RU2087911C1

RU2087911C1 - Method for determining diphtheria corinebacteria exotoxin in patient blood suffering from toxic form of diphtheria infection

Info

Publication number: RU2087911C1
Application number: RU93040843A
Authority: RU
Inventors: О.А. Аксенов; А.Н. Сиземов; В.В. Иванова
Original assignee: Научно-исследовательский институт детских инфекций
Priority date: 1993-08-11
Filing date: 1993-08-11
Publication date: 1997-08-20

Abstract

FIELD: medicine. SUBSTANCE: method involves determining endogenous complement level in blood serum and diluting it to complement level of 1-2 hemolyzing doses, introducing 50-100 antitoxic doses of antitoxic antidiphteria serum. After thermostating at 37 C during 1 h, endogenous complement level delay is determined from catalase activity of lyzed erythrocyte introduced into reaction mixture in combination with 10 hemolyzing doses of anti-erythrocyte serum. EFFECT: enhanced reliability in detecting exotoxin presence in blood serum. 1 tbl

Description

Способ относится к медицине, в частности к бактериологии. Известны различные способы определения экзотоксина коринебактерии дифтерии, среди которых основными являются методы выявления его, главным образом, в процессе размножения бактерий при их выделении от больных на жидких питательных средах. Основной метод обнаружения токсина при этом заключается в введении фильтра бактерий внутрикожно различным лабораторным животным. Наиболее чувствительным в этом отношении являются морские свинки, дающие при введении токсина внутрикожно некротические поражения и погибающие при внутривенном введении (Бунин К. В. Дифференциальная диагностика инфекционных болезней. М.-1965; Данила П. ЖМЭИ, 1975,N 2, с. 21-30; Иванов Ю.А. Материалы лабораторной диагностики дифтерии, Вопр. охраны матер. и детства, 1959, N 3, с. 12-16)
В последние годы появились исследования по определению токсина в реакции непрямой гемагглюцинации с бараньими эритроцитами, сенсибилизированными антитоксическими антителами (Каральник В.В, Царевский Ю. П. Шемардин В.А. В кн. "Эритроцитарные белковые диагностикумы" Наука Каз.ССР, 1982), а также выявление токсинообразования дифтерийной палочки по ДНК-ДНК гибридизации участка ДНК fox+ бактериофага микроба соответственного за синтез токсина в бактериальной клетке (Бобков А. Ф. Бобкова М.Р. Гараев М.М. и соавт. Авт. свид. N 1616991 от 01.09.90).The method relates to medicine, in particular to bacteriology. There are various methods for determining the exotoxin of corynebacterium diphtheria, among which the main are methods for detecting it, mainly in the process of reproduction of bacteria when they are isolated from patients in liquid nutrient media. The main method for detecting toxin in this case is the introduction of a bacteria filter intradermally to various laboratory animals. The most sensitive in this regard are guinea pigs, which give intradermal necrotic lesions when the toxin is injected and die when administered intravenously (K. Bunin. Differential diagnosis of infectious diseases. M.-1965; Danila P. ZhMEI, 1975, N 2, p. 21 -30; Ivanov Yu.A. Materials of laboratory diagnostics of diphtheria, Issues of Maternal and Child Welfare, 1959, No. 3, pp. 12-16)
In recent years, studies have appeared to determine the toxin in the reaction of indirect hemagglutination with sheep red blood cells, sensitized antitoxic antibodies (Karalnik V.V., Tsarevsky Yu.P. Shemardin V.A. in the book "Erythrocyte Protein Diagnostics" Science Kaz.SSR, 1982) as well as detection of toxin formation of diphtheria bacillus by DNA-DNA hybridization of the fox + bacteriophage DNA portion of the microbe corresponding to the synthesis of toxin in the bacterial cell (Bobkov A.F. Bobkova M.R. M. Garaev et al. Auth. author. N 1616991 from 09/01/90).

