102000012750 Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010090054 Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L MgCl2 Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- RZJSUWQGFCHNFS-UHFFFAOYSA-N Monoisobutyl phthalic acid Chemical compound CC(C)COC(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O RZJSUWQGFCHNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 1
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 1
- -1 NIL Proteins 0.000 description 1
- 101710029071 NMRK2 Proteins 0.000 description 1
- 102100011804 NMRK2 Human genes 0.000 description 1
- PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N Neutral red Chemical compound Cl.C1=C(C)C(N)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 PGSADBUBUOPOJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010069586 Orthopox virus infection Diseases 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 229940049954 Penicillin Drugs 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 101710004288 RRM2 Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920001914 Ribonucleotide Polymers 0.000 description 1
- 101710016492 Rv2744c Proteins 0.000 description 1
- 101710029384 SPIN2A Proteins 0.000 description 1
- 101710029380 SPIN2B Proteins 0.000 description 1
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M Sodium lauroyl sarcosinate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC([O-])=O KSAVQLQVUXSOCR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000000952 Spleen Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 Streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000008050 TAE buffer with ethidium bromide Substances 0.000 description 1
- RBSRZNXPRRVYBU-UHFFFAOYSA-O TBK1 Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)COP(O)(=O)OC2C(OC(C2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)CO[P+](O)=O)C(OP(O)(=O)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)OP(O)(=O)OCC2C(CC(O2)N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)OP(O)(=O)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)OP(O)(=O)OCC2C(CC(O2)N2C(N=C(N)C=C2)=O)OP(O)(=O)OCC2C(CC(O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)OP(O)(=O)OCC2C(CC(O2)N2C3=C(C(NC(N)=N3)=O)N=C2)O)C1 RBSRZNXPRRVYBU-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 102100005604 TBK1 Human genes 0.000 description 1
- 101700066570 TBK1 Proteins 0.000 description 1
- 210000003813 Thumb Anatomy 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 210000003501 Vero Cells Anatomy 0.000 description 1
- 210000002268 Wool Anatomy 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(E)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (E)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 1
- 229960000626 benzylpenicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 102000031520 complement binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008909 complement binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 201000003740 cowpox Diseases 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent Effects 0.000 description 1
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 1
- 201000004624 dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 231100001003 eczema Toxicity 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N edta Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108091006088 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034448 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 101710031128 hagA Proteins 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic Effects 0.000 description 1
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 description 1
- 238000002743 insertional mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002530 ischemic preconditioning Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000011068 load Methods 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cells Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic Effects 0.000 description 1
- 230000000051 modifying Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000174 oncolytic Effects 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 239000003973 paint Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000034190 positive regulation of NF-kappaB transcription factor activity Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive Effects 0.000 description 1
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003248 secreting Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 231100000247 serious adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 231100000486 side effect Toxicity 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 231100000803 sterility Toxicity 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Images
Abstract
Description
Изобретение относится к рекомбинантному аттенуированному штамму вируса осповакцины (1421ABJCN) с нарушенными генами вирулентности A56R, B8R, J2R, C3L, NIL на основе клонированного вируса осповакцины штамм ЛИВП и может быть использовано в медицине, биотехнологии, в частности в генной инженерии для получения живой культуральной аттенуированной вакцины против натуральной оспы и других ортопоксвирусов, патогенных для человека.The invention relates to a recombinant attenuated strain of vaccinia virus (1421ABJCN) with violated virulence genes A56R, B8R, J2R, C3L, NIL based on the cloned vaccinia virus strain LIVP and can be used in medicine, biotechnology, in particular in genetic engineering for production vaccines against smallpox and other orthopoxviruses pathogenic for humans.
Вирус осповакцины (ВОВ) является представителем рода Orthopoxvirus семейства Poxviridae [Moss В. Poxviridae: the viruses and their replication. In Fields Virology / edited by D.M. Knipe. - Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2007. - 5th edn. - P. 2905-2946]. Подобно другим ортопоксвирусам BOB является сложно организованным цитоплазматическим вирусом с протяженным геномом, состоящим из двухцепочечной ДНК приблизительно 190 т.п.н. с ковалентно замкнутыми концами. Гены, расположенные в левом и правом концевых районах генома, кодируют белки, связанные, в частности, с функциями вирулентности, круга хозяев и иммуномодуляцией организма хозяина [Jacobs Ν., Bartlett N.W., Clark R.Η. and Smith G.L. Vaccinia virus lacking the Bcl-2-like protein N1 induces a stronger natural killer cell response to infection. // Journal of General Virology. - 2008. - №89. - P. 2877-2881].The vaccinia virus (BAC) is a member of the genus Orthopoxvirus of the family Poxviridae [Moss B. Poxviridae: the viruses and their replication. In Fields Virology / edited by D.M. Knipe - Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 2007 .-- 5th edn. - P. 2905-2946]. Like other orthopoxviruses, BOB is a complexly organized cytoplasmic virus with an extended genome consisting of double-stranded DNA of approximately 190 kb. with covalently closed ends. Genes located in the left and right terminal regions of the genome encode proteins associated, in particular, with the functions of virulence, the host circle, and immunomodulation of the host organism [Jacobs Ν., Bartlett N.W., Clark R.Η. and Smith G.L. Vaccinia virus lacking the Bcl-2-like protein N1 induces a stronger natural killer cell response to infection. // Journal of General Virology. - 2008. - No. 89. - P. 2877-2881].
Вследствие высококонсервативной природы структурных белков ортопоксвирусов иммунизация ВОВ обеспечивает перекрестную защиту против натуральной оспы и других представителей этого рода. Поэтому почти два столетия ВОВ применялся в качестве вакцины для защиты от вируса натуральной оспы, вплоть до ликвидации натуральной оспы в конце 1970-х годов [Wiser I., Balicer R.D., Cohena D. An update on smallpox vaccine candidates and their role in bioterrorism related vaccination strategies. // Vaccine. - 2007. - №25. - P. 976-984]. Эти вакцины, особенно первого поколения, вызывали редкие, но серьезные неблагоприятные последствия, в частности у людей с иммунодефицитом вследствие рака, терапии рака, трансплантации органов и различных заболеваний (ВИЧ/СПИД), а также с экземой или атопическим дерматитом в анамнезе. Хотя осложнения и наблюдались редко, но при этом страдали, а иногда и погибали (в 0,0001% случаев), здоровые до прививки люди [Jacobs B.L., Langland J.O., Kibler K.V., Denzler K.L., White S.D., Holechek S.A., Wong S., Huynh T., Baskin C.R. Vaccinia virus vaccines: past, present and future. // Antiviral Res. - 2009. - V. 84. P. 1-13]. В связи с этим, очень остро стоит вопрос о необходимости разработки современных безопасных вакцин против натуральной оспы и других ортопоксвирусных инфекций человека. Во время кампании по ликвидации оспы предпринимались попытки создать аттенуированный штамм ВОВ, который отличался бы протективной эффективностью при незначительной выраженности побочных эффектов [Fenner F., Henderson D.A., Arita I., Jezek Z., Ladnyi I.D. Smallpox and its eradication. // World Health Organization: Geneva. - 1988]. Наиболее распространенная технология для аттенуации вируса осповакцины включала многократные пассажи исходного вируса дикого типа на культурах клеток различных животных. Современная биотехнология позволяет вводить целевые вставки, делеции генов в нужных участках генома для получения более безопасной и иммуногенной вакцины против натуральной оспы [Jacobs B.L., Langland J.O., Kibler K.V., Denzler K.L., White S.D., Holechek S.A., Wong S, Huynh T., Baskin C.R. Vaccinia virus vaccines: past, present and future. // Antiviral Res. - 2009. - V. 84. P. 1-13]. Получение аттенуированного BOB может быть достигнуто делетированием генов, кодирующих модуляторы иммунного ответа, генов круга хозяев и генов, участвующих в метаболизме нуклеиновых кислот. К настоящему времени выполнен ряд работ по получению высокоаттенуированного вируса осповакцины с помощью генетической инженерии, относимого к вакцинам третьего поколения.Due to the highly conservative nature of the structural proteins of orthopoxviruses, immunization of the Second World War provides cross-protection against smallpox and other representatives of this genus. Therefore, for almost two centuries, the Second World War was used as a vaccine to protect against smallpox virus, up to the eradication of smallpox in the late 1970s [Wiser I., Balicer RD, Cohena D. An update on smallpox vaccine candidates and their role in bioterrorism related vaccination strategies. // Vaccine. - 2007. - No. 25. - P. 976-984]. These vaccines, especially the first generation, caused rare but serious adverse effects, in particular in people with immunodeficiency due to cancer, cancer therapy, organ transplantation and various diseases (HIV / AIDS), as well as with a history of eczema or atopic dermatitis. Although complications were rare, but they suffered and sometimes died (in 0.0001% of cases), people who were healthy before vaccination [Jacobs BL, Langland JO, Kibler KV, Denzler KL, White SD, Holechek SA, Wong S. , Huynh T., Baskin CR Vaccinia virus vaccines: past, present and future. // Antiviral Res. - 2009. - V. 84. P. 1-13]. In this regard, the question of the need for the development of modern safe vaccines against smallpox and other human orthopoxvirus infections is very acute. During the smallpox eradication campaign, attempts were made to create an attenuated strain of the Great Patriotic War, which would be distinguished by its protective efficacy with little side effects [Fenner F., Henderson D.A., Arita I., Jezek Z., Ladnyi I.D. Smallpox and its eradication. // World Health Organization: Geneva. - 1988]. The most common technology for attenuating vaccinia virus included multiple passages of the original wild-type virus in cell cultures of various animals. Modern biotechnology allows the introduction of targeted insertions, deletions of genes in the desired parts of the genome to obtain a safer and immunogenic vaccine against smallpox [Jacobs BL, Langland JO, Kibler KV, Denzler KL, White SD, Holechek SA, Wong S, Huynh T., Baskin CR Vaccinia virus vaccines: past, present and future. // Antiviral Res. - 2009. - V. 84. P. 1-13]. Obtaining attenuated BOB can be achieved by deleting genes encoding immune response modulators, host circle genes, and genes involved in nucleic acid metabolism. To date, a number of works have been carried out to obtain a highly attenuated vaccinia virus using genetic engineering related to third-generation vaccines.
Одна из наиболее хорошо охарактеризованных вакцин на основе нереплицирующегося вируса осповакцины - NYVAC получена из штамма Copenhagen путем селективной делеции 18 генов/открытых рамок трансляции (ОРТ). Были делетированы гены, включая кассету из 12 ОРТ от C7L до K1L (район "генов круга хозяев"); ген, кодирующий тимидинкиназу; B13R и B14R (гены "геморрагического" района); A26L (кодирующий белок включения типа A); A56R (кодирует гемагглютинин); I4L (кодирует большую субъединицу рибонуклеотид редуктазы). В эксперименте на иммунодефицитных макаках NYVAC показал безопасность, но не смог обеспечить защиту от последующей летальной инфекции вирусом оспы обезьян [Edghill-Smith Y., Bray M., Whitehouse C.A., Miller D., Mucker Ε., Manischewitz J., King L.R., Robert-Guroff M., Hryniewicz Α., Venzon D., Meseda C, Weir J., Nalca Α., Livingston V., Wells J., Lewis M.G., Huggins J., Zwiers S.H., Golding H., Franchini G. Smallpox vaccine does not protect macaques with AIDS from a lethal monkeypox virus challenge. // J. Infect. Dis. - 2005. - V. 191. - P. 372-381].One of the best-characterized vaccines based on the non-replicating vaccinia virus virus, NYVAC, was obtained from the Copenhagen strain by selectively deleting 18 genes / open translation frames (ORTs). Genes were deleted, including a cassette of 12 ORTs from C7L to K1L (region of “host circle genes”); gene encoding thymidine kinase; B13R and B14R (genes of the hemorrhagic region); A26L (Type A inclusion coding protein); A56R (encodes hemagglutinin); I4L (encodes a large subunit of the reductase ribonucleotide). In an experiment on immunodeficient macaques, NYVAC showed safety, but could not provide protection against subsequent lethal infection with monkeypox virus [Edghill-Smith Y., Bray M., Whitehouse CA, Miller D., Mucker Ε., Manischewitz J., King LR, Robert-Guroff M., Hryniewicz Α., Venzon D., Meseda C, Weir J., Nalca Α., Livingston V., Wells J., Lewis MG, Huggins J., Zwiers SH, Golding H., Franchini G. Smallpox vaccine does not protect macaques with AIDS from a lethal monkeypox virus challenge. // J. Infect. Dis. - 2005. - V. 191. - P. 372-381].
В исследовании [Lee M.S., Roos J.M., McGuigan L.C, Smith Κ.Α., Cormier N., Cohen L.K., Roberts Β.Ε. and Paynet L.G. Molecular attenuation of vaccinia virus: mutant generation and animal characterization. // J. Virol. - 1992. - V. 66. - №5. - P. 2617-2630] на основе штамма NYCBH BOB были получены мутанты по генам тимидинкиназы (ТК), рибонуклеотид редуктазы (RR), гемагглютинина (НА) или вирусного фактора роста (VGF). В экспериментах на мышах было показано снижение иммуногенности рекомбинантных вирусов, требующее более высокие иммунизирующие дозы в сравнении с вирусом дикого типа для получения равных титров антител. Наблюдались снижение возможности исследуемых вариантов вируса к распространению внутри инфицированного организма и их значительная аттенуация: мутанта по гену ТК на 1.7 log10, гену RR на 2.9 log10, гену НА на 4.0 log10 и гену VGF на 5.4 log10.In a study [Lee M.S., Roos J.M., McGuigan L.C., Smith Κ.Α., Cormier N., Cohen L.K., Roberts Β.Ε. and Paynet L.G. Molecular attenuation of vaccinia virus: mutant generation and animal characterization. // J. Virol. - 1992. - V. 66. - No. 5. - P. 2617-2630] based on the NYCBH BOB strain, mutants were obtained on the genes of thymidine kinase (TC), ribonucleotide reductase (RR), hemagglutinin (HA) or viral growth factor (VGF). In experiments in mice, a decrease in the immunogenicity of recombinant viruses was shown, requiring higher immunizing doses compared to wild-type virus to obtain equal antibody titers. There was a decrease in the ability of the studied variants of the virus to spread within the infected organism and their significant attenuation: mutant in the TK gene by 1.7 log10, the RR gene by 2.9 log10, the HA gene by 4.0 log10 and the VGF gene by 5.4 log10.
