RU2084522C1

RU2084522C1 - Strain of bacterium yersinia pseudotuberculosis 7a used as an antigen for tuberculosis serodiagnosis

Info

Publication number: RU2084522C1
Application number: RU95111636A
Authority: RU
Inventors: И.В. Смирнов
Original assignee: Рязанский государственный медицинский университет им.акад.И.П.Павлова
Priority date: 1995-07-06
Filing date: 1995-07-06
Publication date: 1997-07-20
Also published as: RU95111636A

Abstract

FIELD: biotechnology, medicinal microbiology. SUBSTANCE: strain of bacterium Yersinia pseudotuberculosis 7A is deposited in Collection Ros-NIPCI "Microbe" KM N 105. Strain shows stable S-form content including at 37 C that ensures to prepare high-sensitive and specific corpuscular diagnosticum for reaction agglutination. EFFECT: strain indicated above. 1 tbl

Description

Изобретение относится к медицинской микробиологии и представляет собой оригинальный штамм возбудителя псевдотуберкулеза, используемый в качестве корпускулярного антигена для реакции агглютинации с целью серодиагностики псевдотуберкулеза в диагностической и научно-исследовательской работе. The invention relates to medical microbiology and is an original strain of the causative agent of pseudotuberculosis, used as a corpuscular antigen for the agglutination reaction for the purpose of serodiagnosis of pseudotuberculosis in diagnostic and research work.

Серодиагностика псевдотуберкулеза, наряду с бактериологическим методом, является основным звеном в лабораторной диагностике этой достаточно широко распространенной инфекции. В ряде случаев из-за невозможности диагностировать псевдотурберкулез по клиническим признакам и неэффективности бактериологического исследования (поздние сроки заболевания, внутриклеточная локализация возбудителя и др.), серодиагностика является практически единственным методом подтверждения диагноза. Используемые для серодиагностики реакции неравнозначны: в реакции агглютинации (РА) выявляются антитела к антигенам целых микробных клеток, а в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) к липополисахариду, выделенному из клеток возбудителя и фиксированному на поверхности эритроцитов (в соответствии с технологией получения коммерческого эритроцитарного диагностикума). Serodiagnosis of pseudotuberculosis, along with the bacteriological method, is the main link in the laboratory diagnosis of this fairly widespread infection. In some cases, due to the inability to diagnose pseudotuberculosis by clinical signs and the inefficiency of bacteriological studies (late stages of the disease, intracellular localization of the pathogen, etc.), serodiagnosis is almost the only method of confirming the diagnosis. The reactions used for serodiagnostics are not equivalent: in the agglutination (RA) reaction, antibodies to the antigens of whole microbial cells are detected, and in the passive hemagglutination (RPHA) reaction to lipopolysaccharide isolated from the cells of the pathogen and fixed on the surface of red blood cells (in accordance with the technology for obtaining commercial red blood cells) .

Применяемый в РА антиген должен представлять собой гомогенную взвесь микробных клеток эталонного, лучше местного, штамма с типичными свойствами и той антигенной структурой, которая выражена в период пребывания возбудителя в организме человека. Последнее особенно важно, так как для иерсиний характерна температурная зависимость ряда физиологических характеристик, в том числе многих антигенов (часть из них принимает участие в патогенезе заболевания). The antigen used in RA should be a homogeneous suspension of microbial cells of a reference, better than local, strain with typical properties and that antigenic structure, which is expressed during the stay of the pathogen in the human body. The latter is especially important, since Yersinia is characterized by the temperature dependence of a number of physiological characteristics, including many antigens (some of them take part in the pathogenesis of the disease).

В настоящее время в качестве антигена для РА используют референс-штаммы из международных коллекций. Например, для серодиагностики псевдотуберкулеза используют штамм Y. pseudotuberculosis серовара 01 (N 393) из Международного центра по иерсиниям (Париж). Данный штамм принят за прототип. Currently, reference strains from international collections are used as antigen for RA. For example, for serodiagnosis of pseudotuberculosis, the strain Y. pseudotuberculosis of serovar 01 (N 393) from the International Center for Yersinia (Paris) is used. This strain is taken as a prototype.

