RU2091485C1

RU2091485C1 - Strain of fungus aspergillus niger - a producer of citric acid

Info

Publication number: RU2091485C1
Application number: RU95116989A
Authority: RU
Inventors: П.Б. Авчиева; В.Н. Яшина
Original assignee: Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ
Priority date: 1995-09-21
Filing date: 1995-09-21
Publication date: 1997-09-27

Abstract

FIELD: biotechnology. SUBSTANCE: invention relates to the new strain of fungus Aspergillus niger VKPM F-718. New strain shows high productivity at lower pH value medium that decreases infection risk. The yield of citric acid is increased at average by 10%. Strain is adopted to fermentation at continuous regime. EFFECT: new strain indicated above, increased yield of citric acid. 1 tbl

Description

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к производству лимонной кислоты глубинным методом при периодической или непрерывной ферментации штамма-продуцента. The invention relates to the microbiological industry, in particular to the production of citric acid by the in-depth method during batch or continuous fermentation of a producer strain.

Известен штамм Aspergillus niger P-1, продуцент лимонной кислоты, селекционированный путем ступенчатого воздействия УФ лучами и химическими мутагенами (авт. св. СССР, N 568677, кл. C 12 K 1/02 1975). A known strain of Aspergillus niger P-1, a producer of citric acid, selected by stepwise exposure to UV rays and chemical mutagens (ed. St. USSR, N 568677, class C 12 K 1/02 1975).

Недостатком известного штамма является низкие показатели биохимической активности. A disadvantage of the known strain is low biochemical activity.

Известен также штамм A.niger R-3, продуцент лимонной кислоты, полученный в результате селекции путем ступенчатой обработки этиленимином, N нитрозометилмочевиной и УФ лучами штамма A.niger ЭУ-119 (авт. св. СССР N 939549 C 12 P 7/48). Also known is the strain A.niger R-3, a citric acid producer obtained by selection by stepwise treatment with ethyleneimine, N nitrosomethylurea and UV rays of A.niger strain EU-119 (ed. St. USSR N 939549 C 12 P 7/48) .

Недостатком известного штамма является то, что он проявляет активность только на средах с низкой первоначальной концентрацией сахара, не более 3% и не адаптирован к высоким первоначальным концентрациям сахара в среде. A disadvantage of the known strain is that it is active only on media with a low initial sugar concentration of not more than 3% and is not adapted to high initial sugar concentrations in the medium.

Кроме того, штамм A.niger R-3 предназначен только для производства лимонной кислоты периодическим способом. In addition, A.niger R-3 strain is intended only for the production of citric acid in a batch process.

Задача изобретения заключается в увеличении выхода лимонной кислоты. The objective of the invention is to increase the yield of citric acid.

Технический результат изобретения получение нового штамма Aspergillus niger F-718 с более высокой активностью кислотообразования. The technical result of the invention to obtain a new strain of Aspergillus niger F-718 with a higher activity of acid formation.

Штамм A.niger F-718 получен в результате селекции путем ступенчатой обработки N-нитрозометилмочевиной и нитрозонитрометилмочевиной штамма A.niger F-710. Strain A.niger F-718 was obtained by selection by stepwise treatment with N-nitrosomethylurea and nitrosonitromethylurea strain A.niger F-710.

Штамм хранится в коллекции микроорганизмов ГосНИИ-синтезбелок N945/1. The strain is stored in the collection of microorganisms of the State Research Institute of Synthesis Proteins N945 / 1.

Штамм также депонирован в Музее культур промышленных микроорганизмов института ГНИИгенетика и имеет коллекционный номер ВКПМ F-718. The strain is also deposited in the Museum of cultures of industrial microorganisms of the Institute GNIIInetetika and has a collection number VKPM F-718.

Культурально-морфологическая характеристика штамма А.nider F-718. Cultural and morphological characteristics of the strain A. nider F-718.

В условиях поверхностного культивирования на суслоагаровой среде у пятисуточной культуры конидиальные головки округлые, в диаметре 200-250 мкм. Стеригмы однослойные, длиной 10-17 мкм. Конидии светло-коричневые, округлые, в диаметре 6-8 мкм. Конидиеносцы длиной 1-4 мм. Under conditions of surface cultivation on wort-agar medium, the five-day culture conidial heads are rounded, with a diameter of 200-250 microns. Sterigmas are single-layered, 10-17 microns long. Conidia are light brown, rounded, with a diameter of 6-8 microns. Conidiophores 1-4 mm long.

