RU2085559C1

RU2085559C1 - Stacking-spiralized poly-ortho-phenylene hydroxylated at positions 3, 5, 6 and method of its synthesis

Info

Publication number: RU2085559C1
Application number: RU94033298A
Authority: RU
Inventors: Ю.В. Медведев; А.В. Марковский; С.Ф. Енохин; И.В. Волчек
Original assignee: Акционерное общество закрытого типа Научно-производственная компания "Олифен"
Priority date: 1994-09-14
Filing date: 1994-09-14
Publication date: 1997-07-27
Also published as: RU94033298A

Abstract

FIELD: chemical technology, polymers. SUBSTANCE: invention relates to stacking-spiralized poly-o-phenylene hydroxylated at positions 3, 5 and 6 at polymerization degree 3-10. Polymer is synthesized by polymerization of p-benzoquinone in air in the presence of alkali 10-35% of benzoquinone mass followed by treatment with alkali in inert medium at amount 90-110% of benzoquinone mass. Synthesized polymer enhances antiviral resistance. EFFECT: improved method of synthesis. 3 cl, 4 tbl

Description

Изобретение относится к новым химическим соединениям, а именно к биологически активным полимерам спиральной структуры общей формулы (см. в конце текста) и способу их получения,
где Х 1-3.3 витка спирали.The invention relates to new chemical compounds, namely to biologically active polymers of a spiral structure of the general formula (see the end of the text) and the method for their preparation,
where X 1-3.3 spiral turns.

Указанные полимеры являются фармакологически активными соединениями и могут быть использованы в экспериментальной и клинической медицине, биохимии, ветеринарии и других областях народного хозяйства. These polymers are pharmacologically active compounds and can be used in experimental and clinical medicine, biochemistry, veterinary medicine and other areas of the national economy.

Полимеры, обладающие спиральной структурой, играют важную роль в жизнедеятельности организма (ДНК, РНК, белки и т.п.). При этом их биологическое воздействие на организм определяется не только их первичной, но и вторичной (пространственной) структурой. В частности, не обладающие заметной биологической активностью полирибонуклеотиды начинают проявлять противовирусные, противоопухолевые и иные свойства при образовании комплексов спиральной структуры. Для комплексов полирибонуклеотидов так же, как для ДНК и РНК характерна спиральная структура со стэкинг-взаимодействием (упаковкой нуклеиновых оснований, являющихся хромофорами), основанном на неполярном взаимодействии между параллельно уложенными основаниями. Силы стэкинг-взаимодействия обуславливают высокую степень стабилизации спирали. Polymers with a helical structure play an important role in the life of the body (DNA, RNA, proteins, etc.). Moreover, their biological effect on the body is determined not only by their primary, but also by their secondary (spatial) structure. In particular, polyribonucleotides that do not have significant biological activity begin to exhibit antiviral, antitumor, and other properties during the formation of complexes of the spiral structure. Complexes of polyribonucleotides, as well as DNA and RNA, are characterized by a spiral structure with stacking interaction (packing of nucleic bases, which are chromophores), based on non-polar interaction between parallelly laid bases. Stacking forces cause a high degree of stabilization of the spiral.

Эти комплексы, характеризующиеся наличием стэкингспирализованной вторичной структуры в сочетании с гомогенной первичной структурой, являются прототипом по структуре заявляемого изобретения. Прототипом по эффективности является широко применяемый в медицинской практике препарат ремантадин-метил-1-адамантил-метиламина гидрохлорид. These complexes, characterized by the presence of a stacking-spiralized secondary structure in combination with a homogeneous primary structure, are a prototype in the structure of the claimed invention. The effectiveness prototype is the drug remantadine-methyl-1-adamantyl-methylamine hydrochloride widely used in medical practice.

Недостатками ремантадина являются узкий спектр действия, недостаточное воздействие на противовирусную резистентность, значительное количество противопоказаний (заболевания почек и печени). The disadvantages of rimantadine are a narrow spectrum of action, insufficient effect on antiviral resistance, a significant number of contraindications (kidney and liver diseases).

Спирализованные полифениленовые структуры и способы их получения в литературе не описаны. Для неспирализованных полифениленов явление повышения противовирусной резистентности неизвестно. Spiralized polyphenylene structures and methods for their preparation are not described in the literature. For non-spiralized polyphenylenes, the phenomenon of increased antiviral resistance is unknown.

Целью изобретения является синтез стэкингспирализованных поли-о-фениленов, гидроксилированных в положения 3, 5, 6 (СПФ), которые могут быть использованы в качестве соединений, повышающих противовирусную резистентность. The aim of the invention is the synthesis of stacking-helical poly-o-phenylenes, hydroxylated at positions 3, 5, 6 (SPF), which can be used as compounds that increase antiviral resistance.

