RU2499002C1

RU2499002C1 - Conjugates of gossypol and sodium-carboxymethyl cellulose, their production methods and antiviral agents on their basis

Info

Publication number: RU2499002C1
Application number: RU2012124911/04A
Authority: RU
Inventors: Феликс Иванович Ершов; Владимир Георгиевич Нестеренко; Абдушукур Абдухалилович Сарымсаков; Анатолий Петрович Суслов; Сергей Владимирович Нестеренко; Ирина Васильевна Савоськина
Original assignee: Общество С Ограниченной Ответственностью "Ниармедик Плюс"
Priority date: 2012-06-14
Filing date: 2012-06-14
Publication date: 2013-11-20

Abstract

FIELD: biotechnologies.

SUBSTANCE: invention refers to conjugate of gossypol with sodium-carboxymethyl cellulose with molecular mass of 780-180000 Da at the ratio of gossypol to sodium-carboxymethyl cellulose of (1-5):(99-95) wt % and content of low-molecular fraction with molecular mass of 780 to 1500 Da of up to 20% and high-molecular fraction with molecular mass of 1500 to 180000 Da of up to 80%, conjugate of gossypol with sodium-carboxymethyl cellulose with molecular mass of 780 to 1500 Da at the ratio of gossypol to sodium-carboxymethyl cellulose of (0.35-1.76):(99.65-98.24) wt %, and conjugate of gossypol with sodium-carboxymethyl cellulose with molecular mass of 1500 to 180000 Da at the ratio of gossypol to sodium-carboxymethyl cellulose of (0.65-3.23):(99.35-96.77) wt %, and their production methods. Besides, the invention refers to antiviral agents on the basis of the above conjugates and pharmaceutical compositions containing conjugates.

EFFECT: improving compound application efficiency.

21 cl, 5 tbl, 3 dwg

Description

Изобретение относится к области фармацевтики и медицины и касается новых конъюгатов госсипола и натрийкарбоксиметилцеллюлозы, способов их получения и противовирусных средств на их основе.The invention relates to the field of pharmaceuticals and medicine and relates to new conjugates of gossypol and sodium carboxymethyl cellulose, methods for their preparation and antiviral agents based on them.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИBACKGROUND OF THE INVENTION

Известно, что низкомолекулярный полифенол - госсипол стимулирует синтез интерферона в организме животных и обладает противовирусной активностью [АС СССР No.721103].It is known that low molecular weight polyphenol - gossypol stimulates the synthesis of interferon in animals and has antiviral activity [AS USSR No.721103].

Сам госсипол имеет ряд недостатков - плохая растворимость в воде, высокая токсичность и сравнительно низкая противовирусная активность, и, как следствие, невысокий химико-терапевтический индекс (ХТП).Gossypol itself has a number of drawbacks - poor solubility in water, high toxicity and relatively low antiviral activity, and, as a consequence, a low chemical-therapeutic index (CTP).

Поэтому исследования специалистов были направлены на разработку новых производных госсипола, сохраняющих его полезные свойства индуктора интерферона и лишенные недостатков, присущих самому госсиполу.Therefore, the studies of specialists were aimed at developing new derivatives of gossypol, preserving its useful properties of the interferon inducer and devoid of the disadvantages inherent in gossypol itself.

На основе госсипола и его производных были созданы и внедрены в практику различные препараты противовирусного (линимент госсипола), антигерпетического (мазь мегосина), иммуносупрессивного (таблетки батридена), антихламидийного (таблетки гозалидона) и интеферониндуцирующего действия.On the basis of gossypol and its derivatives, various antiviral (gossypol liniment), antiherpetic (megosin ointment), immunosuppressive (batriden tablets), antichlamydial (gosalidone tablets) and interferon-inducing effects were created and put into practice.

В качестве одного из направлений модификации госсипола было выбрано создание его коньюгатов с полимерной матрицей. Данный выбор был обусловлен тем, что свободный госсипол токсичен, а госсипол в связанной с белками форме, образующейся в процессе технологической обработки семян хлопчатника, для организма млекопитающих нетоксичен.The creation of its conjugates with a polymer matrix was chosen as one of the directions for the modification of gossypol. This choice was due to the fact that free gossypol is toxic, and gossypol in the form associated with proteins formed during the technological processing of cotton seeds is not toxic to mammals.

В фармацевтической практике остается потребность в разработке препаратов на основе госсипола, которые при сохранении и усилении полезных свойств госсипола не обладали бы токсичностью и были бы удобны в применении для различных терапевтических и профилактических целей.In pharmaceutical practice, there remains a need to develop preparations based on gossypol, which, while maintaining and enhancing the beneficial properties of gossypol, would not have toxicity and would be convenient to use for various therapeutic and prophylactic purposes.

Известно производное госсипола и натрийкарбоксиметицеллюлозы, обладающее интерферониндуцирующим и противовирусным действием, представляющее собой гетероцепной полимер с характеристической вязкостью 0,06-0,1, полученный окислением натрийкарбоксиметицеллюлозы с последующим взаимодействием с госсиполом (RU 2002755). Защитное действие препарата подтверждено в исследованиях на мышах, зараженных инфекциями вируса энцефаломиокардита, гриппа и гепатита.A derivative of gossypol and sodium carboxymethyl cellulose is known to have an interferon-inducing and antiviral effect, which is a hetero-polymer with a characteristic viscosity of 0.06-0.1, obtained by oxidation of sodium carboxymethyl cellulose with subsequent interaction with gossypol (RU 2002755). The protective effect of the drug is confirmed in studies on mice infected with infections of the virus of encephalomyocarditis, influenza and hepatitis.

Известно также производное госсипола, представляющее собой натриевую соль сополимера производного госсипола (госсиполята натрийкарбоксиметилцеллюлозы) и карбоксиметилцеллюлозы с молекулярной массой 120000-130000 Да и степенью замещения 0,35-0,80, обладающее противовирусным действием в отношении вирусов ОРВИ, гриппа и герпеса (RU 2270708).A gossypol derivative is also known, which is the sodium salt of a copolymer of gossypol derivative (gossypolate of sodium carboxymethyl cellulose) and carboxymethyl cellulose with a molecular weight of 120,000-130,000 Yes and a degree of substitution of 0.35-0.80, which has an antiviral effect against ARVI, influenza and herpes viruses (22 )

Задачей изобретения является расширение ассортимента противовирусных средств, обладающих высоким уровнем терапевтической эффективности.The objective of the invention is to expand the range of antiviral agents with a high level of therapeutic efficacy.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯSUMMARY OF THE INVENTION

Настоящее изобретение относится к конъюгату госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой, обладающему противовирусным действием, охарактеризованному молекулярной массой 780-180000 Да при соотношении госсипол:натрийкарбоксиметилцеллюлоза (1-5):(99-85)% масс. и содержащему не более 20% масс. низкомолекулярной фракции с молекулярной массой от 780 до 1500 Да и не более 80% масс. высокомолекулярной фракции с молекулярной массой от 1500 до 180000 Да.The present invention relates to a conjugate of gossypol with sodium carboxymethyl cellulose, having an antiviral effect, characterized by a molecular weight of 780-180000 Yes at a ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (1-5) :( 99-85)% wt. and containing not more than 20% of the mass. low molecular weight fraction with a molecular weight of from 780 to 1500 Yes and not more than 80% of the mass. high molecular weight fraction with a molecular weight of from 1500 to 180,000 Yes.