Однако недостатками всех описанных методов является достаточно длительное, определение токсина как, например, у животных на 3-4 день после его инокуляции, а также сложность конструирования диагностикума для РНГА, ИФА и других способов с целью использования их для выявления токсина при размножении в жидкой питательной среде. Более того, в настоящее время отсутствуют способы индикации токсина непосредственно в материале от дифтерийных больных ( пленки из миндалин, кровь и д.р.). However, the disadvantages of all the methods described are quite lengthy, the determination of the toxin as, for example, in animals 3-4 days after its inoculation, as well as the difficulty of constructing a diagnosticum for RNGA, ELISA and other methods in order to use them to detect toxin when propagated in liquid nutrient environment. Moreover, currently there are no methods for indicating the toxin directly in the material from diphtheria patients (tonsils, blood, etc.).

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ выявления токсина при размножении коринебактерий дифтерии в жидкой питательной среде с помощью антительного РНГА- диагностикума /Мазурова И.К. " Комплексная система лабораторной диагностики и наблюдения за возбудителем дифтерийной инфекции ". Авт. докторской диссертации в форме доклада, М. 1993 г./. Автор получал такой диагностикум достаточно сложным способом с двойной очисткой антитоксических антител на иммуносорбентных системах и с фильтратом нетоксикогенного штамма дифтерийной палочки. Дальнейшая насадка антител на эритроциты проводилась стандартным способом, а выявление токсина при размножении бактерий "ин витро" автору удалось уже при первичном посеве патологического материала от больных. С помощью такого способа автор выявлял образование токсина уже на 2-е сутки после начала исследования. Closest to the proposed invention is a method for detecting toxin during the propagation of corynebacteria diphtheria in a liquid nutrient medium using antibody-based RNGA diagnosticum / Mazurova I.K. "An integrated system for laboratory diagnosis and monitoring of the causative agent of diphtheria infection." Auth. doctoral dissertation in the form of a report, M. 1993 /. The author received such a diagnosticum in a rather complicated way with double purification of antitoxic antibodies on immunosorbent systems and with a filtrate of a non-toxicogenic diphtheria bacillus strain. Further insertion of antibodies on red blood cells was carried out in a standard way, and the author succeeded in detecting the toxin during the propagation of bacteria in vitro during the initial plating of pathological material from patients. Using this method, the author detected the formation of toxin already on the 2nd day after the start of the study.

В то же время недостатком базового способа является выявление токсина при выделении от больных и невозможность его определения непосредственно в патологических материалах от пациента. В связи с этим длительность выявления токсина не может обеспечить контроль с помощью этого способа тяжести течения инфекционного процесса, его динамику у больных и эффективность сывороточного антитоксического лечения. At the same time, the disadvantage of the basic method is the detection of toxin during isolation from patients and the inability to determine it directly in pathological materials from the patient. In this regard, the duration of the detection of the toxin cannot provide control using this method of the severity of the course of the infectious process, its dynamics in patients and the effectiveness of serum antitoxic treatment.

Кроме того, получение такого диагностикума достаточно сложно и не может быть изготовлено в практических лабораторных условиях. In addition, obtaining such a diagnosticum is quite difficult and cannot be made in practical laboratory conditions.