Гигантская пятисуточная колония A.niger F-718, выращенная на сусло-агаровой среде, имеет округлую форму, диаметр колонии 45-48 мм, аспорогенная зона 5-10 мм. Центр колонии выпуклый со светло-коричневым спороношением. Край колонии ровный. The giant five-day colony A.niger F-718 grown on wort-agar medium has a rounded shape, the diameter of the colony is 45-48 mm, the asporogenic zone is 5-10 mm. The center of the colony is convex with light brown sporulation. The edge of the colony is even.

Физиолого-биохимическая характеристика
Штамм A.niger F-718 хорошо сбраживает мелассу. Выход лимонной кислоты от сахара мелассы до 100% Из суммы синтезируемых органических кислот доля лимонной кислоты составляет 92-99%
Благодаря высокой амилолитической активности штамм хорошо развивается на крахмалсодержащих средах, а также ассимилирует сахарозу, глюкозу, мальтозу, гидролизаты растительного сырья, этанол. Усваивает органический и минеральный азот.Physiological and biochemical characteristics
Strain A.niger F-718 ferments molasses well. The yield of citric acid from molasses sugar is up to 100%. Of the sum of synthesized organic acids, the proportion of citric acid is 92-99%
Due to the high amylolytic activity, the strain develops well on starch-containing media, and also assimilates sucrose, glucose, maltose, hydrolysates of plant materials, and ethanol. Absorbs organic and mineral nitrogen.

Посевной материал штамма A.niger F-718, в зависимости от условий производства, готовят двумя способами:
1. Посев спорами.Sowing material of strain A.niger F-718, depending on production conditions, is prepared in two ways:
1. Sowing by spores.

Готовят споруляционную среду, содержащую источник углерода, азота и минеральные соли. В качестве источника углерода используют пивное сусло или солодовый экстракт. В среду добавляют следующие компоненты,
Мочевина 0,1
NaCl 1 1,5
CuSO₄•5H₂O 0,0001
Агар 2 2,5
pH устанавливают на уровне 4 6,5
Среду засевают спорами с помощью ватного тампона или пульверизатора. Культивирование поверхностным способом производят в режиме регулирования температуры и влажности в течение 7-10 сут.A sporulation medium is prepared containing a source of carbon, nitrogen and mineral salts. Beer wort or malt extract is used as a carbon source. The following components are added to the medium,
Urea 0.1
NaCl 1 1.5
CuSO ₄ • 5H ₂ O 0.0001
Agar 2 2.5
pH set at 4 6.5
The medium is inoculated with spores using a cotton swab or spray. Surface cultivation is carried out in the temperature and humidity control mode for 7-10 days.

При культивировании указанным способом с 1 дм² споруляционной площади получают 1,4-1,5 г спор. Содержание спор в 1 г до 48 млрд. Всхожесть спор в мелассном растворе через 8-10 ч 95-99%
2. Посев проросшим мицелием гриба.When cultured in this way with 1 DM ² sporulation area receive 1.4-1.5 g of spores. Spore content in 1 g up to 48 billion. Germination of spores in molasses solution after 8-10 hours 95-99%
2. Sowing sprouted mycelium of the fungus.

Готовят стерильную мелассную питательную среду с содержанием 2% PB, сахарозы (сахара) 0,5%этилового спирта 0,1% KH₂PO₄ 0,02% MgSO₄ 0,02% ZnSO₄ 10 мг/л, CoSO₄ 0,1 мг/л, Na₂MoO₄ 0,5 мг/л.Prepare a sterile molasses culture medium containing 2% PB, sucrose (sugar) 0.5% ethyl alcohol 0.1% KH ₂ PO ₄ 0.02% MgSO ₄ 0.02% ZnSO ₄ 10 mg / L, CoSO ₄ 0, 1 mg / L; Na ₂ MoO ₄ 0.5 mg / L.