Известен штамм ВОВ с удаленным геном B8R, кодирующим гомолог рецептора ИНФ-γ, который вызывал сравнимый с исходным штаммом Lister гуморальный и клеточный иммунный ответ в мышах с ослабленным иммунитетом. Но наблюдалось снижение способности к репликации на определенных культурах клеток. В то же время в эксперименте на безтимусных мышах мутантный вирус, даже в более высоких дозах, вызывал меньшую заболеваемость по сравнению с диким штаммом, что проявлялось в менее заметном распространении вируса, меньшей потере веса и большей выживаемости [Denes В., Gridley D.S., Fodor Ν., Takatsy Ζ., Timiryasova T.M., Fodor I. Attenuation of a vaccine strain of vaccinia virus via inactivation of interferon viroceptor. // J. Gene Med. - 2006. - V. 8. - №7. - P. 814-823].A BOB strain is known with the deleted B8R gene encoding the homologue of the INF-γ receptor, which caused a humoral and cellular immune response comparable to the original Lister strain in mice with weakened immunity. But there was a decrease in replication ability in certain cell cultures. At the same time, in an experiment on nude mice, a mutant virus, even at higher doses, caused a lower incidence compared with the wild strain, which was manifested in a less noticeable spread of the virus, less weight loss and greater survival [Denes B., Gridley DS, Fodor Ν., Takatsy Ζ., Timiryasova TM, Fodor I. Attenuation of a vaccine strain of vaccinia virus via inactivation of interferon viroceptor. // J. Gene Med. - 2006. - V. 8. - No. 7. - P. 814-823].
Наиболее близким аналогом (прототипом) является рекомбинантный штамм Copenhagen ВОВ (международная заявка №W092/15672, МПК C12N 7/00, опубл. 17.09.1992 г.), разработанный компанией Virogenetics Corporation. В штамм Copenhagen ВОВ рекомбинационно (рекомбинация специально созданных плазмид с вирусным геномом) вводили делеции по 6-ти областям генома ВОВ.The closest analogue (prototype) is a recombinant strain of Copenhagen BOB (international application No. W092 / 15672, IPC
Однако в рекомбинантном штамме-прототипе наряду с нарушением индивидуальных генов введена протяженная делеция, которая охватывала 2 соседних гена, а также делеция с удалением сразу 10 генов ВОВ, что снизило способность ВОВ реплицироваться на разных линиях человеческих клеток, что снижает его технологические возможности при производстве вакцины. Комбинация генов вирулентности в прототипе отличается от заявляемого технического решения. Кроме того, рекомбинантный штамм-прототип вируса осповакцины не аттестован и не используются в России для производства классической противооспенной вакцины.However, in the recombinant strain of the prototype, along with the violation of individual genes, an extended deletion was introduced, which covered 2 neighboring genes, as well as a deletion with the removal of 10 BOB genes at once, which reduced the ability of BOB to replicate on different lines of human cells, which reduces its technological capabilities in the production of vaccines . The combination of virulence genes in the prototype differs from the claimed technical solution. In addition, the recombinant strain prototype of the vaccinia virus is not certified and is not used in Russia for the production of the classic anti-smallpox vaccine.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание высокоаттенуированного рекомбинантного штамма вируса осповакцины для получения более безопасной живой культуральной аттенуированной вакцины против натуральной оспы и других ортопоксвирусов за счет последовательного удаления из состава генома этого вируса пяти генов вирулентности с использованием плазмид интеграции.The technical result of the invention is the creation of a highly attenuated recombinant strain of smallpox vaccine virus to obtain a safer live culture attenuated vaccine against smallpox and other orthopoxviruses by sequentially removing five virulence genes from the virus genome using integration plasmids.
Указанный технический результат достигается получением рекомбинантного штамма Л-ИВП 1421ABJCN вируса осповакцины с нарушенными генами вирулентности A56R, B8R, J2R, C3L, NIL, предназначенного для получения живой культуральной аттенуированной вакцины против вируса натуральной оспы и других ортопоксвирусов и депонированного в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», регистрационный №V-653 (справка о депонировании прилагается).The specified technical result is achieved by obtaining a recombinant strain of L-IVP 1421ABJCN vaccinia virus virus with violated virulence genes A56R, B8R, J2R, C3L, NIL, designed to receive live culture attenuated vaccine against variola virus and other orthopoxviruses and deposited in the State collection of R , rickettsioses FBUN SSC VB "Vector", registration number V-653 (certificate of deposit is attached).
Для создания высокоаттенуированной осповакцины штамм Л-ИВП авторами был предложен подход последовательного удаления из состава генома этого вируса выбранных генов. В качестве наиболее перспективных для этой цели были предложены следующие гены: A56R, B8R, NIL, C3L и J2R.To create a highly attenuated smallpox vaccine strain L-IVP, the authors proposed an approach for sequential removal of selected genes from the composition of the virus genome. The following genes were proposed as the most promising for this purpose: A56R, B8R, NIL, C3L, and J2R.
A56RA56r
Ген A56R кодирует гемагглютинин - поверхностный гликопротеин, обеспечивающий способность вируса присоединяться к клетке-хозяину, а также ингибирующий слияние инфицированных клеток и протеолитически активирующий инфекционность вирионов. Показано, что делеция этого гена у штамма BOB New-York City Board of Health (NYCBH) вызывает в моделях на мышах снижение внутричерепного и интраназального LD50 приблизительно на 4 log10 единиц по сравнению с родительским штаммом. Это сопровождается исчезновением оспенных образований на скарифицированной коже мышей, несмотря на уровень репликации вируса, близкий к дикому типу [Lee M.S., Roos J.M., McGuigan L.С., Smith Κ.Α., Cormier Ν., Cohen L.К., Roberts В.Ε. and Paynet L.G. Molecular attenuation of vaccinia virus: mutant generation and animal characterization. // Journal of Virology. - 1992. - Vol. 66, №5. - P. 2617-2630]. В других работах использовали штамм Western Reserve, изменения в гене гемагглютинина которого также приводили к значительной аттенуации вируса Zhang Q., Yu Υ.Α., Wang Ε., Chen Ν., Danner R.L., Munson P.J., Marincola F.M., Szalay A.A. Eradication of solid human breast tumors in nude mice with an intravenously injected light-emitting oncolytic vaccinia virus. // Cancer. Res. - 2007. - V. 67. - P. 10038-10046].The A56R gene encodes hemagglutinin - a surface glycoprotein that provides the ability of the virus to attach to the host cell, as well as inhibiting the fusion of infected cells and proteolytically activating virion infectivity. A deletion of this gene in the BOB strain of New York City Board of Health (NYCBH) was shown to cause a decrease in intracranial and intranasal LD 50 by about 4 log 10 units in mouse models compared to the parent strain. This is accompanied by the disappearance of smallpox formations on the scarified skin of mice, despite the level of virus replication close to the wild type [Lee MS, Roos JM, McGuigan L.C., Smith Κ.Α., Cormier Ν., Cohen L.K., Roberts B.Ε. and Paynet LG Molecular attenuation of vaccinia virus: mutant generation and animal characterization. // Journal of Virology. - 1992. - Vol. 66, No. 5. - P. 2617-2630]. Other studies used the Western Reserve strain, changes in the hemagglutinin gene of which also led to significant attenuation of the Zhang Q., Yu Υ.Α., Wang Ε., Chen Ν., Danner RL, Munson PJ, Marincola FM, Szalay AA Eradication of solid human breast tumors in nude mice with an intravenously injected light-emitting oncolytic vaccinia virus. // Cancer. Res. - 2007. - V. 67. - P. 10038-10046].
B8RB8r
Ген B8R вируса осповакцины (BOB) штамм Western Reserve кодирует гликопротеин размером 43 кДа, секретируемый из зараженной клетки в виде гомодимера на ранней стадии развития инфекции. Этот белок имеет сходство по аминокислотной последовательности с внеклеточным доменом клеточного рецептора γ-интерферона (ИФН-γР), вследствие чего связывается и ингибирует γ-интерферон (ИФН-γ) у широкого круга видов (человека, коровы, кролика, крысы и курицы, но не мыши) [Alcami A. and Smith G.L. Vaccinia, cowpox, and camelpox viruses encode soluble gamma interferon receptors with novel broad species specificity. // J. Virol. - 1995. - V. 69. - P. 4633-4639].The vaccinia virus (BOB) gene B8R strain Western Reserve encodes a 43 kDa glycoprotein secreted from the infected cell as a homodimer at an early stage of infection. This protein is similar in amino acid sequence to the extracellular domain of the cellular receptor for γ-interferon (IFN-γP), as a result of which it binds and inhibits γ-interferon (IFN-γ) in a wide range of species (human, cow, rabbit, rat and chicken, but not mice) [Alcami A. and Smith GL Vaccinia, cowpox, and camelpox viruses encode soluble gamma interferon receptors with novel broad species specificity. // J. Virol. - 1995. - V. 69. - P. 4633-4639].
Трансгенные мыши, лишенные ИФН-γ, показывали повышенную чувствительность к заражению ВОВ и другими вирусами. При этом лечение животных ИФН-γ повышала их резистентность к вирусной ифекции. На модели мышей ВОВ, лишенный ИФН-γР, показывал тот же уровень вирулентности, что и вирус дикого типа, что связано с низкой аффинностью ИФН-γР ВОВ к мышиному ИФН-γ. Однако экспрессия растворимого мышиного ИФН-γР немного увеличивала вирулентность вируса.Transgenic mice lacking IFN-γ showed increased sensitivity to infection with BOB and other viruses. At the same time, treatment of animals with IFN-γ increased their resistance to viral infection. In the mouse model, BOB deprived of IFN-γP showed the same level of virulence as the wild-type virus, which is associated with low affinity of IFN-γP BOB to mouse IFN-γ. However, the expression of soluble murine IFN-γP slightly increased the virulence of the virus.
C3LC3l
Ген C3L кодирует комплемент-связывающий белок (КСБ), секретируемый инфицированной клеткой [Kotwal G.J. and Moss В. Analysis of a large cluster of nonessential genes deleted from a vaccinia virus terminal transposition mutant. // Virology. - 1988. - V 167. - P. 524-537] и ингибирующий активность системы комплемента через взаимодействие с C3b и C4b. Этот белок размером 35 кДа содержит четыре коротких консенсусных повторяющихся домена, которые также присутствуют и в регуляторных белках системы комплемента хозяина и необходимы для активности КСБ. КСБ связывается с C3b и C4b и действует как кофактор в их ферментативной инактивации фактором I, препятствуя инициированию классического и альтернативного путей конвертации С3 и ускоряя их распад. Таким образом, КСБ ингибирует антитело-зависимую, усиленную комплементом нейтрализацию вирионов ВОВ. В опытах на животных мутанты, лишенные КСБ, обладали сниженной вирулентностью [Kotwal G.J., Isaacs S.Ν, McKenzie R., Frank M.M. and Moss В. Inhibition of the complement cascade by the major secretory protein of vaccinia virus. // Science. - 1990. - V. 250. - P. 827-830].The C3L gene encodes a complement binding protein (KSB) secreted by an infected cell [Kotwal G.J. and Moss B. Analysis of a large cluster of nonessential genes deleted from a vaccinia virus terminal transposition mutant. // Virology. - 1988. - V 167. - P. 524-537] and the inhibitory activity of the complement system through interaction with C3b and C4b. This 35 kDa protein contains four short consensus repeating domains, which are also present in regulatory proteins of the host complement system and are necessary for KSB activity. KSB binds to C3b and C4b and acts as a cofactor in their enzymatic inactivation by factor I, preventing the initiation of the classical and alternative pathways of C3 conversion and accelerating their decay. Thus, KSB inhibits antibody-dependent, complement-enhanced neutralization of BOB virions. In animal experiments, mutants lacking KSB had reduced virulence [Kotwal G.J., Isaacs S.Ν, McKenzie R., Frank M.M. and Moss B. Inhibition of the complement cascade by the major secretory protein of vaccinia virus. // Science. - 1990. - V. 250. - P. 827-830].
J2RJ2r
Ген J2R кодирует тимидинкиназу. Было продемонстрировано, что встройка чужеродных нуклеотидных последовательностей вместо гена тимидинкиназы (ТК) ВОВ значительно снижает патогенность вируса (в 1000 раз) [Smith G.L. Encyclopedia of Virology. - Elsevier Ltd., 2008. - P. 243-250].The J2R gene encodes thymidine kinase. It was demonstrated that the insertion of foreign nucleotide sequences instead of the gene for thymidine kinase (TK) BOB significantly reduces the pathogenicity of the virus (1000 times) [Smith G.L. Encyclopedia of Virology. - Elsevier Ltd., 2008. - P. 243-250].