В предлагаемом заявителями способе токсин коринебактерии дифтерии представляется непосредственно в сыворотке крови больных и может быть выявлен в течение 3 ч от взятия материала от больного. Способ основан на принципе, что в определенных условиях токсин, присутствующий в крови больного, связывается " ин витро " с добавленными антитоксическими антителами и сорбирует на себя эндогенный /или экзогенный/ комплемент. Последний выявляется при дополнительном внесении гемолитической системы /бараньи эритроциты+ антиэритроцитарная гемолитическая сыворотка; изменение уровня комплемента при этом определяется по каталазной активности лизата эритроцитов с помощью перекисного метода, расщепление перекиси и образование атомарного кислорода меняет цветность вводимого ортофенилендиамина, определяемую в дальнейшем на иммуноферментном анализаторе при длине волны кумулятивно с 492 по 600 нм. In the method proposed by the applicants, the toxin of corynebacterium diphtheria is presented directly in the blood serum of patients and can be detected within 3 hours from taking material from the patient. The method is based on the principle that, under certain conditions, the toxin present in the patient’s blood binds in vitro to the added antitoxic antibodies and adsorbs endogenous / or exogenous / complement. The latter is detected by the additional introduction of the hemolytic system / sheep erythrocytes + anti-erythrocyte hemolytic serum; the change in complement level is determined by the catalase activity of the erythrocyte lysate using the peroxide method, the breakdown of peroxide and the formation of atomic oxygen changes the color of the injected orthophenylenediamine, which is further determined by the enzyme-linked immunosorbent analyzer at a wavelength cumulatively from 492 to 600 nm.

Чувствительность метода позволяет выявить токсин в крови больных в острой фазе заболевания при наличии эндогенного комплемента у больного. При отсутствии его в крови в реакционную смесь вносят эндогенный комплемент /сыворотку морской свинки/ в соответствующей дозе. The sensitivity of the method allows to detect toxin in the blood of patients in the acute phase of the disease in the presence of endogenous complement in the patient. In the absence of it in the blood, the endogenous complement (guinea pig serum) is added to the reaction mixture in the appropriate dose.

Метод осуществляется следующим образом. The method is as follows.

В сыворотке, взятой у больного с дифтерийной интоксикацией в острой фазе болезни до лечения серотерапией, определяют уровень эндогенного комплемента, соединяя 0,1 мл сыворотки с 0,2 мл гемолитической системы, состоящей из равных объемов 0,7% бараньих эритроцитов и 10 гемолизирующих доз антисыворотки к этим эритроцитам. После определения в сыворотке больного комплемента ее разводят в пределах 1:2-1:10 в зависимости от содержания комплемента, так чтобы в разведении сыворотки содержалось 1-2 дозы комплемента. In serum taken from a patient with diphtheria intoxication in the acute phase of the disease before treatment with serotherapy, the level of endogenous complement is determined by combining 0.1 ml of serum with 0.2 ml of a hemolytic system consisting of equal volumes of 0.7% sheep red blood cells and 10 hemolizing doses antisera to these red blood cells. After determining the complement serum in the patient’s serum, it is diluted within 1: 2-1: 10 depending on the complement content, so that 1-2 doses of complement are contained in the serum dilution.

Основа способа заключается в соединении 0,1 мл такой разведенной сыворотки с 50-100 антитоксических доз противодифтерийной антитоксической лошадиной сыворотки /чаще всего это количество антитоксина содержится в разведении этой сыворотки 1:50-1:100/. Антитоксическую сыворотку вносят в равном объеме 0,1 мл. После часового контакта такой смеси в суховоздушном термостате при 37^o в смесь вводят указанную выше гемолитическую систему, состоящую из 0,7% бараньих эритроцитов и 10 гемолизирующих доз антиэритроцитарной сыворотки. Далее указанную смесь параллельно с соответствующими контролями выдерживают в суховоздушной бане до появления начальных этапов гемолиза в контроле, содержащем испытуемую сыворотку больного, разведенную вместо антитоксической сыворотки на мединалово-вероналовом буфере.The basis of the method is to combine 0.1 ml of such diluted serum with 50-100 antitoxic doses of antidiphtheria antitoxic horse serum / most often this amount of antitoxin is contained in a dilution of this serum 1: 50-1: 100 /. Antitoxic serum contribute in an equal volume of 0.1 ml. After an hour-long contact of such a mixture in a dry-air thermostat at 37 ^o , the above hemolytic system is introduced into the mixture, consisting of 0.7% sheep red blood cells and 10 hemolizing doses of anti-erythrocyte serum. Further, this mixture is kept in parallel with the corresponding controls in a dry-air bath until the initial stages of hemolysis appear in the control containing the test serum of the patient, diluted instead of antitoxic serum on the medial-veronal buffer.