Настоящее изобретение также относится к конъюгату госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой, обладающему противовирусным действием и охарактеризованному молекулярной массой от 780 до 1500Да при соотношении госсипол:натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,35-1,76):(99,65-98,24)% масс., а также к конъюгату госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой, обладающему противовирусным действием и охарактеризованному молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,65-3,23):(99,35-96,77)% масс.The present invention also relates to a gossypol conjugate with sodium carboxymethyl cellulose having an antiviral effect and a molecular weight of 780 to 1,500 Da with a ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (0.35-1.76) :( 99.65-98.24% wt., And also to the gossypol conjugate with sodium carboxymethyl cellulose, which has an antiviral effect and is characterized by a molecular weight of from 1500 Da to 180,000 Da with a ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (0.65-3.23) :( 99.35-96.77)% wt.

Конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой, характеризующийся молекулярной массой 780-180000Да при соотношении госсипол:натрийкарбоксиметилцеллюлоза (1-5):(99-85)% масс. и содержащий не более 20% масс. низкомолекулярной фракции с молекулярной массой от 780 до 1500 Да и не более 80% масс. высокомолекулярной фракции с молекулярной массой от 1500 до 180000 Да, может быть получен способом, включающим взаимодействие водного раствора натрийкарбоксиметилцеллюлозы со степенью замещения (0,35-0,8) с водным раствором иодной кислоты при массовом соотношении натрийкарбоксиметилцеллюлозы и иодной кислоты (25-35):(0,5-5) с последующими стадиями осаждения диальдегида натрийкарбоксиметилцеллюлозы путем обработки реакционной смеси смесью подкисленного водного раствора иодистого натрия и ацетона, выделения и обработки полученного диальдегида натрийкарбоксиметилцеллюлозы госсиполоуксусной кислотой в смеси водного раствора щелочи и ацетона с получением целевого продукта. При этом на первой стадии в результате реакции окисления происходит раскрытие глюкопиранозного цикла NaКМЦ с образованием диальдегида КМЦ. Поскольку легче окисляются незамещенные циклы NaКМЦ, то количество образовавшихся диальдегидных групп в них будет больше, чем в замещенных. Поэтому на второй стадии присоединения госсипола к диальдегиду КМЦ незамещенные циклы будут содержать больше госсипола, чем замещенные.The gossypol conjugate with sodium carboxymethyl cellulose, characterized by a molecular weight of 780-180000 Yes, with the ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (1-5) :( 99-85)% wt. and containing not more than 20% of the mass. low molecular weight fraction with a molecular weight of from 780 to 1500 Yes and not more than 80% of the mass. high molecular weight fraction with a molecular weight of from 1500 to 180,000 Yes, can be obtained by a method involving the interaction of an aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose with a degree of substitution (0.35-0.8) with an aqueous solution of iodic acid with a mass ratio of sodium carboxymethyl cellulose and iodic acid (25-35) : (0.5-5) with subsequent steps of precipitating sodium carboxymethyl cellulose dialdehyde by treating the reaction mixture with a mixture of an acidified aqueous solution of sodium iodide and acetone, isolating and treating the obtained dialdehyde n triykarboksimetiltsellyulozy gossipolouksusnoy acid in aqueous alkali-acetone mixture to obtain the desired product. Moreover, at the first stage, as a result of the oxidation reaction, the glucopyranose cycle of NaKMC opens with the formation of CMC dialdehyde. Since unsubstituted NaKMC cycles are more easily oxidized, the number of formed dialdehyde groups in them will be greater than in substituted ones. Therefore, in the second stage of addition of gossypol to CMC dialdehyde, unsubstituted cycles will contain more gossypol than substituted ones.

Конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой, охарактеризованный молекулярной массой от 780 до 1500Да при соотношении госсипол:натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,35-1,76): (99,65-98,24)% масс., может быть получен способом, включающим разделение описанного выше конъюгата госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой молекулярной массой 780-180000 Да методом эксклюзионной хроматографии и выделение фракции с молекулярной массой от 780 Да до 1500 Да.The gossypol conjugate with sodium carboxymethyl cellulose, characterized by a molecular weight of from 780 to 1500 Da, with the ratio gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (0.35-1.76): (99.65-98.24)% by weight, can be obtained by a method involving the separation of the conjugate described above gossypol with sodium carboxymethyl cellulose with a molecular weight of 780-180000 Da by size exclusion chromatography and isolation of a fraction with a molecular weight of from 780 Da to 1500 Da.

Конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой, охарактеризованный молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да при соотношении госсипол:натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,65-3,23):(99,35-96,77)% масс., может быть получен способом, включающим разделение описанного выше конъюгата госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой молекулярной массой 780-180000 Да методом эксклюзионной хроматографии и выделение фракции с молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да соответственно.The gossypol conjugate with sodium carboxymethyl cellulose, characterized by a molecular weight of from 1500 Da to 180,000 Da with a ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (0.65-3.23) :( 99.35-96.77)% by weight, can be obtained by a method involving the separation of the described above the conjugate of gossypol with sodium carboxymethyl cellulose with a molecular weight of 780-180000 Yes by size exclusion chromatography and the separation of fractions with a molecular weight of from 1500 Da to 180,000 Yes, respectively.

Все описанные выше способы являются объектами настоящего изобретения.All of the above methods are objects of the present invention.

Кроме того, еще одним объектом настоящего изобретения является противовирусное средство, представляющее собой конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой с молекулярной массой 780-180000 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (1-5):(99-85)% масс., содержащий не более 20% масс. низкомолекулярной фракции с молекулярной массой от 780 Да до 1500 Да и не более 80% масс. высокомолекулярной фракции с молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да.In addition, another object of the present invention is an antiviral agent, which is a gossypol conjugate with sodium carboxymethyl cellulose with a molecular weight of 780-180000 Yes at a ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (1-5) :( 99-85)% wt., Containing not more than 20% mass low molecular weight fraction with a molecular weight of from 780 Da to 1500 Yes and not more than 80% of the mass. high molecular weight fraction with a molecular weight of from 1500 Da to 180,000 Da.

Еще одним другим объектом настоящего изобретения является противовирусное средство, представляющее собой конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой с молекулярной массой от 780 до 1500 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,35-1,76):(99,65-98,24)% масс.Another other object of the present invention is an antiviral agent, which is a gossypol conjugate with sodium carboxymethyl cellulose with a molecular weight of from 780 to 1500 Da with a ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (0.35-1.76) :( 99.65-98.24)% mass .