NIL - фактор вирулентности, секретируемый из клеток [Kotwal G.J., Hugin A.W. and Moss B. Mapping and insertional mutagenesis of a vaccinia virus gene encoding a 13,800-Da secreted protein. // Virology. - 1989. - №171. - P. 579-587]. Ген NIL относится к группе ранне-поздних генов ВОВ и несущественен для размножения вируса in vitro, но важен для проявления свойств вирулентности in vivo [Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. - М.: КМК Scientific Press Ltd., 1988. - 386 с.]. Несмотря на расположение этого гена в терминальной (вариабельной) области генома, он сохранен у многих представителей рода Orthopoxvirus. Исключением является высокоаттенуированный штамм ВОВ - Modified Vaccinia Ankara (MVA), который кодирует неполный белок. Продукт этого гена представляет собой внутриклеточный гомодимер размером около 14kDa (117 а.о.). Белок N1 относится к семейству Bcl-2-антиапоптических белков и ингибирует как апоптоз, так и сигнал от рецептора IL-1, приводящий к активации NF-κВ-пути (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated В cells - универсальный фактор транскрипции, контролирующий экспрессию генов иммунного ответа, апоптоза и клеточного цикла). Было показано, что сверхэкспрессия N1 в неинфицированных клетках ингибирует активацию NF-κB и IRF3 связыванием ингибитора комплекса IKK и ТВК1, соответственно.NIL is a virulence factor secreted from cells [Kotwal G.J., Hugin A.W. and Moss B. Mapping and insertional mutagenesis of a vaccinia virus gene encoding a 13,800-Da secreted protein. // Virology. - 1989. - No. 171. - P. 579-587]. The NIL gene belongs to the group of early-late BOB genes and is not essential for the propagation of the virus in vitro, but is important for the manifestation of virulence properties in vivo [Marennikova S. S., Schelkunov S. N. Pathogenic for humans orthopoxviruses. - M .: KMK Scientific Press Ltd., 1988. - 386 p.]. Despite the location of this gene in the terminal (variable) region of the genome, it has been preserved in many representatives of the genus Orthopoxvirus. An exception is the highly attenuated strain of the Second World War - Modified Vaccinia Ankara (MVA), which encodes an incomplete protein. The product of this gene is an intracellular homodimer of about 14kDa in size (117 aa). Protein N1 belongs to the family of Bcl-2 anti-apoptotic proteins and inhibits both apoptosis and the signal from the IL-1 receptor, leading to activation of the NF-κB pathway (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells - universal factor transcription, controlling the expression of genes for the immune response, apoptosis and cell cycle). Overexpression of N1 in uninfected cells has been shown to inhibit the activation of NF-κB and IRF3 by binding of an inhibitor of the complex of IKK and TBK1, respectively.
Изобретение поясняется следующими графическими материалами. На фиг. 1 приведена общая схема получения вирусов осповакцины с делецией генов вирулентности (на примере гена A56R). На фиг. 2 представлена общая схема конструирования плазмид интеграции для получения делеционных вариантов ВОВ (на примере гена A56R). На фиг. 3 приведены данные ПНР анализа 21-го клона рекомбинантного вируса осповакцины ΔA56RΔC3LΔB8RΔN1LΔJ2R, а именно электрофореграмма фрагментов ДНК, полученных в результате ПНР: А - с праймерами на ген A56R, В - с праймерами на ген B8R, С - с праймерами на ген C3L, N - с праймерами на ген NIL, Τ - с праймерами на ген J2R. L - lkb ДНК-маркер. На фиг. 4 изображены результаты ПНР анализа 3-х серий вакцинного штамма вируса осповакцины 1421ABJCN с электрофоретической детекцией нарушенных генов: A56R, B8R, J2R, C3L, NIL: серия 1, дата изготовления 21.03.2014 (1 пассаж); серия 2, дата изготовления 10.04.2014 (5 пассаж); серия 3, дата изготовления 05.05.2014 (10 пассаж); 14 кл. Л-ИВП - родительский вирус осповакцины. Электрофореграмма фрагментов ДНК, полученных в результате ПЦР: А - с праймерами на ген A56R, В - с праймерами на ген B8R, С - с праймерами на ген C3L, N - с праймерами на ген NIL, J - с праймерами на ген J2R, L - 1kb ДНК-маркер. На фиг. 5 представлен сравнительный анализ динамики роста штаммов вирусов осповакцины (14 кл. Л-ИВП и вакцинного штамма вируса осповакцины 1421ABJCN) на культуре клеток CV-1. На фиг. 6 приведен протокол контроля генетической однородности и сравнение нуклеотидных последовательностей районов делеций в генах A56R, B8R, J2R, C3L, NIL вируса осповакцины исходного родительского штамма 14 кл. Л-ИВП и вакцинного штамма 1421ABJCN. Идентичные нуклеотиды в сравниваемых последовательностях обозначены точками, делеций - прочерком. На фиг. 7 представлена динамика изменения среднего веса мышей, инфицированных тремя сериями вакцинного штамма 1421ABJCN и родительским 14 кл. Л-ИВП ВОВ. На фиг. 8 изображена диаграмма уровня вируснейтрализующих антител при иммунизации мышей линии BALB/c подкожно (п/к) родительским 14 кл. Л-ИВП вирусом осповакцины и тремя сериями вакцинного штамма 1421ABJCN, выявляемого методом нейтрализации ВОВ на культуре клеток 4647. Представлены среднегеометрические значения, рассчитанные как -lg от наибольшего разведения сыворотки, при котором достигается 50% нейтрализация ВОВ ± стандартное отклонение. На фиг. 9 представлена гистограмма среднегеометрических значений титров вакцинных штаммов в виде log10/г органа ± стандартное отклонение, определенных методом бляшек в гомогенате головного мозга инфицированных новорожденных мышей при интрацеребральном введении.The invention is illustrated by the following graphic materials. In FIG. 1 shows a general scheme for the production of vaccinia viruses with deletion of virulence genes (for example, the A56R gene). In FIG. Figure 2 presents the general scheme for the construction of integration plasmids to obtain deletion variants of the BOB (for example, the A56R gene). In FIG. Figure 3 shows the data from the PPR analysis of the 21 clone of the recombinant vaccinia virus ΔA56RΔC3LΔB8RΔN1LΔJ2R, namely the electrophoregram of DNA fragments obtained as a result of the PPR: A with primers for the A56R gene, B with primers for the B8R gene, N with primers for the C8L gene, C with primers - with primers for the NIL gene, Τ - with primers for the J2R gene. L - lkb DNA marker. In FIG. Figure 4 shows the results of a PNR analysis of 3 series of vaccine strain of smallpox vaccine 1421ABJCN virus with electrophoretic detection of broken genes: A56R, B8R, J2R, C3L, NIL:
Для получения технического результата используют методику временной доминантной селекции [Falkner F.G., Moss В. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. Journal of Virology. // - 1990. - Vol. 64. - P. 3108-3111]. Для реализации этой методики создается рекомбинантная плазмида, которая несет как доминантный селективный маркер (ген gpt E.coli под контролем 7.5К-промотора ВОВ), расположенный вне протяженных областей гомологии с ДНК вируса, так и последовательности генома ВОВ, фланкирующие делетируемый ген. Бактериальный фермент ксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза (gpt), синтезируемый в клетках млекопитающих, способен восстанавливать метаболизм пуриновых нуклеотидов, блокируемый микофеноловой кислотой (МРА). В результате единичного кроссинговера плазмиды интеграции и вирусной ДНК образуется рекомбинантный вирусный геном, содержащий как ген gpt, так и последовательности, представляющие собой сегмент вирусного генома с целевой делецией и этот же сегмент без делеции. Такая генетическая конструкция нестабильна и может существовать лишь под селективным давлением. При снятии селективных условий происходит внутримолекулярная рекомбинация по областям гомологии, в результате которой образуется два вида вирусов - с делецией и без нее, причем выщепляется вся плазмидная часть (фиг. 1), что позволяет получать в дальнейшем двойные, тройные и т.д. рекомбинантные вирусы по различным участкам генома, используя эту же методику и тот же самый селективный маркер. Следует отметить, что в результате внутримолекулярной рекомбинации, удаляются из генома вируса все чужеродные последовательности, что очень важно при создании направленно аттенуированного ВОВ.To obtain a technical result, a temporary dominant selection technique is used [Falkner F.G., Moss B. Transient dominant selection of recombinant vaccinia viruses. Journal of Virology. // - 1990. - Vol. 64. - P. 3108-3111]. To implement this technique, a recombinant plasmid is created that carries both a dominant selectable marker (the E. coli gpt gene under the control of the 7.5K BOB promoter) located outside extended regions of homology with the DNA of the virus and the BOB genome sequences flanking the deleted gene. The bacterial enzyme xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (gpt), synthesized in mammalian cells, is able to restore the metabolism of purine nucleotides blocked by mycophenolic acid (MPA). As a result of a single crossing-over of the integration plasmid and viral DNA, a recombinant viral genome is formed containing both the gpt gene and sequences representing a segment of the viral genome with a target deletion and the same segment without deletion. Such a genetic construct is unstable and can exist only under selective pressure. When selective conditions are removed, intramolecular recombination over homology regions occurs, as a result of which two types of viruses are formed, with and without deletion, and the entire plasmid part is cleaved (Fig. 1), which makes it possible to obtain further double, triple, etc. recombinant viruses at different parts of the genome using the same technique and the same selective marker. It should be noted that as a result of intramolecular recombination, all foreign sequences are removed from the genome of the virus, which is very important when creating a directionally attenuated BOB.
Конструирование плазмид. Для получения плазмид интеграции с делециями генов ВОВ использовали ранее разработанную нами схему (фиг. 2). Выполнение этой технической задачи обеспечивалось применением метода ПНР, ферментативного гидролиза, последующей лигазной сшивки и трансформации клеток E.coli штамм JM-109 [Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. 2nd ed. - Cold Spring Harbor Laboratory Press., 1989].Construction of plasmids. To obtain plasmids for integration with deletions of BOB genes, we used the previously developed scheme (Fig. 2). This technical task was achieved using the PNR method, enzymatic hydrolysis, subsequent ligase crosslinking and transformation of E. coli cells strain JM-109 [Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. 2nd ed. - Cold Spring Harbor Laboratory Press., 1989].
Авторами были получены пять плазмид интеграции - pMGCgpt-ΔA56R, pMGCgpt-ΔB8R, pMGCgpt-ΔJ2R, pMGCgpt-ΔC3L, pMGCgpt-ΔN1L, предназначенные для делеции выбранных генов ВОВ.The authors obtained five integration plasmids - pMGCgpt-ΔA56R, pMGCgpt-ΔB8R, pMGCgpt-ΔJ2R, pMGCgpt-ΔC3L, pMGCgpt-ΔN1L intended for deletion of the selected BOB genes.
Полученные плазмиды интеграции использовали на следующем этапе работы для решения технической задачи: получения вариантов вируса осповакцины с направленно делетированными генами ВОВ. Конструирование мутантных вариантов ВОВ.The obtained integration plasmids were used at the next stage of work to solve the technical problem: obtaining variants of the vaccinia virus with directionally deleted genes of the Second World War. Construction of mutant variants of the Second World War.
В работе был использован вирус осповакцины штамм Л-ИВП (инв. № V-401 из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»). Для того чтобы исключить влияние «генетического фона» и гетерогенности вирусной популяции, все делеционные варианты получали на основе клонированного варианта 14 ВОВ Л-ИВП. Клонирование исходного штамма проводили методом бляшек на монослое клеток линии CV-1 (перевиваемая культура клеток почки африканской зеленой мартышки).In the work, the vaccinia virus strain L-IVP was used (inv. No. V-401 from the collection of the Federal State Budget Scientific Center of the SEC of the World Bank “Vector”). In order to exclude the influence of the “genetic background” and heterogeneity of the viral population, all deletion variants were obtained on the basis of the cloned variant of 14 BOB L-IVP. Cloning of the initial strain was performed by plaque on a monolayer of cells of the CV-1 line (transplanted culture of African green monkey kidney cells).
Для получения вирусов осповакцины с делецией генов вирулентности использовали методику временной доминантной селекции. Авторами была проведена серия экспериментов по трансфекции зараженных ВОВ штамм ЛИВП клеток CV-1 плазмидой интеграции pMGQgpt-ΔB8R. После четырех пассажей в условиях селекции вирус клонировали под агарозным покрытием методом бляшек. Были выделены 12 клонов предполагаемых делеционных мутантов. Далее эти клоны подращивали в неселективных условиях и реклонировали. По результатам ПЦР отбирали по одному стабильно реплицирующемуся реклону от 2-3-х клонов, нарабатывали, расфасовывали на отдельные аликвоты, титровали методом окрашивания бляшек кристаллическим фиолетовым, замораживали и использовали для дальнейшей работы.To obtain vaccinia viruses with a deletion of virulence genes, a temporary dominant selection technique was used. The authors conducted a series of experiments on the transfection of BOB-infected LIVP strain CV-1 cells with the integration plasmid pMGQgpt-ΔB8R. After four passages, under conditions of selection, the virus was cloned under an agarose plaque method. Twelve clones of putative deletion mutants were isolated. Further, these clones were grown under non-selective conditions and recloned. According to the PCR results, one stably replicating recepton from 2-3 clones was selected, produced, packaged in separate aliquots, titrated with plaque staining with crystal violet, frozen and used for further work.
Таким же образом был получен вариант ВОВ с делециями двух генов вирулентности ΔB8RΔC3L. Для трансфекции зараженных ВОВ штамм vΔB8R ЛИВП клеток CV-1 брали плазмиду интеграции pMGC gpt-ΔC3L. После проведенных процедур селекции и клонирования вируса с предполагаемым мутантным генотипом, выделяли ДНК и проводили их анализ методом ПНР. Были выявлены реклоны, полученные фрагменты которых показали соответствие длин теоретически расчетным.In the same way, a BOB variant with deletions of two virulence genes ΔB8RΔC3L was obtained. For transfection of infected BOB strain vΔB8R LIVP CV-1 cells, the integration plasmid pMGC gpt-ΔC3L was taken. After the procedures of selection and cloning of the virus with the putative mutant genotype, DNA was isolated and their analysis was performed by the NDP method. Reclons were identified, the fragments of which showed the correspondence of lengths to theoretically calculated ones.
Далее с использованием тех же процедур и плазмидой интеграции pMGCgpt-ΔA56R авторами был получен ВОВ с делециями трех генов вирулентности ΔB8RΔC3LΔA56R, а затем вариант ВОВ ЛИВП с четырьмя делетированными генами, используя плазмиду интеграции pMGCgpt-ΔN1L.Further, using the same procedures and the integration plasmid pMGCgpt-ΔA56R, the authors obtained BOB with deletions of three virulence genes ΔB8RΔC3LΔA56R, and then the BOB LIVP variant with four deleted genes using the integration plasmid pMGCgpt-ΔN1L.
