RU2070925C1

RU2070925C1 - Strain of bacterium escherichia coli - a producer of restriction endonuclease eco 71 ki

Info

Publication number: RU2070925C1
Application number: RU93033885A
Authority: RU
Inventors: М.М. Деньмухаметов; А.Н. Кравец; А.С. Солонин
Original assignee: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов
Priority date: 1993-06-30
Filing date: 1993-06-30
Publication date: 1996-12-27

Abstract

FIELD: genetic engineering, biotechnology, biochemistry. SUBSTANCE: strain E. coli BM KB-200 6D is isolated from clinic isolates after screening strain-producers of restrictases. Enzyme activity is detected in extracts obtained from the separate colonies grown on agarized medium followed by electrophoresis of DNA cleavage fragments in agarose gel. Obtained strain is a producer of restrictase Eco 71 KI, isoschizomer or restriction endonuclease Eco 31 I. Enzyme content in the proposed strain is at least 200 000 U/g wet cell biomass, yield of the purified enzyme is 5000 U/g cell biomass. EFFECT: new strain indicated above as a restriction endonuclease producer.

Description

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового штамма бактерий Escherichia coli, который может быть использован для получения эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов: 5'-GGCTCTCN! 3'; 3'-CCAGAGNNNNN! 5' в составе двухцепочечной ДНК. Рестриктаза Еco71кI, продуцируемая предлагаемым штаммом, является изошизомером известной рестриктазы Есо31I и может найти применение в генно-инженерных исследованиях как в экспериментах по конструированию рекомбинантных ДНК in vitro, так и при изучении первичной структуры ДНК. The invention relates to the field of biotechnology and relates to a new strain of bacteria Escherichia coli, which can be used to obtain a restriction endonuclease (restrictase) that recognizes and cleaves the nucleotide sequence: 5'-GGCTCTCN! 3 '; 3'-CCAGAGNNNNN! 5 'as part of double-stranded DNA. The restriction enzyme Eco71kI produced by the proposed strain is an isoshizomer of the well-known restriction enzyme Eco31I and can be used in genetic engineering studies both in experiments on the construction of recombinant DNA in vitro and in studying the primary structure of DNA.

Наиболее близким к предлагаемому штамму является штамм Escherichia coli RFL31, продуцирующий рестриктазу Есo311[1] Выход фермента не приводится. Closest to the proposed strain is a strain of Escherichia coli RFL31, producing the restriction enzyme Eco311 [1] The enzyme yield is not given.

Задачей, на решение которой направлено предлагаемое изобретение является получение штамма, продуцирующего рестриктазу заданной специфичности с высоким выходом, быстро растущего на обычных питательных средах. The problem to which the invention is directed is to obtain a strain producing a restriction enzyme of a given specificity with a high yield, rapidly growing on ordinary nutrient media.

Предлагаемый штамм Escherichia coli 71к был получен в результате целенаправленного поиска штаммов продуцентов рестриктаз среди клинических изоляторов (г. Киев) при помощи разработанного нами метода тестирования активности в экстрактах, полученных из отдельно взятых колоний, выросших на агаризованной среде, с последующим электрофорезом продуктов расщепления ДНК в агарозном геле. Содержание рестриктазы Есо71кI в предлагаемом штамме 200000 ед./г сырой биомассы клеток. The proposed strain Escherichia coli 71k was obtained as a result of a targeted search for strains of restriction enzyme producers among clinical isolators (Kiev) using our developed method for testing activity in extracts obtained from individual colonies grown on an agar medium, followed by electrophoresis of DNA cleavage products in agarose gel. The content of restriction enzyme Eco71kI in the proposed strain of 200,000 units / g of crude cell biomass.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ РАН и хранится в ней под номером ВКМ В-2006Д. The strain is deposited in the All-Union Collection of Microorganisms at the IBPM RAS and is stored in it under the number VKM V-2006D.

Штамм Escherichia coli ВКМ В-2006Д имеет следующие характеристики. The strain Escherichia coli VKM V-2006D has the following characteristics.

Культурально-морфологические признаки. Cultural and morphological characters.

Клетки прямые палочковые, размером 0,7 0,8 мкм в поперечнике и 2 3, иногда 5 мкм, в длину, подвижные, грамотрицательные, с латеральными жгутиками. Располагаются одиночно, парами или цепочками, неспороносные. Cells are straight rod-shaped, with a size of 0.7 0.8 μm across and 2 3, sometimes 5 μm, in length, mobile, gram-negative, with lateral flagella. They are located singly, in pairs or chains, not spore-bearing.