Известно использование эталонного штамма в качестве антигена для РА [1, 2] Перед приготовлением антигена его длительно пассируют в жидких питательных средах при низких температурах для накопления S-форм, проверяют культурально-морфологические свойства на питательном агаре, селекционируют колонии в S-форме, выращивают микроорганизмы на слабощелочном агаре (Хоттингера или МПА) при +17 24^oC в течение 24 36 ч. Для приготовления антигена используют взвесь, полученную после смыва агаровой культуры, непосредственно (живая культура) или после обработки микробной массы формалином (убитая культура).It is known to use the reference strain as an antigen for RA [1, 2] Before preparing the antigen, it is passaged for a long time in liquid nutrient media at low temperatures for the accumulation of S-forms, the cultural and morphological properties on nutrient agar are checked, colonies in S-form are selected, grown microorganisms on agar weakly alkaline (Hottinger or IPA) at 17 to 24 ^o C for 24 36 hours. for the preparation of the antigen using slurry obtained after flushing agar culture itself (a living culture) or after obrabot and microbial mass formalin (killed culture).

Недостатком при использовании прототипного штамма является то, что для получения гомогенной взвеси клеток культуру выращивают при температуре ниже +30^oC, когда у микроба имеются жгутики и выражен H-антиген, а часть поверхностных антигенов, принимающих участие в патогенезе заболевания, не выражена (они выражены при температурном режиме хозяина +37^oC). Повышение температуры инкубирования до +37^oC приводит к спонтанному хлопьеобразованию в микробной взвеси из-за гидрофобности клеток, обусловленной, в частности, функционированием плазмиды вирулентности массовой 45 МД. Образование хлопьев в контроле антигена является препятствием для постановки РА с культурой, выращенной при +37^oC.The disadvantage when using the prototype strain is that to obtain a homogeneous suspension of cells, the culture is grown at a temperature below +30 ^o C, when the microbe has flagella and H-antigen is expressed, and some of the surface antigens involved in the pathogenesis of the disease are not expressed (they expressed at a temperature of the host +37 ^o C). Raising the incubation temperature to +37 ^o C leads to spontaneous flocculation in microbial suspension due to hydrophobicity of cells, due, in particular, to the functioning of the virulence plasmid mass 45 MD. The formation of flakes in antigen control is an obstacle to the setting of RA with a culture grown at +37 ^o C.

Цель изобретения получение штамма Y pseudotuberculosis, обладающего выраженной антигенной активностью без признаков спонтанной агглютинации и пригодного для использования в качестве антигена для РА. The purpose of the invention is the obtaining of strain Y pseudotuberculosis, which has a pronounced antigenic activity without signs of spontaneous agglutination and suitable for use as an antigen for RA.

Полученный штамм Y. pseudotuberculosis 7A депонирован в коллекции патогенных микроорганизмов РосНИПЧИ "Микроб" (справка о депонировании N 6/3-286 от 01.06.95). The resulting strain of Y. pseudotuberculosis 7A was deposited in the collection of pathogenic microorganisms RosNIPCHI "Microbe" (certificate of deposit N 6 / 3-286 from 06/01/95).