Учет гемолиза с помощью последовательного внесения в исследуемый материал 0,5 мл 0,2%-ного раствора ортофенилендиамина и 3,0%-ной перекиси водорода, затем после 1-5 минутного выдерживания проб в них добавляют по 1,0 мл 1 N раствора серной кислоты. Accounting for hemolysis by sequentially introducing 0.5 ml of a 0.2% solution of orthophenylenediamine and 3.0% hydrogen peroxide into the test material, then after 1-5 minutes of keeping the samples, 1.0 ml of 1 N solution is added to them sulfuric acid.

Цвет проб учитывают на иммуноферментном анализаторе при суммарной длине волны в пределах 492-600 нм от контроля нормальной лошадиной сыворотки, соединенной с испытуемой сывороткой в аналогичных основной пробе разведениях. Снижение показателей оптической плотности в пробе испытуемая сыворотка + антитоксическая сыворотка по сравнению с пробой испытуемой сыворотки ниже стандартного вариационного отклонения анализатора /5-8%/ означает наличие в крови больного дифтерийного экзотоксина. The color of the samples is taken into account on an immunoassay analyzer at a total wavelength in the range of 492-600 nm from the control of normal horse serum connected to the test serum in similar dilutions of the main sample. The decrease in optical density in the test serum sample + antitoxic serum compared with the test serum sample below the standard variance of the analyzer / 5-8% / means the presence of diphtheria exotoxin in the patient’s blood.

В качестве дополнительного контроля в исследование включается проба, где исследуемая сыворотка соединяется с антитоксической сывороткой, из которой иммуноглобулин G удален одним из известных современных тестов. Лучше всего для этого использовать стафилококковый реагент, выпуска Института эпидемиологии и микробиологии им.Пастера /г. Санкт-Петербург/. Введение этого реагента в антитоксическую сыворотку удаляет в течении 45 мин весь Ig G и соответственно антитоксические антитела. Надосадок после цетрифугирования стафилококка практически этих антител не содержит. As an additional control, a test is included in the study, where the test serum is combined with antitoxic serum, from which immunoglobulin G has been removed by one of the well-known modern tests. It is best to use for this staphylococcal reagent, graduated from the Pasteur Institute of Epidemiology and Microbiology / g. St. Petersburg/. The introduction of this reagent into antitoxic serum removes all Ig G and, accordingly, antitoxic antibodies within 45 minutes. The supernatant after staphylococcus centrifugation practically does not contain these antibodies.

Качественный учет наличия токсина в исследуемой сыворотке может быть дополнен количественной оценкой. Для этого в аналогичном тесте необходимо титрование токсина с известным его количеством /в международных единицах или других количественных характеристиках/ и стандартный перерасчет единиц токсина, исходя из его калибровки по стандарту. При расчете доз токсина разница в оптических единицах пересчитывается с учетом показателей оптической плотности в контроле, содержащем испытуемую сыворотку и нормальную лошадиную сыворотку в соответствующих опытной пробе разведениях. Qualitative accounting of the presence of toxin in the test serum can be supplemented by a quantitative assessment. To do this, in a similar test, it is necessary to titrate the toxin with its known quantity / in international units or other quantitative characteristics / and a standard conversion of toxin units based on its calibration according to the standard. When calculating the doses of the toxin, the difference in optical units is recalculated taking into account the optical density in the control containing the test serum and normal horse serum in the corresponding experimental sample dilutions.

Пример 1. Example 1

Больной Зайцев, 2г. 2 мес. Ранний период токсической формы дифтерии. Patient Zaitsev, 2g. 2 months An early period of the toxic form of diphtheria.