Еще одним другим объектом настоящего изобретения является противовирусное средство, представляющее собой конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой с молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,65-3,23):(99,35-96,77)% масс.Another object of the present invention is an antiviral agent, which is a gossypol conjugate with sodium carboxymethyl cellulose with a molecular weight of from 1500 Da to 180,000 Da with a ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (0.65-3.23) :( 99.35-96.77)% mass

Предложенные в настоящем изобретении противовирусные средства предназначены для применения в терапии больных вирусными заболеваниями, в том числе, гриппом или гепатитом С. Так, в частности, противовирусные средства согласно настоящему изобретению можно применять в комплексной терапии больных гепатитом С и гриппом. Наиболее предпочтительно применять противовирусные средства на основе конъюгатов, которые получены способами согласно настоящему изобретению.The antiviral agents proposed in the present invention are intended for use in the treatment of patients with viral diseases, including influenza or hepatitis C. Thus, in particular, the antiviral agents according to the present invention can be used in the complex treatment of patients with hepatitis C and influenza. It is most preferable to use conjugate antiviral agents that are prepared by the methods of the present invention.

Другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, обладающая противовирусным действием, включающая в качестве активного компонента терапевтически эффективное количество конъюгата госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой с молекулярной массой 780-180000 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (1-5): (99-85)% масс., содержащего не более 20% масс. низкомолекулярной фракции с молекулярной массой от 780 Да до 1500 Да и не более 80% масс. высокомолекулярной фракции с молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да, и фармацевтически приемлемые добавки.Another object of the present invention is a pharmaceutical composition having an antiviral effect, comprising as the active component a therapeutically effective amount of gossypol conjugate with sodium carboxymethyl cellulose with a molecular weight of 780-180000 Yes with a ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (1-5): (99-85)% by weight. containing not more than 20% of the mass. low molecular weight fraction with a molecular weight of from 780 Da to 1500 Yes and not more than 80% of the mass. high molecular weight fractions with a molecular weight of from 1500 Da to 180,000 Yes, and pharmaceutically acceptable additives.

Еще одним другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, обладающая противовирусным действием, включающая в качестве активного компонента терапевтически эффективное количество конъюгата госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой с молекулярной массой от 780 до 1500 Да при соотношении госсипол:натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,35-1,76):(99,65-98,24)% масс.Another object of the present invention is a pharmaceutical composition having an antiviral effect, comprising as the active component a therapeutically effective amount of gossypol conjugate with sodium carboxymethyl cellulose with a molecular weight of from 780 to 1500 Da with a ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (0.35-1.76) :( 99.65-98.24)% of the mass.

Еще одним другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, обладающая противовирусным действием, включающая в качестве активного компонента терапевтически эффективное количество конъюгата госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой с молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,65-3,23):(99,35-96,77) масс.%.Another other object of the present invention is a pharmaceutical composition having an antiviral effect, comprising as the active component a therapeutically effective amount of gossypol conjugate with sodium carboxymethyl cellulose with a molecular weight of from 1500 Da to 180,000 Da with a ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (0.65-3.23): (99.35-96.77) wt.%.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению предназначены для применения в терапии больных вирусными заболеваниями, в частности, гриппом или гепатитом С.The pharmaceutical compositions of the present invention are intended for use in the treatment of patients with viral diseases, in particular influenza or hepatitis C.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Авторы настоящего изобретения разработали способ, который обеспечивает получение конъюгата госсипола и натрийкарбоксиметилцеллюлозы с широким диапазоном молекулярных масс, что неожиданно привело к обеспечению высокого уровня противовирусной активности конъюгата, в особенности его низмолекулярной фракции.The inventors of the present invention have developed a method that provides the preparation of a gossypol conjugate and sodium carboxymethyl cellulose with a wide range of molecular weights, which unexpectedly led to a high level of antiviral activity of the conjugate, especially its low molecular weight fraction.

Получение предложенного в настоящем изобретении конъюгата госсипола и натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (ГКМЦ), характеризующегося молекулярной массой 780-180000 Да при соотношении госсипол:натрийкарбоксиметилцеллюлоза (1-5):(99-85)% масс. и содержащему не более 20% масс. низкомолекулярной фракции с молекулярной массой от 780 до 1500 Да и не более 80% масс. высокомолекулярной фракции с молекулярной массой от 1500 до 180000 Да, осуществляют следующим образом.Obtaining the present invention, the conjugate of gossypol and sodium salt of carboxymethyl cellulose (HCMC), characterized by a molecular weight of 780-180000 Yes at a ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (1-5) :( 99-85)% wt. and containing not more than 20% of the mass. low molecular weight fraction with a molecular weight of from 780 to 1500 Yes and not more than 80% of the mass. high molecular weight fraction with a molecular weight of from 1500 to 180,000 Yes, as follows.

Водный раствор иодной кислоты (предпочтительно с концентрацией 1-25% масс.) добавляют к сильно разбавленному водному раствору натрийкарбоксиметилцеллюлозы (NaКМЦ), предпочтительно с концентрацией 7-10% масс., в массовом соотношении (0,5-5):(25-35) и проводят взаимодействие при перемешивании, предпочтительно в течение 3-4 часов. Полученную реакционную смесь обрабатывают смесью подкисленного водного раствора иодистого натрия и ацетона с последующим осаждением полученного диальдегида натрийкарбоксиметилцеллюлозы (ДАКМЦ). В этом случае предпочтительно использовать смесь (60-67)%-ного раствора NaI, (32-38)%-ного раствора HCl и ацетона в массовом соотношении (2:1:26). Полученный осадок ДАКМЦ отфильтровывают и многократно промывают водно-ацетоновой смесью, взятой в массовом соотношении от 1:4 до 3:7 и, в заключении, чистым ацетоном. Затем ДАКМЦ растворяют в водно-щелочном растворе и добавляют приготовленный заранее раствор госсиполуксусной кислоты (ГУК). Для приготовления раствора ГУК предпочтительно использовать смесь (30-36)%-ного водного раствора NaOH, ацетона и воды, взятые в массовом соотношении (1:100:4). Реакцию можно проводить при комнатной температуре, но более предпочтительно осуществлять взаимодействие при нагревании до 25-38°С, в течение 5-30 мин. Затем, добавляют дополнительную порцию ацетона, перемешивают еще 1-2 ч. Реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры и доводят рН до значения 12. Полученный продукт промывают большим количеством ацетона, отфильтровывают и высушивают.An aqueous solution of iodic acid (preferably with a concentration of 1-25% by weight) is added to a highly dilute aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose (NaKMTS), preferably with a concentration of 7-10% by weight, in a weight ratio of (0.5-5) :( 25- 35) and carry out the interaction with stirring, preferably for 3-4 hours. The resulting reaction mixture was treated with a mixture of an acidified aqueous solution of sodium iodide and acetone, followed by precipitation of the obtained sodium carboxymethyl cellulose dialdehyde (DACMC). In this case, it is preferable to use a mixture of a (60-67)% solution of NaI, (32-38)% solution of HCl and acetone in a weight ratio of (2: 1: 26). The obtained DACMC precipitate was filtered off and washed repeatedly with an aqueous-acetone mixture taken in a mass ratio of 1: 4 to 3: 7 and, finally, with pure acetone. Then, DACMC is dissolved in an aqueous alkaline solution, and a solution of gossypolacetic acid (HAC) prepared in advance is added. To prepare a solution of HUA, it is preferable to use a mixture of (30-36)% aqueous solution of NaOH, acetone and water, taken in a mass ratio (1: 100: 4). The reaction can be carried out at room temperature, but it is more preferable to carry out the reaction by heating to 25-38 ° C for 5-30 minutes. Then, an additional portion of acetone was added, stirred for another 1-2 hours. The reaction mixture was cooled to room temperature and adjusted to pH 12. The resulting product was washed with a large amount of acetone, filtered and dried.