Вариант ВОВ ЛИВП с пятью нарушенными генами вирулентности был получен по отработанной ранее методике с использованием четверного мутанта 21-й клон ΔB8RΔC3LΔA56RΔN1L и плазмиды интеграции pMGCgpt-ΔJ2R, в которой ген тимидинкиназы нарушен встройкой синтетического фрагмента ДНК. После шести пассажей под селективной средой, содержащей микофеноловую кислоту, вирусная суспензия была обработана ультразвуком и проведено клонирование под агарозным покрытием. Выделенные клоны далее пассировали под средой без селекции, затем их реклонировали, подращивали, выделяли ДНК, проводили ПЦР-анализ с использованием внутренних праймеров. Проведенный ПНР-анализ выбранного 14-го реклона однозначно доказывает получение целевых ВОВ с одновременной делецией генов C3L, B8R, A56R, NIL и встройкой в ген J2R (фиг. 3).The WWII LIVP variant with five violated virulence genes was obtained according to the previously worked out method using the fourth mutant of the 21st clone ΔB8RΔC3LΔA56RΔN1L and the integration plasmid pMGCgpt-ΔJ2R, in which the thymidine kinase gene was violated by the insertion of a synthetic DNA fragment. After six passages under a selective medium containing mycophenolic acid, the viral suspension was sonicated and cloned under an agarose coating. The isolated clones were then passaged under the medium without selection, then they were re-cloned, grown, DNA was isolated, and PCR analysis was performed using internal primers. The performed PNR analysis of the selected 14th reclon unequivocally proves the preparation of the target WWII with simultaneous deletion of the C3L, B8R, A56R, NIL genes and insertion into the J2R gene (Fig. 3).
Таким образом, авторами получен аттенуированный вирус осповакцины штамм Л-ИВП с пятью нарушенными генами вирулентности - 1421ABJCN.Thus, the authors obtained an attenuated vaccinia virus strain L-IVP with five violated virulence genes - 1421ABJCN.
Штамм депонирован в Государственной коллекции Роспотребнадзора возбудителей вирусных инфекций, риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» регистрационный номер V-653 от 16.09.2013.The strain is deposited in the State collection of Rospotrebnadzor of viral infections, rickettsioses of the Federal State Budget Scientific Center of the World Bank "Vector" registration number V-653 from 09.16.2013.
Была разработана оптимальная методика наработки и очистки вирусных препаратов для последующей иммунизации мышей. Для этого была использована перевиваемая линия культуры клеток 4647. Посевной и рабочий банки клеток этой линии на уровне 108-го и 128-го пассажей рекомендованы для производства вакцины против натуральной оспы. Были наработаны три серии вакцинного штамма 1421ABJCN вируса осповакцины на различных пассажах. Πоскольку вирус рабочего посевного материала должен обладать теми же характеристиками, что и штамм, который был использован для приготовления главного посевного материала (Европейская фармакопея 7.0), нами были отобраны образцы вакцинного штамма вируса осповакцины 1421ABJCN на следующих пассажах:An optimal technique has been developed for the production and purification of viral preparations for subsequent immunization of mice. For this, the transplantable cell culture line 4647 was used. The sowing and working cell banks of this line at the 108th and 128th passages are recommended for the production of smallpox vaccine. Three series of vaccine strain 1421ABJCN vaccinia virus were produced in different passages. Since the virus of the working seed must have the same characteristics as the strain that was used to prepare the main seed (European Pharmacopoeia 7.0), we selected samples of the vaccine strain of vaccinia virus 1421ABJCN in the following passages:
серия 1, дата изготовления 21.03.2014 (1 пассаж) - 3 пробирки по 2 мл. Титр вируса составил 4.5×108 БОЕ/мл;
серия 2, дата изготовления 10.04.2014 (5 пассаж) - 3 пробирки по 2 мл. Титр вируса составил 5.0×108 БОЕ/мл;
серия 3, дата изготовления 05.05.2014 (10 пассаж) - 3 пробирки по 2 мл. Титр вируса составил 6.0×108 БОЕ/мл.
Было показано, что вакцинный штамм 1421ABJCN вируса осповакцины сохраняет стабильность и биологические свойства в течение исследуемых 10 пассажей. Образцы вакцинного штамма после 1-го, 5-го и 10-го пассажа прошли аттестацию в ОБТК ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» и имеют паспорта №84, №85, №86 от 23.10.2014 г. соответственно.The vaccinia strain 1421ABJCN vaccinia virus has been shown to remain stable and biological for the 10 passages under study. Samples of the vaccine strain after the 1st, 5th and 10th passage passed certification in the OPF CTFB SSC VB "Vector" and have passports No. 84, No. 85, No. 86 dated 10.23.2014, respectively.
Морфологические признаки.Morphological signs.
Подлинность подтверждена в соответствии с требованиями ЕФ 7.0, с. 1152, методами ПЦР и титрованием на культуре клеток 4647. Определено, что при титровании в монослое культуры клеток 4647 вакцинный штамм вируса осповакцины 1421ABJCN продуцирует однотипные БОЕ диаметром от 0.5 до 1.0 мм. Длины фрагментов, полученные в результате ПНР анализа трех серий вакцинного штамма вируса осповакцины, соответствуют расчетным данным, приведенным в таблице 1 и на фиг. 4.Authenticity is confirmed in accordance with the requirements of EF 7.0, p. 1152, by PCR and titration on a 4647 cell culture. It was determined that when titrating into a monolayer of a 4647 cell culture, the vaccine strain of vaccinia virus 1421ABJCN produces the same type of PFU with a diameter of 0.5 to 1.0 mm. The lengths of the fragments obtained as a result of the analysis of three series of vaccine strain of vaccinia virus virus correspond to the calculated data shown in table 1 and in FIG. four.
Штамм прошел 4 пассажа на культуре клеток CV-1, 10 пассажей на культуре клеток 4647. При исследовании свойств полученного штамма были изучены его основные свойства: подлинность, генетическая однородность, стерильность, безвредность, иммуногенная активность, специфическая безопасность, нейровирулентность, остаточная вирулентность. Установлено, что при титровании в монослое культуры клеток 4647 концентрация (титр) вируса составляет не менее 108 БОЕ/мл.The strain passed 4 passages on CV-1 cell culture, 10 passages on 4647 cell culture. When studying the properties of the obtained strain, its main properties were studied: authenticity, genetic uniformity, sterility, harmlessness, immunogenic activity, specific safety, neurovirulence, residual virulence. It was found that when titrating a monolayer of cell culture 4647, the concentration (titer) of the virus is at least 10 8 PFU / ml.
Результаты испытаний репликативных свойств вариантов ВОВ в культуре клеток CV-1 показали, что кривые развития вирусов достоверно не различаются (фиг. 5). Это указывает на то, что делеции одиночных, двух, трех, четырех и пяти генов вирулентности ВОВ не влияют на репродуктивные функции вирусов в изученной культуре клеток.The test results of the replicative properties of WWII variants in CV-1 cell culture showed that the virus development curves do not differ significantly (Fig. 5). This indicates that deletions of single, two, three, four and five genes of virulence of the Second World War do not affect the reproductive functions of viruses in the studied cell culture.
Генетическая однородность показана методом секвенирования (фиг. 6).Genetic homogeneity is shown by sequencing (Fig. 6).
Штамм стерилен и безвреден при подкожном введении для морских свинок и белых мышей.The strain is sterile and harmless when administered subcutaneously for guinea pigs and white mice.
Авторами были проведены лабораторные эксперименты по изучению остаточной вирулентности трех серий вакцинного штамма 1421ABJCN вируса осповакцины после 1-го (1 серия), 5-го (2 серия) и 10-го (3 серия) пассажа в сравнении с родительским кл. 14 штамма Л-ИВП вируса осповакцины при иммунизации животных двумя способами: подкожно или внутрибрюшинно. Для этого мышам линии Balb/c с массой тела 14-16 г вводили препараты вакцинных штаммов в дозе 107 БОЕ/мышь, что соответствует иммунизирующей дозе вакцины. Животные контрольной группы получали инъекцию физиологического раствора.The authors conducted laboratory experiments to study the residual virulence of three series of vaccine strain 1421ABJCN vaccinia virus after the 1st (1st series), 5th (2nd series) and 10th (3rd series) passage in comparison with the parent cl. 14 strains of vaccinia virus L-IVP virus during immunization of animals in two ways: subcutaneously or intraperitoneally. For this, the Balb / c mice weighing 14-16 g were injected with vaccine strains at a dose of 10 7 PFU / mouse, which corresponds to the immunizing dose of the vaccine. Animals of the control group received an injection of saline.
Была определена динамика изменения среднего веса мышей при иммунизации животных вакцинными штаммами подкожно. Мышей взвешивали перед инфицированием и затем в течение 14 сут после иммунизации. Изменение веса рассчитывали как разницу показателя веса перед заражением и показателя веса в определенный день после инфицирования, выраженное в процентах. Как видно из данных, приведенных на фиг. 7, изменение веса иммунизированных вакцинными штаммами 1421ABJCN вируса осповакцины мышей не отличалось от родительского кл. 14 штамма Л-ИВП вируса осповакцины.The dynamics of changes in the average weight of mice during immunization of animals with vaccine strains subcutaneous was determined. Mice were weighed before infection and then for 14 days after immunization. Weight change was calculated as the difference in weight before infection and weight on a certain day after infection, expressed as a percentage. As can be seen from the data shown in FIG. 7, the weight change of mouse vaccinated vaccine strains 1421ABJCN vaccinia virus mice did not differ from the parent cl. 14 strains of vaccinia virus L-IVP virus.
При определении остаточной вирулентности проводили три последовательных пассажа на культуре клеток 4647 10% тканевой суспензии. В результате проведенных экспериментов было установлено, что при подкожной и внутрибрюшинной иммунизации мышей линии BALB/c тремя сериями вакцинного штамма 1421ABJCN и родительским кл. 14 штамма Л-ИВП ВОВ на 3, 7 и 14-е сутки после инъекции вирусы не размножаются, не распространяются и не задерживаются в организме привитых животных в исследуемых органах (табл. 2).When determining residual virulence, three consecutive passages were performed on a cell culture of 4647 10% tissue suspension. As a result of the experiments, it was found that during subcutaneous and intraperitoneal immunization of BALB / c mice with three series of vaccine strain 1421ABJCN and the parent cell. On the 14th, 14th and 14th day of the WWII L-IVP strain, the viruses do not multiply, do not spread, and do not linger in the body of the vaccinated animals in the studied organs (Table 2).
Авторами были определены титры вируснейтрализующих антител в сыворотках крови мышей, полученных после второй иммунизации их тремя сериями вакцинного штамма 1421ABJCN вируса осповакцины и родительским кл. 14, штамм Л-ИВП вируса освповакцины. Мыши были инфицированы разными титрами вирусов: превышающей, равной человеческой и меньшей дозами. Для иммунизации был использован способ, которым препарат предлагается вводить человеку, т.е. подкожный.The authors determined the titers of neutralizing antibodies in the blood serum of mice obtained after the second immunization with three series of vaccine strain 1421ABJCN vaccinia virus and the parent cl. 14, strain L-IVP of the vaccinia virus. Mice were infected with different titers of viruses: in excess, equal to human and lower doses. For immunization, the method by which the drug is proposed to be administered to a person, i.e. subcutaneous.
В результате проведенных экспериментов было установлено, что подкожная иммунизация мышей линии BALB/c тремя сериями вакцинного штамма 1421ABJCN вызывает наработку вируснейтрализующих антител, уровень которых составляет от 0.92±0,11 до 1.69±0,1 БОЕ/мышь, что сопоставимо с уровнем вируснейтрализующих антител при подкожной иммунизации животных родительским вирусом осповакцины кл. 14 Л-ИВП (таблица 3).As a result of the experiments, it was found that subcutaneous immunization of BALB / c mice with three series of vaccine strain 1421ABJCN causes the production of virus-neutralizing antibodies, the level of which is from 0.92 ± 0.11 to 1.69 ± 0.1 PFU / mouse, which is comparable to the level of virus-neutralizing antibodies with subcutaneous immunization of animals with the parental vaccinia virus cl. 14 L-IVP (table 3).
Было показано, что значения нейтрализующей активности сывороток носит дозозависимый характер: с увеличением титра вводимого вакцинного штамма увеличивается титр нейтрализующих антител (фиг. 8).It was shown that the values of the neutralizing activity of sera is dose-dependent in nature: with an increase in the titer of the introduced vaccine strain, the titer of neutralizing antibodies increases (Fig. 8).
Был показан защитный эффект трех серий вакцинного штамма 1421ABJCN вируса осповакцины через 56 дней после иммунизации. В контрольной группе на седьмые сутки после заражения высоковирулентным для мышей вирусом эктромелии в дозе 10 LD50/мышь у большинства животных были отмечены признаки заболевания: взъерошенная шерсть, падение аппетита и общей активности. В последующие сутки эти признаки наблюдались уже у всех животных в группе, а также началась их гибель. На 12 сутки у некоторых мышей в группе наблюдались изъязвления под хвостом. На 14 сутки все животные в контрольной группе погибли.The protective effect of three series of vaccine strain 1421ABJCN vaccinia virus was shown 56 days after immunization. In the control group, on the seventh day after infection with an ectromelia virus highly virulent for mice at a dose of 10 LD 50 / mouse, the signs of the disease were noted in most animals: ruffled coat, loss of appetite and general activity. In the next day, these signs were already observed in all animals in the group, and their death also began. On
Гибели животных в опытных группах не наблюдалось. Однако необходимо отметить, что на восьмые-девятые сутки у некоторых животных, иммунизированных вакцинными штаммами, были зарегистрированы признаки заболевания (взъерошенная шерсть и незначительное падение аппетита), которые проходили к 13-14 суткам.The death of animals in the experimental groups was not observed. However, it should be noted that on the eighth and ninth days in some animals immunized with vaccine strains, signs of the disease (tousled hair and a slight loss of appetite) were recorded, which passed by 13-14 days.