Стэкингспирализованные полимеры формулы (1) получают полимеризацией на воздухе n-бензохинона в присутствии щелочи 10-35% от массы бензохинона в качестве инициатора с последующим введением в инертной среде до 90-110 мас. щелочи. После окончания реакции выделяют полимер традиционными методами, например, центрифугированием или фильтрованием предварительно нейтрализованного раствора. Stacking-coiled polymers of formula (1) are obtained by polymerization in air of n-benzoquinone in the presence of alkali 10-35% by weight of benzoquinone as an initiator, followed by administration in an inert medium to 90-110 wt. alkalis. After completion of the reaction, the polymer is isolated by conventional methods, for example, by centrifuging or filtering a pre-neutralized solution.

Степень полимеризации определяется соотношением щелочи и мономера. Наибольшей эффективностью обладает препарат со средней степенью полимеризации n 10/X 3.3. The degree of polymerization is determined by the ratio of alkali and monomer. The drug with an average degree of polymerization of n 10 / X 3.3 is most effective.

Содержание целевого полимера с заданным числом витков спирали в конечном продукте составляет в зависимости от степени полимеризации от 95 до 98%
Как показали проведенные эксперименты, полимеры СПФ характеризуются сочетанием противовирусных и иных позитивных свойств с низкой токсичностью (LД₅₀) при внутрибрюшинном введении составляет не менее 1350 мг/кг веса, при пероральном не менее 760-920 мг/кг веса в зависимости от вида животных и взятого полимера.The content of the target polymer with a given number of turns of the spiral in the final product is, depending on the degree of polymerization, from 95 to 98%
As shown by experiments, SPF polymers are characterized by a combination of antiviral and other positive properties with low toxicity (LD ₅₀ ) for intraperitoneal administration of at least 1350 mg / kg of body weight, for oral administration of at least 760-920 mg / kg of body weight, depending on the type of animals and taken polymer.

При более высоких степенях полимеризации эффективность полимера снижается при одновременном усложнении технологии выделения конечного продукта; при уменьшении степени полимеризации стэкинг-спираль не образуется. At higher degrees of polymerization, the effectiveness of the polymer is reduced while complicating the technology of separation of the final product; with a decrease in the degree of polymerization, a stacking spiral is not formed.

Пример 1. 1000 г n-бензохинона помещают в реактор емкостью 20 л, снабженный мешалкой и тубусами ввода реагентов, растворяют в 7 л дистиллированной воды и добавляют 100 г едкого натра в 300 мл воды (10% от массы мономера). Смесь перемешивают в течение двух часов пока цвет жидкости не станет темно-коричневым, после чего реактор продувают аргоном и вводят дополнительно 970 г едкого натра в 2 л воды (97% от массы мономера) и перемешивают без доступа воздуха в течение 2 ч. Избыток щелочи нейтрализуют соляной кислотой до рН 3-4, отделяют выпавший осадок фильтрованием, промывают водой и сушат. Выход продукта 945 г. Анализ его структуры показал, что он является полимером общей формулы (1) со средней степенью полимеризации 9.9, Х 3.3. В дальнейшем полимер испытывался под шифром СПФ-10. Example 1. 1000 g of n-benzoquinone is placed in a reactor with a capacity of 20 l, equipped with a stirrer and tubes for introducing reagents, dissolved in 7 l of distilled water and 100 g of sodium hydroxide are added in 300 ml of water (10% by weight of monomer). The mixture is stirred for two hours until the color of the liquid turns dark brown, after which the reactor is purged with argon and an additional 970 g of sodium hydroxide is introduced into 2 liters of water (97% by weight of the monomer) and stirred without air for 2 hours. Excess alkali neutralize with hydrochloric acid to pH 3-4, the precipitate formed is filtered off, washed with water and dried. Yield 945 g. An analysis of its structure showed that it is a polymer of the general formula (1) with an average degree of polymerization of 9.9, X 3.3. Subsequently, the polymer was tested under the code SPF-10.

Пример 2. Процесс осуществлялся в условиях примера 1 при первоначальном введении в раствор 166 г едкого натра в виде 300 мл водного раствора (16,6 мас. от мономера) и введением после полимеризации раствора, содержащего 1100 г едкого натра (110 мас.). Выход конечного полимера 850,2 г, n 6.1, Х 2. Шифр СПФ-6. Example 2. The process was carried out under the conditions of example 1 when initially introduced into the solution of 166 g of sodium hydroxide in the form of 300 ml of an aqueous solution (16.6 wt.% From the monomer) and after polymerization, a solution containing 1100 g of sodium hydroxide (110 wt.) Was introduced. The yield of the final polymer is 850.2 g, n 6.1, X 2. Code SPF-6.