Устанавливают pH среды в пределах 4,0-5,0. Среду разливают в качалочные колбы и засевают смывом мицелия гриба A.niger. Мицелий подращивают при температуре 32-35^oC в течение 16-24 ч, затем, в количестве 5-15 мл. переводят в колбы, содержащие стерильную 3-4%-ную мелассную среду с минеральными компонентами. PH среды 4-5. Культивирование осуществляют при температуре 32-35^oC в течение 24 ч.Set the pH of the medium in the range of 4.0-5.0. The medium is poured into rocking flasks and inoculated with the washout of the fungus mycelium A.niger. Mycelium is grown at a temperature of 32-35 ^o C for 16-24 hours, then, in an amount of 5-15 ml. transferred into flasks containing sterile 3-4% molasses medium with mineral components. Wednesday PH 4-5. The cultivation is carried out at a temperature of 32-35 ^o C for 24 hours

Подрощенный мицелий служит посевным материалом при ферментации в маленьких ферментерах или используется для получения посевного материала в посевном ферментаторе. Полученный указанным способом посевной материал может быть использован в производстве лимонной кислоты при глубинном способе ферментации в периодическом или непрерывном режиме. The bred mycelium serves as a seed for fermentation in small fermenters or is used to obtain seed in a seed fermenter. The seed obtained in this way can be used in the production of citric acid with the deep fermentation method in batch or continuous mode.

Исследование продуктивности штамма F-718 на мелассной питательной среде показало, что штамм обладает высоким уровнем продуктивности, выход лимонной кислоты от сахара составляет 95-97%в то время как выход от сахара при использовании штамма F-710 составляет 88-90%
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения.The study of the productivity of strain F-718 on molasses culture medium showed that the strain has a high level of productivity, the yield of citric acid from sugar is 95-97%, while the yield from sugar when using strain F-710 is 88-90%
Information confirming the possibility of carrying out the invention.

ПРИМЕР 1 (контрольный). В качестве продуцента лимонной кислоты использовали штамм Aspergillus niger F-710. EXAMPLE 1 (control). Aspergillus niger F-710 strain was used as a citric acid producer.

Стерильную мелассную среду с содержанием PB 2% сахарозы 0,5% этилового спирта 0,1% а также солей магния, цинка, кобальта и молибдена засеяли мицелием гриба A. niger F-710. Исходная величина pH среды 5,0. Мицелий гриба подращивали при температуре 32^oC в течение 20 ч, затем 15 мл суспензии перенесли в качалочные колбы, содержащие 150 стерильной мелассной среды с содержанием PB 3% и культивировании при температуре 32^oC в течение 24 ч. Подрощенный мицелий использовали в качестве посевного материала для ферментации.Sterile molasses medium with a PB content of 2% sucrose 0.5% ethyl alcohol 0.1% and magnesium, zinc, cobalt and molybdenum salts was seeded with A. niger F-710 fungus mycelium. The initial pH of the medium is 5.0. The fungal mycelium was grown at a temperature of 32 ^° C for 20 hours, then 15 ml of the suspension was transferred to rocking flasks containing 150 sterile molasses medium with a PB content of 3% and cultured at 32 ^° C for 24 hours. The grown mycelium was used as a seed fermentation material.

Ферментацию проводили периодическим способом на мелассной питательной среде с величиной pH 5,5 и с первоначальным содержанием PB в среде 3% В процессе ферментации концентрацию PB в среде постепенно увеличили до 10% Продолжительность ферментации 6 сут. Выход лимонной кислоты от PB 88%
ПРИМЕР 2. В качестве продуцента лимонной кислоты использовали штамм A. niger F-718. Посевной материал для ферментации получали в колбах на качалке на мелассной питательной среде, содержащей сахарозу, этиловый спирт и источники магния, цинка, кобальта и молибдена по примеру 1.Fermentation was carried out batchwise on molasses nutrient medium with a pH value of 5.5 and with an initial content of PB in the medium of 3%. During the fermentation, the concentration of PB in the medium was gradually increased to 10%. The duration of the fermentation was 6 days. The yield of citric acid from PB 88%
EXAMPLE 2. As a producer of citric acid used strain A. niger F-718. Seed for fermentation was obtained in flasks on a rocking chair on a molasses nutrient medium containing sucrose, ethyl alcohol and sources of magnesium, zinc, cobalt and molybdenum according to example 1.

Ферментацию также проводили периодическим способом на мелассной питательной среде с первоначальным содержанием PB 3% и с исходной величиной pH 5,5. Концентрацию PB в процессе ферментации увеличили до 10% путем доливок концентрированной мелассы (PB 20-25%). Продолжительность ферментации 6 сут. Fermentation was also carried out in a batch manner on molasses culture medium with an initial content of PB of 3% and with an initial pH of 5.5. The concentration of PB during the fermentation was increased to 10% by topping up concentrated molasses (PB 20-25%). The duration of the fermentation is 6 days.