Таким образом, как свидетельствуют результаты исследования в течение всего срока наблюдения, гибели животных, иммунизированных образцами вакцинного штамма после 1-го, 5-го и 10-го пассажей на культуре клеток 4647, не отмечалось, в то время как контрольная группа мышей, которым был введен физиологический раствор, полностью погибла (таблица 4).Thus, according to the results of the study during the entire observation period, the death of animals immunized with samples of the vaccine strain after the 1st, 5th, and 10th passages in 4647 cell culture was not observed, while the control group of mice that saline was introduced, completely died (table 4).
Штамм не вызывает некрозов при подкожном введении кроликам в дозе 104 БОЕ/0,1 мл (специфическая безопасность). Испытание проводили на 2-х белокожих кроликах породы «Шиншилла» массой от 2,5 до 3,5 кг, полученных из питомника лабораторных животных ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». Шерсть на боках в местах предполагаемых прививок удаляли. Для проведения испытания вакцинный штамм вируса осповакцины разводили стерильным физиологическим раствором до содержания 102, 103, 104, 105, 106 и 107 БОЕ в 0,1 мл. Каждое разведение вводили кролику внутрикожно по 0,1 мл, в два разных участка кожи.The strain does not cause necrosis by subcutaneous administration to rabbits at a dose of 10 4 PFU / 0.1 ml (specific safety). The test was carried out on 2 white-skinned Chinchilla rabbits weighing from 2.5 to 3.5 kg, obtained from the laboratory animal nursery FBUN SSC VB "Vector". The wool on the sides at the sites of the alleged vaccinations was removed. To test vaccine strain of vaccinia virus was diluted with sterile saline to content of 10 2, 10 3, 10 4, 10 5, 10 6 and 10 July pfu in 0.1 ml. Each dilution was injected intradermally into the rabbit 0.1 ml, in two different skin areas.
Для сравнения, тем же кроликам аналогичным образом на другом боку вводили по 0,1 мл растворов родительского кл. 14 вируса осповакцины штамм Л-ИВП с концентрацией 102, 103, 104, 105, 106 и 107 БОЕ/0,1 мл. Наблюдение за животными проводили в течение 14 суток. Определяли время появления и заживления инфильтратов в зависимости от титра и исследуемого вирусного штамма. Сравнивали показатели исходного и исследуемого вакцинных штаммов (таблица 5).For comparison, the same rabbits were similarly injected with 0.1 ml of parental cell solutions on the other side. 14 vaccinia virus strain L-IVP with a concentration of 10 2 , 10 3 , 10 4 , 10 5 , 10 6 and 10 7 PFU / 0.1 ml. Observation of animals was carried out for 14 days. The time of appearance and healing of infiltrates was determined depending on the titer and the studied viral strain. The initial and test vaccine strains were compared (Table 5).
Штамм не обладает нейровирулентностью: не вызывает гибель новорожденных мышей линии Balb/c при интрацеребральном заражении. Мышам-сосункам интрацеребрально вводили по 10 мкл вируса кл. 14 Л-ИВП ВОВ и три серии вакцинного штамма 1421ABJCN в дозе 102 БОЕ/мышь. Через 3 сут после введения извлекали пробы головного мозга, гомогенизировали с последующим приготовлением 10 % тканевой суспензии. Полученный гомогенат титровали в монослое культуры клеток 4647, сравнивали исходный вакцинный и исследуемые штаммы.The strain does not possess neurovirulence: it does not cause the death of newborn Balb / c mice during intracerebral infection. Sucker mice were injected intracerebrally with 10 μl of the virus cl. 14 L-IVP BOB and three series of vaccine strain 1421ABJCN at a dose of 10 2 PFU / mouse. 3 days after the injection, brain samples were removed, homogenized, followed by preparation of a 10% tissue suspension. The resulting homogenate was titrated into a monolayer of cell culture 4647, the original vaccine and the studied strains were compared.
Показали снижение нейровирулентности вакцинного штамма 1421ABJCN (титр вируса БОЕ/г органа ± стандартное отклонение - (0.93±0.35)×103) на три порядка в сравнении с родительским кл. 14 штамма Л-ИВП вируса осповакцины (1.32±0.53)×106. Представлены среднегеометрические значения вирусной нагрузки в виде log10/г органа ± стандартное отклонение (фиг. 9).Showed reduced neurovirulence vaccine strain 1421ABJCN (virus titer pfu / g body ± standard deviation - (0.93 ± 0.35) × 10 March) three orders of magnitude as compared with the parental cells. 14 strains of vaccinia virus L-IVP virus (1.32 ± 0.53) × 10 6 . Geometric mean values of the viral load are presented as log 10 / g organ ± standard deviation (Fig. 9).
Изучены условия и сроки хранения штамма:The conditions and shelf life of the strain were studied:
- хранение при температуре от минус 70°C до минус 18°C.- storage at temperatures from minus 70 ° C to minus 18 ° C.
Культура клетокCell culture
Для наработки вакцинного штамма и для определения титра вируснейтрализующих антител использовали: культура клеток 4647, перевиваемая линия клеток почки африканской зеленой мартышки, получена из коллекции культур клеток ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор", аттестована ГИСК им. Л.А. Тарасевича в соответствии с требованиями РД 42-28-10-89 и рекомендована для производства профилактических МИБП (протокол №14 от 28.10.03. заседания Ученого Совета ГИСК им. Л.А. Тарасевича; протокол №9 от 20.11.03. Комитета МИБП).To generate a vaccine strain and to determine the titer of neutralizing antibodies used: cell culture 4647, transplantable cell line of the kidney of the African green monkey, obtained from the collection of cell cultures FBUN SSC VB "Vector", certified GISK them. L.A. Tarasevich in accordance with the requirements of RD 42-28-10-89 and recommended for the production of preventive MIBP (protocol No. 14 of 10/28/03. Meeting of the Scientific Council of GISK named after LA Tarasevich; protocol No. 9 of 11/20/03. )
ЖивотныеAnimals
В зависимости от задач эксперимента для оценки специфической активности и безвредности были использованы мыши линии Balb/c, самки, весом 14-16 г или сосунки этой же линии весом 5-6 г, полученные из питомника ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор".Depending on the objectives of the experiment, Balb / c mice, females weighing 14–16 g or suckers of the same line weighing 5–6 g, obtained from the nursery FBUN SSC VB "Vector" were used to evaluate specific activity and harmlessness.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.The invention is illustrated by the following examples of specific performance.
Пример 1. Получение плазмид интеграции.Example 1. Obtaining plasmids integration.
Методом ПЦР получали два фрагмента генома ВОВ, фланкирующие делетируемый ген слева (L-flank) и справа (R-flank). Олигонуклеотидные праймеры для ПЦР рассчитывали таким образом, чтобы делеция целевого гена не приводила к нарушению прилегающих к нему генов. Нуклеотидная последовательность ДНК ВОВ штамма Л-ИВП была получена из базы данных с идентификационным номером DQ121394 (http://www.poxvirus.org). Расчет олигонуклеотидных праймеров для ПЦР и подбор условий реакции выполняли с помощью программы "Oligo" (версия 3.3) фирмы Borland International. В работе использовали следующие праймеры, которые были синтезированы на автоматическом синтезаторе ABI-394 («Applied Biosystems», США) в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск):Two fragments of the BOB genome were obtained by PCR, flanking the deleted gene on the left (L-flank) and on the right (R-flank). The oligonucleotide primers for PCR were calculated so that the deletion of the target gene did not lead to disruption of the adjacent genes. The nucleotide sequence of BOB DNA of strain L-IVP was obtained from the database with identification number DQ121394 (http://www.poxvirus.org). Calculation of oligonucleotide primers for PCR and the selection of reaction conditions were performed using the Oligo program (version 3.3) of Borland International. The following primers were used in the work, which were synthesized on an ABI-394 automatic synthesizer (Applied Biosystems, USA) at the Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine of the SB RAS (Novosibirsk):
Для делеций гена B8RFor B8R gene deletions
L-flank:L-flank:
R-flank:R-flank:
Для делеций гена C3LFor C3L gene deletions
L-flank:L-flank:
R-flank:R-flank:
Для делеций гена A56RFor A56R gene deletions
L-flank:L-flank:
R-flank:R-flank:
Для делеций гена N1bFor deletions of the N1b gene
L-flank:L-flank:
R-flank:R-flank:
Участки узнавания эндонуклеаз рестрикции, названия которых указаны справа в скобках, подчеркнуты.The recognition sites of restriction endonucleases, the names of which are indicated on the right in brackets, are underlined.
Клонировали одновременно обе фланкирующие области каждого гена в векторную плазмиду pMGC20-gpt. Для этого ПЦР-фрагменты и векторная плазмида были обработаны соответствующими ферментами и подвергнуты электрофорезу в 1% агарозном геле. Фрагменты ДНК были вырезаны из геля и очищены на колонках производства QIAGene. По 2 мкл из 30 мкл каждого элюата были анализированы электрофорезом в 1.2% агарозном геле. На лигирование было взято по 5 мкл каждого фрагмента и 2 мкл векторной плазмиды. Далее лигазные смеси были использованы для электротрансформации электрокомпетентных клеток E.coli штамм JM-109. На чашки Петри с 1% агаром и антибиотиком (ампициллин 50 мкг/мл) было высеяно по 1/10 части трансформированного материала. Индивидуальные колонии с каждой чашки были засеяны в пробирки с LB. Плазмидные ДНК выделяли щелочным способом и негидролизованные ДНК анализировали в 1% агарозном геле. По результатам анализа отбирали нужные клоны и дополнительно анализировали их гидролизом эндонуклеазами рестрикции. Препаративные количества трех клонов нарабатывали в 50 мл LB-среды с антибиотиком (ампициллин 50 мкг/мл). Плазмиды выделяли щелочным способом. Очистка плазмид проводилась следующим способом: обработка 2.5 M LiCl полчаса при -18 градусах, обработка 2.5 M LiCl 10 мин при +65 градусах, далее двухкратное осаждение этиловым спиртом. Обработка РНКазой 10 мин при +37 градусах, экстракция фенолом, двухкратная реэкстракция изоамиловым спиртом с последующим двухкратным осаждением этиловым спиртом. Осадки плазмид растворяли в 500 мкл ТЕ-буфера и анализировали гидролизом ферментами рестрикции.Both flanking regions of each gene were cloned simultaneously into the vector plasmid pMGC20-gpt. For this, PCR fragments and a vector plasmid were treated with the corresponding enzymes and subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel. DNA fragments were excised from the gel and purified on QIAGene columns. 2 μl of 30 μl of each eluate were analyzed by electrophoresis in 1.2% agarose gel. For ligation, 5 μl of each fragment and 2 μl of the vector plasmid were taken. Next, ligase mixtures were used for the electrotransformation of electrocompetent cells of E. coli strain JM-109. 1/10 of the transformed material was seeded on Petri dishes with 1% agar and antibiotic (
Пример 2. Получение рекомбинантных вирусов.Example 2. Obtaining recombinant viruses.
Рекомбинантные вирусы осповакцины получали в клетках CV-1 с помощью набора Lipofectine (Gibco BRL) и селективной среды, содержащей МРА, ксантин и гипоксантин. Для этого монослой клеток CV-1 инфицировали вирусом с множественностью заражения 0.1 БОЕ на клетку, выдерживали 1 ч при 37°C, отмывали средой без сыворотки и проводили трансфекцию рекомбинантной плазмидой интеграции: 3 мкл плазмиды в концентрации 1 мкг/мкл смешивали с 15 мкл липофектина в концентрации 1 мг/мл, добавляли 1 мл среды ДМЕМ, содержащей: МРА в концентрации 25 мкг/мл, ксантин - 250 мкг/мл и гипоксантин - 15 мкг/мл, и оставляли на 15 мин при комнатной температуре, затем наносили по каплям на монослой. Через 20 ч клетки заливали селективной средой, которая содержала МРА, ксантин и гипоксантин и оставляли еще на сутки. После четырех-пяти пассажей в условиях селекции (до получения ЦПД), вирус клонировали под агарозным покрытием. Для этого вирусную суспензию обрабатывали ультразвуком в течение 30 с, титровали на монослое клеток CV-1 и выделяли клоны, используя 2-кратную поддерживающую среду ДМЕМ с 2% агарозой. Далее эти клоны подращивали в неселективных условиях и реклонировали как указано выше. По результатам ПЦР отбирали по одному стабильно реплицирующемуся реклону от 2-3-х клонов, нарабатывали, расфасовывали на отдельные аликвоты, титровали методом окрашивания бляшек кристаллическим фиолетовым, замораживали и использовали для дальнейшей работы.Recombinant vaccinia viruses were obtained in CV-1 cells using a Lipofectine kit (Gibco BRL) and selective medium containing MPA, xanthine and hypoxanthine. For this, a monolayer of CV-1 cells was infected with a virus with a multiplicity of infection of 0.1 PFU per cell, kept for 1 h at 37 ° C, washed with serum-free medium and transfected with a recombinant integration plasmid: 3 μl of the plasmid at a concentration of 1 μg / μl was mixed with 15 μl of lipofectin at a concentration of 1 mg / ml, 1 ml of DMEM medium was added, containing: MPA at a concentration of 25 μg / ml, xanthine - 250 μg / ml and hypoxanthine - 15 μg / ml, and left for 15 min at room temperature, then applied dropwise on a monolayer. After 20 hours, the cells were poured with selective medium, which contained MPA, xanthine and hypoxanthine and left for another day. After four to five passages under selection conditions (until the CPP was obtained), the virus was cloned under an agarose coating. For this, the viral suspension was sonicated for 30 s, titrated onto a monolayer of CV-1 cells, and clones were isolated using 2-fold DMEM support medium with 2% agarose. Further, these clones were grown under non-selective conditions and recloned as described above. According to the PCR results, one stably replicating recepton from 2-3 clones was selected, produced, packaged in separate aliquots, titrated with plaque staining with crystal violet, frozen and used for further work.