Авторы настоящего изобретения полагают, что предложенные в настоящем изобретении условия обработки водного раствора натрийкарбоксиметилцеллюлозы водным раствором иодной кислоты (массовое соотношение натрийкарбоксиметилцеллюлозы и иодной кислоты (25-35):(0,5-5)) в сочетании с проведением стадии осаждения и выделения диальдегида натрийкарбоксиметилцеллюлозы и особыми условиями его взаимодействия с госсиполом (обработка госсипол уксусной кислотой в смеси водного раствора щелочи и ацетона) позволяют получить конъюгат госсипола и натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы с широким диапазоном молекулярных масс от 780-180000 Да что, в свою очередь, как это будет показано ниже, обеспечивает высокую терапевтическую эффективность целевого продукта (для сравнения продукт, описанный в RU 2270708, имеет существенно более узкий диапазон молекулярных масс 120000-130000 Да). Кроме того, в отличие от известного способа получения натриевой соли производного госсипола и карбоксиметилцеллюлозы (RU 2270708) предложенный в настоящем изобретении способ получения ГКМЦ позволяет избежать использования в качестве растворителя изопропилового спирта, примеси которого являются трудно удаляемыми и загрязняют целевой продукт.The authors of the present invention believe that the conditions proposed in the present invention for the treatment of an aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose with an aqueous solution of iodic acid (mass ratio of sodium carboxymethyl cellulose and iodic acid (25-35) :( 0.5-5)) in combination with the precipitation and isolation stage of sodium carboxymethyl cellulose dialdehyde and the special conditions of its interaction with gossypol (treatment of gossypol with acetic acid in a mixture of an aqueous solution of alkali and acetone) make it possible to obtain gossypol and sodium conjugate th salt of carboxymethyl cellulose with a wide range of molecular weights from 780-180000 Yes, which, in turn, as will be shown below, provides high therapeutic efficacy of the target product (for comparison, the product described in RU 2270708 has a significantly narrower molecular weight range of 120,000 130,000 Yes). In addition, in contrast to the known method for producing the sodium salt of a gossypol derivative and carboxymethyl cellulose (RU 2270708), the inventive method for producing HCMC avoids the use of isopropyl alcohol as a solvent, the impurities of which are difficult to remove and contaminate the target product.

Получение предложенного в настоящем изобретении конъюгата госсипола и натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (конъюгат НМ), охарактеризованного молекулярной массой от 780 до 1500 Да при соотношении госсипол:натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,35-1,76): (99,65-98,24)% масс., проводят путем разделения ГКМЦ методом эксклюзионной хроматографии и выделения фракции с молекулярной массой от 780 Да до 1500 Да.Obtaining the gossypol conjugate and the carboxymethyl cellulose sodium salt (HM conjugate) proposed in the present invention, characterized by a molecular weight of from 780 to 1500 Da with a ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (0.35-1.76): (99.65-98.24)% mass ., is carried out by separating HCMC by size exclusion chromatography and isolating a fraction with a molecular weight of from 780 Da to 1500 Da.

Получение предложенного в настоящем изобретении конъюгата госсипола и натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы (конъюгат ВМ), охарактеризованного молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да при соотношении госсипол:натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,65-3,23):(99,35-96,77)% масс., проводят путем разделения ГКМЦ методом эксклюзионной хроматографии и выделения фракции с молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да.Obtaining the gossypol conjugate and the carboxymethyl cellulose sodium salt (BM conjugate) proposed in the present invention, characterized by a molecular weight of from 1500 Da to 180,000 Da with a ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (0.65-3.23) :( 99.35-96.77)% mass., carried out by separation GKMTS method of size exclusion chromatography and separation of fractions with a molecular weight of from 1500 Yes to 180,000 Yes.

Предложенные в настоящем изобретении фармацевтические композиции могут быть получены с использованием стандартных методик объединения активного компонента и фармацевтически приемлемых добавок и представлены в виде различных лекарственных форм в зависимости от выбранного способа их применения. Для перорального приема фармацевтическую композицию можно использовать в виде таблеток, капсул или суспензий. Кроме того, для ректального приема можно использовать суппозитории. Количество активного компонента в фармацевтической композиции может варьировать в широком диапазоне в зависимости от различных факторов, хорошо известных специалистам в области фармацевтики. В качестве фармацевтически приемлемых добавок можно использовать обычно применяемые для вышеуказанных лекарственных форм вещества. Например, в таблетках в качестве наполнителя можно использовать крахмал, например, картофельный крахмал, стеарат кальция или магния, сахар молочный и другие фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества.The pharmaceutical compositions of the present invention can be prepared using standard techniques for combining the active component and pharmaceutically acceptable additives and are presented in different dosage forms depending on the chosen method of their use. For oral administration, the pharmaceutical composition can be used in the form of tablets, capsules or suspensions. In addition, for rectal administration, suppositories can be used. The amount of active ingredient in a pharmaceutical composition can vary over a wide range depending on various factors well known to those skilled in the pharmaceutical art. As pharmaceutically acceptable additives, substances commonly used for the above dosage forms can be used. For example, in tablets, starch can be used as filler, for example, potato starch, calcium or magnesium stearate, milk sugar and other pharmaceutically acceptable excipients.

Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению предназначены для применения в терапии больных вирусными заболеваниями, в частности, гриппом или гепатитом С. Схема лечения (режим и доза введения препарата) выбирается специалистом, исходя из тяжести заболевания, состояния и возраста пациента. Например, для лечения гриппа назначают по 2 таблетки три раза в день (9 час., 14 час. и 20 час.) в течение первых 2-х дней, затем по 1 таблетке 3 раза в день в течение последующих 2-х дней. Суммарная доза препарата на 1 пациента за 4 дня составляет 18 таблеток.The pharmaceutical compositions according to the present invention are intended for use in the treatment of patients with viral diseases, in particular, influenza or hepatitis C. The treatment regimen (regimen and dose of the drug) is chosen by a specialist based on the severity of the disease, condition and age of the patient. For example, for the treatment of influenza, 2 tablets are prescribed three times a day (9 hours, 14 hours and 20 hours) for the first 2 days, then 1 tablet 3 times a day for the next 2 days. The total dose of the drug per 1 patient for 4 days is 18 tablets.

Например, для лечения гепатита С назначают по 2 таблетки три раза в день (9 час., 14 час. и 20 час.) в течение 5 дней. Суммарная доза препарата на 1 пациента составляет 30 таблеток.For example, for the treatment of hepatitis C, 2 tablets are prescribed three times a day (9 hours, 14 hours and 20 hours) for 5 days. The total dose of the drug per 1 patient is 30 tablets.

В предпочтительно варианте предложенная фармацевтическая композиция может иметь следующий состав, в % масс.:In a preferred embodiment, the proposed pharmaceutical composition may have the following composition, in% by weight:

Коньюгат ГКМЦKonyugat GKMTS - 10,00-25,00- 10.00-25.00 Картофельный крахмалPotato starch - 9,00-21,00- 9.00-21.00 Кальция стеаратCalcium stearate - 0,60-1,35- 0.60-1.35 Лудипресс (лактоза моногидрат, повидон, кросповидон)Ludipress (lactose monohydrate, povidone, crospovidone) - до 100- up to 100

Далее представлены примеры получения предложенных конъюгатов госсипола и натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы, физико-химические характеристики полученных продуктов и результаты изучения их биологической активности.The following are examples of the preparation of the proposed conjugates of gossypol and sodium salt of carboxymethyl cellulose, physicochemical characteristics of the obtained products, and results of a study of their biological activity.

ПРИМЕРЫ ПОЛУЧЕНИЯ ГКМЦEXAMPLES OF OBTAINING SCMC

Образцы ГКМЦ получали следующим образом. Водный раствор иодной кислоты (1-25% масс.) добавляли к сильно разбавленному водному раствору NaКМЦ (7-10% масс.) в массовом соотношении (0,5-5):(25-35) при перемешивании в течение 3-4 ч. В полученную реакционную смесь добавляли смесь водного раствора NaI (концентрация 64,9% масс.), 36%-ного водного раствора HCl и ацетона в массовом соотношении (2:1:26) и проводили осаждение полученного диальдегида натрийкарбоксиметилцеллюлозы (ДАКМЦ). Осадок отфильтровывали и многократно промывали водно-ацетоновой смесью взятой в массовом соотношении от 1:4 до 3:7 и, в заключении, чистым ацетоном. Полученный ДАКМЦ растворяли в водно-щелочном растворе и добавляли приготовленный заранее раствор госсиполуксусной кислоты (ГУК) (34%-ный водный раствор NaOH, ацетон и вода, взятые в массовом соотношении 1:100:4). Реакцию проводили при температуре 25-38°С в течение 5-30 мин. Затем добавляли дополнительную порцию ацетона и перемешивали в течение 1-2 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и доводили рН до значения 12. Полученный продукт промывали большим количеством ацетона, отфильтровывали и высушивали. Получали порошок светло-коричневого цвета, представляющий собой конъюгат госсипола и натрийкарбоксиметилцеллюлозы с молекулярной массой 780-180000 Да при соотношении госсипол:натрийкарбоксиметилцеллюлоза (1-5): (99-85) масс.%, содержащий не более 20% низкомолекулярной фракции с молекулярной массой от 780 Да до 1500 Да и не более 80% высокомолекулярной фракции с молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да. Выход продукта составил 60% в пересчете на исходную NaКМЦ. Физико-химические показатели промежуточного (ДАКМЦ) и целевого (ГКМЦ) продуктов приведены в таблицах 1 и 2 соответственно. GCMC samples were prepared as follows. An aqueous solution of iodic acid (1-25% wt.) Was added to a highly diluted aqueous solution of NaKMTS (7-10% wt.) In a mass ratio of (0.5-5) :( 25-35) with stirring for 3-4 h. A mixture of an aqueous NaI solution (concentration of 64.9% by weight), a 36% aqueous solution of HCl and acetone in a mass ratio (2: 1: 26) was added to the resulting reaction mixture, and the obtained dialdehyde sodium carboxymethyl cellulose (DACMC) was precipitated. The precipitate was filtered off and washed repeatedly with a water-acetone mixture taken in a mass ratio of 1: 4 to 3: 7 and, finally, with pure acetone. The obtained DACMC was dissolved in an aqueous alkaline solution, and a solution of gossypolacetic acid (HAC) prepared in advance (34% aqueous NaOH solution, acetone and water taken in a mass ratio of 1: 100: 4) was added. The reaction was carried out at a temperature of 25-38 ° C for 5-30 minutes. Then an additional portion of acetone was added and stirred for 1-2 hours. The reaction mixture was cooled to room temperature and the pH was adjusted to 12. The resulting product was washed with a large amount of acetone, filtered and dried. A light brown powder was obtained, which is a conjugate of gossypol and sodium carboxymethyl cellulose with a molecular weight of 780-180000 Yes at a ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (1-5): (99-85) wt.%, Containing not more than 20% low molecular weight fraction with a molecular weight from 780 Da to 1500 Yes and not more than 80% of high molecular weight fraction with a molecular weight of from 1500 Da to 180,000 Da. The product yield was 60% in terms of the initial NaKMTS. Physico-chemical characteristics of the intermediate (DACMC) and target (GCMC) products are shown in tables 1 and 2, respectively.

Таблица 1
Физико-химические показатели ДАКМЦTable 1
Physico-chemical indicators DAKMTS ДАКМЦDAKMTS Физико-химические показателиphysical and chemical indicators СерияSeries рН, ммоль/гpH mmol / g УФ спектр (дифференциальный изоконцентрационный спектр), нмUV spectrum (differential isoconcentration spectrum), nm Массовая доля альдегидных групп, мг/гMass fraction of aldehyde groups, mg / g Приведенная вязкость, мг/гThe reduced viscosity, mg / g 1one 3,43.4 max - 289
min - 235max - 289
min - 235 10,510.5 28,728.7 22 3,53,5 max - 291
min - 235max - 291
min - 235 10,410,4 26,926.9 33 3,33.3 max - 291
min - 234max - 291
min - 234 9,59.5 29,329.3