Штамм хорошо растет на обычных питательных средах (МПА, МПБ, LB-бульон и LB-агар). При росте на мясо-пептонном агаре или LB-агаре колонии гладкие, круглые, прижатые, блестящие, мутные. При росте в жидких средах: в МПБ-бульоне или LB-бульоне образуют ровную интенсивную муть. The strain grows well on ordinary nutrient media (MPA, MPB, LB broth and LB agar). When growing on meat peptone agar or LB agar, the colonies are smooth, round, pressed, shiny, cloudy. When growing in liquid media: in the BCH-broth or LB-broth form a uniform intense turbidity.

Физиолого-биохимические признаки. Physiological and biochemical characteristics.

Клетки растут в пределах от 4 до 50^oС, оптимальная температура роста 37^oС, оптимум pH 6,8 7,4.Cells grow in the range from 4 to 50 ^o C, the optimum growth temperature of 37 ^o C, the optimum pH of 6.8 7.4.

В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органические кислоты, в частности: альфа-глюкозу, альфа-фруктозу, галактозу, арабинозу, лактозу, трегалактозу. As a carbon source, many carbohydrates, alcohols, organic acids are used, in particular: alpha-glucose, alpha-fructose, galactose, arabinose, lactose, trehalactose.

В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической форме в виде пептона, аминокислот. As a source of nitrogen, both mineral salts in ammonium and nitrate forms, and in organic form in the form of peptone, amino acids, are used.

Нитраты восстанавливают до нитритов. Nitrates are reduced to nitrites.

Желатину не разжижают. Gelatin is not liquefied.

Индол не образуют. Indole does not form.

Генетические признаки: Клетки обладают устойчивостью к тетрациклину (20 мкг/мл). Genetic traits: Cells are resistant to tetracycline (20 μg / ml).

Условия хранения штамма:
Штамм бактерий Escherichia coli ВКМ В-2006Д хранят на чашках и косяках. Пересевы на свежие среды один раз в месяц. Может храниться не менее года в 15% глицерине при от -20 до -70^oС, в лиофильно-высушенном состоянии с сахаро-желатиновым агаром или в полужидкой агаризованной среде LB под вазелиновым маслом.The storage conditions of the strain:
The bacterial strain Escherichia coli VKM V-2006D is stored on plates and jambs. Reseeding on fresh media once a month. It can be stored for at least a year in 15% glycerol at from -20 to -70 ^o C, in a freeze-dried state with sugar-gelatin agar, or in semi-liquid agarized LB medium under liquid paraffin.

Пример 1. Тестирование ферментов рестрикции. Example 1. Testing of restriction enzymes.

Для поиска рестриктаз использовали экспресс-метод, представляющий собой модификацию метода Белавина и соавт. [2] Для этого одну-две большие колонии (около 5•10⁶ 1•10⁷ клеток) суспендируют в 20 мкл буфера А (20 мМ трис-HCl, pH 7,6, 12,5 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 10 мМ 2-меркаптоэтанола), содержащего 10 мг/мл лизоцима, и инкубируют при комнатной температуре (18^oC). Через 30 мин добавляют равный объем буфера В (20 мМ трис-HCl, pH 7,6, 2% тритон Х-100, 10 мМ 2-меркаптоэтанола), и инкубируют еще 60 мин при 4^oС. Клеточную суспензию (1 и 4 мкл) смешивают с 2 мкг ДНК фага ⌀ 80 vir в 40 мкл буфера С (10 мМ трис-НCl, pH 7,6, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 50, мМ NaCl). Гидролиз проводят при 37^oС в течение 10 мин. Кроме того, 4 мкл клеточной суспензии дополнительно инкубируют в 40 мкл буфера С без субстрата с целью проверки возможного наличия в растворе экстрахромосомной ДНК. Реакцию останавливают экстракцией равным объемом водонасыщенного фенола. Для электрофоретического анализа используют 20 мкл гидролизата.To search for restriction enzymes, the express method was used, which is a modification of the method of Belavin et al. [2] For this, one or two large colonies (about 5 • 10 ⁶ 1 • 10 ⁷ cells) are suspended in 20 μl of buffer A (20 mm Tris-HCl, pH 7.6, 12.5 mm EDTA, 100 mm NaCl, 10 mm 2-mercaptoethanol) containing 10 mg / ml lysozyme and incubated at room temperature (18 ^o C). After 30 min, an equal volume of buffer B (20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 2% Triton X-100, 10 mM 2-mercaptoethanol) was added, and incubated for another 60 min at 4 ^° C. Cell suspension (1 and 4 μl) was mixed with 2 μg of DNA of phage ⌀ 80 vir in 40 μl of buffer C (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl ₂ , 10 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM NaCl). Hydrolysis is carried out at 37 ^o C for 10 minutes In addition, 4 μl of the cell suspension is further incubated in 40 μl of buffer C without substrate in order to verify the possible presence of extrachromosomal DNA in the solution. The reaction is stopped by extraction with an equal volume of water-saturated phenol. For electrophoretic analysis using 20 μl of hydrolyzate.