Пример 3. Выделение вирусной ДНК.Example 3. Isolation of viral DNA.
Для выделения вирусной ДНК монослой клеток CV-1 в стеклянных флаконах (25 см3) заражали вирусными клонами с множественностью 0.1-1 БОЕ на клетку, инкубировали 1 ч при 37°C. Через 1-2 дня, при появлении ЦПД, поддерживающую среду удаляли, монослой отмывали промывочным раствором, добавляли 1 мл/флакон этого же раствора и замораживали. Вирус высвобождали из клеток путем двукратной заморозки/оттаивания. К вирусной суспензии добавляли 100 мкл 10% тритона Х-100 и 2,5 мкл меркаптоэтанола и осаждали 10 мин при 10000 об/мин в роторе JA-20 в центрифуге J2-21 (Beckman, США). Супернатант отбирали и осаждали при 18000 об/мин 60 мин в роторе JA-20 в центрифуге J2-21 (Beckman, США). Растворяли в 100 мкл холодного ТЕ и добавляли:To isolate viral DNA, a monolayer of CV-1 cells in glass vials (25 cm 3 ) was infected with viral clones with a multiplicity of 0.1-1 PFU per cell, incubated for 1 h at 37 ° C. After 1-2 days, when the CPD appeared, the supporting medium was removed, the monolayer was washed with a washing solution, 1 ml / vial of the same solution was added and frozen. The virus was released from cells by freezing / thawing twice. 100 μl of 10% Triton X-100 and 2.5 μl of mercaptoethanol were added to the viral suspension and precipitated for 10 min at 10,000 rpm in a JA-20 rotor in a J2-21 centrifuge (Beckman, USA). The supernatant was collected and besieged at 18,000 rpm for 60 minutes in a JA-20 rotor in a J2-21 centrifuge (Beckman, USA). Dissolved in 100 μl of cold TE and added:
170 мкл 46% сахарозы170
6 мкл 5М NaCl6 μl 5M NaCl
6 мкл 250 мМ ЭДТА6 μl 250 mM EDTA
1,5 мкл меркаптоэтанола1.5 μl mercaptoethanol
10 мкл 30% саркозила10 μl 30% sarcosyl
20 мкл протеиназы К (50-100 мкг/мл) Инкубировали 2 часа при 55°C. ДНК очищали от белков смесью фенол/хлороформ (1:1), отбирали верхнюю фазу и добавляли 2,5 объема спирта и 0,1 объема 3 M КАс и осаждали ДНК ночь при -20°C. Центрифугировали 5 мин при 10000 об/мин в центрифуге типа «Эппендорф», тщательно промывали осадок этанолом и растворяли в 30 мкл деионизованной воды.20 μl of proteinase K (50-100 μg / ml) were incubated for 2 hours at 55 ° C. DNA was purified from proteins with a phenol / chloroform mixture (1: 1), the upper phase was selected and 2.5 volumes of alcohol and 0.1 volumes of 3 M KAs were added and DNA was precipitated overnight at -20 ° C. It was centrifuged for 5 min at 10,000 rpm in an Eppendorf centrifuge, the precipitate was thoroughly washed with ethanol and dissolved in 30 μl of deionized water.
Клоны анализировали методом ПЦР на наличие целевых делеций/инсерций с использованием соответствующих пар праймеров.Clones were analyzed by PCR for the presence of target deletions / insertions using the appropriate pairs of primers.
Пример 4. ПЦР анализ ДНК рекомбинантных вирусов.Example 4. PCR analysis of DNA of recombinant viruses.
Клоны анализировали методом ПЦР на наличие целевых делеций/инсерций в их ДНК с использованием соответствующих пар праймеров, которые были синтезированы на автоматическом синтезаторе ABI-394 («Applied Biosystems», США) в Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск):Clones were analyzed by PCR for the presence of target deletions / insertions in their DNA using the corresponding pairs of primers that were synthesized on an ABI-394 automatic synthesizer (Applied Biosystems, USA) at the Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS (Novosibirsk):
Для ΔB8R:For ΔB8R:
Для AC3L:For AC3L:
Для ΔA56R:For ΔA56R:
Для ΔN1L:For ΔN1L:
Для J2R-MCS:For J2R-MCS:
Полимеразную цепную реакцию проводили в 0,2 мл тонкостенных микропробирках («Applied Biosystems», США) в амплификаторе «GeneAmp PCR System 9700» («Applied Biosystems», США). Реактивы для реакции: SE-буфер для Taq ДНК-полимеразы, трифосфаты, Taq Д НК-полимеразу, производства фирмы «СибЭнзим» (г. Новосибирск, Россия), стерильную деионизованную воду размораживали. Готовили смесь компонентов тест-системы из расчета на одну пробу (25 мкл):The polymerase chain reaction was carried out in 0.2 ml of thin-walled microtubes (Applied Biosystems, USA) in a GeneAmp PCR System 9700 thermocycler (Applied Biosystems, USA). Reagents for the reaction: SE-buffer for Taq DNA polymerase, triphosphates, Taq D NK polymerase, manufactured by SibEnzyme (Novosibirsk, Russia), sterile deionized water was thawed. A mixture of test system components was prepared based on one sample (25 μl):
- 2.5 мкл SE-буфера для Taq ДНК-полимеразы (рН 8,5 при 25°C: 60 мМ Tris-HCl, 25 мМ KCl, 1.5 мМ MgCl2, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1% Тритон Х-100);2.5 μl of Taq DNA polymerase SE buffer (pH 8.5 at 25 ° C: 60 mM Tris-HCl, 25 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , 10 mM 2-mercaptoethanol, 0.1% Triton X-100 );
- 2.5 мкл смеси трифосфатов (по 0.2 мМ, dNTP);- 2.5 μl of a mixture of triphosphates (0.2 mmol, dNTP);
- по 1 мкл прямого и обратного праймеров (0,7 мкМ);- 1 μl of forward and reverse primers (0.7 μM);
- 0.5 мкл Taq ДНК-полимеразы (2.5 ед.);- 0.5 μl of Taq DNA polymerase (2.5 units);
- 5 мкл ДНК-матрицы (около 2-10 нг);- 5 μl of the DNA template (about 2-10 ng);
- 13.5 мкл воды стерильной деионизованной (Н2Оди).- 13.5 μl of sterile deionized water (H 2 O di ).
В пробирку, помеченную как отрицательный контроль, вместо ДНК-матрицы вносили Н2Оди. Затем пробирки переносили в амплификатор и проводили ПНР по программе, включающей следующие этапы:In a test tube labeled as a negative control, H 2 O di was added instead of the DNA template. Then the tubes were transferred to an amplifier and a NDP was carried out according to a program that included the following steps:
- предварительная денатурация ДНК при 94°C, 1 мин 30 с;- preliminary DNA denaturation at 94 ° C, 1 min 30 s;
- 20 циклов, состоящих из:- 20 cycles consisting of:
1. денатурации ДНК при температуре 94°C, 20 с,1. DNA denaturation at a temperature of 94 ° C, 20 s,
2. отжига праймеров при 55°C в течение 30 с,2. annealing the primers at 55 ° C for 30 s,
3. синтеза комплементарной цепи при 72°C, 1 мин,3. synthesis of a complementary chain at 72 ° C, 1 min,
- после последнего цикла пробирки прогревают в течение 5 мин при 72°C.- after the last cycle, the tubes are heated for 5 min at 72 ° C.
Продукты амплификации хранили при температуре 4°C до проведения электрофоретического анализа.Amplification products were stored at 4 ° C until electrophoretic analysis.
Анализ фрагментов проводили электрофорезом в 1% агарозном геле в буфере ТАЕ с бромистым этидием в концентрации 0.2 мкг/мл.Fragments were analyzed by electrophoresis on a 1% agarose gel in TAE buffer with ethidium bromide at a concentration of 0.2 μg / ml.
Для приготовления 1% агарозного геля к 0.5 г агарозы добавляли 50 мл буферного раствора для электрофореза. Смесь в термостойкой колбе нагревали в кипящей водяной бане, пока агароза не расплавится, после охлаждения до температуры 50°C агарозу выливали на подготовленный столик аппарата для электрофореза (типа ПГ-9), при этом образуется слой агарозы высотой 4 мм. С помощью специального штампа - "гребенки" на катодном конце геля формировали лунки для нанесения проб. Между дном лунок и основанием геля должен оставаться слой агарозы 0.5-1.0 мм. Буферные емкости аппарата ПГ-9 заполняли буферным раствором для электрофореза, при этом он должен покрывать гель слоем 4-5 мм.To prepare a 1% agarose gel, 50 ml of electrophoresis buffer solution was added to 0.5 g of agarose. The mixture in a heat-resistant flask was heated in a boiling water bath until the agarose melted, after cooling to a temperature of 50 ° C, the agarose was poured onto the prepared table of the electrophoresis apparatus (type PG-9), and a 4 mm high agarose layer was formed. Using a special stamp - “combs”, holes were formed on the cathode end of the gel for depositing samples. A layer of agarose 0.5-1.0 mm should remain between the bottom of the wells and the base of the gel. The buffer capacities of the PG-9 apparatus were filled with electrophoresis buffer solution, while it should cover the gel with a layer of 4-5 mm.
Для контроля размера полученного амплифицированного фрагмента вносили 20 мкл маркера молекулярных весов в диапазоне 100-10000 п. о. («СибЭнзим»). Электрофорез проводили при градиенте напряжения 10 В/см в течение 45-90 мин, пока краситель - бромфеноловый синий - не пройдет от катодного конца геля 6-8 см.To control the size of the obtained amplified fragment, 20 μl of molecular weight marker was added in the range of 100-10000 bp. (SibEnzyme). Electrophoresis was carried out at a voltage gradient of 10 V / cm for 45-90 min, until the dye - bromphenol blue - passes from the cathode end of the gel 6-8 cm
Окрашенную бромистым этидием ДНК в геле просматривали под ультрафиолетовым излучением, для чего использовали трансиллюминатор с максимальной длиной волны 254 нм. Гель фотографировали в проходящем ультрафиолете при помощи цифрового фотоаппарата.The ethidium bromide-stained DNA in the gel was viewed under ultraviolet radiation, for which a transilluminator with a maximum wavelength of 254 nm was used. The gel was photographed in the passing ultraviolet with a digital camera.
Пример 5. Титрование вируса и клонирование через бляшку.Example 5. Virus titration and plaque cloning.
Вирусную суспензию предварительно обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе типа "MSE 500" мощностью 22 кГц импульсивно 2-3 раза по 10-15 с. Титрование вируса проводили, используя 6-луночный планшет, на 90-100% монослое клеток CV-1 и Vero. Готовили разведения вируса: 1:10, 1:102, 1:103, 1:104, 1:105, 1:106 на среде ДМЕМ. Сорбцию вируса проводили 1 час при 37°C. Затем отбирали вирусную суспензию и добавляли 2 мл среды ДМЕМ с 2% сыворотки в лунку.The viral suspension was pre-treated on an ultrasonic disintegrator of the
Клонирование вируса через бляшку проводили на 6-луночных планшетах. Для этого монослой клеток CV-1 заражали вирусной суспензией в таком разведении, чтобы образовывались отдельно расположенные бляшки, и проводили адсорбцию в течение 60 мин при 37°C. Отбирали вирус и заливали 2 мл/лунку поддерживающей среды ДМЕМ, содержащей 1%-ую легкоплавкую агарозу (Sigma). Выдерживали 15 мин при комнатной температуре. После застывания добавляли 1 мл/лунку поддерживающей среды DMEM. Инкубировали в термостате при 37°C 48-72 час. Отбирали верхнюю жидкую фазу и добавляли по 1 мл/лунку водный раствор нейтрального красного, разведенного в среде DMEM в соотношении 1:20. Инкубировали при 37°C в течение 1-2 час. После этого отбирали среду с краской и отмечали бляшки, образованные вирусными частицами. Затем выделяли индивидуальную бляшку, переносили ее в 100 мкл среды DMEM и замораживали.Cloning of the virus through plaque was performed on 6-well plates. For this, a monolayer of CV-1 cells was infected with a viral suspension in such a dilution that separate plaques formed, and adsorption was carried out for 60 min at 37 ° C. The virus was selected and 2 ml / well of DMEM support medium containing 1% low-melting agarose (Sigma) was added. Maintained for 15 min at room temperature. After solidification, 1 ml / well of DMEM support medium was added. Incubated in a thermostat at 37 ° C for 48-72 hours. The upper liquid phase was selected and 1 ml / well of an aqueous solution of neutral red diluted in DMEM medium was added in a ratio of 1:20. Incubated at 37 ° C for 1-2 hours. After that, the medium with paint was selected and plaques formed by viral particles were noted. An individual plaque was then isolated, transferred to 100 μl of DMEM medium, and frozen.
Пример 6. Определение динамики роста мутантных вариантов ВОВ.Example 6. Determination of the growth dynamics of mutant variants of the Second World War.
Для изучения динамики развития исходного ВОВ ЛИВП и мутантных штаммов с делециями генов вирулентности C3L, B8R, A56R, NIL и J2R 90-100% монослой культуры клеток CV-1, полученный на 6-луночных планшетах, инфицировали вирусами с множественностью заражения 0,1 БОЕ/кл. Время после инфекции составляло 24, 48 и 72 час.На каждом временном этапе определяли титр вируса, как описано выше.To study the dynamics of the development of the initial WWII LIVP and mutant strains with deletions of virulence genes C3L, B8R, A56R, NIL and J2R, 90-100% CV-1 cell culture monolayer obtained on 6-well plates was infected with viruses with a multiplicity of infection of 0.1 PFU / cl. The time after infection was 24, 48, and 72 hours. At each time step, the virus titer was determined as described above.