Морфологические и физиологические характеристики. Грамотрицательные палочковидные клетки размером 0,4 0,7 х 0,5 1,2 мкм слабоподвижны при температуре ниже +30 (перитрихи), при +37 неподвижны; спор и капсул не образуют. На жидких средах (Кларка, питательном бульоне) в аэробных условиях при +26 или +37 образуют равномерное помутнение и небольшой компактный осадок на дне. Аутоагглютинация не наблюдается. На среде Эндо при +37 колонии гладкие с относительно ровным краем, выпуклые, прозрачные с желтоватым оттенком, пастообразной консистенции, размером через 24 ч 0,6 1,0 мм, через 48 ч - до 1,2 1,8 мм, нередко с красным центром. При +26 колонии на той же среде меньшего диаметра (через 24 ч 0,4 0,8 мм, через 48 ч 1,0 1,5 мм) круглые, с ровным краем, голубоватые, иногда с красным центром. На агаре Хоттингера колонии имеют аналогичные характеристики. Morphological and physiological characteristics. Gram-negative rod-shaped cells measuring 0.4 0.7 x 0.5 1.2 μm are weakly mobile at temperatures below +30 (peritrichi), at +37 they are motionless; spores and capsules do not form. On liquid media (Clark, nutrient broth) under aerobic conditions at +26 or +37 form a uniform turbidity and a small compact sediment at the bottom. Autoagglutination is not observed. On Endo medium, at +37, the colonies are smooth with a relatively even edge, convex, transparent with a yellowish tint, pasty consistency, after 0.6 hours 0.6 1.0 mm, after 48 hours - up to 1.2 1.8 mm, often with red center. At +26, the colonies on the same medium of smaller diameter (after 24 hours 0.4 0.8 mm, after 48 hours 1.0 1.5 mm) are round, with an even edge, bluish, sometimes with a red center. On Hottinger agar, colonies have similar characteristics.

Биохимическая активность. Ферментирует с образованием кислоты: глюкозу, маннит, рамнозу, трегалозу, гидролизует эскулин; не ферментирует лактозу, сахарозу, сорбит, дульцит, инозит, целлобиозу; лизин и орнитин не декарбоксилирует, не обладает аргининдегидролазной активностью, цитрат не утилизирует, фенилаланин не дезаминирует; пробы Фогеса-Проскауэра при +37 отрицательны; пробы на индол, сероводород и с твином-80 отрицательны. Biochemical activity. It ferments with the formation of acid: glucose, mannitol, rhamnose, trehalose, hydrolyzes esculin; does not ferment lactose, sucrose, sorbitol, dulcite, inositol, cellobiose; lysine and ornithine do not decarboxylate, do not have arginine dehydrolase activity, citrate does not utilize, phenylalanine does not deamine; Foges-Proskauer tests at +37 are negative; samples for indole, hydrogen sulfide and with tween-80 are negative.

Антигенные свойства. Вступает в реакцию агглютинации с диагностической псевдотуберкулезной сывороткой, полученной путем иммунизации кроликов эталонным штаммом Y. pseudotuberculosis серовара 01. Обладает общим энтеробактериальным антигеном. Antigenic properties. It enters into agglutination reaction with diagnostic pseudotuberculosis serum obtained by immunization of rabbits with the reference strain of Y. pseudotuberculosis serovar 01. It has a common enterobacterial antigen.

Генетические особенности. Содержит плазмиду с мол.массой около 82 МД; плазмиду pYV не содержит. Устойчив к бензилпенициллину, оксациллину, эритромицину, фузидину, чувствителен к стрептомицину, канамицину, тетрациклину, карбенициллину, ампициллину, левомицетину, рифампицину. Genetic features. Contains a plasmid with a molar mass of about 82 MD; plasmid pYV does not contain. Resistant to benzylpenicillin, oxacillin, erythromycin, fusidine, sensitive to streptomycin, kanamycin, tetracycline, carbenicillin, ampicillin, levomycetin, rifampicin.

Штамм 7A получен путем селекции на плотной питательной среде из популяции исходного штамма Y. pseudotuberculosis N 7, выделенного от больного псевдотуберкулезом в г. Москве в 1990 году. В отличие от родительского, штамм 7A стабильно поддерживает S-форму в диапазоне +26.+37^oC, способен образовывать гомогенные суспензии без признаков спонтанной агглютинации.Strain 7A was obtained by selection on a solid nutrient medium from a population of the original strain Y. pseudotuberculosis N 7 isolated from a patient with pseudotuberculosis in Moscow in 1990. Unlike the parent, strain 7A stably maintains the S-form in the range + 26. + 37 ^o C, is able to form homogeneous suspensions without signs of spontaneous agglutination.

Использование штамма 7A осуществляют следующим образом. The use of strain 7A is as follows.