При определении токсина в крови больного в острой фазе заболевания выявлено (см. таблицу)
Относительная величина наличия токсина в испытуемой пробе 0,057.When determining the toxin in the patient’s blood in the acute phase of the disease, it was revealed (see table)
The relative amount of toxin in the test sample is 0.057.

Относительная величина активности токсина 0,057 0,105 0,54, в процентах 54%
Преимуществом данного способа является следующее: во-первых, в отличие от прототипа, экзотоксин определяется непосредственно в крови больных, что дает возможность оценить у больного экспрессно, в течение нескольких часов, тяжесть заболевания и дать прогноз в отношении его дальнейшего лечения. Это практически невозможно при определении экзотоксина базовым способом, так как с его помощью токсин определяется в популяции выделенных бактерий дифтерии, а не непосредственно в организме больного. Базовый способ таким образом исключает роль организма в развитии токсического дифтерийного процесса. Во-вторых, выявление токсина в заявляемом способе позволяет прослеживать эффективность пассивной серотерапии противодифтерийной антитоксической сывороткой, оценивая степень снижения токсина в крови больных.Relative toxin activity 0.057 0.105 0.54, in percentage 54%
The advantage of this method is the following: firstly, unlike the prototype, exotoxin is determined directly in the blood of patients, which makes it possible to assess the patient's severity, within a few hours, the severity of the disease and give a prognosis regarding its further treatment. This is practically impossible when determining exotoxin in a basic way, since with it, the toxin is determined in a population of isolated bacteria of diphtheria, and not directly in the patient's body. The basic method thus eliminates the role of the body in the development of the toxic diphtheria process. Secondly, the detection of the toxin in the present method allows you to track the effectiveness of passive serotherapy with antidiphtheria antitoxic serum, assessing the degree of reduction of the toxin in the blood of patients.

Кроме того, при использовании данного способа возможно параллельное определение в крови иммунных комплексов (ИК) аналогичным комплемент-сорбционным тестом. До лечения сывороткой эти иммунные комплексы предположительно являются комплексами токсина и антитоксических антител, вырабатывающихся в организме больного. После начала серотерапии это главным образом образующиеся "де ново" комплексы токсина и вводимых антитоксинов. Получаемые в этом случае данные (определение токсина и ИК) легко сопоставимы и могут быть включены в систему контроля указанного специфического лечения. In addition, when using this method, it is possible to simultaneously determine in the blood the immune complexes (IR) by a similar complement sorption test. Before treatment with serum, these immune complexes are believed to be complexes of toxin and antitoxic antibodies produced in the patient's body. After the initiation of serotherapy, these are mainly the newly formed “de novo” complexes of the toxin and the administered antitoxins. The data obtained in this case (determination of the toxin and IR) are easily comparable and can be included in the control system of the specified specific treatment.

И, наконец, существенным преимуществом заявляемого способа является конечный цифровой показатель результатов (количественное определение). Это дает возможность выявлять токсин в определенном одном разведении исследуемой сыворотки без его титрования, так как определение токсина с помощью титрования меняет соотношение белков сыворотки, что может существенно искажать результаты определения токсина базовым способом. And finally, a significant advantage of the proposed method is the final digital indicator of the results (quantitative determination). This makes it possible to detect the toxin in a specific dilution of the test serum without titration, since the determination of the toxin by titration changes the ratio of serum proteins, which can significantly distort the results of the determination of the toxin in the basic way.

Claims

A method for determining the exotoxin of corynebacteria in the blood of patients with a toxic form of diphtheria infection by incubating a source of exotoxin isolated in the acute period of the disease with antitoxic antibodies and quantifying the reaction, characterized in that the patient’s blood serum is used before serotherapy, diluted to complement content of 1 2 hemolytic doses incubate it with 50 to 100 antitoxic doses of antidiphtheria antitoxic serum for 1 h at 37 ^o C, add endogenous com to the reaction mixture tribe with 10 hemolytic doses of anti-erythrocyte serum and determine the degree of hemolysis by catalase activity.