Достоверность результатов определяли по t-критерию Стьюдента с использованием программы Origin Professional 8.1.10.86. Достоверными считали значения при уровне значимости Ρ<0.05.The reliability of the results was determined by student t-test using the program Origin Professional 8.1.10.86. Values were considered significant at a significance level of Ρ <0.05.
Пример 7. Наработка и очистка вирусов:Example 7. The accumulation and purification of viruses:
- монослой культуры клеток 4647, выращенный на культуральных матрасах 650 мл, 175 см (Griener, Австрия), инфицировали исходным вирусом осповакцины, штамм ЛИВП или полученными сериями вакцинного штамма вируса осповакцины 1421ABJCN, с множественностью 1,0 БОЕ/кл.;- a monolayer of cell culture 4647, grown on culture mattresses 650 ml, 175 cm (Griener, Austria), was infected with the original vaccinia virus, strain LIVP or the obtained series of vaccine strain vaccinia virus 1421ABJCN, with a multiplicity of 1.0 PFU / cell .;
- инкубировали 48 час при температуре 37°C до образования полного ЦПД, в 20 мл поддерживающей среды, затем получали криолизат (три цикла замораживания-оттаивания) инфицированных клеток;- they were incubated for 48 hours at a temperature of 37 ° C until a complete CPD was formed in 20 ml of a supporting medium, then a cryolysate (three freeze-thaw cycles) of infected cells was obtained;
- объединяли криолизат из 15 культуральных матрасов и центрифугировали 14000 об/мин, 1,5 час в роторе JA-14 в центрифуге J2-21;- combined cryolysate from 15 cultural mattresses and centrifuged at 14,000 rpm, 1.5 hours in a JA-14 rotor in a J2-21 centrifuge;
- осадок растворяли в среде ДМЕМ, проводили еще один цикл замораживания-оттаивания, обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе типа "MSE 500" мощностью 22 кГц импульсивно 2-3 раза по 10-15 с;- the precipitate was dissolved in DMEM medium, another freeze-thaw cycle was performed, processed on an
- дебрис осаждали центрифугированием 10 мин при 5000 об/мин, в роторе JA-14 в центрифуге J2-21;;- debris was besieged by centrifugation for 10 min at 5000 rpm, in a rotor JA-14 in a centrifuge J2-21 ;;
- супернатант (120 мл) центрифугировали 14000 об/мин, 1,5 час в роторе JA-14 в центрифуге J2-21;- the supernatant (120 ml) was centrifuged at 14,000 rpm, 1.5 hours in a JA-14 rotor in a J2-21 centrifuge;
- осадок восстанавливали в 4 мл физиологического раствора, обрабатывали ультразвуком и расфасовывали по 1,5 мл пробиркам.- the precipitate was restored in 4 ml of physiological saline, treated with ultrasound and packaged in 1.5 ml tubes.
- Инфекционный титр всех образцов проверяли методом бляшек в монослое клеток CV-1 или 4647. Показано, что все выбранные варианты ВОВ нарабатываются с помощью описанной выше методики в достаточном для иммунизации мышей количестве.- The infectious titer of all samples was checked by plaques in a monolayer of cells CV-1 or 4647. It was shown that all selected BOB variants were produced using the above-described method in sufficient quantities to immunize mice.
Пример 8. Измерение титра вируснейтрализующих антител.Example 8. Measurement of the titer of neutralizing antibodies.
Титры вируснейтрализующих антител после второй иммунизации мышей определяли следующим образом, у мышей каждой группы после наркотизации пипеткой с наконечником на 200 мкл отбирали кровь из ретробульбарного венозного сплетения, объединяли внутри группы и инкубировали при 4°C в течение 20 час. Сыворотку получали последующим центрифугированием в течение 10 мин при 5000 об/мин в центрифуге типа «Эппендорф»,. Препараты сывороток хранили при минус 20°C.The titers of neutralizing antibodies after the second immunization of mice were determined as follows, in mice of each group after anesthesia with a pipette with a tip of 200 μl, blood was taken from the retrobulbar venous plexus, combined within the group and incubated at 4 ° C for 20 hours. Serum was obtained by subsequent centrifugation for 10 min at 5000 rpm in an Eppendorf centrifuge ,. Serum preparations were stored at minus 20 ° C.
Для измерения титра вируснейтрализующих антител клетки 4647 растили в среде DMEM с 10% эмбриональной сывороткой коров в 6-луночных планшетах до получения 90-100% монослоя клеток. К 100 мкл сывороток крови мышей, последовательно разведенных с шагом пять - 1:5, 1:25, 1:125 и т.д., добавляли равный объем вирусной суспензии осповакцины штамм Л-ИВП с титром 103 БОЕ/мл в среде DMEM и инкубировали при 37°C в течение 1 час. 200 мкл смеси сывороток с ВОВ наносили на монослой клеток 4647, проводили сорбцию в течение часа, после чего добавляли 2 мл среды DMEM с 2% эмбриональной сыворотки коров, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина на лунку и инкубировали 72 час при 37°C в атмосфере, содержащей 5% СО2. Затем удаляли среду и добавляли 0,2% красителя кристаллического фиолетового, разведенного в 10% этаноле. Подсчитывали число бляшек и рассчитывали эффективность нейтрализации относительно числа бляшек в лунках без сывороток.To measure the titer of neutralizing antibodies, 4647 cells were grown in DMEM medium with 10% fetal bovine serum in 6-well plates to obtain 90-100% cell monolayer. An equal volume of the virus suspension of smallpox vaccine strain L-IVP with a titer of 10 3 PFU / ml in DMEM medium was added to 100 μl of blood serum of mice sequentially diluted in steps of five - 1: 5, 1:25, 1: 125, etc. and incubated at 37 ° C for 1 hour. 200 μl of a mixture of serum with BOB was applied to a monolayer of cells 4647, sorption was performed for one hour, after which 2 ml of DMEM medium with 2% fetal serum of cows, 100 u / ml penicillin and 100 μg / ml streptomycin per well were added and incubated for 72 hours at 37 ° C in an atmosphere containing 5% CO 2 . Then the medium was removed and 0.2% crystalline violet dye diluted in 10% ethanol was added. The number of plaques was counted and the neutralization efficiency was calculated relative to the number of plaques in the wells without serum.
Пример 9. Оценка протективного иммунного ответа.Example 9. Evaluation of a protective immune response.
Для определения протективного иммунного ответа группы из 10 мышей линии BALB/c были инфицированы родительским кл. 14 Л-ИВП вируса осповакцины и тремя сериями вакцинного штамма 1421ABJCN в дозах 106, 107 и 108 БОЕ/мышь, подкожно, в объеме 100 мкл. Животные контрольной группы получали инъекцию физиологического раствора в том же объеме. Иммунизация проводилась дважды с интервалом в 28 дней. Спустя 28 дней после второй иммунизации штаммами вируса осповакцины мышей подвергали интраназальной инокуляции вирусом эктромелии с целью заражения через дыхательные пути. Для этого животных вводили в состояние легкого наркоза с помощью эфира. Затем, держа мышь за кожу шеи указательным и большим пальцами левой руки, а безымянным пальцем и мизинцем той же руки придерживая хвост и левую заднюю лапку, растягивали ее брюшком вверх. В этом положении вводили по 20 мкл суспензии ВЭ в каждую ноздрю с помощью микропипетки, согласно методике [Martinez M.J., Bray M.P., Huggins J.W. A mouse model o f aerosol-transmitted orthopoxviral disease: morphology of experimental aerosol-transmitted orthopoxviral disease in a cowpox virus-BALB/c mouse system. // Arch. Pathol. Lab. Med. - 2000. - V. 124. - P. 362-377]. Суммарный титр вируса, вводимого животному, составлял 10 LD50/мышь. Животные контрольной группы получали инъекцию физиологического раствора в том же объеме. Наблюдение за мышами вели в течение двух недель, учитывая количество выживших и погибших животных.To determine a protective immune response, groups of 10 BALB / c mice were infected with parental cells. 14 L-IVP of vaccinia virus and three series of vaccine strain 1421ABJCN at doses of 10 6 , 10 7 and 10 8 PFU / mouse, subcutaneously, in a volume of 100 μl. Animals of the control group received an injection of saline in the same volume. Immunization was carried out twice with an interval of 28 days. 28 days after the second immunization with vaccinia virus strains, the mice were intranasally inoculated with ectromelia virus for infection through the respiratory tract. For this, the animals were introduced into a state of mild anesthesia using ether. Then, holding the mouse by the skin of the neck with the index finger and thumb of the left hand, and holding the tail and left hind foot with the ring finger and little finger of the same hand, we stretched it abdomen up. In this position, 20 μl of the PE suspension was injected into each nostril using a micropipette according to the method of [Martinez MJ, Bray MP, Huggins JW A mouse model of aerosol-transmitted orthopoxviral disease: morphology of experimental aerosol-transmitted orthopoxviral disease in a cowpox virus- BALB / c mouse system. // Arch. Pathol. Lab. Med. - 2000. - V. 124. - P. 362-377]. The total titer of the virus administered to the animal was 10 LD 50 / mouse. Animals of the control group received an injection of saline in the same volume. Mice were monitored for two weeks, given the number of surviving and dead animals.
Для определения LD50 мышей подвергали интраназальной инокуляции вирусом эктромелии, как описано выше. Титры вируса, вводимого каждой группе животных, составляли 10, 102, 103, 104, 105 БОЕ/мышь. Наблюдение за мышами вели в течение двух недель, учитывая количество выживших и погибших животных. Расчет летальной дозы, вызывающей гибель 50% животных (LD50) вычисляли по методу Кербера.To determine the LD 50, mice were intranasally inoculated with ectromelia virus as described above. The titers of the virus administered to each group of animals were 10, 10 2 , 10 3 , 10 4 , 10 5 PFU / mouse. Mice were monitored for two weeks, given the number of surviving and dead animals. The calculation of the lethal dose causing the death of 50% of the animals (LD 50 ) was calculated by the method of Kerber.
Пример 10. Методы исследования остаточной вирулентности вакцинного штамма.Example 10. Research methods of residual virulence of a vaccine strain.
Мышам линии Balb/c в возрасте 6-8 недель с массой тела 14-16 г вводили препараты вируса осповакцины подкожно или внутрибрюшинно в объеме 0,1 мл на животное в область спины с помощью шприца на 1 мл с иглой 26G. Доза препаратов составляла 107 БОЕ/мышь, что соответствует иммунизирующей дозе вакцины. Животные контрольной группы получали инъекцию физиологического раствора в объеме 0,1 мл. Каждая экспериментальная группа состояла из 10 особей. Через 3, 7 и 14 сут после инъекции у мышей брали пробу крови из ретробульбарного венозного сплетения путем вырывания глаза с предварительной анестезией эфиром, после чего мышей подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации, стерильно извлекали селезенку, легкие, печень и головной мозг. Пробы одинаковых органов от трех мышей из одной группы помещали в одну пробирку и хранили при минус 70°C до титрования. Непосредственно перед титрованием пробы размораживали, гомогенизировали с последующим приготовлением 10% тканевой суспензии (на среде DMEM), затем после двух актов замораживания-оттаивания проводили озвучивание и центрифугирование (5000 об/мин, 10 мин, 4°C) полученного гомогената. После чего определяли концентрацию вирусов титрованием методом бляшек в монослое культуры клеток 4647. При определении остаточной вирулентности проводили три последовательных пассажа на культуре клеток 4647.Mice of the Balb / c line at the age of 6-8 weeks with a body weight of 14-16 g were injected with smallpox vaccine virus subcutaneously or intraperitoneally in a volume of 0.1 ml per animal in the back with a 1 ml syringe with a 26G needle. The dose was 10 7 PFU / mouse, which corresponds to the immunizing dose of the vaccine. Animals of the control group received an injection of saline in a volume of 0.1 ml. Each experimental group consisted of 10 individuals. 3, 7, and 14 days after injection, a blood sample was taken from mice from the retrobulbar venous plexus by tearing out the eyes with preliminary anesthesia with ether, after which the mice were euthanized by cervical dislocation, and the spleen, lungs, liver and brain were sterile. Samples of the same organs from three mice from the same group were placed in one tube and stored at minus 70 ° C until titration. Immediately prior to titration, the samples were thawed, homogenized, followed by preparation of a 10% tissue suspension (on DMEM medium), then, after two acts of freezing and thawing, sonication and centrifugation (5000 rpm, 10 min, 4 ° C) of the obtained homogenate were performed. After that, the concentration of viruses was determined by titration using plaques in a monolayer of cell culture 4647. When determining residual virulence, three consecutive passages were performed on a cell culture of 4647.
Пример 11. Методы исследования нейровирулентности вакцинного штамма.Example 11. Research methods for the neurovirulence of a vaccine strain.
Мышам-сосункам интрацеребрально вводили по 10 мкл вируса кл. 14 ЛИВП ВОВ и три серии вакцинного штамма 1421ABJCN в дозе 104 БОЕ/мл или 102 БОЕ/мышь. Через 3 сут после введения мышей подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации, стерильно извлекали пробы головного мозга, помещали в пробирку и хранили при минус 80°C до титрования. Непосредственно перед титрованием пробы размораживали, гомогенизировали с последующим приготовлением 10% тканевой суспензии (на среде DMEM), затем после трех актов замораживания-оттаивания проводили озвучивание и центрифугирование (5000 об/мин, 10 мин, 4°C) полученного гомогената. После чего определяли концентрации вирусов титрованием методом бляшек в монослое культуры клеток 4647, сравнивали исходный вакцинный и исследуемый штаммы.Sucker mice were injected intracerebrally with 10 μl of the virus cl. 14 LIVP BOB and three series of vaccine strain 1421ABJCN at a dose of 10 4 PFU / ml or 10 2 PFU / mouse. 3 days after administration, the mice were euthanized by cervical dislocation, brain samples were sterilized, placed in a test tube and stored at minus 80 ° C until titration. Immediately prior to titration, the samples were thawed, homogenized, followed by preparation of a 10% tissue suspension (on DMEM), then after three acts of freezing and thawing, sonication and centrifugation (5000 rpm, 10 min, 4 ° C) of the obtained homogenate were performed. After that, virus concentrations were determined by plaque titration in a monolayer of cell culture 4647, the original vaccine and the studied strains were compared.