Пример 3. Процесс проводился в условиях примера 1 при введении в мономер раствора, содержащего 350 г едкого натра, а в полимер 900 г едкого натра (соответственно 35 и 90 мас. от массы мономера). Выход 750,6 г, n 3.3, Х 1. Шифр СПФ-1. Example 3. The process was carried out under the conditions of example 1 with the introduction of a solution containing 350 g sodium hydroxide into the monomer, and 900 g sodium hydroxide into the polymer (respectively 35 and 90 wt.% Of the monomer). Yield 750.6 g, n 3.3, X 1. Identifier SPF-1.

Пример 4. Анализ структуры полимеров. Example 4. Analysis of the structure of polymers.

Полученные в примерах 1-3 образцы анализировались методами ПМР, инфракрасной и ультрафиолетовой спектроскопии. Для сопоставления анализировались аналогично спектры триоксибензола (ТОБ). Obtained in examples 1-3, the samples were analyzed by NMR, infrared and ultraviolet spectroscopy. For comparison, the spectra of trioxybenzene (TOB) were analyzed similarly.

Сняты спектры ПМР образцов СПФ в ДСМО-α₆. На спектрах наблюдаются три полосы, соответствующие трем типам протонов, присутствующих в полимерах: широкая полоса 6.66 m.g, которая может быть отнесена к атомам Н, связанным с С_ap, узкая полоса 6.56 m.g, характерная для Н-С_ap, и полоса при 3.5 m.g, относящаяся к Н-связи в О-Н. На основании синглетной природы сигнала при 6.56 m. g. и узкого характера полосы можно предположить, что данный сигнал соответствует концевому, наиболее подвижному протону связи Н-С_ap. Из соотношения интенсивностей суммарного пика атомов водорода связи Н-С_ap к пику концевого атома водорода была определена степень полимеризации, которая для образцов, полученных по примерам 1-3, равна порядка 10.6 и 3 соответственно.The PMR spectra of SPF samples in DMSO-α _{6 were} recorded. The spectra show three bands corresponding to the three types of protons present in the polymers: a broad band of 6.66 mg, which can be attributed to H atoms bound to C _ap , a narrow band of 6.56 mg characteristic of H-C _ap , and a band at 3.5 mg relating to the H-bond in OH. Based on the singlet nature of the signal at 6.56 mg and the narrow nature of the band, it can be assumed that this signal corresponds to the terminal, most mobile proton of the H – C bond _ap . From the peak intensity ratio of total hydrogen atoms of the H-C _ap to a peak end of a hydrogen atom was determined degree of polymerisation that for the samples obtained in Examples 1-3, is equal to about 10.6 and 3 respectively.

Наличие спиральной структуры подтвердилось электронными и дифференциальными спектрами в УФ области при различных рН и в присутствии 7 М мочевины (табл. 1). The presence of a helical structure was confirmed by electronic and differential spectra in the UV region at various pH and in the presence of 7 M urea (Table 1).

Анализ спектров показал, что при переходе от спектров триоксибензола к СПФ с Х=1, 2, 3.3 наблюдается гипохромный эффект Н 20-27% вместо ожидаемого гиперхромного эффекта более 50% что подтверждает наличие перекрывания хромофоров. Кроме того, при развернутой сопряженной системе введение фениленого радикала должно давать батохромный сдвиг Δλ_max= 70 нм, в то время как для СПФ сдвиг отсутствует и λ_max и 1,2,4 ТОБ = λ_max СПФ при рН 7. Наличие батохромного сдвига при
λ_max в 7 М мочевине (Δλ = 34 нм) указывает на существенность вклада водородных связей в систему стэкинга. При переходе от рН 7 к рН 9 для 1, 2, 4 ТОБ характерен батохромный сдвиг Δλ = 10-12 нм, а для СПФ гипохромный сдвиг Δλ = 5-6 нм, что также подтверждает наличие сильно сопряженной спиральной структуры. В области рН 5 спектр 1, 2, 4 ТОБ характеризуется одним пиком с λ_max= 290 нм, в то время как спектры СПФ имеют батохромный сдвиг, пропорциональный степени полимеризации, что позволяет проверять или уточнять степень полимеризации отдельных образцов СПФ, ранее установленную другими методами.An analysis of the spectra showed that, when switching from the spectra of trioxybenzene to SPF with X = 1, 2, 3.3, a hypochromic effect of H of 20-27% is observed instead of the expected hyperchromic effect of more than 50%, which confirms the presence of overlapping chromophores. In addition, with a developed conjugated system, the introduction of a phenyl radical should give a bathochromic shift Δλ _max = 70 nm, while for SPF, there is no shift and λ _max and 1.2.4 TOB = λ _max SPF at pH 7. The presence of the bathochromic shift at
λ _max in 7 M urea (Δλ = 34 nm) indicates the significant contribution of hydrogen bonds to the stacking system. When transitioning from pH 7 to pH 9, 1, 2, 4 TBTs are characterized by a bathochromic shift Δλ = 10-12 nm, and by a hypochromic shift Δλ = 5-6 nm for SPF, which also confirms the presence of a strongly conjugated spiral structure. In the range of pH 5, the spectrum of 1, 2, 4 TBP is characterized by one peak with λ _max = 290 nm, while the SPF spectra have a bathochromic shift proportional to the degree of polymerization, which allows one to check or clarify the degree of polymerization of individual SPF samples previously established by other methods .