Пример 2. Получение и очистка рестриктазы. Example 2. Obtaining and purification of restrictase.

Культуру клеток Е.coli 71к выращивают в 1 л LB-бульона (5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl, 10 г бактотриптон на 1 л воды) при 37 град.С до титра 4•10⁹ кл/мл. Клетки осаждают центрифугированием (6000 об/мин 15 мин). 1 г сырой биомассы суспендируют в 5 мл буфера содержащего 10 мМ трис HCl, pH 7,5, 150 мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА 10 мМ 2- меркаптоэтанола. Клетки разрушают ультразвуком, экстракт получают центрифугированием при 2^oС (48000g).The E. coli 71k cell culture is grown in 1 L of LB-broth (5 g of yeast extract, 10 g of NaCl, 10 g of bactotryptone per 1 l of water) at 37 degrees C to a titer of 4 • 10 ⁹ cells / ml. Cells are pelleted by centrifugation (6000 rpm for 15 minutes). 1 g of crude biomass is suspended in 5 ml of buffer containing 10 mM Tris HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 10 mM EDTA 10 mM 2-mercaptoethanol. Cells are destroyed by ultrasound, the extract is obtained by centrifugation at 2 ^o C (48000g).

Для определения активности рестриктазы Есо71кI готовят серийные разведения супернатанта: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 в буфере (10 мМ трис HCl pH 7,5, 50мМ NaCl, 10 мМ ЭДТА, 10 мМ 2-меркаптоэтанол). В инкубационную смесь (9 мкл), содержащую 10 мМ трис-HCl, pH 8,0, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl₂, 1мМ ЭДТА, 10 мМ ДТЕ, 1 мкг ДНК фага лямбда, добавляют 1 мкл соответствующего разведения экстракта и инкубируют при 37^oС в течение 1 ч. Результаты гидролиза проверяют с помощью электрофореза в 0,8% агарозном геле.To determine the activity of the restriction enzyme Eco71kI, serial dilutions of the supernatant are prepared: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 in buffer (10 mM Tris HCl pH 7.5, 50 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM 2-mercaptoethanol). In an incubation mixture (9 μl) containing 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl ₂ , 1 mM EDTA, 10 mM DTE, 1 μg lambda phage DNA, add 1 μl of the appropriate dilution of the extract and incubate at 37 ^o C for 1 h. The results of hydrolysis are checked by electrophoresis in 0.8% agarose gel.

За единицу активности берут количество фермента, необходимое для полного специфического расщепления 1 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 часа. The amount of enzyme required for complete specific cleavage of 1 μg lambda phage DNA for 1 hour is taken per unit of activity.

Уровень активности рестриктазы Есо71кI, определенный в бесклеточном экстракте штамма Е. coli 71к, около 200000 ед. в пересчете на 1 г сырой биомассы. The level of activity of the restriction enzyme Eco71kI, determined in the cell-free extract of the strain E. coli 71k, is about 200,000 units. in terms of 1 g of raw biomass.

Рестриктаза Есо71кI может быть очищена фракционированием клеточного экстракта последовательно на колонках с DEAE-целлюлозой (DE-52 Whatman) и фосфоцеллюлозой Р-11 (Whatman) с последующей хромографией на гидроксилапатите, карбоксиметилцеллюлозе (СМ-32 Whatman) и ДНК-агарозе. Препарат фермента окончательно концентрируют при диализе против буфера: 15 мM Трис-HCl, pH 7,5; 150 мM NaCl; 7 мM 2-меркаптоэтанол; 1мM ЭДТА, 50% глицерин. Выход очищенного фермента 5000 ед на 1 г сырой биомассы. The restriction enzyme Eco71kI can be purified by fractionation of the cell extract sequentially on columns with DEAE cellulose (DE-52 Whatman) and phosphocellulose P-11 (Whatman), followed by chromatography on hydroxylapatite, carboxymethyl cellulose (CM-32 Whatman) and DNA agarose. The enzyme preparation is finally concentrated during dialysis against the buffer: 15 mM Tris-HCl, pH 7.5; 150 mM NaCl; 7 mM 2-mercaptoethanol; 1mM EDTA, 50% glycerin. The yield of purified enzyme is 5000 units per 1 g of crude biomass.

Очищенный фермент стабилен при -20^oС в течение полугода. Рестриктаза пригодна для анализа структуры ДНК и для молекулярного клонирования.The purified enzyme is stable at -20 ^o C for six months. Restriction enzyme is suitable for DNA structure analysis and molecular cloning.

Пример 3. Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Есо71kI и места гидролиза ДНК. Example 3. Determination of the nucleotide sequence recognized by the restriction enzyme Eco71kI and the place of DNA hydrolysis.