Чистую культуру штамма выращивают на плотной питательной среде (МПА, Хоттингера) при +37^oC в течение 18 24 ч. Смывают бактерии с агара 0,85% стерильным раствором хлорида натрия и дважды отмывают таким же раствором путем центрифугирования при 5000g в течение 15 мин с последующим ресуспензированием осадка. Доводят концентрацию клеток по оптическому стандарту мутности до 2•10 в 9 степени, добавляют формалин (в конечной концентрации 0,2% об.) и выдерживают при температуре +15.+25^oC в течение 20 24 ч. Реакцию агглютинации с сывороткой крови и готовым антигеном ставят и учитывают общепринятым способом, как правило, смешивая по 0,5 мл антигена с таким же объемом сыворотки в разведениях от 1:50 до 1:1600. Положительная реакция в титре 1:200 и выше, а также динамика титров антител в парных сыворотках позволяют диагностировать псевдотуберкулез.A pure strain culture is grown in solid nutrient medium (MPA, Hottinger) at +37 ^° C for 18-24 hours. The bacteria are washed off with agar with a 0.85% sterile sodium chloride solution and washed twice with the same solution by centrifugation at 5000g for 15 minutes followed by resuspension of sediment. The cell concentration was adjusted to an optical turbidity standard of 2 • 10 to the power of 9, formalin (at a final concentration of 0.2% vol.) Was added and kept at a temperature of + 15. + 25 ^o C for 20 24 hours. Agglutination reaction with blood serum and the finished antigen is put and taken into account in the generally accepted way, as a rule, mixing 0.5 ml of antigen with the same volume of serum in dilutions from 1:50 to 1: 1600. A positive reaction in a titer of 1: 200 and higher, as well as the dynamics of antibody titers in paired sera, can diagnose pseudotuberculosis.

Сущность изобретения поясняется следующими примерами. The invention is illustrated by the following examples.

Пример 1. У больной Л. 16 лет, со средне-тяжелым течением осложненного псевдотуберкулеза на 4 месяце заболевания взята кровь для серодиагностики. После отделения от сгустка сыворотка прогрета при +56^o в течение 30 мин и разведена в 0,85% растворе хлорида натрия от 1:50 до 1:1600 в объеме 0,5 мл путем двукратных разведений.Example 1. Patient L., 16 years old, with a moderate to severe course of complicated pseudotuberculosis at 4 months of illness, took blood for serodiagnosis. After separation from the clot, the serum was heated at +56 ^o for 30 min and diluted in a 0.85% sodium chloride solution from 1:50 to 1: 1600 in a volume of 0.5 ml by two dilutions.

Предварительно на агаре Хоттингера при +37^oC в течение 24 ч выращены культуры штаммов Y. pseudotuberculosis 7A, прототипного (393) и Escherichia coli, при 26^oC прототипного штамма. После приготовления смывов и отмывания бактерий в 0,85% растворе хлорида натрия суспензии стандартизированы по оптическому стандарту мутности до 2 млрд.кл/мл и обработаны формалином (0,2% ) в течение 20 ч.Previously, cultures of Y. pseudotuberculosis 7A strains, prototype (393) and Escherichia coli, at 26 ^o C of the prototype strain, were grown on Hottinger agar at +37 ^° C for 24 hours. After preparation of the washings and washing of bacteria in a 0.85% sodium chloride solution, the suspensions were standardized according to the optical turbidity standard to 2 billion cells / ml and treated with formalin (0.2%) for 20 hours.

Суспензии приготовленных антигенов внесены по 0,5 мл в пробирки с соответствующими разведениями сыворотки и в контроле антигена. После встряхивания пробирки выдержаны 2 ч при +37^oC и 18 ч при комнатной температуре. Результаты РА представлены ниже.Suspensions of the prepared antigens were added in 0.5 ml in tubes with the appropriate dilutions of the serum and in the antigen control. After shaking, the tubes were kept for 2 hours at +37 ^o C and 18 hours at room temperature. RA results are presented below.