Анализ полученных ИК спектров показывает следующие характеристические полосы: 875 см^-1 внеплоскостные деформационные колебания атома водорода в пентазамещенном бензольном кольце; 1188 см^-1 валентные колебания гидроксила в бензольном кольце; 1450, 1495, 1610 см^-1 - плоскостные колебания бензольного кольца; 3400 см^-1 валентные колебания группы ОН; связанной водородными связями, что также подтверждает соответствие анализируемого вещества формуле (1).An analysis of the obtained IR spectra shows the following characteristic bands: 875 cm ^-1 out-of-plane deformation vibrations of a hydrogen atom in a pentasubstituted benzene ring; 1188 cm ^-1 stretching vibrations of hydroxyl in the benzene ring; 1450, 1495, 1610 cm ^-1 - plane vibrations of the benzene ring; 3400 cm ^-1 stretching vibrations of the OH group; bound by hydrogen bonds, which also confirms the compliance of the analyte with the formula (1).

Методология получения спектральных характеристик включала в себя:
а) определение молекулярных экстинкций для каждого из 4 продуктов по двум независимым навескам (точность до 5 знака после запятой) с последующим разведением в дистиллированной воде до концентрации с учетом соблюдения закона Ламберта-Бэра (Σ = 0,3-0,5 o.e.). Молекулярная экстинкция считалась определенной при сходимости результатов;
б) были приготовлены из равных по массе навесок исходные растворы, содержащие продукты СПФ-10, СПФ-6, СПФ-3, ТОБ с концентрацией 10^-3 М;
в) из каждого раствора брали аликвоту и разводили соответственно заранее приготовленным раствором: I трис буфер 0,001 М, II НСl с рН 5, III NaOH с рН 9 и IV буфер с 7 М мочевиной. Разброс рН максимально возможный, так как при рН < 5 и рН > 9 продукт не растворяется;
г) для каждого продукта были сняты спектры (абсолютно одинаковые концентрации 3•10^-5 М) с тем, чтобы облегчить обработку и сравнение полученных результатов.The methodology for obtaining spectral characteristics included:
a) determination of molecular extinctions for each of 4 products by two independent samples (accuracy up to 5 decimal places), followed by dilution in distilled water to a concentration, taking into account the Lambert-Baire law (Σ = 0.3-0.5 oe). Molecular extinction was considered defined when the results converged;
b) initial solutions containing products of SPF-10, SPF-6, SPF-3, TOB with a concentration of 10 ^-3 M were prepared from equal mass of samples;
c) an aliquot was taken from each solution and diluted with a pre-prepared solution, respectively: I Tris buffer 0.001 M, II Hcl with pH 5, III NaOH with pH 9 and IV buffer with 7 M urea. The pH spread is the maximum possible, since at pH <5 and pH> 9 the product does not dissolve;
d) spectra (absolutely identical concentrations of 3 • 10 ^-5 M) were taken for each product in order to facilitate the processing and comparison of the results.