Для определения последовательности узнавания рестриктазы проводят сравнение величин длин фрагментов, полученных экспериментально при гидролизе ДНК фага лямбда рестриктазой с величинами длин фрагментов, рассчитанных на ЭВМ по соответствующим программам для различных последовательностей нуклеотидов. Была обнаружена только одна последовательность:
5'-GGTCTCN!-3'
3'-CCAGAGNNNNN!-5',
для которой рассчитанные величины фрагментов совпадали с экспериментальными и были локализованы в следующих районах первичной нуклеотидной последовательности ДНК фага лямбда: 11424, 42715.To determine the recognition sequence for restrictase, the lengths of fragments obtained experimentally by hydrolysis of phage lambda restriction enzyme DNA are compared with the lengths of fragments calculated on a computer using appropriate programs for different nucleotide sequences. Only one sequence was detected:
5'-GGTCTCN! -3 '
3'-CCAGAGNNNNN! -5 ',
for which the calculated values of the fragments coincided with the experimental ones and were localized in the following regions of the primary nucleotide sequence of lambda phage DNA: 11424, 42715.

Для подтверждения полученных данных проводят картирование участков узнавания рестриктазой Есо71kI на ДНК фага лямбда, используя совместный гидролиз рестриктазами: ЕсоRI- и Есо71kI, BamHI и Есо71kI, CfrBI и Eco71kI. To confirm the obtained data, the recognition sites are mapped with the restriction enzyme Eco71kI on lambda phage DNA using co-hydrolysis with restriction enzymes: EcoRI and Eco71kI, BamHI and Eco71kI, CfrBI and Eco71kI.

Для определения места гидролиза ДНК рестриктазой Есо71kI была использована ДНК фага o 80. Полученные при гидролизе фрагменты ДНК дефосфорилируют фосфатазой из кишечника теленка, фосфатазу инактивируют прогреванием проб при 65^oС в течение 15 мин, смешивают с ДНК-лигазой и в присутствии 0,5 мМ АТФ, проводят реакцию лигирования. В отдельной пробе полученные фрагменты смешивают с фрагментами ДНК фага o 80, полученными при гидролизе Есо31I, не обработанными фосфатазой. Сравнение электрофоретических профилей фрагментов ДНК после обработки ДНК-лигазой позволяет сделать вывод о том, что место гидролиза для рестриктаз Есо31I и Есо71kI идентично, Проведенные эксперименты показывают, что рестриктаза Есо71kI является истинным изошизомером рестриктазы Есо31I.Phage o 80 DNA was used to determine the site of DNA hydrolysis with Eco71kI restriction enzyme. DNA fragments obtained during hydrolysis are dephosphorylated by calf intestine phosphatase, inactivated by heating samples at 65 ^° C for 15 min, mixed with DNA ligase and in the presence of 0.5 mM ATP, carry out the ligation reaction. In a separate sample, the obtained fragments are mixed with DNA fragments of phage o 80 obtained by hydrolysis of Eco31I, not treated with phosphatase. Comparison of the electrophoretic profiles of DNA fragments after treatment with DNA ligase allows us to conclude that the hydrolysis site for the restriction enzymes Eco31I and Eco71kI is identical.The performed experiments show that the restriction enzyme Eco71kI is a true isoschisomer of the Eco31I restrictase.

Полученная рестриктаза Есo71kI характеризуется следующими свойствами:
узнает и специфически расщепляет последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК 6 5'-GGTCTCN!-3'; 3'-CCAGAGNNNNN!-5';
оптимальное значение pH для действия рестриктазы 7,8 8,0;
оптимальная температура действия 37^oС.The obtained restrictase Enco71kI is characterized by the following properties:
recognizes and specifically cleaves the nucleotide sequence in the DNA molecule 6 5'-GGTCTCN! -3 ';3'-CCAGAGNNNNN! -5 ';
the optimal pH for the action of restriction enzyme is 7.8 to 8.0;
optimal temperature action 37 ^o C.

NaCl 50 мM
БСА 100 мкг/мл
Таким образом, полученный штамм Е.coli ВКМ В-2006Д, как продуцент специфической эндонуклеазы Есо71kI, обеспечивает высокий уровень содержания фермента, не менее 200000 ед./г сырого вещества биомассы клеток, что достаточно для получения рестриктазы в препаративных количествах. Выход очищенного фермента составляет 5000 ед./1 г биомассы клеток.NaCl 50 mM
BSA 100 mcg / ml
Thus, the obtained E. coli strain VKM B-2006D, as a producer of specific endonuclease Eco71kI, provides a high level of enzyme content of at least 200,000 units / g of crude biomass of cells, which is sufficient to obtain restriction enzyme in preparative quantities. The yield of purified enzyme is 5000 units / 1 g of cell biomass.

Claims

The bacterial strain Escherichia coli VKM B-2006D producer of restriction endonuclease Eco 71 k1.