Таблица 2
Физико-химические показатели ГКМЦtable 2
Physico-chemical indicators GKMTS ГКМЦSCMC Физико-химические показателиphysical and chemical indicators серияseries рН, ммоль/гpH mmol / g УФ спектр, (дифференциальный изоконцентрационный спектр), нмUV spectrum, (differential isoconcentration spectrum), nm Растворимость в воде (0,1г/мл в течение 10 мин)Solubility in water (0.1g / ml for 10 min) 1one 10,6010.60 max - 244, 285, 376
min - 226, 267, 318max - 244, 285, 376
min - 226, 267, 318 Полностью растворимCompletely soluble 22 10,5910.59 max - 244, 285, 375
min - 226, 268, 318max - 244, 285, 375
min - 226, 268, 318 Полностью растворимCompletely soluble 33 10,6210.62 max - 243, 284, 376
min - 227, 267, 319max - 243, 284, 376
min - 227, 267, 319 Полностью растворимCompletely soluble

Сравнение представленных в таблицах 1 и 2 физико-химических показателей промежуточного продукта ДАКМЦ и целевого продукта ГКМЦ показывает практически полное конъюгирование ароматической (госсипол) и полимерной (натрийкарбоксиметилцеллюлоза) частей. Об этом свидетельствует изменение значений max и min поглощения в дифференциальных изоконцентрационных УФ спектрах, характерных для ДАКМЦ и ГКМЦ снятых на спектрофотомерте в кювете толщиной слоя в 10 мм в области от 220 до 700 нм, а также полная растворимость ГКМЦ в воде, в то время как ДАКМЦ в воде практически не растворим.A comparison of the physicochemical parameters of the intermediate product DACMC and the target product GCMC shown in tables 1 and 2 shows an almost complete conjugation of the aromatic (gossypol) and polymer (sodium carboxymethyl cellulose) parts. This is evidenced by a change in the values of max and min absorption in the differential isoconcentration UV spectra characteristic of DACMC and GCMC recorded on a spectrophotometer in a cuvette with a layer thickness of 10 mm in the range from 220 to 700 nm, as well as the complete solubility of GCMC in water, while DACMC is practically insoluble in water.

С помощью метода гельпроникающей хроматографии (ГПХ) было установлено, что молекулярная масса (ММ) ГКМЦ варьирует в пределах 780-180000 Да. Анализ ММ ГКМЦ проводили на хроматографе фирмы Waters, снабженном дифференциальным рефрактометрическим детектором “Waters 2414” и спектрофотометрическим детектором с диодной матрицей “PDA 996”. Использовали набор из двух колонок “Ultrahydrogel 250” и “Ultrahydrogel 1000”, в качестве элюента - водный 0,25 N аммиачно-ацетатный буферный раствор (pH~9), скорость элюирования 0,6 мл/мин. Регистрацию спектров проводили в интервале длин волн от 220 нм (нижний предел прозрачности буферного раствора) до 600 нм. Результаты приведены на Фиг. 1Using gel permeation chromatography (GPC), it was found that the molecular weight (MM) of HCMC varies between 780-180000 Da. The analysis of MMHMCM was carried out on a Waters chromatograph equipped with a Waters 2414 differential refractometric detector and a PDA 996 diode array spectrophotometric detector. A set of two columns “Ultrahydrogel 250” and “Ultrahydrogel 1000” was used, aqueous 0.25 N ammonia-acetate buffer solution (pH ~ 9), elution rate 0.6 ml / min. Spectra were recorded in the wavelength range from 220 nm (lower limit of transparency of the buffer solution) to 600 nm. The results are shown in FIG. one

На Фиг. 2 приведен график зависимости содержания госсипола ((D300/Iref)103) от молекулярной массы ГКМЦ (LgM) для пяти полученных образцов. По соотношению интенсивности поглощения в УФ-области спектра и интенсивности сигнала рефрактометрического детектора установлено, что звенья, содержащие госсипол в образцах ГКМЦ распределены по цепи неравномерно, а именно, концентрация этих звеньев возрастает при уменьшении молекулярной массы.In FIG. Figure 2 shows a graph of the dependence of the gossypol content ((D300 / Iref) 103) on the molecular weight of HCMC (LgM) for the five samples obtained. By the ratio of the absorption intensity in the UV region of the spectrum and the signal intensity of the refractometric detector, it was found that the units containing gossypol in the HCMC samples are distributed unevenly along the chain, namely, the concentration of these units increases with decreasing molecular weight.

Образец ГКМЦ условно разделяли на фракции по молекулярным массам, как это показано на Фиг.3 и для каждой фракции определяли относительное содержание госсипола. Результаты представлены в Таблице 3.The HCMC sample was conventionally divided into fractions by molecular weights, as shown in Fig. 3, and the relative content of gossypol was determined for each fraction. The results are presented in Table 3.

Таблица 3
Распределение госсипола во фракциях ГКМЦ с различной молекулярной массойTable 3
Distribution of gossypol in HCMC fractions with different molecular weights Интервал масс. долей фракций, %Mass interval fractions fraction,% Интервал молеку-лярных масс, ДаInterval of molecular masses, Yes Доля госсипола (% от суммы)Gossypol share (% of the amount) Препаративно выделенные фракцииPreparative fractions 0-100-10 180000-53500180,000-53500 7,57.5 ВМVM 10-3010-30 53500-2890053500-28900 14,914.9 30-5030-50 28900-1690028900-16900 15,115.1 50-7050-70 16900-845016900-8450 16,016,0 70-9070-90 8450-12708450-1270 19,019.0 НМNM 90-10090-100 1270-7801270-780 27,527.5

Из Таблицы 3 видно, что почти половина звеньев, содержащих госсипол сосредоточена в 30% от всего образца (в низкомолекулярной части с ММ<9000), причем, почти треть - в самой низкомолекулярной фракции (ММ~1000 и меньше), доля которой составляет всего 10%.From Table 3 it is seen that almost half of the units containing gossypol are concentrated in 30% of the entire sample (in the low molecular weight part with MM <9000), and almost a third in the lowest molecular weight fraction (MM ~ 1000 or less), whose share is only 10%.