Пример 5. Сопоставление противовирусной активности СПФ, интерферона и ремантадина. Сопоставление активности противовирусных препаратов проводилось в соответствии с известной методикой. 8 мл венозной крови больного отбирались в пробирку, содержащую 1 мл среды 199 и 0,08 мл гепарина, центрифугировали в течение 5 мин при 800 об/мин, отделяли лейкоцитарный слой и суспендировали его в 1-2 мл среды 199. 0,25 мл суспензии и 0,75 мл среды 199 вносили в чашки Петри и добавляли 0,1 мл физиологического раствора, содержащего анализируемый препарат. Чашку инкубировали при 37^oС в течение 1 ч. Неприлипшую фракцию удаляли, промывали осадок физиологическим раствором, фиксировали в течение 20 мин литиевым кармином Орта и заливали на 18 ч раствором орсеина, после чего вновь промывали и высушивали. Под микроскопом подсчитывали количество вирусных включений на 100 моноцитов и определяли долю моноцитов, содержащих вирусные включения, и процент поражения моноцитов. Результаты сопоставления эффективности препаратов, а также дозозависимый эффект приведены в табл. 2-4. Для сравнения приведены данные на введение в чашку Петри чистого физиологического раствора.Example 5. Comparison of the antiviral activity of SPF, interferon and remantadine. Comparison of the activity of antiviral drugs was carried out in accordance with known methods. 8 ml of the patient’s venous blood were taken into a test tube containing 1 ml of 199 medium and 0.08 ml of heparin, centrifuged for 5 minutes at 800 rpm, the leukocyte layer was separated and suspended in 1-2 ml of 199 medium. 0.25 ml suspensions and 0.75 ml of 199 medium were added to Petri dishes and 0.1 ml of physiological saline containing the analyzed preparation was added. The cup was incubated at 37 ^° C for 1 hour. The non-adherent fraction was removed, the precipitate was washed with physiological saline, fixed for 20 minutes with Horta lithium carmine and poured with Orcein solution for 18 hours, after which it was again washed and dried. The number of viral inclusions per 100 monocytes was counted under a microscope, and the percentage of monocytes containing viral inclusions and the percentage of monocyte damage were determined. The results of comparing the effectiveness of the drugs, as well as the dose-dependent effect are given in table. 2-4. For comparison, the data on the introduction of a pure saline into the Petri dish are given.

Пример 6. Использование препарата СПФ для понижения падежа птиц от инфекционных агентов. Example 6. The use of the drug SPF to reduce the mortality of birds from infectious agents.

Испытания препарата проводились на Костинской птицефабрике (г. Киров) с использованием 8 тысяч цыплят породы "Бройлер-6". Препарат СПФ-10 использовался в дозе 25,50 и 100 г на тонну корма. Испытания проводили на 4 группах по 1600 цыплят, пятая группа была контрольной. Препарат давали с 10 до 20 и с 30 по 40 день откорма (группы 2 и 4) и постоянно (группы 1 и 3). Tests of the drug were carried out at the Kostinsky poultry farm (Kirov) using 8 thousand chickens of the Breiler-6 breed. The drug SPF-10 was used at a dose of 25.50 and 100 g per ton of feed. The tests were carried out on 4 groups of 1600 chickens, the fifth group was the control. The drug was given from 10 to 20 and from 30 to 40 days of fattening (groups 2 and 4) and constantly (groups 1 and 3).

В результате испытаний выяснилось, что введение 25 г/т корма приводит к падежу и отбраковке 600 цыплят при постоянном кормлении; при дозе 50 г/т эта величина составила: 630 при постоянном кормлении и 631 при периодическом; при дозе 100 г/т и периодическом кормлении она составила 642 цыпленка. В контрольной партии потери составили 908 цыплят. При этом падеж составил соответственно: 201, 194, 201, 185 цыплят при использовании СПФ, при падеже 323 цыплят в контрольной группе. As a result of the tests, it was found that the introduction of 25 g / t of feed leads to the death and rejection of 600 chickens with constant feeding; at a dose of 50 g / t, this value was: 630 with constant feeding and 631 with periodic; at a dose of 100 g / t and periodic feeding, it amounted to 642 chickens. In the control batch, losses were 908 chickens. In this case, the case was respectively: 201, 194, 201, 185 chickens using SPF, with the case 323 chickens in the control group.

Все параметры цыплят, потреблявших СПФ (упитанность, прирост, качество мяса и т. п. ) как минимум не уступали аналогичным показателям контроля. Повторные испытания, проведенные на 80 тыс. цыплят, привели к аналогичным результатам. All parameters of chickens consuming SPF (fatness, growth, meat quality, etc.) were at least as good as those of control. Repeated tests conducted on 80 thousand chickens led to similar results.

Claims

1. Stacking-spiralized poly-o-phenylene, hydroxylated at position 3, 5, 6

with a degree of polymerization of 3 to 10, where x 1 is 3.3 turns of the helix, as a substance that increases antiviral resistance.

2. The method of producing stacking-coiled poly-o-phenylene according to claim 1, which consists in the polymerization of p-benzoquinone in the presence of 10 35 alkali from the mass of p-benzoquinone, followed by treatment with alkali in an inert medium in an amount of 90 110 from the mass of p- benzoquinone.