Следует отметить, что антитела к возбудителю псевдотуберкулеза в диагностических титрах выявлены по отношению к антигенам обоих штаммов, но в отношении штамма 7A в более высоком титре; антиген из прототипного штамма после преинкубации при +37^oC непригоден для использования из-за спонтанной агглютинации. Полученный результат позволяет серологически подтвердить псевдотуберкулез у больной Л.It should be noted that antibodies to the causative agent of pseudotuberculosis in diagnostic titers were detected in relation to the antigens of both strains, but in relation to strain 7A in a higher titer; the antigen from the prototype strain after preincubation at +37 ^o C is unsuitable for use due to spontaneous agglutination. The result allows us to serologically confirm pseudotuberculosis in patient L.

Пример 2. У больного С. 19 лет, поступившего из очага псевдотуберкулеза с неясным диагнозом в конце 1 недели заболевания взята кровь для серологического исследования. Приготовлены двукратные разделения сыворотки крови от 1: 50 до 1:1600 в объеме 0,5 мл. На МПА в течение 24 ч при +37^oC выращена культура шт. 7A, при +26 культура прототипного штамма. После приготовления смывов, отмывания клеток, стандартизации суспензий до концентрации 2 млрд.кл/мл, а также обработки формалином (0,2% в течение 24 ч) готовые антигены по 0,5 мл внесены в пробирки с разведениями сыворотки и контроли антигена. Пробирки выдержаны 2 ч при +37^oC и 20 ч при комнатной температуре. При учете диагностический титр антител (1:200) выявлен только с диагностикумом из штамма 7A (с диагностикумом из прототипного штамма-титр 1:100). Следовательно, при использовании штамма 7A подтвержден диагноз псевдотуберкулеза у больного С.Example 2. Patient S., 19 years old, who came from the focus of pseudotuberculosis with an unclear diagnosis at the end of 1 week of illness, took blood for a serological examination. Double separation of blood serum from 1: 50 to 1: 1600 in a volume of 0.5 ml was prepared. On MPA for 24 hours at +37 ^o C culture was grown pcs. 7A, at +26 the culture of the prototype strain. After preparation of the washings, washing of the cells, standardization of the suspensions to a concentration of 2 billion cells / ml, as well as treatment with formalin (0.2% for 24 hours), 0.5 ml ready-made antigens were added to serum dilution tubes and antigen controls. The tubes were incubated for 2 hours at +37 ^o C and 20 hours at room temperature. When you take into account the diagnostic antibody titer (1: 200) was detected only with the diagnosticum from strain 7A (with the diagnosticum from the prototype strain titer 1: 100). Therefore, when using strain 7A, the diagnosis of pseudotuberculosis in patient C. was confirmed.

Таким образом, предлагаемый для использования в качестве антигена с целью серодиагностики псевдотуберкулеза штамм N7A имеет следующие преимущества по сравнению с прототипом:
для штамма 7A не характерна выраженная диссоциация при культивировании на питательных средах в температурном диапазоне +26.+37^oC; он не требует трудоемкого клонирования для получения S-формы и гомогенных суспензий, используемых в качестве антигена для РА;
в РА выявляются антитела в более высоких титрах, чем с антигенами из других штаммов; это повышает частоту серологического подтверждения псевдотуберкулеза;
штамм 7A выделен на территории Европейской части страны и имеет типичные для циркулирующих в этом регионе иерсиний биологические характеристики;
выраженная активность штамма 7A позволяет использовать приготовленный из него антиген в качестве высокого чувствительного и достаточно специфичного диагностикума для РА.Thus, proposed for use as an antigen for the purpose of serodiagnosis of pseudotuberculosis strain N7A has the following advantages compared with the prototype:
strain 7A is not characterized by pronounced dissociation during cultivation on nutrient media in the temperature range + 26. + 37 ^o C; it does not require laborious cloning to obtain the S-form and homogeneous suspensions used as antigen for RA;
antibodies in higher titres are detected in RA than with antigens from other strains; this increases the frequency of serological confirmation of pseudotuberculosis;
strain 7A was isolated in the European part of the country and has biological characteristics typical of Yersinia circulating in this region;
the pronounced activity of strain 7A allows the use of the antigen prepared from it as a highly sensitive and sufficiently specific diagnosticum for RA.

Claims

The bacterial strain Yersinia pseudotuber culosis 7A KM N 105 used as an antigen for serodiagnosis of pseudotuberculosis.