ПРИМЕРЫ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГАТОВ НМ и ВМEXAMPLES OF OBTAINING CONJUGATES OF NM and VM

Препаративное разделение ГКМЦ на низкомолекулярную (от 780 Да до 1500 Да) и высокомолекулярную (от 1500 Да до 180000 Да) фракции проводили методом эксклюзионной хроматографии, используя в качестве носителя Bio-Gel P-2 (предел эксклюзии 1,6 кДа). Колонку 1,5×35 см с носителем уравновешивали водой MQ. Для калибровки колонки использовали цитохром С (свободный объем колонки) и шестиводный хлорид хрома (полный объем колонки). Навеску ГКМЦ 150-170 мг растворяли в 0,6 мл воды MQ и центрифугировали при 13400 об/мин в течение 5 мин. Полученный раствор ГКМЦ наносили на колонку и проводили изократическую элюцию водой MQ со скоростью 1 мл/мин, собирая фракции по 2 мл. Выход фракций из колонки оценивали визуально (желто-коричневое окрашивание) и по оптической плотности фракций при 254 нм. Фракцию, выходящую в начале свободного объема (высокомолекулярную), представляющую собой конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой с молекулярной массой от 1500 Да до 180000 Да при соотношении госсипол: натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,65-3,23):(99,35-96,77)% масс. (конъюгат ВМ), и фракцию, выходящую в конце полного объема (низкомолекулярную), представляющую собой конъюгат госсипола с натрийкарбоксиметилцеллюлозой с молекулярной массой от 780 до 1500 Да при соотношении госсипол:натрийкарбоксиметилцеллюлоза (0,35-1,76):(99,65-98,24)% масс. (конъюгат НМ), собирали и использовали для дальнейшего тестирования биологической активности.The preparative separation of HCMC into low molecular weight (from 780 Da to 1500 Da) and high molecular weight (from 1500 Da to 180,000 Da) fractions was carried out by size exclusion chromatography using Bio-Gel P-2 as a carrier (1.6 kDa exclusion limit). A 1.5 × 35 cm column with support was equilibrated with MQ water. To calibrate the column, cytochrome C (free column volume) and six-water chromium chloride (total column volume) were used. A weighed portion of HCMC of 150-170 mg was dissolved in 0.6 ml of MQ water and centrifuged at 13400 rpm for 5 minutes. The resulting HCMC solution was applied to a column and isocratic elution with MQ water was performed at a rate of 1 ml / min, collecting 2 ml fractions. The yield of fractions from the column was evaluated visually (tan) and by the optical density of the fractions at 254 nm. The fraction leaving the beginning of the free volume (high molecular weight), which is a gossypol conjugate with sodium carboxymethyl cellulose with a molecular weight of 1500 Da to 180,000 Da with a ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (0.65-3.23) :( 99.35-96.77) % of the mass. (VM conjugate), and the fraction leaving the end of the full volume (low molecular weight), which is a gossypol conjugate with sodium carboxymethyl cellulose with a molecular weight of 780 to 1,500 Da with a ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (0.35-1.76) :( 99.65 -98.24)% of the mass. (HM conjugate) were collected and used for further testing of biological activity.

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ КОНЪЮГАТОВSTUDYING THE BIOLOGICAL ACTIVITY OF CONJUGATES

Противовирусную активность ГКМЦ и его фракций (конъюгаты НМ и ВМ) в отношении вируса гепатита С изучали на экспериментальной модели инфекции, вызванной вирусом гепатита С. Использовали высоко-патогенный штамм вируса гепатита С (ВГС), выделенный из крови ВГС инфицированного пациента, страдающего гепатоклеточной карциномой, в сыворотке крови которого были обнаружены антитела к ВГС и РНК ВГС. Исследования конъюгатов согласно настоящему изобретению проводили в культурах клеток почки зеленой мартышки (Vero), выращенных в виде однодневного монослоя в 48-луночных панелях. Культуры клеток Vero обрабатывали различными концентрациями конъюгатов сразу после адсорбции вируса.The antiviral activity of HCMC and its fractions (HM and BM conjugates) against hepatitis C virus was studied in an experimental model of hepatitis C virus infection. A highly pathogenic strain of hepatitis C virus (HCV) was used, isolated from the blood of the HCV of an infected patient suffering from hepatocytic carcinoma , in the blood serum of which antibodies to HCV and HCV RNA were detected. Studies of the conjugates of the present invention were carried out in green monkey kidney cell cultures (Vero) grown as a one-day monolayer in 48-well panels. Vero cell cultures were treated with various concentrations of conjugates immediately after virus adsorption.

Результаты экспериментов учитывали способность конъюгатов защищать инфицированные клетки от цитопатогенного действия ВГС; в этом случае результаты учитывали на 6-й, 7-й дни, когда в контрольных, инфицированных ВГС без добавления конъюгата культурах развивались максимальные цитопатические изменения. В этом случае подсчитывали % жизнеспособных клеток в монослое, обработанном и необработанном конъюгатом. Полученные результаты представлены в таблице 4.The experimental results took into account the ability of conjugates to protect infected cells from the cytopathogenic effect of HCV; in this case, the results were taken into account on the 6th, 7th days, when the maximum cytopathic changes developed in the control infected with HCV without the addition of conjugate cultures. In this case,% viable cells were counted in a monolayer treated and untreated conjugate. The results are presented in table 4.

Таблица 4
Способность ГКМЦ и его фракций (конъюгаты НМ и ВМ) защищать культуры клеток Vero от цитопатического действия вируса гепатита СTable 4
The ability of HCMC and its fractions (NM and BM conjugates) to protect Vero cell cultures from the cytopathic effect of hepatitis C virus Концентрация препарата, (мг)The concentration of the drug (mg) Доза вируса, ТЦД 50The dose of the virus, TCD 50 100,0100.0 10,010.0 1,01,0 % погибших культур клеток Vero в монослое% dead Vero cell cultures in a monolayer ГКМЦSCMC ВМ*VM * НМ**NM ** ГКМЦSCMC ВМVM НМNM ГКМЦSCMC ВМVM НМNM 0,250.25 100one hundred 100one hundred 00 7070 00 00 2525 00 00 0,120.12 100one hundred 100one hundred 00 100one hundred 100one hundred 00 4040 7575 00 Контроль (без препарата)Control (without drug) 100one hundred 100one hundred 100one hundred 100one hundred 100one hundred 100one hundred 50fifty 7575 2525 ВМ* - фракция с ММ от 1500 Да до 180000 Да,
НМ**- фракция с ММ от 780 Да до 1500 ДаVM * - fraction with MM from 1500 Yes to 180,000 Yes,
NM ** - fraction with MM from 780 Yes to 1500 Yes

Таким образом, изучение противовирусного действия фракции с ММ от 780 Да до 1500 Да (конъюгат НМ) показало, что при использовании конъюгата в дозе 0,25 и 0,12 мг приводит к 100%-ной защите клеток Vero от литического действия вируса гепатита С. Защита клеток от вируса гепатита С фракцией с ММ от 1500 Да до 180000 Да (конъюгат ВМ) проявляется значительно хуже и наблюдается зависимость от используемой дозы конъюгата.Thus, the study of the antiviral effect of the fraction with MM from 780 Da to 1,500 Da (NM conjugate) showed that when using the conjugate at a dose of 0.25 and 0.12 mg, the Vero cells are 100% protected from the lytic effect of hepatitis C virus The protection of cells from hepatitis C virus with a fraction with an MM from 1500 Da to 180,000 Da (BM conjugate) is much worse and there is a dependence on the used dose of the conjugate.