Концентрация лимонной кислоты в культуральной жидкости составляла 78 г/л, выход от PB 97,5%
В таблице представлены сравнительные данные по биосинтезу лимонной кислоты известным и предлагаемым штаммами в зависимости от первоначальной величины pH среды при периодическом способе ферментации.The concentration of citric acid in the culture fluid was 78 g / l, the yield from PB 97.5%
The table provides comparative data on the biosynthesis of citric acid known and proposed strains depending on the initial pH of the medium with a periodic method of fermentation.

Результаты, представленные в таблице показывают, что снижение исходной величины pH среды от 7,0 до 3,0 не оказывает существенного значения на биосинтез лимонной кислоты штаммом гриба A.niger F-71, тогда как активность биосинтеза лимонной кислоты штаммом A.niger F-710 снижается на 10-18% Адаптация штамма продуцента к более кислым первоначальным значениям pH (в пределах от 5,5 до 3,0) имеет огромное промышленное значение, так как при этом значительно снижается риск возникновения посторонней микрофлоры в среде. Кроме того, при быстром закислении среды гриб преимущественно синтезирует лимонную кислоту, а синтез побочных кислот (щавелевой и глюконовой) снижается до минимальных значений. The results presented in the table show that a decrease in the initial pH of the medium from 7.0 to 3.0 does not significantly affect the biosynthesis of citric acid by the strain of the fungus A.niger F-71, while the activity of citric acid biosynthesis by the strain A.niger F- 710 is reduced by 10-18%. Adaptation of the producer strain to more acidic initial pH values (ranging from 5.5 to 3.0) is of great industrial importance, since this significantly reduces the risk of extraneous microflora in the medium. In addition, with rapid acidification of the medium, the fungus predominantly synthesizes citric acid, and the synthesis of side acids (oxalic and gluconic) is reduced to minimal values.

ПРИМЕР 3. Посевной материал для ферментации получали по примеру 2 с использованием в качестве продуцента лимонной кислоты A.niger F-718. EXAMPLE 3. Seed for fermentation was obtained according to example 2 using A.niger F-718 as a citric acid producer.

Ферментацию продуцента осуществляли в непрерывном режиме на мелассной питательной среде в две стадии. Fermentation of the producer was carried out in a continuous mode on molasses nutrient medium in two stages.

Культивирование на первой стадии осуществляли при первоначальной величине pH Среды 5.0 и температуре 33^oC. Через 48 ч от начала ферментации, после снижения интенсивности образования биомассы мицелия, процесс перевели на непрерывный режим путем непрерывной подачи в ферментационную среду мелассного питательного раствора с содержанием редуцирующих веществ 8% со скоростью разбавления Среды 0,025 ч 1. Культуральная жидкость с первого ферментера с такой же скоростью разбавления Среды поступала на вторую стадию (во второй ферментер), где ферментацию осуществляли при температуре 31^oC.The cultivation in the first stage was carried out at an initial pH of 5.0 and a temperature of 33 ^o C. After 48 hours from the start of fermentation, after a decrease in the intensity of mycelium biomass formation, the process was transferred to a continuous mode by continuously feeding molasses nutrient solution containing reducing substances into the fermentation medium 8 % with a medium dilution rate of 0.025 h 1. The culture fluid from the first fermenter with the same medium dilution rate entered the second stage (in the second fermenter), where fermentation carried out at a temperature of 31 ^o C.

pH на второй стадии поддерживали в пределах 2,0-2,5. The pH in the second stage was maintained in the range of 2.0-2.5.

Культуральная жидкость после отделения биомассы гриба использовалась для выделения лимонной кислоты. Концентрация лимонной кислоты в культуральной жидкости составляла 77 г/л, выход от PB 96%
Таким образом, использование штамма гриба A.niger F-718 в качестве продуцента лимонной кислоты дает возможность проведения ферментации при более кислых первоначальных значениях pH Среды, что существенно снижает риск возникновения инфекции в Среде, выход лимонной кислоты при этом возрастает в среднем на 10%
Кроме того, штамм A.niger F-718 адаптирован к ферментации в непрерывном режиме.The culture fluid after separation of the biomass of the fungus was used to isolate citric acid. The concentration of citric acid in the culture fluid was 77 g / l, yield from PB 96%
Thus, the use of the A.niger F-718 fungus strain as a producer of citric acid makes it possible to carry out fermentation at more acidic initial pH values of the Medium, which significantly reduces the risk of infection in the Medium, while the yield of citric acid increases by an average of 10%
In addition, A.niger F-718 strain is adapted for continuous fermentation.

Claims

The strain of the fungus Aspergillus niger VKPM F-718 producer of citric acid.