Пример 12. Анализ данных.Example 12. Data analysis.
Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы Excel из пакета Microsoft Office 2010 (Microsoft Corp., USA). С использованием t-критерия Стьюдента оценивали обнаруженные межгрупповые различия. Расчет летальной дозы, вызывающей гибель 50% животных (LD50), осуществляли по методу Кербера. Статистически значимыми результатами эксперимента считали значения при уровне значимости Ρ<0.05 (Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. - Гос. изд. мед. лит., Л. - 1962.- 186 с.).Statistical processing of experimental data was performed using Excel from Microsoft Office 2010 (Microsoft Corp., USA). Using t-student criterion, the detected intergroup differences were evaluated. The calculation of the lethal dose causing the death of 50% of the animals (LD 50 ) was carried out according to the Kerber method. Statistically significant results of the experiment were considered values at a significance level of Ρ <0.05 (Ashmarin I.P., Vorobyov A.A. Statistical methods in microbiological research. - State ed. Med. Lit., L. - 1962.- 186 s.) .
Титры антител рассчитывали как среднее геометрическое в предположении, что элементы выборки распределены по логнормальному закону, и определяли его как -lg от наибольшего разведения сыворотки, при котором достигается 50% нейтрализация ВОВ ± стандартное отклонение.Antibody titers were calculated as geometric mean under the assumption that the sample elements were distributed according to the lognormal law, and determined as -lg from the highest dilution of serum, at which 50% neutralization of BOB ± standard deviation was achieved.
Таким образом, результаты приведенных выше исследований демонстрируют возможность создания безопасной вакцины третьего поколения против натуральной оспы и предсказывают высокую вероятность защиты населения от возможных актов биотерроризма, связанных с применением вируса натуральной оспы, а также от вспышек заболеваний, обусловленных зоонозными ортопоксвирусами, при использовании кандидатной живой вакцины на основе заявляемого аттенуированного вируса осповакцины штамм Л-ИВП с пятью нарушенными генами вирулентности (1421ABJCN). В материалах заявки показано, что:Thus, the results of the above studies demonstrate the possibility of creating a safe third-generation vaccine against smallpox and predict the high probability of protecting the population from possible acts of bioterrorism associated with the use of variola virus, as well as from outbreaks of diseases caused by zoonotic orthopoxviruses when using the candidate live vaccine based on the claimed attenuated vaccinia virus strain L-IVP with five violated virulence genes (1421ABJCN). The application materials show that:
- штамм может быть использован в качестве живой культуральной аттенуированной вакцины против натуральной оспы и других ортопоксвирусов;- the strain can be used as a live culture attenuated vaccine against smallpox and other orthopoxviruses;
- штамм получен с помощью сконструированных авторами пяти плазмид интеграции - pMGCgpt-ΔA56R, pMGCgpt-ΔB8R, pMGCgpt-ΔJ2R, pMGCgpt-ΔC3L, pMGCgpt-ΔN1L с использованием методики временной доминантной селекции и выявлено, что метод временной доминантной селекции обеспечивает выход делеционных вариантов ВОВ с высокой частотой и все полученные делеционные варианты являются жизнеспособными и стабильно сохраняют генотип в течение 10 пассажей;- the strain was obtained using five integration plasmids designed by the authors - pMGCgpt-ΔA56R, pMGCgpt-ΔB8R, pMGCgpt-ΔJ2R, pMGCgpt-ΔC3L, pMGCgpt-ΔN1L using the method of temporary dominant selection and it was found that it was found that high frequency and all obtained deletion variants are viable and stably preserve the genotype for 10 passages;
- в исследованиях для сравнения использован родительский (клон 14) кл. 14 вируса осповакцины, штамм Л-ИВП. Штамм получен методом клонирования вируса осповакцины, штамм Л-ИВП, который принят в России для производства классической противооспенной вакцины первого поколения;- in studies, the parent (clone 14) class was used for comparison. 14 vaccinia viruses, strain L-IVP. The strain obtained by the method of cloning smallpox vaccine virus, strain L-IVP, which is adopted in Russia for the production of the classic anti-smallpox vaccine of the first generation;
- проведено изучение репликативных свойств полученных вариантов ВОВ в культуре клеток CV-1 путем определения динамики роста вируса. Полученные результаты позволяют заключить, что удаление выбранных генов вирулентности не влияет на продуктивные свойства вируса осповакцины на культурах клеток, что важно с точки зрения технологии наработки высокоаттенуированной противооспенной вакцины нового поколения;- the replicative properties of the obtained WWII variants were studied in the CV-1 cell culture by determining the dynamics of the virus growth. The results allow us to conclude that the removal of selected virulence genes does not affect the productive properties of smallpox vaccine virus in cell cultures, which is important from the point of view of the technology for producing a highly attenuated new generation anti-pox vaccine;
- наработано три серии вакцинного штамма 1421ABJCN, который сохраняет стабильность и биологические свойства в течение исследуемых 10 пассажей. Образцы вакцинного штамма после 1-го, 5-го и 10-го пассажа прошли аттестацию в ОБТК ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» и имеют паспорта №84, №85, №86 от 23.10.2014 г. соответственно;- Three series of vaccine strain 1421ABJCN have been developed, which maintains stability and biological properties during the 10 passages under study. Samples of the vaccine strain after the 1st, 5th and 10th passage passed certification in the OPF CTFB SSC VB "Vector" and have passports No. 84, No. 85, No. 86 dated 10.23.2014, respectively;
- в экспериментах на животных авторами было установлено, что препараты вакцинного штамма 1421ABJCN, полученные после 1-го, 5-го и 10-го пассажей на культуре клеток 4647, наравне с родительским вирусом осповакцины вызывают наработку высоких титров ВОВ-нейтрализующих антител и обеспечивают полную защиту животных против летальной дозы высокопатогенного вируса эктромелии, что свидетельствует о стабильности иммуногенных свойств вакцинного штамма 1421ABJCN в течение 10 пассажей, проведенных на культуре клеток 4647, а вируснейтрализующая активность сывороток крови животных, иммунизированных разными дозами вакцинного штамма 1421ABJCN, имеет дозозависимый характер для всех трех изученных серий вакцинного штамма;- in animal experiments, the authors found that the preparations of the vaccine strain 1421ABJCN obtained after the 1st, 5th and 10th passages on a 4647 cell culture, along with the parent vaccinia virus, produce high titers of BOB-neutralizing antibodies and ensure complete protection of animals against a lethal dose of the highly pathogenic ectromelia virus, which indicates the stability of the immunogenic properties of the vaccine strain 1421ABJCN for 10 passages carried out on a cell culture 4647, and the virus-neutralizing activity of serum the blood of animals immunized with different doses of the vaccine strain 1421ABJCN, has a dose-dependent manner for all three studied series of the vaccine strain;
- отсутствие вируса в исследуемых органах 8-10-недельных мышей линии Balb/c на 3, 7 и 14-е сутки после инъекции вакцинными штаммами осповакцины подкожно или внутрибрюшинно;- the absence of virus in the studied organs of 8-10-week-old Balb / c mice on the 3rd, 7th and 14th day after injection of vaccine strains of smallpox vaccine subcutaneously or intraperitoneally;
- динамика изменения веса тела у мышей, иммунизированных тремя сериями вакцинного штамма 1421ABJCN вируса осповакцины подкожно, не отличалась от родительского кл. 14 штамма Л-ИВП вируса осповакцины;- the dynamics of changes in body weight in mice immunized with three series of vaccine strain 1421ABJCN vaccinia virus subcutaneous, did not differ from the parent cl. 14 strains of vaccinia virus L-IVP virus;
- выявлено снижение нейровирулентности трех серий вакцинного штамма 1421ABJCN на три порядка по сравнению с родительским ВОВ. Титр вакцинного штамма 1421ABJCN в головном мозге инфицированных новорожденных мышей на третьи сутки после интрацеребрального введения составил (0.93±0.35)×103 БОЕ/г органа, в то время как у родительского 14 кл. штамма Л-ИВП вируса осповакцины - (1.32±0.53)×106 БОЕ/г органа.- revealed a decrease in the neurovirulence of three series of vaccine strain 1421ABJCN by three orders of magnitude compared with the parent BOB. The titer of vaccine strain 1421ABJCN in the brain of infected newborn mice on the third day after intracerebral administration was (0.93 ± 0.35) × 10 3 PFU / g of organ, while that of the
Claims (1)
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2588388C1 true RU2588388C1 (en) | 2016-06-27 |
Family
ID=
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2781070C1 (en) * | 2022-07-06 | 2022-10-05 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Live attenuated culture vaccine for prevention of smallpox and other orthopoxvirus infections based on smallpox vaccine virus and methods for its preparation and application |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992015672A1 (en) * | 1991-03-07 | 1992-09-17 | Virogenetics Corporation | Genetically engineered vaccine strain |
| RU2091489C1 (en) * | 1993-04-08 | 1997-09-27 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Strain of recombinant small pox virus expressing structural proteins of the horse venezuelan encephalomyelitis virus and useful for immunobiological preparations production and a method of its preparing |
| RU2542400C1 (en) * | 2013-12-16 | 2015-02-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | SMALLPOX VIRAL STRAIN GPA FOR STUDYING EFFICACY OF ANTIVIRAL PREPARATIONS in vivo AND ASSESSING REDUCTION ROUTINES UNDESIRED VACCINE REACTIONS ACCOMPANYING PRIMARY SMALLPOX VACCINATION |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1992015672A1 (en) * | 1991-03-07 | 1992-09-17 | Virogenetics Corporation | Genetically engineered vaccine strain |
| RU2091489C1 (en) * | 1993-04-08 | 1997-09-27 | Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" | Strain of recombinant small pox virus expressing structural proteins of the horse venezuelan encephalomyelitis virus and useful for immunobiological preparations production and a method of its preparing |
| RU2542400C1 (en) * | 2013-12-16 | 2015-02-20 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") | SMALLPOX VIRAL STRAIN GPA FOR STUDYING EFFICACY OF ANTIVIRAL PREPARATIONS in vivo AND ASSESSING REDUCTION ROUTINES UNDESIRED VACCINE REACTIONS ACCOMPANYING PRIMARY SMALLPOX VACCINATION |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2781070C1 (en) * | 2022-07-06 | 2022-10-05 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора) | Live attenuated culture vaccine for prevention of smallpox and other orthopoxvirus infections based on smallpox vaccine virus and methods for its preparation and application |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Volz et al. | Modified vaccinia virus Ankara: history, value in basic research, and current perspectives for vaccine development | |
| JP3826055B2 (en) | Immunization with recombinant avipoxvirus | |
| US5741492A (en) | Preparation and use of viral vectors for mixed envelope protein vaccines against human immunodeficiency viruses | |
| AU2011316164B2 (en) | Recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA) influenza vaccine | |
| RU2003118436A (en) | ANKARA MODIFIED VERSION OF ANKARA | |
| JP2005525823A (en) | Recombinant poxvirus that expresses a homologous gene inserted into the poxvirus genome | |
| JP2002514885A (en) | Poxvirus-canine distemper virus (CDV) recombinants and compositions and methods of using said recombinants | |
| US10421790B2 (en) | Feline calicivirus vaccine | |
| AU2020264302B2 (en) | Recombinant Orf virus vector | |
| CN102858959A (en) | Oncolytic rhabdovirus | |
| CN103189506A (en) | Virus vector for prime/boost vaccines, which comprises vaccinia virus vector and sendai virus vector | |
| ES2287949T3 (en) | PARAPOXVIRUS, THAT CONTAIN FORANEOUS DNA, ITS OBTAINING AND ITS EMPLOYMENT IN VACCINES. | |
| JP2007254489A (en) | Immunogenic composition containing recombinant attenuated poxvirus expressing htlv antigen | |
| Vliegen et al. | Deletion of the vaccinia virus F13L gene results in a highly attenuated virus that mounts a protective immune response against subsequent vaccinia virus challenge | |
| CA2372709C (en) | Vector for integration of heterologous sequences into poxviral genomes | |
| JP2021503965A (en) | Immunomodulatory vaccinia virus strain with high replication efficiency | |
| Staib et al. | Live viral vectors: vaccinia virus | |
| RU2588388C1 (en) | Recombinant strain l-ivp 1421abjcn pox virus virulence genes with broken a56r, b8r, j2r, c3l, n1l for producing live culture of attenuated smallpox vaccine and other orthopoxviruses, pathogenic for humans | |
| EP1523333A2 (en) | Use of vaccinia virus deleted for the e3l gene as a vaccine vector | |
| WO2016162845A1 (en) | Recombinant lumpy skin disease virus knock-out mutant and uses thereof | |
| WO2004024756A2 (en) | Orthopoxvirus antigens and use thereof | |
| KR20100131480A (en) | Recombinant vaccinia virus having hepatitis c virus gene | |
| RU2621868C1 (en) | Recombinant stain of vacδ6 vaccinia virus with broken genes of viralence c3l, n1l, j2r, a35r, a56r, b8r for the production of live cultural attenuated vaccine against natural smallpox and other orthopoxviral human infections | |
| RU2678003C1 (en) | Recombinant oncolytic strain of l-ivp_oncoq vaccinia virus, containing genes encoding granulocyte macrophage colony-stimulating factor and polyepitope immunogen consisting of antigen epitopes, overexpressing tumor cells in ovarian cancer | |
| JPWO2006013815A1 (en) | Recombinant vaccinia virus DIs strain carrying DNA encoding HCV virus protein and use thereof |