Исследование противовирусной активности препарата ГКМЦ и его фракций (конъюгаты НМ и ВМ) в отношении гриппозной инфекции А/H5N1 также проводили на модели клеточной культуры Vero. В предварительных исследованиях было показано, что максимальная активность изучаемых конъюгатов наблюдается при введении их в культуру за 24 часа до заражения клеток. Учет результатов проводили на пятый день после инфицирования клеток. Результаты представлены в таблице 5.A study of the antiviral activity of the HCMC preparation and its fractions (NM and BM conjugates) against influenza A / H5N1 infection was also carried out on a Vero cell culture model. In preliminary studies, it was shown that the maximum activity of the studied conjugates is observed when they are introduced into the culture 24 hours before infection of the cells. Analysis was carried out on the fifth day after infection of the cells. The results are presented in table 5.

Таблица 5
Влияние ГКМЦ и его фракций (конъюгаты НМ и ВМ) на жизнеспособность клеток Vero, инфицированных вирусом гриппа А/H5N1Table 5
The effect of HCMC and its fractions (conjugates of NM and BM) on the viability of Vero cells infected with influenza A / H5N1 virus Доза вируса, ТЦД 50 = 10,0The dose of the virus, TCD 50 = 10.0 Концентрация препаратов (мг/мл)The concentration of drugs (mg / ml) 1,01,0 0,50.5 0,250.25 0,120.12 0,060.06 0,030,03 Контроль (без препарата)Control (without drug) % выживших клеток% surviving cells ГКМЦSCMC 6565 6565 55 00 00 00 00 НМ*NM * 8080 8080 8080 8080 30thirty 00 00 ВМ*VM * 4545 30thirty 00 00 00 00 00 ВМ* - фракция с ММ от 1500Да до 180000 Да,
НМ**- фракция с ММ от 780 Да до 1500 ДаVM * - fraction with MM from 1500 Da to 180,000 Yes,
NM ** - fraction with MM from 780 Yes to 1500 Yes

Как видно из приведенных данных, НМ защищает клетки лучше, чем ГКМЦ, в то время как ВМ обладает наименее выраженной активностью.As can be seen from the above data, NM protects cells better than HCMC, while BM has the least pronounced activity.

Таким образом, эффективное противовирусное действие ГКМЦ обеспечивается за счет расширения диапазона ММ продукта, что, в свою очередь, позволяет получить и выделить низкомолекулярную фракцию с высоким содержанием госсипола в составе коньюгата, которая обладает очень высокой противовирусной активностью.Thus, the effective antiviral effect of HCMC is ensured by expanding the range of the MM product, which, in turn, allows one to obtain and isolate a low molecular weight fraction with a high gossypol content in the conjugate, which has a very high antiviral activity.

Claims

1. The gossypol conjugate with sodium carboxymethyl cellulose, having an antiviral effect, characterized by a molecular weight of 780-180000 Yes at a ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (1-5) :( 99-95) wt.% And containing not more than 20% low molecular weight fraction with a molecular weight of from 780 Yes up to 1500 Yes and no more than 80% of high molecular weight fraction with a molecular weight from 1500 Yes to 180,000 Yes.

2. The conjugate of gossypol with sodium carboxymethyl cellulose, having an antiviral effect and characterized by a molecular weight of from 780 to 1500 Da with a ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (0.35-1.76) :( 99.65-98.24) wt.%.

3. The conjugate of gossypol with sodium carboxymethyl cellulose, which has an antiviral effect and is characterized by a molecular weight of from 1500 Da to 180,000 Da with a ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (0.65-3.23) :( 99.35-96.77) wt.%.

4. The method of obtaining the gossypol conjugate with sodium carboxymethyl cellulose according to claim 1, comprising the interaction of an aqueous solution of sodium carboxymethyl cellulose with an aqueous solution of iodic acid at a weight ratio of sodium carboxymethyl cellulose and iodic acid (25-35) :( 0.5-5) with the subsequent stages of the precipitation of sodium dialdehyde carboxymethyl dehyddehydide treating the reaction mixture with a mixture of an acidified aqueous solution of sodium iodide and acetone; isolating and treating the resulting gossypoloux sodium sodium carboxymethyl cellulose dialdehyde acid in a mixture of an aqueous solution of alkali and acetone to obtain the target product.

5. The method of obtaining the gossypol conjugate with sodium carboxymethyl cellulose according to claim 2, comprising separating the gossypol conjugate with sodium carboxymethyl cellulose, characterized in clause 1 or obtained by the method according to claim 4, by size exclusion chromatography and isolating the fraction with a molecular weight of from 780 Da to 1,500 Da.

6. A method for producing a gossypol conjugate with sodium carboxymethyl cellulose according to claim 3, comprising separating a gossypol conjugate with sodium carboxymethyl cellulose, as described in claim 1 or obtained by the method according to claim 4, by size exclusion chromatography and isolating a fraction with a molecular weight of from 1500 Da to 180,000 Da, respectively.

7. An antiviral agent that is a conjugate of gossypol with sodium carboxymethyl cellulose with a molecular weight of 780-180000 Yes with a ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (1-5) :( 99-95) wt.%, Containing up to 20 wt.% Low molecular weight fraction with a molecular weight of 780 Yes up to 1500 Yes and up to 80 wt.% High molecular weight fraction with a molecular weight of from 1500 Da to 180,000 Yes.

8. The antiviral agent according to claim 7, intended for the treatment of influenza.

9. The antiviral agent according to claim 7, intended for the treatment of hepatitis C.

10. The antiviral agent according to claim 7, which is a gossypol conjugate with sodium carboxymethyl cellulose obtained by the method according to claim 4.

11. An antiviral agent, which is a conjugate of gossypol with sodium carboxymethyl cellulose with a molecular weight of from 780 to 1500 Da with a ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (0.35-1.76) :( 99.65-98.24) wt.%.

12. The antiviral agent according to claim 11, intended for the treatment of influenza.

13. The antiviral agent according to claim 11, intended for the treatment of hepatitis C.

14. The antiviral agent according to claim 11, which is a gossypol conjugate with sodium carboxymethyl cellulose obtained by the method according to claim 5.

15. An antiviral agent, which is a conjugate of gossypol with sodium carboxymethyl cellulose with a molecular weight of from 1500 Da to 180,000 Yes with a ratio of gossypol: sodium carboxymethyl cellulose (0.65-3.23) :( 99.35-96.77) wt.%.

16. The antiviral agent of claim 15 for treating influenza.

17. The antiviral agent according to clause 15, intended for the treatment of hepatitis C.

18. The antiviral agent according to clause 15, which is a gossypol conjugate with sodium carboxymethyl cellulose obtained by the method according to claim 6.

19. A pharmaceutical composition having an antiviral effect, containing as the active component a therapeutically effective amount of the conjugate according to claim 1 and pharmaceutically acceptable additives.

20. A pharmaceutical composition having an antiviral effect, containing as the active component a therapeutically effective amount of the conjugate according to claim 2 and pharmaceutically acceptable additives.

21. A pharmaceutical composition having an antiviral effect, containing as the active component a therapeutically effective amount of the conjugate according to claim 3 and pharmaceutically acceptable additives.